Prezentujemy solidny, przenośny i predykcyjny system ekspozycji in vitro do badania i monitorowania cząstek unoszących się w powietrzu pod kątem ich ostrej cytotoksyczności płucnej poprzez eksponowanie hodowanych ludzkich komórek płuc na granicy powietrze-ciecz (ALI).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena ostrej toksyczności inhalacyjnej cząstek unoszących się w powietrzu poprzez wystawienie hodowanych ludzkich komórek płuc na granicy faz powietrze-ciecz
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tutaj prezentujemy specjalnie zaprojektowany modułowy system ekspozycji in vitro, który umożliwia jednorodną ekspozycję hodowanych ludzkich komórek płucnych w ALI na gazy, cząsteczki lub złożone atmosfery (np. dym papierosowy), zapewniając w ten sposób realistyczną fizjologiczną ekspozycję powierzchni wierzchołkowej ludzkiego obszaru pęcherzykowego na działanie powietrza. W przeciwieństwie do sekwencyjnych modeli ekspozycji z liniowym prowadzeniem aerozolu, modułowa konstrukcja promieniowego systemu przepływu spełnia wszystkie wymagania dotyczące ciągłego wytwarzania i transportu atmosfery testowej do komórek, jednorodnego rozkładu i osadzania cząstek oraz ciągłego usuwania atmosfery. Ta metoda ekspozycji jest przeznaczona przede wszystkim do narażenia komórek na cząstki unoszące się w powietrzu, ale może być dostosowana do ekspozycji na ciekłe aerozole oraz wysoce toksyczne i agresywne gazy, w zależności od metody wytwarzania aerozoli i materiału, z którego wykonane są moduły ekspozycyjne.
W ramach niedawno zakończonego badania walidacyjnego, ten system ekspozycji okazał się być uniwersalną, powtarzalną i predykcyjną metodą przesiewową do jakościowej oceny ostrej cytotoksyczności płucnej cząstek unoszących się w powietrzu, potencjalnie zmniejszając lub zastępując doświadczenia na zwierzętach, które normalnie dostarczyłyby tej oceny toksykologicznej.
Wprowadzenie
Wdychanie toksycznych cząstek unoszących się w powietrzu jest problemem zdrowia publicznego, prowadzącym do wielu zagrożeń dla zdrowia na całym świecie i wielu milionów zgonów rocznie1,2. Zmiany klimatyczne, ciągły rozwój przemysłowy i rosnące zapotrzebowanie na energię, produkty rolne i konsumpcyjne przyczyniły się do wzrostu zachorowań na choroby płuc w ostatnich latach3,4,5,6. Wiedza i ocena substancji wdychanych pod kątem ich ostrej toksyczności inhalacyjnej stanowią podstawę oce....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Protokół jednego eksperymentu ekspozycyjnego obejmuje okres trzech dni.
Dzień 1
1. Ogólne przygotowania i hodowla komórek
UWAGA: Ludzka linia komórek nabłonkowych gruczolakoraka płuc A549 została użyta do eksperymentów ekspozycyjnych. Z komórkami należy obchodzić się w sterylnych warunkach. Można wykorzystać inne linie komórkowe, które nadają się do hodowli w ALI.
- Przygotować pożywkę wzrostową (Minimum Essential Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 5 μg/ml gentamycyny) oraz pożywkę ekspozycyjną (DMEM, uzupełnioną 5 μg/ml gent....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
CULTEX RFS to specjalnie zaprojektowany modułowy system ekspozycji in vitro, który umożliwia bezpośrednią i homogeniczną ekspozycję komórek na poziomie ALI. W poprzednim badaniu przedwalidacyjnym pomyślnie wykazano ogólną przydatność tego systemu ekspozycji oraz jego przenoszalność, stabilność i powtarzalność. W niedawnym projekcie badawczym finansowanym przez niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań, system ekspozycji został pomyślnie zwalidowany i ustanowiony jako model predyk.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W ostatnich latach opracowano wiele modeli badania toksyczności inhalacyjnej bez udziału zwierząt w celu uzyskania informacji na temat ostrego zagrożenia wdychaniem cząstek wdychanych oraz w celu ograniczenia i zastąpienia doświadczeń na zwierzętach zgodnie z zasadą 3R25.
Jeśli chodzi o modele hodowli komórkowych, ekspozycja komórek może odbywać się w warunkach zanurzenia lub w ALI. Wystawienie komórek na działanie czynników chemicznych w warunkach zanurzenia może wpływ.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy AT, KG, AB, SH, HM, TG, HT i DS nie mają nic do ujawnienia. Firma Cultex Technology GmbH (dawniej Cultex Laboratories GmbH) produkuje instrumenty (np. CULTEX RFS, CULTEX DG) użyte w tym artykule. NM był pracownikiem Cultex Laboratories GmbH podczas tego badania. OK jest pracownikiem firmy Cultex Technology GmbH (dawniej Cultex Laboratories GmbH). Patent PCT/EP2009/007054 na urządzenie posiada założyciel firmy Cultex Technology GmbH, prof. dr Ulrich Mohr (dawniej Cultex Laboratories GmbH).
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Niemcy (Grant 031A581, podprojekt A-D)) oraz przez Niemiecką Fundację Badawczą (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Research Training Group GRK 2338).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Cells | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Pożywka do hodowli komórkowych i materiały | |||
| DMEM | Biochrom, Berlin, Niemcy | FG 0415 | stosowany jako podłoże wzrostowe |
| DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Niemcy | 22320 | stosowany jako podłoże ekspozycyjne |
| FBS superior | Biochrom, Berlin, Niemcy | S 0615 | |
| Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlin, Niemcy | A 2710 | |
| HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Niemcy | L 0180 | |
| PBS | Biochrom, Berlin, Niemcy | L 1825 | |
| Trypsyna/EDTA (0,05%/0,02%) | Biochrom, Berlin, Niemcy | L 2143 | |
| Materiał do hodowli komórkowych | |||
| CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Niemcy | REF 05651794 | |
| Płytki do hodowli komórkowych | Corning, Wiesbaden, Niemcy | 3516 | Płytki 6&calowe;-dołkowe |
| Corning Transwell Wkładki do hodowli komórkowych | Corning, Wiesbaden, Niemcy | 3450 | Wkładki 24mm; 6- płytki studzienne; 0,4 &mikro; m |
| Chemicals | |||
| CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Niemcy | REF 05651808001 | |
| Sprężone powietrze (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleiß heim, Niemcy | 2290152 | |
| WST-1 | Abcam, Cambridge, Wielka Brytania | ab155902 | |
| Instruments + equipment | |||
| CASY Cell Counter | Schä rfe System GmbH, Reutlingen, Niemcy | ||
| Termostat cyrkulacyjny | LAUDA, Lauda-Kö nigshofen, Niemcy | Ecoline RE 100 | |
| CULTEX HyP - Prasa hydrauliczna | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| Tuleja wsuwana CULTEX | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS - System przepływu promieniowego Typ 2 (moduł do naświetlania cząstek) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS - System przepływu promieniowego Typ 2 (moduł do ekspozycji na czyste powietrze) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX supply | |||
| Regulator przepływu 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Regulator przepływu 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Filtry (duże) | Munktell & Filtrak GmbH, Saksonia, Niemcy | LP-050 | Filtr sterylny Munktell; Skuteczność zatrzymywania cząstek > 99,999% |
| Filtry (małe) | Parker Hannifin Corporation, Moguncja, Niemcy | 9933-05-DQ | Jednorazowy filtr Balston |
| Pompa medium | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Niemcy | Ismatec IPC Wysoka precyzja wielokanałowego dozownika | pompa perystaltyczna |
| Czytnik mikropłytek Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Niemcy | ||
| Pompa Vakuum | KNF, Freiburg, Niemcy | N86 KT.18 | |
| Vö gtlin regulator przepływu masowego 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vö Regulator kompaktowy gtlin red-y, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
| Łaźnia wodna | LAUDA, Lauda-Kö Nigshofen, Niemcy | Ecoline Staredition RE 104 |
Bibliografia
- Faber, S. C., McCullough, S. D. Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).
- Ambient air pollution: a global assessment of exposure and burden of disease. , World Health Organization. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/250141/9789241511353-eng.pdf?sequence=1 ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
