Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zakażenie in vivo Leishmania amazonensis w celu oceny zjadliwości pasożyta u myszy

8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60617

⸱

20 lutego 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Institute of Bioscience, University of Sao Paulo

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy skompilowany protokół do oceny infekcji skórnej myszy Leishmania amazonensis. Jest to wiarygodna metoda badania zjadliwości pasożytów, pozwalająca na systemowy wgląd w reakcję kręgowców gospodarza na infekcję.

Streszczenie

Wprowadzenie

Leiszmaniozy są powszechnymi na całym świecie pasożytniczymi chorobami zakaźnymi, stanowiącymi poważne wyzwanie w krajach rozwijających się i są uznawane przez Światową Organizację Zdrowia za jedną z najważniejszych zaniedbanych chorób tropikalnych1,2. Leiszmaniozy charakteryzują się objawami skórnymi, śluzówkowymi i/lub trzewnymi. Leiszmanioza skórna jest zwykle wywoływana przez L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica i L. aethiopica3. Ta forma choroby często leczy się samoistnie u ludzi ze względu na indukcję ochronnej komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Jednak komórkowa odpowiedź immunologiczna może się nie powieść, a choroba może rozwinąć się w rozsianą leiszmaniozę skórną4,5. Nie ma dostępnej szczepionki ze względu na różnorodność gatunków Leishmania i tła genetycznego gospodarza6,7. Możliwości leczenia są również ograniczone, ponieważ większość obecnie dostępnych leków jest droga, toksyczna i/lub może wymagać długotrwałego leczenia8,9. Poza tym pojawiły się doniesienia o lekooporności na dostępne metody leczenia10,11.

Czynnikiem wywołującym leiszmaniozy jest pasożyt pierwotniaka Leishmania. Pasożyt w swoim cyklu życiowym prezentuje dwie różne formy morfologiczne: promastigotes, wiciową formę występującą u muszek piaskowych; i amastigoty, forma wewnątrzkomórkowa znajdująca się w parazytoforycznych wakuolach makrofagów gospodarza ssaków12,13. Zdolność amastigotów do inwazji, przetrwania i replikacji pomimo mechanizmów obronnych makrofagów gospodarza kręgowców jest przedmiotem wielu badań14,15,16,17. W związku z tym kilka grup badawczych opisało testy infekcji makrofagami in vitro, aby ocenić wpływ określonych czynników środowiskowych, a także genów pasożytów i gospodarzy na zakaźność pasożytów. Test ten ma kilka zalet, takich jak możliwość dostosowania badań do formatu o wysokiej przepustowości, stosunkowo krótszy czas oczekiwania na wyniki oraz zmniejszona liczba zwierząt laboratoryjnych uśmiercanych18. Jednak wyniki testów in vitro są ograniczone, ponieważ nie zawsze powtarzają one badania in vivo14,19,20,21. Testy in vivo zapewniają ogólnoustrojowy fizjologiczny przegląd interakcji gospodarz-pasożyt, którego nie można w pełni naśladować za pomocą testów in vitro. Na przykład, badania immunologiczne można przeprowadzić za pomocą testów immunohistochemicznych z pobranych skrawków tkanki opuszki stopy lub nawet z węzłów chłonnych podkolanowych w celu analizy odzyskanych komórek odpornościowych22.

Zwierzęta są często używane jako model chorób ludzkich w badaniach biologicznych i biomedycznych, aby lepiej zrozumieć fizjologiczne mechanizmy leżące u podstaw chorób23. W przypadku leiszmaniozy droga, miejsce lub dawka szczepienia wpływają na wynik choroby24,25,26,27. Co więcej, podatność i odporność na infekcję u ludzi i myszy są silnie regulowane przez podłoże genetyczne gospodarza i pasożyta4,5,22,28,29,30,31. Myszy BALB/c są bardzo podatne na zakażenie skóry L. amazonensis, wykazując szybki postęp choroby z rozprzestrzenianiem się pasożytów do węzłów chłonnych, śledziony i wątroby32. Ponieważ choroba może przekształcić się w przerzuty skórne, infekcja może być śmiertelna. W przeciwieństwie do tego, myszy C57BL/6 często rozwijają przewlekłe zmiany z trwałym obciążeniem pasożytami w testach infekcji L. amazonensis33. W związku z tym zakażenie L. amazonensis tym konkretnym gatunkiem myszy zostało uznane za doskonały model do badania przewlekłych postaci leiszmaniozy skórnej u ludzi, ponieważ naśladuje postęp choroby lepiej niż model infekcji myszy BALB/c5,34.

Dlatego proponujemy, że mysia infekcja in vivo jest użyteczną metodą do badań fizjologicznych nad wirulencją Leishmania mającą zastosowanie do chorób ludzkich, pozwalając na systemowe spojrzenie na interakcję gospodarz-pasożyt. Wracając do dobrze ugruntowanych testów22, przedstawiamy tutaj skompilowany protokół krok po kroku zakażenia in vivo myszy C57BL/6 L. amazonensis, który obejmuje różnicowanie pasożytów na aksendyjskie amastigoty, szczepienie skórne opuszki stopy myszy, rozwój zmian i określanie obciążenia pasożytami. Protokół ten można dostosować do innych szczepów myszy i gatunków Leishmania, które powodują leiszmaniozy skórne. Podsumowując, przedstawiona tutaj metoda ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji nowych celów leków i szczepionek przeciwko Leishmanii, a także w badaniach fizjologicznych odpowiedzi immunologicznej i metabolicznej gospodarza na zakażenie Leishmania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Instytucie Nauk Biologicznych Uniwersytetu w São Paulo (CEUA 342/2019) i zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami i zasadami opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych stanu São Paulo (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) oraz rządu brazylijskiego (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Wszystkie czynności opisane w rozdziałach 1-5 należy wykonywać aseptycznie w komorach o przepływie laminarnym. Podczas pracy z żywymi pasożytami Leishmania należy stosować środki ochrony osobistej.

1. In Vitro Różnicowanie L. amazonensis Promastigotes na Axenic Amastigotes15,20,35,36,37,38

UWAGA: Pasożyt L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La) został użyty w tym teście. W zależności od celu badania, zakaźną formę pasożyta można uzyskać albo przez oczyszczenie postaci metacyklicznej za pomocą gradientu gęstości, jak opisano wcześniej14, albo przez różnicowanie promastigotów w aksendyjskie amastigoty, zgodnie z poniższym protokołem.

  1. Hodować La promastigotes w 25 cm 2-komórkowej kolbie hodowlanej zawierającej 10 ml pożywki dla promastigotów (pro-pożywki) (pH = 7,0).
  2. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 3 dni.
    UWAGA: Użyj kultur promastynów, które były pasażowane in vitro mniej niż 10 razy, aby uniknąć utraty zjadliwości i zmian aneuploidii pasożytów39,40,41,42,43,44.
  3. Odpipetować 5 ml logarytmicznej kultury promastigotów w fazie wzrostu do nowej kolby o średnicy 25cm2.
  4. Dodać 5 ml pożywki dla aksenów amastigotów (ama-pożywka) (pH = 5,2).
  5. Inkubować w temperaturze 34 °C przez 3-4 dni.
  6. Podzielić kulturę, rozcieńczając pożywką ama-medium w stosunku 1:3 do nowej kolby o średnicy 25cm2.
  7. Inkubować w temperaturze 34 °C przez 3-5 dni.
    UWAGA: Inkubuj aksseniczne amastigoty przez okres do 5 dni, ponieważ oznacza to koniec dojrzewania37.

2. C57BL/6 Zakażenie opuszki stopy L. amazonensis

UWAGA: Samice myszy C57BL/6 (w wieku 6-8 tygodni) zostały pozyskane i utrzymywane w Centrum Zwierząt Instytutu Nauk Biomedycznych Uniwersytetu w São Paulo. Zwierzęta otrzymywały pożywienie i wodę ad libitum.

  1. Policz kulturę akskonów amastigotów, przenosząc podwielokrotność zawiesiny pasożyta rozcieńczonej w PBS do komory Neubauera (tj. hemocytometru). Policz niewiciowe pasożyty, które reprezentują formy amastigotes.
    UWAGA: Alternatywnie, błękit trypanowy (1:1) może być użyty do zliczenia liczby żywotnych amastigotów (tj. tych, które nie są barwione błękitem trypanowym).
  2. Rozcieńczyć amestigoty akseniczne w PBS zgodnie z pożądaną dawką inokulum i zamierzoną liczbą inokulum (zaleca się 1 x 106 aksenicznych amastigotów w 50 μl PBS).
  3. Załadować strzykawkę tuberkulinową igłą 27 G z przygotowaną zawiesiną pasożytów.
  4. Znieczulenie myszy C57BL/6 za pomocą 3-5% izofluranu, zgodnie z zaleceniami Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa45. Oceń głębokość znieczulenia, testując reakcję myszy na uszczypnięcie palca u nogi.
  5. Zaszczepić 50 μl homogenizowanej zawiesiny pasożyta (1 x 106 aksenicznych amastigotów lub pożądana dawka inokulum) w tkance podpodeszwowej lewej tylnej poduszki stopy, używając uprzednio załadowanej strzykawki tuberkulinowej (krok 2.3).

3. Rozwój uszkodzeń opuszki stopy myszy

  1. Mierz postęp zmiany raz w tygodniu, mierząc grubość lewej (zainfekowanej) i prawej (niezainfekowanej) opuszki stopy za pomocą suwmiarki.
  2. Oblicz różnicę grubości między lewą i prawą tylną poduszką stopy co tydzień, aby ocenić postęp zmiany.
  3. Wykreślić obliczone różnice na osi Y i czas infekcji na osi X i obliczyć istotność statystyczną.
    UWAGA: Zgodnie z zaleceniami Komisji ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania, zwierzęta muszą zostać uśmiercone, zanim zakażona zmiana ulegnie owrzodzeniu, ponieważ owrzodzenia skóry mogą prowadzić do wtórnego zakażenia. Jak pokazano na rysunku uzupełniającym 1, potrzeba około 10 tygodni, aby zmiany wykazywały oznaki owrzodzenia po dawce pasożyta (106 aksenicznych amastigotów) i szczepu gospodarza (C57BL/6) zastosowanej w tym protokole. Myszy należy poświęcić w celu usunięcia zmiany chorobowej, zanim zaobserwuje się oznaki owrzodzenia.

4. Usuwanie uszkodzeń opuszki stopy myszy i rozcieńczanie ograniczające pasożyty

  1. Przygotuj 96-dołkową płytkę (płaskie dno) do testu rozcieńczenia granicznego46,47, dodając 180 μl pro-pożywki do wszystkich studzienek.
    UWAGA: Użyj czterech pasów płytki (połowa płytki) dla każdego zwierzęcia, reprezentujących poczwórne testy (tj. zwierzę 1 = pasy A-D; zwierzę 2 = pasy E-H).
  2. Dodać 1 ml pro-pożywki do szklanej probówki do rozdrabniania tkanek na zmianę i zważyć probówkę.
    UWAGA: Probówka musi być sterylna, więc użyj sterylnej pokrywki i zważ probówkę z zamkniętą pokrywką, jeśli waży się poza komorą z przepływem laminarnym.
  3. Zwierzę należy złożyć w ofierze w komorze CO2 , postępując zgodnie z zaleceniami Komisji ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania. Zdezynfekuj zwierzę, spryskując je 70% etanolem.
  4. Wytnij stopę zwierzęcia na piętach, aby usunąć zainfekowaną poduszkę stopy i spryskaj ją 70% etanolem w celu dezynfekcji. Zapewnij sterylizację nożyczek i kleszczy, trzymając je namoczone w 70% etanolu.
  5. Umieść zainfekowaną opuszkę stopy na sterylnej szalce Petriego i przeprowadź sekcję za pomocą sterylnych kleszczy i skalpela, aby zebrać wszystkie tkanki miękkie. Wyrzuć kości.
    UWAGA: Zaleca się jednorodność na etapie sekcji, aby uniknąć tendencyjnego odzyskiwania tkanki.
  6. Przenieś zebrane tkanki do szklanej probówki do mielenia tkanek za pomocą pro-medium, a następnie ponownie zważyć probówkę, aby określić masę zmiany.
    UWAGA: Unikaj umieszczania kleszczy i skalpela bezpośrednio w podłożu, ponieważ małe objętości mogą zostać usunięte, co spowoduje niedoszacowanie masy tkanki. Masę zmiany oblicza się poprzez odjęcie masy probówki zawierającej pro-pożywkę z pobraną tkanką od masy probówki zawierającej tylko pro-pożywkę.
  7. Homogenizuj tkankę 10 razy za pomocą młynka, aby całkowicie rozbić tkankę.
  8. Pozostawić mieszaninę do osadzenia się na 10 minut, a następnie zebrać 20 μl supernatantu.
  9. Załadować 20 μl supernatantu do pierwszej kolumny 1. pasa 96-dołkowej płytki przygotowanej w kroku 4.1. Powtórz to dla następnych trzech pasów, aby uzyskać poczwórne duplikaty dla każdego zwierzęcia (tj. dla zwierzęcia 1 dodaj 20 μl do każdego dołka i oznacz A1, B1, C1 i D1).
  10. Homogenizować każdą studzienkę w 1. kolumnie 10x za pomocą pipety wielokanałowej. Następnie przenieść 20 μl rozcieńczonych próbek z 1. kolumny do 2. kolumny.
    UWAGA: Ważne jest, aby homogenizować każdą studzienkę 10x z jednej kolumny do drugiej.
  11. Powtórzyć krok 4.10 dla wszystkich pozostałych kolumn aż do ostatniej kolumny (12-tej) i wyrzucić ostatnie 20 μl rozcieńczonej próbki.
    UWAGA: Wymieniaj końcówki po każdym rozcieńczeniu, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
  12. Uszczelnić płytki folią i inkubować w temperaturze 25 °C przez 7 dni w wilgotnej komorze.

5. Określanie obciążenia pasożytami zmian chorobowych

  1. Przeanalizuj płytki po 7 dniach inkubacji za pomocą odwróconego mikroskopu, aby określić ostatnią studzienkę zawierającą pasożyty dla każdego pasa.
    UWAGA: Możliwe jest również wskazanie wzrostu pasożytów lub gęstości komórek poprzez wizualną analizę zmian koloru i zmętnienia pożywki.
  2. Obliczyć obciążenie tkanką pasożyta dla każdego pasa, dzieląc współczynnik rozcieńczenia na masę zmiany.
    UWAGA: Na określonym torze, jeśli pasożyty są obecne tylko w kolumnach 1-5 (tj. studzienki A1-A5 są dodatnie dla wzrostu pasożyta), oznacza to, że kolumna 5 zawierała tylko 1 pasożyta, kolumna 4 zawierała 10 pasożytów i tak dalej, w wielokrotnościach dziesięciu. Kolumna 1 zawierałaby 104 pasożytów, co odpowiada liczbie pasożytów w początkowych 20 μl supernatantu (nierozcieńczona próbka w kroku 4.7). Ponieważ te 20 μl rozcieńczono 180 μl pro-pożywki, początkowa probówka zawierała 5 x 105 pasożytów: (1 x 104) / (0,02 ml) = 5 x 105 pasożytów/1 ml. Następnie obciążenie pasożytem w tej zmianie można obliczyć, dzieląc początkowe stężenie pasożyta przez masę zmiany: (5 x 105) / masę zmiany (patrz krok 4.6).
  3. Wykreślić średnią z poczwórnego wyniku dla każdego zwierzęcia za pomocą logarytmicznej skali Y.

6. Analiza statystyczna

  1. Należy przedstawić dane jako średnią ± odchyleniem standardowym, wykorzystując co najmniej pięć zwierząt na grupę doświadczalną jako kontrpróby.
  2. Przeprowadź analizę statystyczną przy użyciu niesparowanego testu dwustronnego, uznając wartość p < 0,05 za istotną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Leishmania, pierwotniaki pasożytnicze, występują w dwóch formach rozwojowych podczas swojego cyklu życiowego u gospodarzy bezkręgowców i kręgowców: promastygotach, formach proliferacyjnych znajdujących się w świetle jelita samicy muchówki z rodzaju Phlebotomus; oraz amastygotach, formach proliferacyjnych znajdujących się w wakuolach pasożytniczych komórek gospodarza ssaka. Promastygoty mają wydłużony kształt o szerokości około 1,5 µm i długości 20 µm, z wicią zazwyczaj wychodzącą...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Test zakażenia in vivo opisany w tym protokole pozwala każdemu badaczowi ocenić leiszmaniozę skórną in vivo, biorąc pod uwagę interakcję gospodarz-pasożyt w scenariuszu ogólnoustrojowym. Testy te były używane przez wiele grup 22,24,27,29,31,32,34,49, a tutaj opracowaliśmy protokół krok po kroku, aby ustandaryzować tę metodę, biorąc pod uwagę ograniczenia infrastrukturalne, które mogą mieć niektóre grupy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Prof. Dr. Nielsowi Olsenowi Saraivie Câmara z Centrum Zwierząt Instytutu Nauk Biomedycznych Uniwersytetu w São Paulo za wsparcie oraz Prof. Dr. Silvii Reni Uliana za dostarczenie szlifierki do szklanych chusteczek. Prace te były wspierane przez Fundację Badawczą Sao Paulo (FAPESP - grant MFLS 2017/23933-3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 96-dołkowaGreiner bio-ne655180Płytka z płaskim dnem do oznaczania granicznego rozcieńczania
adeninaSigmaA8626Suplement dodany do pożywki do hodowli komórkowych M199
suwmiarkaMitutoyo700-118-20Suwmiarka do pomiaru grubości
kolby do hodowli komórkowychCorning353014Kolba do hodowli komórkowych o objętości 25 cm2 do hodowli pasożytów Leishmania
Wirówka Eppendorf5804RUrządzenie służące do rozdzielania próbek na podstawie ich gęstości
Inkubator CO2 34 ° CThermo Scientific3110Inkubator do różnicowania amastigotów
etanoluMerckK50237083820Środek dezynfekujący do przedmiotów ogólnych
płodowa surowica bydlęcaGibco12657-029Suplement dodany do pożywki do hodowli komórkowych M199
szklana rurka do mielenia tkanekThomas Scientific3431 E04Probówka do zbierania i niszczenia zainfekowanej tkanki
opuszki stopyglukozaSynthG1008.01.AHSuplement dodany do pożywki do hodowli komórkowych M199
Oprogramowanie GraphPad PrismGraphPadOprogramowanie służące do wykreślania danych i obliczania istotności statystycznej
heminSigmaH-2250Suplement dodany do pożywki do hodowli komórkowych M199
HEPESPromegaH5303pożywek do hodowli komórkowych M199
25 ° CFanem347CDInkubator do hodowli promastigot,
mikroskop odwrócony,NikonTMSSprzęt służący do wizualnej analizy kultur promastigotów i amastigotów
izofluranŚrodek wziewny znieczulający dla myszy (3-5%)
komora z przepływem laminarnymVecoVLFS-09Szafa bezpieczeństwa biologicznego używana do aseptycznego obszaru roboczego Komórka
M199 pożywki hodowlaneGibco31100-035Pożywka do hodowli komórkowych do mikrowirówki do hodowli Leishmania
AxygenMCT150CMikroprobówka służąca do pobierania, przetwarzania i przechowywania próbek
Pipeta wielokanałowaLabsystemsF61978Pipeta wielokanałowa służąca do oznaczania granicznego rozcieńczenia
NaHCO3Merck6329Suplement dodany do pożywki do hodowli komórkowych M199
NaOHSigma S8045Suplement dodany do pożywki do hodowli komórkowych M199
Komora NeubaueraHBG2266Hemocytometr do zliczania zawiesiny pasożytów
mikroskop optycznyNikonE200Sprzęt optyczny używany do liczenia
parafilmuBemis349Elastyczne i odporne tworzywo sztuczne do uszczelniania
penicylina płytkowa/streptomycynaGibco15140122 Suplement dodawany do pożywki do hodowli komórkowych M199
Szalki PetriegoTPP93100Sterylne naczynie do preparowania tkanek opuszki stopy
Zestaw do pipetowaniaGilsonF167360Zestaw do mikropipet zawierający cztery pipety (P2, P20, P200, P1000)
QuimisBG2000Sprzęt służący do ważenia pobranej podkładki pod stopy skalpel do zmian chorobowych
Solidor10237580026Skalpel do cięcia i pobierania tkanek opuszki stopy
pipeta serologiczna 10 mlNest327001Sterylna pipeta służąca do przenoszenia końcówek o objętościach mililitrowych
AxygenKońcówka do pipet służąca do przenoszenia objętości mikrolitrów
Trypan niebieskiGibco15250-061Barwnik używany do liczenia żywotnych pasożytów
tryptyka peptonMerckdodany do pożywki tuberkulinowej M199 pożywki
tuberkulinowejBD305945Strzykawka z igłą 27G do inokulacji zawiesiny pasożyta
Suplement dodany do inkubatora pasożyta tkanek Suplement

Bibliografia

  1. Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PloS One. 7 (5), e35671(2012).
  2. Ashford, R. W. The leishmaniases as emerging and reemerging zoonoses. International Journal for Parasitololy. 30 (12-13), 1269-1281 (2000).
  3. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  4. Scorza, B. M., Carvalho, E. M., Wilson, M. E. Cutaneous Manifestations of Human and Murine Leishmaniasis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), e1296(2017).
  5. Afonso, L. C., Scott, P. Immune responses associated with susceptibility of C57BL/10 mice to Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 61 (7), 2952-2959 (1993).
  6. Khamesipour, A., Rafati, S., Davoudi, N., Maboudi, F., Modabber, F. Leishmaniasis vaccine candidates for development: a global overview. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 423-438 (2006).
  7. Kumar, R., Engwerda, C. Vaccines to prevent leishmaniasis. Clinical & Translational Immunology. 3 (3), e13(2014).
  8. Murray, H. W., Berman, J. D., Davies, C. R., Saravia, N. G. Advances in leishmaniasis. Lancet. 366 (9496), 1561-1577 (2005).
  9. Hotez, P. J., Bottazzi, M. E., Franco-Paredes, C., Ault, S. K., Periago, M. R. The neglected tropical diseases of Latin America and the Caribbean: a review of disease burden and distribution and a roadmap for control and elimination. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2 (9), e300(2008).
  10. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clinical Microbiology Reviews. 19 (1), 111-126 (2006).
  11. Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052(2017).
  12. Teixeira, D. E., et al. The cell biology of Leishmania: how to teach using animations. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003594(2013).
  13. Sunter, J., Gull, K. Shape, form, function and Leishmania pathogenicity: from textbook descriptions to biological understanding. Open Biology Journal. 7 (9), 170165(2017).
  14. Laranjeira-Silva, M. F., et al. A MFS-like plasma membrane transporter required for Leishmania virulence protects the parasites from iron toxicity. PLoS Pathogens. 14 (6), e1007140(2018).
  15. Aoki, J. I., et al. L-arginine availability and arginase activity: Characterization of amino acid permease 3 in Leishmania amazonensis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006025(2017).
  16. Probst, C. M., et al. A comparison of two distinct murine macrophage gene expression profiles in response to Leishmania amazonensis infection. BMC Microbiology. 12, 22(2012).
  17. Dillon, L. A., et al. Simultaneous transcriptional profiling of Leishmania major and its murine macrophage host cell reveals insights into host-pathogen interactions. BMC Genomics. 16, 1108(2015).
  18. Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. Journal of Visualized Experiments. (133), e57486(2018).
  19. Mittra, B., Laranjeira-Silva, M. F., Miguel, D. C., Perrone Bezerra de Menezes, J., Andrews, N. W. The iron-dependent mitochondrial superoxide dismutase SODA promotes. The Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12324-12338 (2017).
  20. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 ferric iron reductase of Leishmania amazonensis is essential for the generation of infective parasite forms. The Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  21. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PloS One. 7 (3), e34022(2012).
  22. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Current Protocols in Immunology. , (1998).
  23. Andersen, M. L., Winter, L. M. F. Animal models in biological and biomedical research - experimental and ethical concerns. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91, e20170238(2019).
  24. Ribeiro-Gomes, F. L., et al. Site-dependent recruitment of inflammatory cells determines the effective dose of Leishmania major. Infection and Immunity. 82 (7), 2713-2727 (2014).
  25. Mahmoudzadeh-Niknam, H., Khalili, G., Abrishami, F., Najafy, A., Khaze, V. The route of Leishmania tropica infection determines disease outcome and protection against Leishmania major in BALB/c mice. The Korean Journal of Parasitology. 51 (1), 69-74 (2013).
  26. Oliveira, D. M., et al. Evaluation of parasitological and immunological parameters of Leishmania chagasi infection in BALB/c mice using different doses and routes of inoculation of parasites. Parasitology Research. 110 (3), 1277-1285 (2012).
  27. Côrtes, D. F., et al. Low and high-dose intradermal infection with Leishmania major and Leishmania amazonensis in C57BL/6 mice. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 105 (6), 736-745 (2010).
  28. Blackwell, J. M., et al. Genetics and visceral leishmaniasis: of mice and man. Parasite Immunology. 31 (5), 254-266 (2009).
  29. Loeuillet, C., Bañuls, A. L., Hide, M. Study of Leishmania pathogenesis in mice: experimental considerations. Parasites & Vectors. 9, 144(2016).
  30. Alexander, J., Brombacher, F. T Helper1/T Helper2 Cells and Resistance/Susceptibility to Leishmania Infection: Is This Paradigm Still Relevant? Frontiers in Immunology. 3, 80(2012).
  31. Sacks, D., Noben-Trauth, N. The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania major in mice. Nature Reviews Immunology. 2 (11), 845-858 (2002).
  32. Bogdan, C., et al. Experimental Cutaneous Leishmaniasis: Mouse Models for Resolution of Inflammation Versus Chronicity of Disease. Methods in Molecular Biology. 1971, 315-349 (2019).
  33. Jones, D. E., Ackermann, M. R., Wille, U., Hunter, C. A., Scott, P. Early enhanced Th1 response after Leishmania amazonensis infection of C57BL/6 interleukin-10-deficient mice does not lead to resolution of infection. Infection and Immunity. 70 (4), 2151-2158 (2002).
  34. Velasquez, L. G., et al. Distinct courses of infection with Leishmania (L.) amazonensis are observed in BALB/c, BALB/c nude and C57BL/6 mice. Parasitology. 143 (6), 692-703 (2016).
  35. de Menezes, J. P., et al. Leishmania infection inhibits macrophage motility by altering F-actin dynamics and the expression of adhesion complex proteins. Cellular Microbiology. 19 (3), 1266(2017).
  36. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005340(2016).
  37. Zilberstein, D., Nitzan Koren, R. Host-Free Systems for Differentiation of Axenic Leishmania. Methods in Molecular Biology. 1971, 1-8 (2019).
  38. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annual Review of Microbiology. 48, 449-470 (1994).
  39. Dumetz, F., et al. Modulation of Aneuploidy in Leishmania donovani during adaptation to different in vitro and in vivo environments and its impact on gene expression. MBio. 8 (3), e00599-e00517 (2017).
  40. Sinha, R., et al. Genome Plasticity in Cultured Leishmania donovani: Comparison of Early and Late Passages. Frontiers in Microbiology. 9, 1279(2018).
  41. Magalhães, R. D., et al. Identification of differentially expressed proteins from Leishmania amazonensis associated with the loss of virulence of the parasites. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (4), e2764(2014).
  42. Lei, S. M., Romine, N. M., Beetham, J. K. Population changes in Leishmania chagasi promastigote developmental stages due to serial passage. Journal of Parasitology. 96 (6), 1134-1138 (2010).
  43. Ali, K. S., Rees, R. C., Terrell-Nield, C., Ali, S. A. Virulence loss and amastigote transformation failure determine host cell responses to Leishmania mexicana. Parasite Immunology. 35 (12), 441-456 (2013).
  44. Rebello, K. M., et al. Leishmania (Viannia) braziliensis: influence of successive in vitro cultivation on the expression of promastigote proteinases. Experimental Parasitology. 126 (4), 570-576 (2010).
  45. Johns Hopkins Animal Care and Use Program. , The Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee. http://web.jhu.edu/animalcare/index.html (2019).
  46. Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunology. 7 (5), 545-555 (1985).
  47. Lima, H. C., Bleyenberg, J. A., Titus, R. G. A simple method for quantifying Leishmania in tissues of infected animals. Parasitology Today. 13 (2), 80-82 (1997).
  48. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (1997).
  49. Sacks, D., Kamhawi, S. Molecular aspects of parasite-vector and vector-host interactions in leishmaniasis. Annual Review of Microbiology. 55, 453-483 (2001).
  50. Reimão, J. Q., et al. Parasite burden in Leishmania (Leishmania) amazonensis-infected mice: validation of luciferase as a quantitative tool. Journal of Microbiological Methods. 93 (2), 95-101 (2013).
  51. Buckley, S. M., et al. In vivo bioimaging with tissue-specific transcription factor activated luciferase reporters. Scientific Reports. 5, 11842(2015).
  52. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. Journal of Visualized Experiments. (41), e1980(2010).
  53. Roberts, S. C., et al. Arginase plays a pivotal role in polyamine precursor metabolism in Leishmania. Characterization of gene deletion mutants. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23668-23678 (2004).
  54. Boitz, J. M., et al. Arginase Is Essential for Survival of Leishmania donovani Promastigotes but Not Intracellular Amastigotes. Infection and Immunity. 85 (1), e00554(2017).
  55. Rosas, L. E., et al. Genetic background influences immune responses and disease outcome of cutaneous L. mexicana infection in mice. International Immunology. 17 (10), 1347-1357 (2005).
  56. Belkaid, Y., et al. Development of a natural model of cutaneous leishmaniasis: powerful effects of vector saliva and saliva preexposure on the long-term outcome of Leishmania major infection in the mouse ear dermis. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1941-1953 (1998).
  57. Titus, R. G., Ribeiro, J. M. Salivary gland lysates from the sand fly Lutzomyia longipalpis enhance Leishmania infectivity. Science. 239 (4845), 1306-1308 (1988).
  58. Lima, H. C., Titus, R. G. Effects of sand fly vector saliva on development of cutaneous lesions and the immune response to Leishmania braziliensis in BALB/c mice. Infection and Immunity. 64 (12), 5442-5445 (1996).
  59. Theodos, C. M., Ribeiro, J. M., Titus, R. G. Analysis of enhancing effect of sand fly saliva on Leishmania infection in mice. Infection and Immunity. 59 (5), 1592-1598 (1991).
  60. Kaur, S., et al. Effect of dose and route of inoculation on the generation of CD4+ Th1/Th2 type of immune response in murine visceral leishmaniasis. Parasitology Research. 103 (6), 1413-1419 (2008).
  61. Rolão, N., Melo, C., Campino, L. Influence of the inoculation route in BALB/c mice infected by Leishmania infantum. Acta Tropica. 90 (1), 123-126 (2004).
  62. Kébaïer, C., Louzir, H., Chenik, M., Ben Salah, A., Dellagi, K. Heterogeneity of wild Leishmania major isolates in experimental murine pathogenicity and specific immune response. Infection and Immunity. 69 (8), 4906-4915 (2001).
  63. Baldwin, T. M., Elso, C., Curtis, J., Buckingham, L., Handman, E. The site of Leishmania major infection determines disease severity and immune responses. Infection and Immunity. 71 (12), 6830-6834 (2003).
  64. Aoki, J. I., et al. RNA-seq transcriptional profiling of Leishmania amazonensis reveals an arginase-dependent gene expression regulation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006026(2017).
  65. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. International Journal for Parasitology. 35 (7), 757-764 (2005).
  66. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Experimental Parasitology. 99 (2), 97-103 (2001).
  67. Aoki, J. I., Laranjeira-Silva, M. F., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M. The impact of arginase activity on virulence factors of Leishmania amazonensis. Current Opinion in Microbiology. 52, 110-115 (2019).
  68. Jackson, A. P. The evolution of amastin surface glycoproteins in trypanosomatid parasites. Molecular Biology and Evolution. 27 (1), 33-45 (2010).
  69. Rochette, A., et al. Characterization and developmental gene regulation of a large gene family encoding amastin surface proteins in Leishmania spp. Molecular and Biochemical Parasitology. 140 (2), 205-220 (2005).
  70. Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
  71. Schneider, P., Rosat, J. P., Bouvier, J., Louis, J., Bordier, C. Leishmania major: differential regulation of the surface metalloprotease in amastigote and promastigote stages. Experimental Parasitology. 75 (2), 196-206 (1992).
  72. Ji, J., Sun, J., Qi, H., Soong, L. Analysis of T helper cell responses during infection with Leishmania amazonensis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 66 (4), 338-345 (2002).
  73. Ji, J., Sun, J., Soong, L. Impaired expression of inflammatory cytokines and chemokines at early stages of infection with Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 71 (8), 4278-4288 (2003).
  74. Felizardo, T. C., Toma, L. S., Borges, N. B., Lima, G. M., Abrahamsohn, I. A. Leishmania (Leishmania) amazonensis infection and dissemination in mice inoculated with stationary-phase or with purified metacyclic promastigotes. Parasitology. 134 (12), 1699-1707 (2007).
  75. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M., Markus, R. P. Melatonin attenuates Leishmania (L.) amazonensis infection by modulating arginine metabolism. Journal of Pineal Research. 59 (4), 478-487 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

poduszka stopy myszyskórna leiszmaniozaprogresja zmianyoznaczenie ładunku pasożytówamastygoty akseniczneinokulacja podplantarnatest rozcieńczeń ograniczających
Zakażenie in vivo Leishmania amazonensis w celu oceny zjadliwości pasożyta u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.