Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ilościowy pomiar białek syntetyzowanych dooponowo u myszy

11.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60495

⸱

29 listopada 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine & Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

W tym artykule

Podsumowanie

Podwyższony poziom białka w płynie mózgowo-rdzeniowym może być wynikiem dyfuzji białka osocza przez zmienioną barierę krew-mózg lub syntezy dokanałowej. W artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół testowy, który pomaga rozróżnić oba przypadki i zapewnia pomiary ilościowe białek syntetyzowanych dokanałowo.

Streszczenie

Płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF), płyn znajdujący się w mózgu i rdzeniu kręgowym, ma ogromne znaczenie zarówno dla nauk podstawowych, jak i klinicznych. Analiza składu białka płynu mózgowo-rdzeniowego dostarcza kluczowych informacji w podstawowych badaniach neurologicznych, a także w chorobach neurologicznych. Jednym zastrzeżeniem jest to, że białka mierzone w płynie mózgowo-rdzeniowym mogą pochodzić zarówno z syntezy dokanałowej, jak i transudacji z surowicy, a analiza białka płynu mózgowo-rdzeniowego może określić tylko sumę tych dwóch składników. W celu rozróżnienia między transudacją białka z krwi a białkami wytwarzanymi dooponowo w modelach zwierzęcych, jak również u ludzi, pomiary profilowania białek płynu mózgowo-rdzeniowego przy użyciu konwencjonalnych narzędzi do analizy białek muszą obejmować obliczenie ilorazu albuminy płynu mózgowo-rdzeniowego / surowicy (albumina Q), markera integralności interfejsu krew-mózg (BBI) oraz indeksu białkowego (białko Q/albumina Q), oszacowanie dokanałowej syntezy białek. Protokół ten ilustruje całą procedurę, od pobrania płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi po obliczenia ilorazów i wskaźników, do ilościowego pomiaru dokanałowej syntezy białek i upośledzenia BBI w mysich modelach zaburzeń neurologicznych.

Wprowadzenie

Płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF), przezroczysty i bezbarwny płyn otaczający mózg i rdzeń kręgowy, ma wielkie znaczenie kliniczne i naukowe. Płyn mózgowo-rdzeniowy zachowuje środowisko elektrolityczne ośrodkowego układu nerwowego (OUN), równoważy ogólnoustrojowy stan kwasowo-zasadowy, dostarcza składniki odżywcze do komórek neuronalnych i glejowych, działa jako układ limfatyczny dla OUN i transportuje hormony, neuroprzekaźniki, cytokiny i inne neuropeptydy w całym OUN1. Tak więc, ponieważ skład płynu mózgowo-rdzeniowego odzwierciedla aktywność OUN, płyn ten oferuje cenny, choć pośredni, dostęp do scharakteryzowania fizjologicznego i patologicznego stanu OUN.

CSF był używany do diagnozowania schorzeń wpływających na OUN przez ponad sto lat, a przez większość tego czasu był głównie badany przez klinicystów jako narzędzie diagnostyczne. Jednak w ostatnich latach neurobiolodzy dostrzegli potencjał płynu mózgowo-rdzeniowego w badaniu patofizjologii OUN. W szczególności w dziedzinie neurobiologii wprowadzono kilka wysokoprzepustowych narzędzi do analizy białek, które umożliwiają szczegółowe badanie składu białek płynu mózgowo-rdzeniowego, z oczekiwaniem, że analiza ta może pomóc w uzyskaniu wglądu w dynamiczne zmiany zachodzące w OUN.

Rozwój technologiczny w technikach multipleksowych testów immunologicznych, takich jak technologie Luminex i Simoa2,3, dają dziś naukowcom możliwość wykrywania setek białek w bardzo niskich stężeniach. Co więcej, te same technologie pozwalają na wykorzystanie małych objętości próbek, co sprzyja badaniom na małych zwierzętach, w tym myszach, w których ograniczona objętość próbki płynu mózgowo-rdzeniowego do niedawna uniemożliwiała szczegółową charakterystykę płynu.

Niemniej jednak, jednym zastrzeżeniem jest to, że białka mierzone w płynie mózgowo-rdzeniowym mogą pochodzić z syntezy dokanałowej i/lub transudacji z surowicy z powodu uszkodzonego interfejsu krew-mózg (BBI). Niestety, sama analiza białka płynu mózgowo-rdzeniowego może określić tylko sumę tych dwóch składników. Aby odróżnić białka przesiękowe od białek wytwarzanych dooponowo, pomiary białka płynu mózgowo-rdzeniowego przy użyciu dowolnego dostępnego narzędzia do analizy białek muszą być dostosowane do indywidualnej zmienności stężeń w surowicy, jak również integralności bariery. Jednakże, chociaż ta korekta jest powszechnie stosowana w praktyce klinicznej, np. indeks IgG płynu mózgowo-rdzeniowego, który ma wysoką czułość wykrywania dokanałowej syntezy IgG4,5,6, do tej pory bardzo niewiele badań naukowych skorygowało stężenia białka płynu mózgowo-rdzeniowego pod kątem stężenia w surowicy i integralności bariery7,8.

Obecnie, podejście Reibergram jest najlepszym sposobem na określenie funkcji bariery i syntezy wewnątrzoponowej białek. Jest to graficzna ocena na wykresach ilorazu płynu mózgowo-rdzeniowego/surowicy, która analizuje w zintegrowany sposób zarówno funkcję (dys)funkcji, jak i syntezę białek dooponowych, odnosząc się do białka pochodzącego wyłącznie z krwi9,10. Albumina białkowa o wysokiej obfitości jest zwykle wybierana jako białko referencyjne, ponieważ jest wytwarzana tylko w wątrobie, a jej rozmiar, około 70 kDa, jest pośredni między małymi i dużymi białkami11. Diagram analizy został po raz pierwszy zdefiniowany przez Reibera i Felgenhauera w 1987 roku dla głównych klas immunoglobulin (Igs)11, empirycznie opierając się na wynikach uzyskanych z analizy tysięcy próbek ludzkich9. Podejście to zostało następnie potwierdzone przez zastosowanie dwóch praw dyfuzji Ficka w teorii dyfuzji molekularnej/natężenia przepływu12. Taka teoria pokazuje, że dyfuzja białka przez barierę ma rozkład hiperboliczny i może ilościowo wyjaśnić dynamikę białek w klasie CNS9,13. Ogólnie rzecz biorąc, zaletą stosowania Reibergramu do demonstracji dokanałowej syntezy białek jest to, że jednocześnie identyfikuje on frakcję białkową, która dostaje się do płynu mózgowo-rdzeniowego z surowicy, a także ilość białka znajdującego się w płynie mózgowo-rdzeniowym ze względu na lokalną produkcję.

Obecny artykuł i związany z nim protokół opisują całą procedurę, od pobrania płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi do końcowych obliczeń korygujących poziomy białka płynu mózgowo-rdzeniowego, dla ilościowego pomiaru wewnątrzoponowej syntezy białek w mysich modelach zaburzeń neurologicznych. Procedura ta stanowi punkt odniesienia, na podstawie którego można ocenić (1) patofizjologiczne pochodzenie dowolnego białka płynu mózgowo-rdzeniowego oraz (2) stabilność i funkcjonalne znaczenie integralności bariery. Ta procedura i protokół są przydatne nie tylko do oceny próbek płynu mózgowo-rdzeniowego u myszy, ale są również przydatne w analizie płynu mózgowo-rdzeniowego w wielu zwierzęcych modelach chorób neurologicznych i pacjentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace z udziałem zwierząt są prowadzone zgodnie z protokołami przeanalizowanymi i zatwierdzonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w Geisel School of Medicine at Dartmouth.

1. Pobieranie płynów

UWAGA: Wymagane są zarówno surowica, jak i płyn mózgowo-rdzeniowy. Dla każdego rodzaju pobieranego płynu konieczne są dwa protokoły: jeden dla zwierząt przeżywających, a drugi dla zwierząt poddawanych nekropsji.

  1. Pobieranie surowicy i płynu mózgowo-rdzeniowego z zastosowaniem procedur przeżywalności
    UWAGA: W przypadku pobierania płynów w ramach analizy przeżywalności, pobranie surowicy powinno poprzedzać pobranie płynu mózgowo-rdzeniowego (PMR), ponieważ jest to procedura mniej inwazyjna. PMR należy pobrać w ciągu jednego tygodnia od pobrania surowicy.
    1. Procedura pobieria krwi z zatoki dopokątniczej w celu pozyskania surowicy.
      UWAGA: Niniejsza procedura dotyczy pobierania krwi z myszy w celu przeżycia zwierzęcia.14Opisana procedura ma zastosowanie do myszy w każdym wieku, płci i szczepie. Ponieważ zasady IACUC stanowią, że podczas jednorazowego pobrania krwi można usunąć maksymalnie 1% masy ciała w objętości krwi, zaleca się przeprowadzanie tej procedury wyłącznie u myszy o masie powyżej 15 g.
      1. Przenieś klatki z myszami z regału do odpowiedniego obszaru roboczego. Przygotuj aparat do narkozy gazowej, ustawiając przepływomierz tlenu na 1 l/min.
      2. Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i szczelnie zamknij pokrywę. Ustaw parowar izofluranu na 3,5% i monitoruj zwierzę do momentu utraty przytomności.
      3. Wyjmij zwierzę z komory i oceń poziom znieczulenia za pomocą odruchu stopowego, t. j. poprzez mocne uciśnięcie poduszeczki stopy. Przed przystąpieniem do procedury upewnij się, że głębokość znieczulenia jest odpowiednia: brak reakcji na mocne uciśnięcie wskazuje na właściwe znieczulenie.
      4. Unieruchom znieczuloną mysz, chwytając luźną skórę za uszami kciukiem i palcem wskazującym niedominującej ręki. Wypchnij gałki oczne, odciągając palcem wskazującym skórę nad okiem, a kciukiem skórę pod oczami.
      5. Wprowadź końcówkę pipety Pasteura do oczodołu pod gałkę oczną (Rysunek 1, lewy panel), kierując końcówkę pod kątem około 45° w kierunku środka oczodołu (Rysunek 1, prawy panel). Podczas ruchu do przodu obracaj pipetę między palcami. Wywieraj delikatny nacisk, a następnie zwolnij, aż krew zacznie wpływać do pipety.
        UWAGA: Maksymalna ilość krwi, jaką można pobrać jednorazowo z tego miejsca, wynosi około 1% masy ciała, np. 0,2 mL od myszy o masie 20 g.
      6. Ostrożnie usuń kapilarę, aby uniknąć uszkodzenia oka, i przenieś pobraną krew do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Zamknij powiekę i lekko dociśnij ją gazikiem, aby zapobiec dalszemu krwawieniu. Gdy mysz odzyska pełną przytomność i sprawność ruchową (zazwyczaj po 3–5 min), umieść ją z powrotem w klatce.
      7. Pozostawić krew do skrzepnięcia na 30–60 min w temperaturze pokojowej (RT), a następnie odwirować przez 10 min przy 2 000 x g w 4 °C wirówka z chłodnicą. Stosując technikę czystej pipety, należy zebrać surowicę do nowej, opisanej probówki o objętości 0,5 ml. Probówkę z surowicą należy bezzwłocznie zamrozić w temperaturze -80 °C.
    2. Pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego w procedurze z przeżyciem zwierzęcia
      UWAGA: Niniejsza procedura dotyczy operacji przeżyciowej i opiera się na protokole opublikowanym przez Liu i Duffa w 2008 roku15Myszy znieczulono za pomocą koktajlu ketaminy (20 mg/ml), ksylazyny (0,5 mg/ml) i acepromazyny (0,5 mg/ml) podanego doglebowo.
      1. Przenieś klatki z myszami z regału do wyznaczonego obszaru roboczego przeznaczonego do zabiegów chirurgicznych. Przygotuj przestrzeń operacyjną w środowisku sterylnym. Upewnij się, że wszystkie instrumenty i materiały wykorzystywane podczas zabiegu zostały wysterylizowane.
      2. Zważ mysz i oblicz wymaganą objętość znieczulenia (0,1 ml koktajlu znieczulającego na mysz o masie 20 g). Wstrzyknij środek znieczulający drogą dostrzyczynową.16Po kilku minutach należy sprawdzić mysz, uciskając poduszkę stopy, aby upewnić się, że znieczulenie jest odpowiednie. Jeśli wymagana jest większa dawka środka znieczulającego, należy wstrzyknąć dodatkowo 0,01–0,03 ml koktajlu znieczulającego.
      3. Za pomocą nożyczek lub strzygarki należy ogolić niewielki obszar głowy, w części dystalnej (kaudalnej), w linii środkowej czaszki, aby odsłonić obszar roboczy wystarczająco duży do pobrania płynu mózgowo-rdzeniowego. Mysz należy umieścić w pozycji brzusznej na aparacie stereotaktycznym i unieruchomić głowę za pomocą prętów usznych (Rysunek 2A).
        UWAGA: Myszkę układa się w taki sposób, aby głowa tworzyła niemal 135° kąt względem ciała (Rysunek 2A). Po ustawieniu zwierzęcia należy użyć pola chirurgicznego, aby zachować sterylność w miejscu operacji. W przypadku pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego u myszy preferowane są przezroczyste pola samoprzylepne, ponieważ umożliwiają one bezpośrednią i bardziej precyzyjną wizualizację zwierzęcia.
      4. Przetrzyj pole operacyjne 30% roztworem diacetanu chlorheksydyny. Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj cięcie strzałkowe skóry poniżej potylicy, aby odsłonić mięśnie pokrywające cysternę wielką.
      5. Za pomocą rozdzielania tępym narzędziem przy użyciu pęsety oddzielić tkankę podskórną i mięśnie, aby odsłonić cysternę wielką (Rysunek 2B). Użyć mikroretraktorów do rozchylenia mięśni (Rycina 2B) i odsłonić oponę twardą warstwy oponowej nad cysterną wielką.
      6. Delikatnie przemyj sterylnym solą fizjologiczną buforowaną fosforanowo (PBS), aby usunąć ewentualne zanieczyszczenia krwią. Osusz oponę twardą sterylnym patyczkiem bawełnianym i delikatnie nakłuj igłą 30 G błonę pokrywającą cysternę wielką. Szybko i delikatnie wprowadź małą kapilarę szklaną, aby pobrać płyn mózgowo-rdzeniowy (Rycina 2C).
        UWAGA: Ciśnienie wewnątrzczaszkowe umożliwia spontaniczny przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego do kapilary (Rysunek 2C). W zależności od wieku i wielkości myszy, około 5−12 µL od każdego myszy pobiera się CSF.
      7. Ostrożnie wyjmij rurkę kapilarną z membrany. Połącz rurkę z strzykawką o pojemności 3 ml za pomocą rurki polietylenowej (Tabela materiałów) i wstrzyknąć zebraną ciecz mózgowo-rdzeniową do oznakowanej probówki o pojemności 0,5 ml (Rysunek 2D). Przechowywać fiolki w lodzie.
      8. Zamknąć nacięcie, stosując szew z polidioksanonu (PDS) z jednorazową igłą oraz wykonując szwy wewnątrzskórne.17Oczyścić obszar z zaschniętej krwi lub tkanek.
      9. Wykonać iniekcję u myszy, podskórnie lub dosytniewnie16podając 0,05–0,1 mg/kg chlorowodorku buprenorfiny jako leczenie przeciwbólowe. Ponadto wstrzyknąć podskórnie 1 ml jałowej soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu.
      10. Umieść mysz z powrotem w czystej i ciepłej klatce w celu rekonwalescencji. Gdy mysz odzyska sprawność ruchową i będzie w stanie dotrzeć do pożywienia oraz wody, umieść klatkę z powrotem na regale.
      11. Wirować CSF przez 10 min przy 1000 x g g w 4 °C wirówka chłodząca. Stopień zanieczyszczenia krwią należy ocenić poprzez inspekcję wizualną w celu zidentyfikowania ksantochromii oraz obecności czerwonego osadu na dnie probówki. Próbki zanieczyszczone krwią należy odrzucić.
        UWAGA: Wzór wykorzystywany do korekty ilości białka w płynie mózgowo-rdzeniowym (PMR) w próbkach zanieczyszczonych krwią opiera się na parametrach równania, które obejmują zawartość białka w PMR i surowicy, hematokryt (HCT) oraz liczbę erytrocytów (RBC) w PMR i krwi.18Jednakże taką strategię korekcji nie można łatwo zastosować do próbek płynu mózgowo-rdzeniowego myszy ze względu na ich niewielką objętość, co ogranicza strategię korekcji do inspekcji wizualnej.
      12. Stosując technikę czystego pipetowania, należy zebrać płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) do nowej probówki o pojemności 0,2 ml, pozostawiając osad z komórkami. Rozcieńczyć CSF w stosunku 1:3 w PBS, aby zminimalizować ubytek objętości wynikający z powstawania aerozolu. Natychmiast zamrozić probówkę z CSF w temperaturze -80 °C.
  2. Pobieranie surowicy i płynu mózgowo-rdzeniowego przy użyciu procedur nieprzeżywalnych
    UWAGA: W przypadku pobierania płynów bez przeżycia zwierzęcia, pobranie płynu mózgowo-rdzeniowego poprzedza pobranie surowicy, ponieważ mysz musi mieć tętno.
    1. Pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego podczas sekcji zwłok
      UWAGA: Niniejsza procedura dotyczy operacji w trybie nieprzeżywalnym, a około 10−20 µL z każdej myszy pobiera się płyn mózgowo-rdzeniowy. Zaleca się zachowanie jałowości pola operacyjnego, choć nie jest to wymagane w przypadku operacji nieprzeżywalnych.
      1. Przenieś klatki z myszami z regału do wygodnego miejsca pracy. W celu pobrania płynu mózgowo-rdzeniowego postępuj zgodnie z krokami 1.1.2.2–1.1.2.7 oraz 1.1.2.11–1.1.2.12. W celu pobrania surowicy przejdź do sekcji 1.2.2.
    2. Pobieranie krwi poprzez nakłucie wewnątrzsercowe (metoda otwarta)
      UWAGA: Przewidywana objętość krwi wynosi około 3% masy ciała, np. 0,6 ml od myszy o masie 20 g.
      1. Po pobraniu płynu mózgowo-rdzeniowego należy upewnić się, że mysz nadal znajduje się w dostatecznej znieczuleniu, uciskając poduszkę stopy. W przypadku wystąpienia jakiejkolwiek reakcji należy podać drugą dawkę środka znieczulającego. Jeśli nie zaobserwowano reakcji, można kontynuować procedurę.
      2. Ułóż zwierzę na plecach i przemyj skórę w okolicy brzucha 70% alkoholem. Za pomocą nożyczek chirurgicznych otwórz jamę klatki piersiowej i odsłoń serce. Wprowadź igłę 25 G (podłączoną do strzykawki 3 ml) do lewej komory i delikatnie wywarzyj podciśnienie, przesuwając tłok strzykawki. Wyjmij igłę po pobraniu krwi.
      3. Należy przeprowadzić wtórną metodę eutanazji, taką jak gilotynowanie lub zwichnięcie stawów potylicznych, aby upewnić się, że zwierzę nie żyje.
      4. Naciśnij tłok strzykawki i wstrzyknij pobraną krew do fiolki o pojemności 1,5 ml. Pozostaw krew do skrzepnięcia na 30–60 min w temperaturze pokojowej, a następnie wiruj przez 10 min przy 2 000 x g. g w 4 °C wirówka chłodząca
      5. Stosując technikę czystego pipetowania, należy zebrać surowicę do nowej, oznakowanej probówki o pojemności 0,5 ml. Probówkę z surowicą należy natychmiast zamrozić w temperaturze -80 °C zamrażarka.

2. Analiza białek

  1. Należy zastosować preferowaną metodę, np. technologię Luminex, do ilościowego oznaczenia białek docelowych i albuminy w dopasowanych próbkach surowicy i płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF).
    UWAGA: W tym przypadku podano przykład z wykorzystaniem magnetycznej technologii Luminex, jednak w obecnym protokole można zastosować praktycznie każdą technikę mierzącą ilość białek, w tym testy immunoenzymatyczne (ELISA). Idealnie próbki CSF i surowicy powinny być analizowane pod kątem albuminy i białek docelowych na tej samej platformie. Warunki analizy muszą być zoptymalizowane dla kluczowych etapów protokołu, takich jak stężenie sprzęgania antygenu z kuleczkami, rozcieńczenia próbek surowicy i CSF, najlepiej dopasowane krzywe standardowe dla każdego anality oraz skład buforu w celu ograniczenia reaktywności niespecyficznej. W przypadku zastosowania komercyjnego zestawu do pomiaru białek, np. zestawu do izotypowania immunoglobulin (Tabela materiałów) użytego do uzyskania danych przedstawionych na Rysunku 3, należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Po rozmrożeniu i przed analizą należy odwirować próbki CSF i surowicy (2,000 x g przez 10 min) i użyć supernatantu, aby zapobiec zapychaniu płytek filtracyjnych i/lub sondy. Należy postępować zgodnie z procedurą analizy dostarczoną w zestawie w celu odpowiedniego rozcieńczenia próbek. W przeciwnym razie należy określić odpowiednie rozcieńczenie dla każdego anality i płynu. Próbki należy odpowiednio rozcieńczyć w PBS.
      UWAGA: W przypadku braku szczegółowych wytycznych lub instrukcji, rozcieńczenia dla każdego anality i płynu muszą zostać ustalone przed badaniem testowym poprzez wyznaczenie odpowiednich zakresów rozcieńczeń niezbędnych do uzyskania szacunków stężeń mieszczących się w najbardziej wiarygodnym zakresie krzywej standardowej. Znajomość charakterystyki analizowanej próbki biologicznej, np. fizjologicznych i patologicznych stężeń w płynie, pozwala na przetestowanie różnych rozcieńczeń próbek o niskiej, średniej i wysokiej zawartości anality. Jeśli przewidywany zakres stężeń w próbkach jest znany a priori, rozcieńczenia można dobrać po obliczeniu, ile razy próbka musi zostać rozcieńczona, aby zmieścić się w wybranym zakresie krzywej standardowej.
      OSTROŻNIE: Obliczając czynniki rozcieńczenia, należy pamiętać, że CSF zostało już rozcieńczone 1:3.
    2. Należy przygotować krzywą standardową dla każdego białka zainteresowania, np. albuminy i IgG, jak w przypadku generowania danych na Rysunku 3, poprzez szeregowe rozcieńczanie białek standardów referencyjnych. Podczas przygotowywania krzywych standardowych należy dokładnie wymieszać każdą wyższą koncentrację przed wykonaniem kolejnego rozcieńczenia.
      UWAGA: Niezależnie od wybranej metody ilościowej, przy każdym wykonaniu analizy niezbędne jest uwzględnienie krzywej standardowej w celu oszacowania stężenia białek w próbkach. Najlepszym wyborem standardu referencyjnego jest oczyszczone białko zainteresowania o znanej koncentracji. Decyzja o konkretnych rozcieńczeniach, a także o liczbie punktów danych i powtórzeniach użytych do zdefiniowania krzywej standardowej, zależy od stopnia nieliniowości krzywej standardowej.
    3. Należy wybrać odpowiednie zestawy magnetycznych kuleczek sprzęganych z przeciwciałami (Tabela materiałów). W przypadku pojedynczych fiolek z kuleczkami, każdą fiolkę należy poddać sonikacji przez 30 s i wymieszać w wortexie przez 1 min. Należy przygotować „roboczą mieszankę kuleczek” poprzez rozcieńczenie zapasów kuleczek do końcowego stężenia 50 kuleczek każdego zestawu/µL w buforze do analizy/płukania (PBS, 1% albuminy surowicy bydlęcej [BSA]). Do każdej studzienki płytki 96-dołkowej z płaskim dnem (Tabela materiałów) należy dodać 50 µL zmieszanych kuleczek.
      OSTROŻNIE: Kuleczki fluorescencyjne są światłoczułe. Dlatego powinny być chronione przed przedłużoną ekspozycją na światło przez cały czas trwania procedury.
    4. Należy zaplanować rozmieszczenie tła, standardów i próbek na arkuszu mapy studzienek.
    5. Do każdej studzienki tła należy dodać 50 µL buforu do analizy/płukania, a do studzienek krzywej standardowej po 50 µL każdego standardu. Na koniec do odpowiednich studzienek należy nalać po 50 μL każdej rozcieńczonej próbki. Płytkę należy owinąć folią i inkubować z wytrząsaniem (~800 rpm) na wstrząsarce do płytek przez 30 min w temperaturze pokojowej (RT).
    6. Płytkę należy umieścić na magnesie ręcznym (Tabela materiałów) i pozostawić na nim przez ~60 s, aby umożliwić całkowite osadzenie kuleczek magnetycznych. Zawartość studzienek należy usunąć, delikatnie zlewając zawartość z płytki, a następnie stukając płytką o chłonne podkładki, aby usunąć pozostałą ciecz.
    7. Płytkę należy przemyć, zdejmując ją z magnesu, dodając 200 µL buforu do analizy/płukania, wytrząsając przez ~30 s i ponownie przymocowując do magnesu. Płukanie należy powtórzyć 3 razy.
    8. Biotynilowane przeciwciało detekcyjne, tj. przeciwciało znakowane biotyną skierowane przeciwko gatunkowi gospodarza białka, należy rozcieńczyć do 4 μg/mL w buforze do analizy/płukania. Do każdej studzienki należy dodać 50 µL rozcieńczonego przeciwciała detekcyjnego. Płytkę należy przykryć i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej (RT) na wstrząsarce do płytek przy ~800 rpm. Płytkę należy umieścić na magnesie i powtórzyć kroki 2.1.6 i 2.1.7.
    9. Streptawidynę sprzężoną z fykoerytryną (PE) (SAPE) należy rozcieńczyć do 4 μg/mL w buforze do analizy/płukania. Do każdej studzienki należy dodać 50 µL rozcieńczonego SAPE. Płytkę należy przykryć i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej (RT) na wstrząsarce do płytek przy ~800 rpm. Płytkę należy umieścić na magnesie i powtórzyć kroki 2.1.6 i 2.1.7.
    10. Płytkę należy zdjąć z magnesu i resuspendować kuleczki w 100 μL buforu do analizy/płukania. Studzienki należy odczytać za pomocą dwulaserowego instrumentu detekcyjnego opartego na przepływie, który umożliwia pomiar natężenia fluorescencji PE (FI).
      UWAGA: Generowany sygnał, np. FI, jest proporcjonalny do ilości antygenu docelowego przyczepionego do powierzchni kuleczek.
    11. Należy wyeksportować surowe dane i stworzyć krzywe standardowe, wykreślając sygnał detekcji FI w funkcji stężeń białek standardowych. Należy wykorzystać krzywe standardowe do obliczenia stężenia analitów w próbkach.
      UWAGA: Albuminę wyraża się preferencyjnie w g/dL, natomiast białka zainteresowania preferencyjnie w mg/dL.

3. Obliczanie indeksów dokanałowych

  1. Wprowadź wartości stężeń białek do arkusza kalkulacyjnego i przeanalizuj wyniki, stosując poniższe wzory.
  2. Oblicz Qalbumin:
    Schemat wzoru na iloraz albumin Q_albumin = (CSF_albumin / Serum_albumin), stosowany w analizie białek.
    gdzie CSFalbumin i Serumalbumin to odpowiednio stężenia albuminy w dopasowanych próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego i surowicy.
  3. Oblicz Qprotein:
    Równanie stosunku białek Q_protein dla analizy płynu mózgowo-rdzeniowego i surowicy, reprezentacja wzoru.
    gdzie CSFprotein i Serumprotein to odpowiednio stężenia docelowych białek w dopasowanych próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego i surowicy.
  4. Oblicz indeks białkowy:
    Wzór na indeks białkowy Q_protein/Q_albumin na schemacie równania stanu równowagi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem tego reprezentatywnego eksperymentu było porównanie wewnątrzoponowej syntezy IgG w dwóch klinicznie istotnych modelach stwardnienia rozsianego (MS) u gryzoni: rzutowo-remisyjnym eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia (R-EAE) indukowanym PLP139-151 oraz przewlekłej postaci postępującej choroby demielinizacyjnej indukowanej wirusem zapalenia mózgu i rdzenia myszy Theilera (TMEV-IDD). R-EAE jest użytecznym modelem do zrozumienia rzutowo-remisyjnego przebiegu MS, podczas gdy model TME...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ilościowe metody oceny zwiększonych stężeń białka płynu mózgowo-rdzeniowego są użytecznymi narzędziami w charakterystyce fizjologicznego i patologicznego stanu OUN. Jednak poza wiarygodną kwantyfikacją poziomów białka płynu mózgowo-rdzeniowego, wykrywanie białek płynu mózgowo-rdzeniowego wymaga wyrażenia wyników, które rozróżniają frakcje pochodzące z krwi i OUN w płynie mózgowo-rdzeniowym. Jednak do tej pory powszechnie stosowane testy kwantyfikacji białek nie pozwalają na rozróżnienie między tymi dwoma składnikami biał...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują personelowi Centrum Medycyny Porównawczej i Badań (CCMR) w Dartmouth za fachową opiekę nad myszami wykorzystywanymi do tych badań. Fundusz Badawczy Bornstein sfinansował te badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka insulinowa 1 mlBD329650
Strzykawka 1 mlBD329622
igła 25 GBD305122
Strzykawka 3 mlBD309582
Igła insulinowa 30 GBD305106
Wkładki chłonneDowolna odpowiednia marka
AcepromazynaPatterson Vet Supply Inc
BioPlex Ręczna myjka magnetycznaBioRad171020100
Magnet BioPlex MAGPIX Multiplex Czytnik multipleksówBioRad171015001
BioPlex Pro Płaskie dnoBioRad171025001
Biotynilowane przeciwciało detekcyjneKażde odpowiednie źródłoPrzeciwciało musi być skierowane przeciwko gatunkom białko będące przedmiotem zainteresowania.
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA4503
Chlorowodorek buprenorfinyPAR PharmaceuticalNDC 42023-179-05
Rurki kapilarneSutter InstrumentB100-75-10OD: 1,0 mm, ID: 0,75 mm Szkło borokrzemianowe 10 cm; narysowane na Bunsena, aby zmniejszyć ID.
Probówka wirówkowa, 0,2 mlVWR20170-012
Probówka wirówkowa, 0,5 mlVWR87003-290
Probówka wirówkowa, 1,5 mlVWR87003-294
Dioctan chlorheksydynyNolvasanE004272
Jednorazowe końcówki do pipetDowolna odpowiednia marka
Listwy słuchoweKOPF Instruments1921 lub 1922
EtanolKopterV1001
ZamrażarkaVWRVWR32086A
GauzeMedlineNON25212
Poduszka grzewczaSunbeamXL King Size SoftTouch, 4 ustawienia grzania z automatycznym wyłączaniem, turkusowa, komora indukcyjna 12 cali x 24 cale
VETEQUIP
IsofluranePatterson Vet Supply IncNDC 14043-704-06
Ketamina (KetaVed)Patterson Vet Supply Inc
MagPlex Mikrosfery (sprzężone z przeciwciałami)BioRadKulka magnetyczna sprzężona z przeciwciałami
Wytrząsarka do mikropłytekSouthwest ScientificSBT1500
Jakość wypełnieniaACD-010Blunt - 1 mm
Microsoft Office (Excel)Microsoft
MilliPlex MAP Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead PanelEMD MilliporeMGAMMAG-300KKomercyjny zestaw do ilościowego oznaczania za pomocą Luminex panelu izotypów i podklas immunoglobulin w płynach myszy.
Zestaw ELISA do wychwytywania albuminy myszyNovus BiologicalNBP2-60484Komercyjny zestaw do ilościowego oznaczania albuminy w płynach mysich za pomocą testu ELISA.
Pipeta wielokanałowaEppendorf3125000060
Waciki niesterylneMediChoiceWOD1002Muszą być autoklawowane w celu uzyskania sterylności
TlenAIRGAS OX USPEA
Pasteur PippettesFisher13-678-20A5 & 3/4"
PDS z jednorazową igłą, 6-0 ProlenPatterson Vet8695GP-3 Cięcie wsteczne,
BD Biosciences554061
PipeteryEppendorfResearch Rurki
Wirówka z chłodzeniemBeckman CoulterALLEGRA X-12R
SkalaUlineH2716
Skalpel PióroEF7281
GolarkaAparat Harvard52-5204
Standardowe białkaKażde odpowiednie źródłoNajlepszym wyborem dla wzorca referencyjnego jest oczyszczone, znane stężenie białka będącego przedmiotem zainteresowania.
Instrument stereotaktycznyInstrumenty KOPFModel 900LSStandardowe akcesoria
Sterylne 1 x PBSCorning Cellgro21-040-CV
Sterylna sól fizjologicznaBaxter0338-0048-020,9% Irygacja chlorkiem sodu Kleszcze
chirurgiczne USP zakrzywione, 7 (2)Narzędzia do nauki o nauce11271-30
Nożyczki chirurgiczneNarzędzia do nauki14094-11Nierdzewny 25x
parownik + przepływomierzModuflex Anhestesia Instruments
VortexFisher02-215-414
Podkładka rozgrzewającaKent Scientific CorporationRT-JR-20
Sonikator wodyCole ParmerEW-08895-01
XylazinePatterson Vet Supply Inc
18-PE-Streptawidyna polietylenowe Dumont

Bibliografia

  1. Whedon, J. M., Glassey, D. Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance. Alternative Therapies in Health and Medicine. 15 (3), 54-60 (2009).
  2. Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
  3. Barro, C., et al. Fluid biomarker and electrophysiological outcome measures for progressive MS trials. Multiple Sclerosis. 23 (12), 1600-1613 (2017).
  4. Tourtellotte, W. W., et al. Multiple sclerosis: measurement and validation of central nervous system IgG synthesis rate. Neurology. 30 (3), 240-244 (1980).
  5. Bonnan, M. Intrathecal IgG synthesis: a resistant and valuable target for future multiple sclerosis treatments. Multiple Sclerosis International. 2015, 296184(2015).
  6. Reiber, H. Cerebrospinal fluid--physiology, analysis and interpretation of protein patterns for diagnosis of neurological diseases. Multiple Sclerosis. 4 (3), 99-107 (1998).
  7. DiSano, K. D., Linzey, M. R., Royce, D. B., Pachner, A. R., Gilli, F. Differential neuro-immune patterns in two clinically relevant murine models of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 109(2019).
  8. Pachner, A. R., Li, L., Lagunoff, D. Plasma cells in the central nervous system in the Theiler's virus model of multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 232 (1-2), 35-40 (2011).
  9. Reiber, H. Flow rate of cerebrospinal fluid (CSF)--a concept common to normal blood-CSF barrier function and to dysfunction in neurological diseases. Journal of Neurological Sciences. 122 (2), 189-203 (1994).
  10. Reiber, H., Zeman, D., Kusnierova, P., Mundwiler, E., Bernasconi, L. Diagnostic relevance of free light chains in cerebrospinal fluid - The hyperbolic reference range for reliable data interpretation in quotient diagrams. Clinica Chimica Acta. 497, 153-162 (2019).
  11. Reiber, H., Felgenhauer, K. Protein transfer at the blood cerebrospinal fluid barrier and the quantitation of the humoral immune response within the central nervous system. Clinica Chimica Acta. 163 (3), 319-328 (1987).
  12. Dorta-Contreras, A. J. Reibergrams: essential element in cerebrospinal fluid immunological analysis. Revista de Neurologia. 28 (10), 996-998 (1999).
  13. Metzger, F., Mischek, D., Stoffers, F. The Connected Steady State Model and the Interdependence of the CSF Proteome and CSF Flow Characteristics. Frontiers Neuroscience. 11, 241(2017).
  14. Wolforth, J. Methods of blood collection in the mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  15. Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. Journal of Visualized Experiments. (21), e960(2008).
  16. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771(2012).
  17. Johnston, S. A., Tobias, K. M. Veterinary Surgery: Small Animal Expert Consult - E-Book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
  18. Nigrovic, L. E., Shah, S. S., Neuman, M. I. Correction of cerebrospinal fluid protein for the presence of red blood cells in children with a traumatic lumbar puncture. Journal of Pediatrics. 159 (1), 158-159 (2011).
  19. McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler's virus-induced demyelinating disease. Methods in Molecular Biology. 900, 381-401 (2012).
  20. Link, H., Tibbling, G. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. II. Relation of the concentration of the proteins in serum and cerebrospinal fluid. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 391-396 (1977).
  21. Tibbling, G., Link, H., Ohman, S. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. I. Establishment of reference values. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 385-390 (1977).
  22. Deisenhammer, F., et al. Guidelines on routine cerebrospinal fluid analysis. Report from an EFNS task force. European Journal of Neurology. 13 (9), 913-922 (2006).
  23. Johanson, C. E., Stopa, E. G., McMillan, P. N. The blood-cerebrospinal fluid barrier: structure and functional significance. Methods in Molecular Biology. 686, 101-131 (2011).
  24. Zaias, J., Mineau, M., Cray, C., Yoon, D., Altman, N. H. Reference values for serum proteins of common laboratory rodent strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (4), 387-390 (2009).
  25. Felgenhauer, K., Renner, E. Hydrodynamic radii versus molecular weights in clearance studies of urine and cerebrospinal fluid. Annals of Clinical Biochemistry. 14 (2), 100-104 (1977).
  26. Pachner, A. R., DiSano, K., Royce, D. B., Gilli, F. Clinical utility of a molecular signature in inflammatory demyelinating disease. Neurology, Neuroimmunology & Neuroinflammation. 6 (1), 520(2019).
  27. Pachner, A. R., Li, L., Gilli, F. Chemokine biomarkers in central nervous system tissue and cerebrospinal fluid in the Theiler's virus model mirror those in multiple sclerosis. Cytokine. 76 (2), 577-580 (2015).
  28. Gerbi, C. Protein concentration in the arterial and venous renal blood serum of the rabbit. Archives of Biochemistry and Biophysics. 31 (1), 49-61 (1951).
  29. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  30. Reiber, H. Proteins in cerebrospinal fluid and blood: barriers, CSF flow rate and source-related dynamics. Restorative Neurology and Neuroscience. 21 (3-4), 79-96 (2003).
  31. Reiber, H. Knowledge-base for interpretation of cerebrospinal fluid data patterns. Essentials in neurology and psychiatry. Arquivos de Neuropsiquiatria. 74 (6), 501-512 (2016).
  32. Kuehne, L. K., Reiber, H., Bechter, K., Hagberg, L., Fuchs, D. Cerebrospinal fluid neopterin is brain-derived and not associated with blood-CSF barrier dysfunction in non-inflammatory affective and schizophrenic spectrum disorders. Journal of Psychiatric Research. 47 (10), 1417-1422 (2013).
  33. Bromader, S., et al. Changes in serum and cerebrospinal fluif cytokines in response to non-neurological surgery: an observational study. Journal of Neuroinflammation. 9, 242(2012).
  34. Starhof, C., et al. Cerebrospinal fluid pro-inflammatory cytokines differentiate parkinsonian syndromes. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 305(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Wewnątrzoponowa synteza białekanaliza białek w płynie mózgowo-rdzeniowymbariera krew-mózgiloraz albuminy w płynie mózgowo-rdzeniowym i surowicyobliczanie indeksu białkowegopobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego u myszyupust krwi z splotu zatwarzkowegonakłucie serca w celu pobrania surowicywirowanie w celu oddzielenia surowicypomiar intensywności fluorescencji
Ilościowy pomiar białek syntetyzowanych dooponowo u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.