Artykuł metodologiczny

Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej

DOI:

10.3791/60548

⸱

9 lutego 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Bioengineering, University of Illinois at Chicago, 3MD Program, University of Illinois College of Medicine Rockford

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Upośledzony transport i morfologia mitochondriów są zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne. Prezentowany protokół wykorzystuje indukowane pluripotencjalne neurony przodomózgowia pochodzące z komórek macierzystych do oceny transportu mitochondrialnego i morfologii w dziedzicznej paraplegii spastycznej. Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie transportu mitochondrialnego wzdłuż aksonów i analizę ich morfologii, co ułatwi badanie chorób neurodegeneracyjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurony mają duże zapotrzebowanie na energię, aby wspierać swoje funkcje. W ludzkich neuronach zaobserwowano upośledzony transport mitochondrialny wzdłuż aksonów, co może przyczyniać się do neurodegeneracji w różnych stanach chorobowych. Chociaż badanie dynamiki mitochondriów w żywych ludzkich nerwach jest trudne, takie paradygmaty mają kluczowe znaczenie dla badania roli mitochondriów w neurodegeneracji. Opisano tutaj protokół analizy transportu mitochondrialnego i morfologii mitochondriów w aksonach neuronów przodomózgowia pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). IPSC są różnicowane w neurony glutaminergiczne kresomózgowia przy użyciu dobrze znanych metod. Mitochondria neuronów są barwione za pomocą MitoTracker CMXRos, a ruchy mitochondriów w obrębie aksonów są rejestrowane za pomocą mikroskopu do obrazowania żywych komórek wyposażonego w inkubator do hodowli komórek. Obrazy poklatkowe są analizowane za pomocą oprogramowania z wtyczkami "MultiKymograph", "Bioformat importer" i "Macros". Generowane są kimografy transportu mitochondrialnego, a z kimografu odczytywana jest średnia prędkość mitochondrialna w kierunku następczym i wstecznym. Jeśli chodzi o analizę morfologii mitochondriów, długość, obszar i proporcje mitochondriów uzyskuje się za pomocą ImageJ. Podsumowując, protokół ten pozwala na scharakteryzowanie transportu mitochondriów wzdłuż aksonów i analizę ich morfologii w celu ułatwienia badań nad chorobami neurodegeneracyjnymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ruchliwość i dystrybucja mitochondriów odgrywają istotną rolę w zaspokajaniu zmiennych i wyspecjalizowanych potrzeb energetycznych w spolaryzowanych neuronach. Neurony mogą rozciągać bardzo długie aksony, aby łączyć się z celami poprzez tworzenie synaps, które wymagają wysokiego poziomu energii dla buforowania Ca2+ i prądów jonowych. Transport mitochondriów z somy do aksonu ma kluczowe znaczenie dla wspierania funkcji aksonalnych i synaptycznych neuronów. Przestrzennie i czasowo dynamiczny ruch mitochondriów odbywa się za pomocą szybkiego transportu aksonalnego z prędkością kilku mikrometrów na sekundę1.

W szczególności, białka motoryczne lub adaptorowe, takie jak kinezyna i dyneina, uczestniczą w szybkim transporcie organelli wzdłuż mikrotubul, aby kontrolować ruch mitochondriów2,3. Normalna aktywność neuronalna wymaga prawidłowego transportu nowo powstałych mitochondriów z somy neuronalnej do dystalnego aksonu (następczy transport aksonalny) oraz odwrotnego transportu mitochondriów z dystalnego aksonu z powrotem do ciała komórki (transport wsteczny). Ostatnie badania wykazały, że niewłaściwa alokacja mitochondriów jest silnie związana z defektami neuronów i chorobami zwyrodnieniowymi neuronów ruchowych4,5. Dlatego, aby przeanalizować rolę mitochondriów w neurodegeneracji, ważne jest ustalenie metod badania ruchu mitochondriów wzdłuż aksonów w żywych kulturach.

Istnieją dwa główne wyzwania związane z badaniem i analizą śledzenia mitochondriów: (1) identyfikowanie mitochondriów z tła w każdej klatce, oraz (2) analizowanie i generowanie połączeń między każdą klatką. Rozwiązując pierwsze wyzwanie, szeroko stosuje się podejście do znakowania fluorescencyjnego w celu odróżnienia mitochondriów od tła, takie jak barwnik MitoTracker lub transfekcja mitochondrialnego białka ukierunkowanego na fluorescencje (np. mito-GFP)6,7,8. Aby przeanalizować związek między ramkami, w poprzednich badaniach opisano kilka algorytmów i narzędzi programowych9. W niedawnym artykule naukowcy porównali cztery różne zautomatyzowane narzędzia (np. Volocity, Imaris, wrMTrck i Difference Tracker) w celu ilościowego określenia transportu mitochondrialnego. Wyniki pokazały, że pomimo rozbieżności w długości ścieżki, przemieszczeniu mitochondriów, czasie trwania ruchu i prędkości, te zautomatyzowane narzędzia są odpowiednie do oceny różnic w transporcie po leczeniu10. Oprócz tych narzędzi, zintegrowana wtyczka "Macros" dla ImageJ (napisana przez Rietdorfa i Seitza) jest szeroko stosowana do analizy transportu mitochondrialnego11. Ta metoda generuje kimografy, które można wykorzystać do analizy ruchu mitochondriów, w tym prędkości zarówno w kierunku następczym, jak i wstecznym.

Mitochondria to wysoce dynamiczne organelle, które nieustannie zmieniają liczbę i morfologię w odpowiedzi na warunki fizjologiczne i patologiczne. Rozszczepienie i fuzja mitochondriów ściśle regulują morfologię i homeostazę mitochondriów. Brak równowagi między rozszczepieniem mitochondriów a fuzją może indukować bardzo krótkie lub długie sieci mitochondrialne, co może upośledzać funkcję mitochondriów i powodować nieprawidłową aktywność neuronów i neurodegenerację. Upośledzony transport i morfologia mitochondriów są zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, choroba Huntingtona i dziedziczna paraplegia spastyczna (HSP)12,13,14,15. HSP to niejednorodna grupa dziedzicznych zaburzeń neurologicznych charakteryzujących się zwyrodnieniem drogi korowo-rdzeniowej i wynikającym z tego brakiem kontroli mięśni kończyn dolnych16,17. W tym badaniu neurony przodomózgowia pochodzące z iPSC są wykorzystywane do oceny transportu mitochondrialnego i morfologii w HSP. Metoda ta zapewnia unikalny paradygmat do badania dynamiki mitochondriów aksonów neuronalnych w żywych kulturach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie neuronów glutaminergicznym kresomózgowia z iPSC

UWAGA: Szczegółowy protokół utrzymywania iPSC i ich różnicowania w neurony glutaminergiczne kresomózgowia są podobne do tych opisanych wcześniej18. W tym miejscu przedstawiono i podkreślono krytyczny proces podczas różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

  1. Hodowla iPSC na karmnikach z mysich fibroblastów zarodkowych (MEF) w pożywce z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) uzupełnionej czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF, 4 ng/ml).
  2. Po inkubacji z dypazą (1 mg/ml) przez 3 minuty należy rozdzielić iPSC na małe grudki. Następnie hoduje iPSC agregowane w zawiesinie w pożywce hESC przez 4 dni. Odnieś się do tego punktu czasowego, w którym iPSC zaczynają się jako posiew zawiesiny, jako dzień 1 (D1). Zmieniaj podłoże codziennie przez 4 dni.
  3. W D5 zebrać agregaty iPSC po odwirowaniu przy 200 x g przez 2 minuty i hodowli w pożywce do indukcji neuronalnej (NIM) przez 3 dni. Hoduj komórkę agregowaną w zawiesinie przez 3 dni, zmieniając połowę pożywki co 2 dni. Dodaj DMH-1 (2 μM) i SB431542 (2 μM) do pożywki NIM, aby zwiększyć wydajność indukcji neuronalnej.
  4. W D8 zebrać agregaty iPSC po odwirowaniu przy 200 x g przez 2 minuty i pozwolić im przylegać do 6 dołków (około 20–30 agregatów na dołek płytki) poprzez hodowlę w NIM z 10% FBS (lub z płytkami pokrytymi lamininą) przez noc. Następnego dnia wyjmij starą pożywkę i zmieniaj ją na NIM co 2 dni, aż do D17.
    UWAGA: W tym okresie obserwuje się wytwarzanie komórek neuronabłonkowych, na co wskazuje tworzenie się komórek walcowatych o strukturach rozetowych.
  5. W D17 mechanicznie wyizoluj komórki neuronabłonkowe w środku kolonii (podnosząc bezpośrednio przez przyłożenie niewielkiego nacisku do środka kolonii) lub enzymatycznie (potraktowane dypazą). Przenieść izolowane komórki nabłonka nerwowego do niepoddanej działaniu substancji kolby T25 do hodowli tkankowej bez traktowania, zawierającej 8 ml NIM z dodatkiem B27 (1x), cAMP (1 μM) i IGF (10 ng/ml).
    UWAGA: Hodowla zawiesiny umożliwia komórkom tworzenie neurosfer, które są wzbogacone o progenitory neuronalne z projekcją korową.
  6. Po D35 umieść neurosfery na pokrytej poliornityną i wolnej od LDEV matrycy błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu (tabela materiałów) 35-milimetrowych szklanych naczyniach dolnych, aby wygenerować neurony glutaminergiczne kresomózgowia (neurony projekcyjne kory). Przed posiewem należy rozdzielić neurosfery na małe skupiska poprzez inkubację z roztworem do odrywania komórek o stężeniu 1 mg/ml przez 2 minuty w temperaturze 37 °C.
  7. Usunąć roztwór do odrywania komórek przez odwirowanie i ponownie zawiesić w 1 ml pożywki różnicującej neurony (NDM). Umieść komórki na szklanym dnie naczynia (około pięciu skupisk na 100 μl podłoża na naczynie), aby umożliwić im przyczepienie się. Następnie dodaj NDM (1 ml na szalkę) i hoduj komórki w NDM zawierającym B27 (1x), cAMP (1 μM), IGF (10 ng / ml), hBDNF (10 ng / ml) i GDNF (10 ng / ml).
    UWAGA: Małe skupiska są platerowane, ponieważ dobrze przeżywają i dają początek długim neuronom projekcyjnym. Alternatywnie, komórki można zdysocjować i posiać z gęstością około 20 000 komórek na szalkę w celu lepszej separacji.
  8. Scharakteryzuj neurony glutaminergiczne kresomózgowia poprzez immunobarwienie markerów Tbr1 i βIII-tubuliny.

2. Badanie transportu mitochondrialnego wzdłuż aksonów neuronów glutaminergicznego kresomózgowia

  1. Rozgrzej NDM i włącz inkubator dla mikroskopu fluorescencyjnego ustawionego na 37 °C i 5% CO2 .
  2. Aby uwidocznić mitochondria wzdłuż aksonów neuronów przodomózgowia, inkubuj neurony z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym 50 nM, aby wybarwić mitochondria w żywych komórkach (np. MitoTracker CMXRos) w NDM przez 3 minuty w temperaturze 37 °C. Następnie umyj komórki 2x podgrzanym NDM. Neurony są inkubowane w NDM.
  3. Aby zarejestrować transport mitochondriów wzdłuż aksonów, należy wykonać zdjęcia poklatkowe ruchu mitochondriów za pomocą obiektywu 40x z mikroskopem fluorescencyjnym.
    UWAGA: Aby ustabilizować hodowlę, należy wykonać obrazowanie żywych komórek, gdy komórki są inkubowane w inkubatorze przez 20 minut po barwieniu mitochondriów.
  4. W polu fazowym zidentyfikuj aksony na podstawie cech morfologicznych (bezpośrednio wyłaniają się z ciała komórki neuronalnej, stałe cienkie długie neuryty bez rozgałęzień). Mitochondria poruszają się w kierunku następczym (od ciała komórki do dystalnego aksonu) i wstecznym (od końca aksonu do ciała komórki). Aby rozróżnić kierunek ruchu mitochondriów wzdłuż aksonów, wyraźnie zidentyfikuj ciała komórkowe neuronów. Na tym etapie skup aksony pod polem fazowym, aby zmniejszyć fotowybielanie.
  5. Po rozróżnieniu ciała komórki i aksonu dostosuj czas ekspozycji i skupienie mitochondriów w aksonach. Następnie przechwytuj transport mitochondriów w aksonach co 5 s przez łączny czas 5 minut, uzyskując 60 klatek. Losowo przejmij co najmniej pięć miejsc dla każdego dania i powtórz 3 razy dla każdej grupy.

3. Analiza danych dotyczących transportu i morfologii mitochondriów w neuronach korowych

UWAGA: Analizuj zebrane dane dotyczące transportu mitochondrialnego za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (np. ImageJ lub MetaMorph19). Ponieważ ImageJ jest łatwo dostępny, przeprowadź analizę transportu i morfologii mitochondriów za pomocą ImageJ z wtyczkami MultiKymograph, Macros i Analyze particles .

  1. Analiza transportu mitochondrialnego za pomocą ImageJ
    1. Po przechwyceniu poklatkowych obrazów ruchliwości mitochondriów przeanalizuj prędkość i ruch mitochondriów za pomocą wtyczki MultiKymograph. Obrazy są zapisywane jako pliki w formacie .tiff, które są analizowane przez oprogramowanie Fidżi zgodnie z wcześniej zgłoszoną metodą20.
    2. Pobierz oprogramowanie Fidżi. Pobierz wtyczki, które będą potrzebne do analizy prędkości ruchu mitochondriów z kimogramów. Pobierz pakiet Bio-formats i wtyczkę Kymograph wraz z tymi czterema wtyczkami .class, w tym: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class i WalkingAverage.class (Tabela materiałów). Przenieś te pliki do folderu wtyczek Fidżi. Pobierz wtyczki "tsp050706.txt" do folderu wtyczek. Uruchom ponownie oprogramowanie Fiji, gdy pliki zostaną przeniesione do folderu wtyczek.
    3. Otwórz oprogramowanie Fiji. Wybierz wtyczki, a następnie zaimportuj obrazy serii .tiff za pomocą Bio-Formats Importer w sekcji Bio-Formats. Upewnij się, że w widoku stosu wybrano opcję Standardowy ImageJ, wybierz pozycję Otwórz wszystkie serie, zaznacz opcję Autoskalowanie, a następnie kliknij przycisk OK. Zwróć uwagę na numer klatki i rozmiar obrazów w pikselach, które są wyświetlane w górnej części obrazu.
      UWAGA: Zrób 60 klatek na obraz.
    4. Zastanów się, czy obrazy są wyraźniejsze, dostosowując jasność/kontrast w menu Obraz dla wszystkich 60 klatek.
    5. Kliknij prawym przyciskiem myszy narzędzie linii, aby wybrać linię segmentową i narysować linię segmentowaną, zaczynając od treści komórki i kończąc na aksonie końcowym. Wygeneruj kimograf, wybierając MultipleKymograph w obszarze Wtyczki. Wybór szerokości linii jest wyświetlany po wybraniu MultipleKymograph. Upewnij się, że jest to liczba nieparzysta. Wybierz 1 dla szerokości linii. Po wykonaniu tego kroku generowany jest kimograf.
      UWAGA: Z kimografu można odczytać kilka ważnych informacji. Oś y kimografu to czas trwania (5 minut) dla 60 klatek. Oś x reprezentuje położenie wybranych aksonów.
    6. Użyj ukośnej linii w kimografie, aby określić kierunek ruchu mitochondriów (następczy, wsteczny lub stabilny). Na przykład linia biegnąca w dół w prawo wzdłuż osi y wskazuje na ruch następczy, a linia biegnąca w dół w lewo wzdłuż osi y wskazuje na ruch wsteczny. Pionowa linia wskazuje, że w mitochondrium nie było ruchu.
    7. Zmierz odległość, wartości czasu i prędkość poruszających się mitochondriów za pomocą wtyczki Makra w oprogramowaniu Fidżi. Przejdź do Wtyczki | Makra | Instalacja | tsp050607.txt. Narysuj odcinkową linię nad śladem ruchu mitochondriów na kimografie i zawsze rysuj linię od górnego do dolnego obszaru (oś y).
    8. Po narysowaniu linii przejdź do zakładki Wtyczki | Makra | Odczyt prędkości z TSP. Ponieważ wzdłuż ścieżki rysowana jest linia podzielona na segmenty, wtyczka odczytuje prędkości segmentowe odpowiadające linii.
      UWAGA: Jednostką wszystkich danych są piksele. Suma dy to czas zużyty od punktu początkowego, a suma dx wskazuje odległość mitochondrium poruszającego się w osi x. dy now i dx pokazują teraz odpowiednio okres, czas i odległość ruchu dla każdego segmentu. Rzeczywista prędkość pokazuje prędkość dla każdego segmentu (DX TERAZ/DY TERAZ). Średnia prędkość wskazuje średnią prędkość poruszania się mitochondriów (suma DX/suma DY).
    9. Zmień teraz jednostkę dx z piksela na μm jako stosunek pikseli w μm, mierząc pasek skali. Przelicz jednostkę odległości od piksela na μm, mierząc podziałkę liniową na obrazach. Użyj narzędzia linii, aby narysować linię wzdłuż podziałki liniowej i zmierz długość linii, wybierając opcję Zmierz w sekcji "Analizuj. Zmień czas z piksela na sekundy, ponieważ w tym eksperymencie 1 piksel = 5 sekund.
    10. W pliku arkusza kalkulacyjnego oblicz średnią prędkość i odpowiednio oznacz ruch wsteczny lub następczy. Uśrednij prędkość ruchu w kierunku następczym lub wstecznym.
    11. Określ procent stacjonarnych i ruchliwych mitochondriów na podstawie kimografu. Poruszające się mitochondria w kierunku następczym lub wstecznym definiuje się jako poruszające się o 5 μm do przodu lub do tyłu od początku przez cały okres21. Mitochondria uważa się za nieruchome, jeśli nie poruszyły się o więcej niż 5 μm w ciągu 5 minut.
  2. Analiza morfologii mitochondriów za pomocą ImageJ
    UWAGA: Określ morfologię mitochondriów, mierząc długość, powierzchnię i proporcje mitochondriów za pomocą ImageJ. Aby to zrobić, wykonaj poniższe czynności.
    1. Aby przeanalizować długość i obszar mitochondriów w aksonach, pobierz wtyczkę Straighten_.jar ze strony ImageJ (patrz Spis materiałów) i przenieś ją do folderu wtyczek. Uruchom ponownie oprogramowanie ImageJ.
    2. Otwórz obraz za pomocą funkcji otwierania w obszarze Plik i przekonwertuj obraz 32-bitowy na 8-bitowy za pomocą opcji Typ w obszarze Obraz.
    3. Narysuj linię podzieloną na segmenty wzdłuż aksonów. Wybierz opcję Prostowanie w obszarze Wtyczki i ustaw 50 pikseli dla szerokości filamentu/szerokiej linii. Spowoduje to wygenerowanie wyprostowanego aksonu.
    4. Dostosuj próg w obszarze Obraz i ustaw pomiar w obszarze Analizuj, wybierając "Obszar | Obwód | Dopasuj elipsę | Deskryptory kształtów.
    5. Zmierz podziałkę liniową za pomocą funkcji linii i ustaw skalę w obszarze Analizuj, wypełniając odległość w pikselach, znaną odległość i jednostkę długości. Następnie wybierz pozycję Globalne, aby ustawić to ustawienie skali.
    6. Użyj opcji Analizuj cząstki w obszarze Analizuj, aby określić obszar. Parametry monitu to rozmiar (piksel^2) = 0,20–nieskończoność, okrągłość = 0,00–1,00 i show = elipsy. Wybierz pozycję Wyświetl wyniki.
      UWAGA: Pomiar przyniesie wyniki wielu parametrów morfologii mitochondriów, w tym powierzchni, obwodów, długości (główna), szerokości (mniejsza) i współczynnika proporcji (AR). Podawana jest również odpowiednia liczba mitochondrialna.
    7. Oblicz liczbę mitochondriów na akson (μm), używając liczby mitochondrialnej podzielonej przez długość aksonów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj ludzkie iPSC zostały zróżnicowane na neurony glutaminergiczne kretomózgowiowe, które charakteryzowały się immunologicznym barwieniem markerami tubuliny Tbr1 i βIII (Rysunek 1A). Aby zbadać transport aksonalny mitochondriów, komórki te wybarwiono czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym i wykonano obrazowanie poklatkowe. Ponieważ ImageJ jest łatwo dostępny i łatwiejszy do uzyskania, transport mitochondrialny był dalej analizowany za pomocą wtyczek ImageJ "MultiKymograph" i "Macros",...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule opisano metodę analizy transportu i morfologii mitochondriów w aksonach neuronalnych przy użyciu czerwonego barwnika fluorescencyjnego i oprogramowania ImageJ, które stanowią unikalną platformę do badania zwyrodnienia aksonów i morfologii mitochondriów w chorobie neurodegeneracyjnej. W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków, w tym barwienie mitochondriów, obrazowanie żywych komórek i analiza obrazów. W tej metodzie użyto barwnika fluorescencyjnego do barwienia mitochondriów. Ponieważ ludzkie neurony p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Fundację Paraplegii Spastycznej, Fundację Blazer i NIH (R21NS109837).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rozwiązanie Accutase Cell Detachment Innowacyjnetechnologie komórkoweAT104
Kaptur bezpieczeństwa biologicznegoThermo Scientific1300 SERIES A2
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA-7906
Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF)Wirówka Peprotech450-02
Thermo ScientificSorvall Legend X1R/
Szkiełka nakrywkoweChemiglass Nauki przyrodnicze1760-012
Cykliczny AMP (cAMP)Sigma-AldrichD0627
DyspazaGibco17105-041
DorsomorphinSelleckchemS7146
Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco z mieszanką składników odżywczych F12 (DMEM/F12)Corning10-092-CV
FBSGibco16141-002
Czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2, bFGF)Peprotech100-18B
Geltrex LDEV-Free Obniżony czynnik wzrostu Macierz błony podstawnejGibcoA1413201
Gem21 NeuroPlex Suplement bez serumGemini400-160
Naczynia ze szklanym dnemMatTekP35G-0.170-14-C
Szklane pipety 9''VWR14673-043
Neurotroficzny czynnik glejowy (BDNF)Sigma-AldrichD0627
GlutaMAX-IGibco35050-061
HeparynaSigmaH3149
Insulinowy czynnik wzrostu 1 (IGF1)InvitrogenM7512
Zamienniksurowicy nokautującejGibcoA31815
LamininSigmaL-6274
2-MerkaptoetanolSigmaM3148-100ML
MitoTracker CMXRosInvitrogenM7512
Podłoże neuropodstawoweGibco21103-049
Aminokwasy endogenneGibco11140-050
N2 NeuroPle Bez serum SuplementGemini400-163
Mikroskop Olympus IX83OlympusIX83-ZDC2
PBSCorning21-031-CV
Mikroskop z kontrastem fazowymOlympusCKX41/ IX2-SLP
6-dołkoweCorning353046
24-dołkoweCorning353047
Bromowodorek poli-L-ornityny (poliornityna))Sigma-AldrichP3655
SB431542Stemgent04-0010
Sterylny jednorazowy system filtracji próżniowej 50 ml 0,22 i mu; m Millipore Express® Plus MembranaMilliporeSCGP00525
Stericup 500/1000 ml Durapore 0,22 μ M PVDFPrzeciwciało miliporeSCGVU10RE
Tbr1 (1:2000)ChemiconAB9616
Inhibitor trypsynyGibco17075029
probówki 50 ml ProbówkiPhenixSS-PH50R
15 ml KolbyPhenixSS-PH15R
T25 (nieobrobione)VWR10861-572
Wtyczki do oprogramowania
Bio-formats Packagehttp://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/
Fiji softwarehttps://fiji.sc/
Wtyczka Kymographhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleKymograph.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleOverlay.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
WalkingAverage.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
StackDifference.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
Straighten_.jarhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html
tsp050706.txthttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
75004261 płytki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
  2. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
  3. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
  4. Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
  5. Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
  6. Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
  7. Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
  8. Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948(2009).
  9. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  10. Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
  11. Rietdorf, J. http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html. , Available from: http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html (2015).
  12. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
  13. Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
  14. Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
  15. Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
  16. Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
  17. Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
  18. Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321(2013).
  19. Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
  20. Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
  21. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  22. Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
  23. Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
  24. Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
  25. Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
  26. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  27. Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
  28. De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
  29. Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
  30. Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
  31. Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
  32. Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
  33. Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
  34. Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
  35. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1(2016).
  36. Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
  37. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, Pt 1 469-477 (1999).
  38. Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
  39. Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Morfologia mitochondri wludzkie neurony pochodz ce z iPSCobrazowanie ywych kom rekanaliza kymograficznabarwienie MitoTrackeremtransport anterogradny i retrogradnyanaliza w programie ImageJmodele chor b neurodegeneracyjnychtransport aksonalny

Powiązane artykuły