Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena ostrej toksyczności inhalacyjnej cząstek unoszących się w powietrzu poprzez wystawienie hodowanych ludzkich komórek płuc na granicy faz powietrze-ciecz

6.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60572

⸱

23 lutego 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology, 2Walther Straub Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Munich, 3Cultex Laboratories GmbH, 4Cultex Technologies GmbH (formerly Cultex Laboratories GmbH), 5seh consulting + services

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy solidny, przenośny i predykcyjny system ekspozycji in vitro do badania i monitorowania cząstek unoszących się w powietrzu pod kątem ich ostrej cytotoksyczności płucnej poprzez eksponowanie hodowanych ludzkich komórek płuc na granicy powietrze-ciecz (ALI).

Streszczenie

Tutaj prezentujemy specjalnie zaprojektowany modułowy system ekspozycji in vitro, który umożliwia jednorodną ekspozycję hodowanych ludzkich komórek płucnych w ALI na gazy, cząsteczki lub złożone atmosfery (np. dym papierosowy), zapewniając w ten sposób realistyczną fizjologiczną ekspozycję powierzchni wierzchołkowej ludzkiego obszaru pęcherzykowego na działanie powietrza. W przeciwieństwie do sekwencyjnych modeli ekspozycji z liniowym prowadzeniem aerozolu, modułowa konstrukcja promieniowego systemu przepływu spełnia wszystkie wymagania dotyczące ciągłego wytwarzania i transportu atmosfery testowej do komórek, jednorodnego rozkładu i osadzania cząstek oraz ciągłego usuwania atmosfery. Ta metoda ekspozycji jest przeznaczona przede wszystkim do narażenia komórek na cząstki unoszące się w powietrzu, ale może być dostosowana do ekspozycji na ciekłe aerozole oraz wysoce toksyczne i agresywne gazy, w zależności od metody wytwarzania aerozoli i materiału, z którego wykonane są moduły ekspozycyjne.

W ramach niedawno zakończonego badania walidacyjnego, ten system ekspozycji okazał się być uniwersalną, powtarzalną i predykcyjną metodą przesiewową do jakościowej oceny ostrej cytotoksyczności płucnej cząstek unoszących się w powietrzu, potencjalnie zmniejszając lub zastępując doświadczenia na zwierzętach, które normalnie dostarczyłyby tej oceny toksykologicznej.

Wprowadzenie

Wdychanie toksycznych cząstek unoszących się w powietrzu jest problemem zdrowia publicznego, prowadzącym do wielu zagrożeń dla zdrowia na całym świecie i wielu milionów zgonów rocznie1,2. Zmiany klimatyczne, ciągły rozwój przemysłowy i rosnące zapotrzebowanie na energię, produkty rolne i konsumpcyjne przyczyniły się do wzrostu zachorowań na choroby płuc w ostatnich latach3,4,5,6. Wiedza i ocena substancji wdychanych pod kątem ich ostrej toksyczności inhalacyjnej stanowią podstawę oceny zagrożeń i zarządzania ryzykiem, ale nadal brakuje tych informacji w odniesieniu do szerokiego zakresu tych substancji7,8. Od 2006 r. prawodawstwo UE w zakresie chemikaliów REACH (rejestracja, ocena, udzielanie zezwoleń i stosowane ograniczenia w zakresie chemikaliów) wymaga, aby już istniejące i nowo wprowadzone produkty były poddawane charakterystyce toksykologicznej, w tym drodze wziewnej, przed wprowadzeniem do obrotu. W związku z tym REACH koncentruje się na metodach alternatywnych i nieuwzględniających zwierząt, wdrażaniu zasady "3R" (Replacement, Refinement, and Reduction of animal experiments) oraz stosowaniu odpowiednich modeli in vitro9. W ostatnich latach opracowano wiele różnych i odpowiednich modeli badania toksyczności inhalacyjnej bez udziału zwierząt (np. hodowle komórkowe in vitro, modele płuc na chipie, precyzyjnie cięte plastry płuc (PCLS)) w celu oceny ostrej toksyczności inhalacyjnej cząstek unoszących się w powietrzu5,7,10,11. Jeśli chodzi o modele hodowli komórkowych in vitro, hodowane komórki mogą być wystawione w warunkach zanurzonych lub w ALI (ryc. 1). Jednakże ważność badań narażenia w zanurzeniu jest ograniczona w odniesieniu do oceny toksyczności związków unoszących się w powietrzu, w szczególności cząstek. Techniki narażenia w zanurzeniu nie odpowiadają sytuacji człowieka in vivo; Pożywka do hodowli komórkowej pokrywająca komórki może wpływać na właściwości fizykochemiczne, a tym samym na właściwości toksyczne substancji badanej12,13. Modele inhalacji ALI in vitro pozwalają na bezpośrednie narażenie komórek na substancje badane bez ingerencji pożywki hodowli komórkowej w cząstki testowe, naśladując w ten sposób narażenie człowieka z wyższym podobieństwem fizjologicznym i biologicznym niż narażenie zanurzone12,14.

Dla procesów regulacyjnych, takich jak REACH, dostępne są jednak tylko modele zwierzęce w dziedzinie ostrej toksykologii inhalacyjnej, ponieważ do tej pory żadne alternatywne metody in vitro nie zostały wystarczająco zatwierdzone i oficjalnie zaakceptowane14. W tym celu modele testowe muszą zostać zatwierdzone zgodnie z wymogami Laboratorium Referencyjnego Unii Europejskiej ds. Metod Alternatywnych wobec Badań na Zwierzętach (EURL-ECVAM) w zakresie ważności testu15.

Poprzednie badanie pre-walidacyjne i niedawno zakończone badanie walidacyjne z powodzeniem zademonstrowały obszar zastosowania systemu ekspozycji CULTEX RFS oraz jego przenośność, stabilność i odtwarzalność13. Ten system ekspozycji jest systemem ekspozycji in vitro opartym na komórkach, który umożliwia jednorodną ekspozycję komórek na gazy, cząstki lub złożone atmosfery (np. dym papierosowy) w ALI dzięki koncepcji promienistego rozkładu aerozolu i przewodzeniu aerozolu testowego w ciągłym przepływie przez komórki16. Podstawowy moduł tego promieniowego systemu przepływu składa się z adaptera wlotowego, modułu prowadzącego aerozol z promieniowym rozkładem aerozolu, modułu pobierania próbek i gniazda oraz modułu blokującego z pokrętłem ręcznym (rysunek 2). Wytworzone cząstki docierają do komórek przez adapter wlotowy i moduł prowadzący aerozol i są osadzane na wkładkach do hodowli komórkowych, które znajdują się w trzech promieniście rozmieszczonych komorach ekspozycyjnych modułu do pobierania próbek. Moduł prowadzący aerozol oraz moduł pobierania próbek można podgrzać, podłączając go do zewnętrznej łaźni wodnej17.

W ramach obu badań, komórki A549 zostały użyte do wszystkich eksperymentów ekspozycji. Linia komórkowa A549 to ludzka nienarodzona linia komórek nabłonkowych, która jest bardzo dobrze scharakteryzowana i została wykorzystana jako model in vitro dla komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu II w licznych badaniach toksykologicznych. Komórki charakteryzują się blaszkowatymi ciałami, produkcją środka powierzchniowo czynnego i szeregiem czynników istotnych dla stanu zapalnego18. Wykazują również właściwości komórek nabłonka oskrzeli ze względu na produkcję śluzu19. Co więcej, mogą być hodowane w ALI. Mimo, że ta linia komórkowa ma braki w budowaniu kontaktów komórka-komórka, hodowla tych komórek jest znacznie wygodniejsza, tańsza, kosztowna, a wyniki z niej uzyskane są niezależne od dawcy w porównaniu z komórkami pierwotnymi20.

Komórki A549 zostały wysiane w 6-dołkowych wkładkach do hodowli komórkowych (membrana PET, 4,67 cm2, wielkość porów 0,4 mm) o gęstości 3,0 x 105 komórek na wkładkę i hodowane przez 24 godziny w warunkach zanurzenia. Komórki zostały następnie wystawione w trzech niezależnych laboratoriach na działanie czystego powietrza i trzech różnych dawek ekspozycji (25, 50 i 100 μg/cm2) 20 badanych substancji w ALI. Dawka ekspozycji jest skorelowana z czasem osadzania, co skutkuje stałą szybkością cząstek wynoszącą 25 μg/cm2, 50 μg/cm2 i 100 μg/cm2 na komórkach odpowiednio po 15, 30 lub 60 minutach. Osadzone cząstki nie zostały jednak zmyte po osadzaniu, lecz pozostawały na komórkach przez 24 godziny. Czasy osadzania cząstek wynosiły zatem 15, 30 i 60 minut, ale ekspozycja komórek trwała łącznie 24 godziny. Szybkość osadzania badanych substancji określono we wstępnych doświadczeniach zgodnie z poprzednimi metodami17.

Żywotność komórek jako wskaźnik toksyczności została oceniona 24 godziny po osadzeniu cząstek za pomocą testu żywotności komórek. Szczególny nacisk położono na jakość kontroli czystego powietrza, optymalizację i udoskonalenie protokołu narażenia, odtwarzalność wewnątrz- i międzylaboratoryjną oraz ustanowienie modelu predykcyjnego (PM). Substancje, które prowadziły do zmniejszenia żywotności komórek poniżej 50% (PM 50%) lub 75% (PM 75%) przy każdej z trzech dawek narażenia, uznano za stwarzające ostre zagrożenie wdychania. Wyniki porównano następnie z istniejącymi danymi in vivo (w oparciu o co najmniej jedno wiarygodne badanie zgodnie z wytycznymi OECD dotyczącymi badań (TG) 403 lub TG 43621,22), co doprowadziło do ogólnej zgodności na poziomie 85%, ze swoistością 83% i czułością 88%23.

Oprócz pomiaru żywotności komórek, inne punkty końcowe, takie jak uwalnianie cytokin, badanie lizatu komórkowego lub integralność błony za pomocą testu LDH, mogą być oceniane, ale nie były wymagane do badania walidacyjnego. W ten sposób system ekspozycji (np. CULTEX RFS) okazał się predykcyjnym systemem przesiewowym do jakościowej oceny ostrej toksyczności inhalacyjnej badanych cząstek unoszących się w powietrzu, stanowiąc obiecującą alternatywę dla testów na zwierzętach. Poniższy protokół jest zalecany w przypadku eksperymentów z narażeniem na cząstki unoszące się w powietrzu przy użyciu tego systemu ekspozycji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Protokół jednego eksperymentu ekspozycyjnego obejmuje okres trzech dni.

Dzień 1

1. Ogólne przygotowania i hodowla komórek

UWAGA: Ludzka linia komórek nabłonkowych gruczolakoraka płuc A549 została użyta do eksperymentów ekspozycyjnych. Z komórkami należy obchodzić się w sterylnych warunkach. Można wykorzystać inne linie komórkowe, które nadają się do hodowli w ALI.

  1. Przygotować pożywkę wzrostową (Minimum Essential Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 5 μg/ml gentamycyny) oraz pożywkę ekspozycyjną (DMEM, uzupełnioną 5 μg/ml gentamycyny i końcowym stężeniem HEPES 100 mM).
  2. Hodowla komórek A549 w pożywce wzrostowej w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 .
  3. Hodować komórki w kolbie do hodowli komórkowej o długości 75cm2 (T-75) w 14 ml pożywki wzrostowej do zbiegu 80-90% przed podziałem (co 2-3 dni) i pasażem 35.
  4. Obliczyć objętość zawiesiny i wymaganą liczbę wkładek do hodowli komórkowych (trzy wkładki do hodowli komórkowych jako kontrole inkubatora i wkładki do hodowli komórkowych w celu narażenia na czyste powietrze i cząstki) oraz płytek do hodowli komórkowych.
  5. Przed trypsynizacją i wysiewem komórek dodaj 2,5 ml temperowanej pożywki wzrostowej do każdego dołka 6-dołkowej płytki. Ostrożnie umieść wkładki do hodowli komórkowych bez komórek w studzienkach i dodaj 1 ml pożywki wzrostowej do każdej wkładki do hodowli komórkowej. Inkubować płytki 6-dołkowe przez co najmniej 30 minut w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).

2. Trypsynizacja komórek

  1. Roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i pożywką wzrostową w temperaturze 37 °C, a roztworem trypsyna/EDTA (0,05%/0,02%) w temperaturze pokojowej.
  2. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z kolby do hodowli komórkowych i dokładnie umyć komórki 8 ml wstępnie podgrzanego PBS.
  3. Usunąć PBS, dodać 2 ml roztworu trypsyny/EDTA (0,05%/0,02%) do komórek i inkubować maksymalnie 6 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Kontrolować proces odrywania pod mikroskopem.
  4. Zneutralizować aktywność trypsyny, dodając 8 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej, odłączyć komórki, delikatnie stukając w boki kolby i ponownie zawiesić komórki przez wielokrotne pipetowanie w górę i w dół.
  5. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml. Określ liczbę komórek do dalszej procedury (np. wysiewu komórek, przejścia komórek).

3. Określenie numeru komórki

UWAGA: Stężenie komórek zostało określone za pomocą licznika komórek lub komór zliczających.

  1. Rozcieńczyć 100 μl zawiesiny hodowli komórkowej w kubku wypełnionym 10 ml roztworu izotonicznego. Przechylaj kubek powoli, nie potrząsając.
  2. Określ liczbę żywotnych komórek/ml i żywotność komórek na podstawie specyficznych dla komórek parametrów pomiarowych komórek A549.

4. Wysiewanie komórek na mikroporowate błony we wkładkach do hodowli komórkowych

UWAGA: System ekspozycji jest wyposażony w specjalne adaptery, które umożliwiają korzystanie z komercyjnych wkładek od różnych dostawców i o różnych rozmiarach. Do tych eksperymentów ekspozycyjnych użyto płytek 6-dołkowych i odpowiadających im wkładek do hodowli komórkowych. Wszystkie etapy pracy muszą być wykonywane w sterylnych warunkach.

  1. Dostarczyć wstępnie podgrzaną pożywkę wzrostową w sterylnych warunkach hodowli komórek (przepływ laminarny).
  2. Przygotować odpowiednio dużą objętość zawiesiny komórek o stężeniu komórek 3,0 x 105 komórek/ml.
  3. Po odpuszczaniu płytek przez 30 minut, odessać pożywkę w wkładkach do hodowli komórkowych i zasiać 1 ml komórek A549 o gęstości 3,0 x 105 komórek/ml w każdej wkładce do hodowli komórkowej. Rozprowadzić zawiesinę komórkową poprzez delikatne kołysanie.
  4. Inkubować wkładki do kultur komórkowych z zawiesiną komórek przez 24 godziny (37 °C i 5% CO2 ).

5. Tłoczenie substancji badanych

UWAGA: Substancje testowe zostały sprasowane w placki proszkowe za pomocą w pełni kontrolowanej prasy hydraulicznej. Pakiet prasy może przyłożyć maksymalną siłę 18 kN, która jest wyświetlana jako aktualne ciśnienie oleju (w barach) pakietu prasy. Warunki tłoczenia (ciśnienie prasowania, czas prasowania) nieznanych substancji badanych muszą zostać ustalone i scharakteryzowane w badaniach wstępnych. W zależności od właściwości prasowania substancji można stosować różne parametry prasowania i rodzaje tłoka dociskowego.

UWAGA: Nosić sprzęt ochronny podczas wciskania toksycznych lub niebezpiecznych substancji.

  1. Ustaw czas prasowania za pomocą regulatora czasu z przodu prasy.
  2. Otwórz dopływ sprężonego powietrza na zaworze sprężonego powietrza. Ustawić ciśnienie sprężonego powietrza na około 2 bary (wskazywane przez manometr z przodu) za pomocą regulatora ciśnienia z przodu prasy lub na zaworze sprężonego powietrza zasilania sprężonym powietrzem. Wyciągnij szufladę, naciśnij przycisk Press i odczytaj ciśnienie docisku na cyfrowym przełączniku ciśnienia.
    1. Odczytaj tylko ciśnienie na regulatorze ciśnienia, jeśli ciśnienie jest za wysokie lub za niskie.
  3. Zamontuj pojemnik na substancję i upewnij się, że szklany cylinder jest prawidłowo wyśrodkowany (rysunek uzupełniający 1). Napełnić pojemnik z substancją niewielką ilością substancji badanej. Włożyć tłok do pojemnika z substancją i obracać go lekko do przodu i do tyłu, aby równomiernie rozprowadzić proszek w pojemniku.
  4. Umieścić pojemnik na substancję z tłokiem w szufladzie i nacisnąć przycisk Naciśnij przycisk. Tłok hydrauliczny prasy przesuwa się na tłok i wywiera nacisk na substancję badaną przez ustawiony czas prasowania. Otwórz szufladę i wyjmij tłok.
  5. Powtarzać kroki 5.3 i 5.4 do momentu, gdy pojemnik z substancją będzie wypełniony co najmniej do połowy.
  6. Po zakończeniu prasowania wyjmij pojemnik na substancję z szuflady i odwróć go do góry nogami, aby usunąć luźne i osadzone cząstki.
  7. Jeżeli pojemnik na substancję nie jest potrzebny tego samego dnia, należy zamknąć pojemnik z substancją parafilmem, aby zapobiec wysychaniu substancji badanej lub wchłanianiu wilgoci.

Dzień 2

6. Montaż systemu ekspozycji i podłączenie urządzeń peryferyjnych

UWAGA: Bardziej szczegółowy widok znajduje się w Rysunek 3, Rysunek uzupełniający 2 i Rysunek uzupełniający 3. Zmontuj oba moduły i generator aerozolu zgodnie z instrukcjami producenta.

  1. Umieść system naświetlania na solidnej i równej powierzchni, z dopływem wody skierowanym do przodu. Połącz regulatory przepływu masowego z generatorem aerozolu i butelką z trzema szyjkami podłączoną do modułu w celu naświetlania czystego powietrza.
  2. Podłączyć regulator przepływu i pompę próżniową. Połącz rurki z regulatorów przepływu ze złączem rurki na nasadkach modułu prowadzącego aerozol. Połącz rurki po drugiej stronie regulatorów przepływu z pompą próżniową. Upewnij się, że przepływ przechodzi z modułu przez regulatory przepływu do pompy próżniowej.
  3. Podłączyć łaźnię wodną do dopływu wody grzewczej. Dopływ wody biegnie z łaźni wodnej do wlotu wody na module prowadzącym aerozol. Połączyć wylot wody modułu prowadzącego aerozol z wlotem wody modułu do pobierania próbek. Zamknąć okrąg za pomocą połączenia od wylotu wody modułu pobierania próbek do łaźni wodnej.
  4. Umieść generator aerozolu wraz z elutriatorem w pobliżu modułu naświetlania i połącz nadmiarowe przewody elutriatora oraz modułu ekspozycji i czystego powietrza dużymi mikrofiltrami, a zasysanie komór naświetlających małymi mikrofiltrami (np. filtrami jednorazowymi). Elutriator służy jako zbiornik dla wytwarzanej atmosfery cząstek stałych i zatrzymuje cząstki większe niż ok. 7 μm, podczas gdy mniejsze cząstki są transportowane do modułu ekspozycyjnego.
  5. Podłącz komputer używany do sterowania wytwarzaniem aerozoli do portu USB w górnej części generatora aerozoli za pomocą USB, a zasilacz do portu zasilania. Podłącz wtyczkę zasilania prądem zmiennym zasilacza do gniazdka (220-240 V).
  6. Podłącz rury do dostarczania i odprowadzania medium za pomocą dwóch pomp. Zamiast używać pompy do dostarczania medium, medium można również napełniać ręcznie.

7. Przygotowanie do czystego powietrza i ekspozycji na cząstki

  1. Włączyć pompę próżniową, regulatory przepływu i łaźnię wodną (37 °C) na okres nagrzewania wynoszący co najmniej 30 minut.
  2. Otwórz dopływ sprężonego powietrza. Ustawić regulatory przepływu masowego na 8 l/min dla przewodu zasilającego do generatora aerozoli i na 3 l/min dla przewodu zasilającego butelkę z trzema szyjkami. Zamknij karty sterowników przepływu masowego.
    UWAGA: Wartości te mogą się różnić w zależności od charakterystyki substancji badanej.
  3. Wyreguluj regulatory przepływu za pomocą komputera, aby regulować przepływ modułu (1,5 l/min) i ssanie komory (30 mL/min).

8. Test szczelności systemu przepływu promieniowego

UWAGA: Kontrola szczelności musi być przeprowadzona w próżni i dla obu modułów (moduł ekspozycji i modułu czystego powietrza), aby upewnić się, że moduł został prawidłowo złożony.

  1. Wyjmij adapter wlotowy i odbłyśnik kondensatu z modułu prowadzącego aerozol. Zamknąć trzy otwory doprowadzające aerozol w module prowadzenia aerozolu za pomocą zaślepek, a przyłącza doprowadzające medium w module do pobierania próbek za pomocą fikcyjnych klapek.
  2. Podłącz przewody podciśnieniowe bez filtra za pomocą łącznika rurki modułu prowadzącego aerozol. Zamknij moduł za pomocą pokrętła ręcznego i zmierz wartość regulatorów przepływu. Wartości powinny spaść kilka minut po zamknięciu poniżej 5 ml / min.
  3. Po sprawdzeniu szczelności należy wyjąć wszystkie zaślepki i atrapy klap, włożyć adapter wlotowy i odbłyśnik kondensatu do modułu prowadzącego aerozol i podłączyć rury do dostarczania i usuwania medium.

9. Wytwarzanie aerozoli

  1. Uruchom komputer i oprogramowanie (Rysunek uzupełniający 4). Uruchom oprogramowanie generatora aerozoli, klikając dwukrotnie przycisk uruchamiania generatora aerozoli na pulpicie komputera. Pojawi się okno komunikatu z pytaniem, czy ustawienia powinny zostać zresetowane, czy nie. Kliknij przycisk Tak, jeśli oprogramowanie jest uruchamiane po raz pierwszy tego dnia. Ustaw wartości w polach Pozycja suwaka i Pozycja skrobaka na wartości domyślne. Kliknij przycisk Nie, aby zachować wartości w polach Pozycja suwaka i Pozycja skrobaka, w przeciwnym razie suwak nie znajduje się w pozycji początkowej.
  2. Wkręć skrobak do substancji w rurę, która znajduje się w centralnym otworze górnego generatora aerozolu.
    UWAGA: W zależności od charakterystyki prasy można stosować różne rodzaje skrobaków do substancji.
  3. Użyj przycisku Tryb bazowania, jeśli skrobak do substancji nie znajduje się w najniższym położeniu.
  4. Umieścić pojemnik na substancję ze sprasowanym materiałem do badań do góry nogami nad skrobakiem do substancji. Upewnij się, że szkło pojemnika na substancję jest skierowane do przodu. Upewnij się, że dwa otwory w pojemniku na substancję pasują do dwóch kołków górnego generatora aerozolu. Umieść płytkę blokującą w szczelinie nad pojemnikiem na substancję i dokręć czarną.
  5. Zmień wartości posuwu (od 0,24 do 20 mm/h) i obrotu (od 1 do 800 obr./h) na żądane ustawienia. Stężenie cząstek można modyfikować poprzez zwiększanie lub zmniejszanie wartości zasilania lub natężenia przepływu gazu nośnego.
  6. Użyj strzałek skierowanych w dół, aby popchnąć szkiełko z pojemnikiem na substancję, aż skrobak do substancji znajdzie się w pobliżu sprasowanej substancji.
  7. Otworzyć dopływ sprężonego powietrza do generatora aerozoli za pomocą dotknięcia regulatora przepływu masowego i rozpocząć wytwarzanie aerozolu, klikając przycisk Start. Ustaw prędkość posuwu na 15-20 mm/h, aby uniknąć długiego czasu oczekiwania.
  8. Kontroluj prawidłowe wytwarzanie cząstek, obserwując chmurę drobnego pyłu za pomocą małej latarki (umieszczonej od dołu za szklaną rurką elutriatora). Zmień wartość opcji Feed back na żądane ustawienia, gdy pierwsza para aerozolu dotrze w sposób ciągły do elutriatora i kliknij przycisk Stop.

10. Eksperymenty z ekspozycją

  1. Rozpocząć dopływ medium z podgrzanym podłożem ekspozycyjnym i napełniać moduły do pobierania próbek, aż rury spustowe zostaną zakryte, gdy moduł jest otwarty. Użyj pompy pożywki lub napełnij pożywkę ręcznie (25 ml na pojedynczą komorę ekspozycyjną).
  2. Włożyć ślepe wkładki do hodowli komórkowych (wkładki bez komórek) do modułu ekspozycji. Pompuj medium ekspozycyjne w dół, aż rury spustowe zostaną pokryte medium, a dolna strona wkładek zetknie się z medium.
  3. Uruchom generator aerozolu, zamknij moduł ekspozycji i podłącz moduł ekspozycji do wylotu modułu ekspozycji generatora aerozolu. Daj generatorowi aerozoli czas oczekiwania wynoszący co najmniej 20-30 minut przed rozpoczęciem ekspozycji, aby umożliwić stabilne wytwarzanie cząstek.
  4. Przygotować płytki po inkubacji do kontroli inkubatora i naświetlonych wkładek do kultur komórkowych w czasie przeprowadzania inkubacji. Dodać 1,5 ml pożywki wzrostowej do dołka i inkubować płytki w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
  5. Po upływie czasu realizacji należy uszczelnić wylot modułu ekspozycyjnego Elutriatora gumową zatyczką i wyjąć wkładki zaślepiające. Uzupełnij medium ekspozycyjne (za pomocą pompy lub ręcznie), aż rury spustowe zostaną pokryte medium. W tym momencie należy również otworzyć dopływ sprężonego powietrza do modułu czystego powietrza za pomocą kurka regulatora przepływu masowego (3 l/min)
  6. Usuń wkładki do hodowli komórkowych z płytek 6-dołkowych za pomocą pęsety. Ostrożnie wylej pożywkę wzrostową z wkładek do hodowli komórkowych, przewracając wkładki, a następnie odessać i wyrzucić pozostały płyn za pomocą pipety. Umieść wkłady w komorach naświetlania obu modułów, modułu naświetlania i modułu czystego powietrza.
  7. Zamknij moduły i rozpocznij eksperymenty z ekspozycją, podłączając jednocześnie moduł ekspozycyjny do wylotu modułu naświetlania generatora aerozolu, a moduł czystego powietrza do źródła gazu nośnego.
    UWAGA: Stężenie cząstek można modyfikować poprzez zwiększanie/zmniejszanie wartości zasilania, natężenia przepływu gazu nośnego lub czasu ekspozycji.
  8. Po zakończeniu eksperymentu odłącz moduły ekspozycji i czystego powietrza i uszczelnij wylot modułu ekspozycji.
  9. Zatrzymaj dopływ sprężonego powietrza i generator aerozolu, klikając przycisk Zatrzymaj.
  10. Otwórz moduł naświetlania i czystego powietrza i przenieś wkładki z kultur komórkowych na przygotowane płytki po inkubacji za pomocą pęsety. Inkubować płytki 6-dołkowe przez 24 godziny (37 °C, 5% CO2) w ALI.
    UWAGA: Powtórz kroki 10.5 -10.10, jeśli planowane są dalsze eksperymenty z ekspozycją.
  11. Podnieś wkładki do hodowli komórkowych, które są używane jako kontrole inkubatora, do ALI w takich samych warunkach, jak wkładki do hodowli komórkowych poddane działaniu ekspozycji i inkubuj je przez 24 godziny (37 °C, 5 % CO2 ) w ALI.
  12. Użyj przycisku Homing Mode, aby wyjąć pojemnik z substancją. Zamknij oprogramowanie generatora aerozolu, klikając X w prawym górnym rogu i wyłącz komputer.
  13. Po zakończeniu wszystkich eksperymentów ekspozycyjnych wyczyść generator aerozolu i oba moduły ekspozycji. Zamknąć pojemnik z substancją parafilmem, jeżeli substancja badana będzie dalej używana w ciągu następnych dni.

Dzień 3

11. Żywotność komórek

UWAGA: Żywotność komórek została określona 24 godziny po osadzeniu cząstek, mierząc aktywność mitochondriów za pomocą testu WST-1. Test został wykonany zgodnie z protokołem producenta. Żywotność komórek można również określić za pomocą innych testów żywotności komórek (np. XTT).

  1. Odpuszczać pożywkę w temperaturze 37 °C i rozmrażać roztwór WST-1 chroniąc przed światłem. Przygotować odpowiednią liczbę nowych płytek 6-dołkowych z 2,5 ml pożywki wzrostowej na dołek i inkubować płytki w inkubatorze.
  2. Przygotować rozcieńczenie WST-1 rozcieńczając wystarczającą ilość WST-1 1:7 w pożywce wzrostowej
  3. Wkładki do kultur komórkowych należy umieścić 24 godziny po ekspozycji w nowo przygotowanych płytkach 6-dołkowych. Dodać 1 ml świeżo przygotowanego roztworu WST-1 do każdej wkładki do hodowli komórkowej. Ostrożnie kołysz płytki, aby równomiernie rozprowadzić roztwór na komórkach. Inkubować płytki 6-dołkowe z wkładkami do hodowli komórkowych przez 1 godzinę (37 °C, 5% CO2 ).
  4. Przenieść 100 μl supernatantu w trzech egzemplarzach z każdej płytki 6-dołkowej na płytkę 96-dołkową. Zmierzyć absorbancję przy 450 nm przy referencyjnej długości fali 650 nm za pomocą czytnika mikropłytek.

12. Statystyki

  1. Normalizuj żywotność komórek w poszczególnych kontrolkach inkubatora do 100%.
  2. Wyrazić żywotność narażonych komórek w odniesieniu do poszczególnych kontrolnych komórek inkubatora. Cytotoksyczność badanych substancji porównano z odpowiednimi kontrolami w inkubatorze i wykorzystano jako wskaźnik toksyczności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

CULTEX RFS to specjalnie zaprojektowany modułowy system ekspozycji in vitro, który umożliwia bezpośrednią i homogeniczną ekspozycję komórek na poziomie ALI. W poprzednim badaniu przedwalidacyjnym pomyślnie wykazano ogólną przydatność tego systemu ekspozycji oraz jego przenoszalność, stabilność i powtarzalność. W niedawnym projekcie badawczym finansowanym przez niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań, system ekspozycji został pomyślnie zwalidowany i ustanowiony jako model predyk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W ostatnich latach opracowano wiele modeli badania toksyczności inhalacyjnej bez udziału zwierząt w celu uzyskania informacji na temat ostrego zagrożenia wdychaniem cząstek wdychanych oraz w celu ograniczenia i zastąpienia doświadczeń na zwierzętach zgodnie z zasadą 3R25.

Jeśli chodzi o modele hodowli komórkowych, ekspozycja komórek może odbywać się w warunkach zanurzenia lub w ALI. Wystawienie komórek na działanie czynników chemicznych w warunkach zanurzenia może wpływ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy AT, KG, AB, SH, HM, TG, HT i DS nie mają nic do ujawnienia. Firma Cultex Technology GmbH (dawniej Cultex Laboratories GmbH) produkuje instrumenty (np. CULTEX RFS, CULTEX DG) użyte w tym artykule. NM był pracownikiem Cultex Laboratories GmbH podczas tego badania. OK jest pracownikiem firmy Cultex Technology GmbH (dawniej Cultex Laboratories GmbH). Patent PCT/EP2009/007054 na urządzenie posiada założyciel firmy Cultex Technology GmbH, prof. dr Ulrich Mohr (dawniej Cultex Laboratories GmbH).

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Niemcy (Grant 031A581, podprojekt A-D)) oraz przez Niemiecką Fundację Badawczą (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Research Training Group GRK 2338).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cells
A549ATCCCCL-185
Pożywka do hodowli komórkowych i materiały
DMEMBiochrom, Berlin, NiemcyFG 0415stosowany jako podłoże wzrostowe
DMEMGibco-Invitrogen, Darmstadt, Niemcy22320stosowany jako podłoże ekspozycyjne
FBS superiorBiochrom, Berlin, NiemcyS 0615
Gentamycin (10mg/mL)Biochrom, Berlin, NiemcyA 2710
HEPES 1MTh. Geyer, Renningen, NiemcyL 0180
PBSBiochrom, Berlin, NiemcyL 1825
Trypsyna/EDTA (0,05%/0,02%)Biochrom, Berlin, NiemcyL 2143
Materiał do hodowli komórkowych
CASY CupsRoche Diagnostic GmbH, Mannheim, NiemcyREF 05651794
Płytki do hodowli komórkowychCorning, Wiesbaden, Niemcy3516Płytki 6&calowe;-dołkowe
Corning Transwell Wkładki do hodowli komórkowychCorning, Wiesbaden, Niemcy3450Wkładki 24mm; 6-­ płytki studzienne; 0,4 &mikro; m
Chemicals
CASYtonRoche Diagnostic GmbH, Mannheim, NiemcyREF 05651808001
Sprężone powietrze (DIN EN 12021)Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleiß heim, Niemcy2290152
WST-1Abcam, Cambridge, Wielka Brytaniaab155902
Instruments + equipment
CASY Cell CounterSchä rfe System GmbH, Reutlingen, Niemcy
Termostat cyrkulacyjnyLAUDA, Lauda-Kö nigshofen, NiemcyEcoline RE 100
CULTEX HyP - Prasa hydraulicznaCultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
Tuleja wsuwana CULTEXCultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - System przepływu promieniowego Typ 2 (moduł do naświetlania cząstek)Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - System przepływu promieniowego Typ 2 (moduł do ekspozycji na czyste powietrze)Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX supply
Regulator przepływu 0-30 ml/min (IQ-Flow)Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Regulator przepływu 0-1,5 l/min (EL-Flow)Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Filtry (duże)Munktell & Filtrak GmbH, Saksonia, NiemcyLP-050Filtr sterylny Munktell; Skuteczność zatrzymywania cząstek > 99,999%
Filtry (małe)Parker Hannifin Corporation, Moguncja, Niemcy9933-05-DQJednorazowy filtr Balston
Pompa mediumCole-Parmer GmbH, Wertheim, NiemcyIsmatec IPC Wysoka precyzja wielokanałowego dozownikapompa perystaltyczna
Czytnik mikropłytek Infinite M200 ProTecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Niemcy
Pompa VakuumKNF, Freiburg, NiemcyN86 KT.18
Vö gtlin regulator przepływu masowego 0,2-10 l/minTrigasFI GmbHVö Regulator kompaktowy gtlin red-y, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20
Łaźnia wodnaLAUDA, Lauda-Kö Nigshofen, NiemcyEcoline Staredition RE 104
cyfrowa

Bibliografia

  1. Faber, S. C., McCullough, S. D. Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).
  2. Ambient air pollution: a global assessment of exposure and burden of disease. , World Health Organization. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/250141/9789241511353-eng.pdf?sequence=1 (2018).
  3. De Matteis, S., et al. Current and new challenges in occupational lung diseases. European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).
  4. LANUV Nordrhein-Westfalen. Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).
  5. Bérubé, K., et al. In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop. Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).
  6. Lopez, A. D., Murray, C. C. The global burden of disease, 1990-2020. Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).
  7. Clippinger, A. J., et al. Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report. Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).
  8. Agrawal, M. R., Winder, C. Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace. Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).
  9. Amtsblatt der Europäischen Union. Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates. Europäische Union. 860, (2006).
  10. Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  11. Fisher, R. L., et al. The Use of Human Lung Slices in Toxicology. Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
  12. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 12, (2013).
  13. Steinritz, D., et al. Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
  14. Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).
  15. Eskes, C., Whelan, M. Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, Springer International Publishing. (2016).
  16. Rach, J., Budde, J., Möhle, N., Aufderheide, M. Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances. Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).
  17. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 15, (2013).
  18. Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).
  19. Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).
  20. Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).
  21. OECD. Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
  22. OECD. Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
  23. Tsoutsoulopoulos, A., et al. Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles. Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).
  24. Tsoutsoulopoulos, A., et al. A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure. Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).
  25. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Johns Hopkins School of Public Health. http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc (1959).
  26. Tsoutsoulopoulos, A., et al. Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents. Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).
  27. Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations. Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).
  28. OECD. Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2018).
  29. OECD. Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , OECD Publishing. Paris. (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspozycja in vitrosystem przep ywu radialnegogenerowanie aerozoludepozycja cz steczektest ywotno ci kom rekroztw r WST1
Ocena ostrej toksyczności inhalacyjnej cząstek unoszących się w powietrzu poprzez wystawienie hodowanych ludzkich komórek płuc na granicy faz powietrze-ciecz
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.