Badania przesiewowe w kierunku inhibitorów pirofosfatazy związanych z błoną Thermotoga maritima

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę przesiewową dla inhibitorów pirofosfatazy związanej z błoną (z Thermotoga maritima) opartą na reakcji błękitu molibdenowego w formacie płytki 96-dołkowej.

Streszczenie

Pirofosfatazy związane z błoną (mPPazy) to dimeryczne enzymy, które występują w bakteriach, archeonach, roślinach i pasożytach protistów. Białka te rozszczepiają pirofosforan na dwie cząsteczki ortofosforanu, które są sprzężone z protonem i/lub jonami sodu pompowanymi przez błonę. Ponieważ u zwierząt i ludzi nie występują białka homologiczne, mPPazy są dobrymi kandydatami do projektowania potencjalnych celów leków. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół badań przesiewowych w kierunku inhibitorów mPPazy wykorzystujących reakcję błękitu molibdenowego w systemie 96-dołkowym. Jako enzym modelowy używamy mPPazy z ciepłolubnej bakterii Thermotoga maritima (TmPPaza). Ten protokół jest prosty i niedrogi, zapewniając spójny i solidny wynik. Wypełnienie protokołu oznaczania aktywności zajmuje tylko około jednej godziny od rozpoczęcia testu do pomiaru absorbancji. Ponieważ niebieski kolor uzyskany w tym teście jest stabilny przez długi czas, kolejne testy można przeprowadzić natychmiast po poprzedniej partii, a absorbancję można zmierzyć później dla wszystkich partii jednocześnie. Wadą tego protokołu jest to, że jest on wykonywany ręcznie, a zatem może być wyczerpujący, a także wymagać dobrych umiejętności pipetowania i pomiaru czasu. Ponadto roztwór cytrynianu arsenitu stosowany w tym teście zawiera arsenin sodu, który jest toksyczny i należy obchodzić się z nim z zachowaniem niezbędnych środków ostrożności.

Wprowadzenie

Około 25% wszystkich białek komórkowych to białka błonowe, a około 60% z nich to cele leków^1,2. Jednym z potencjalnych celów leków³, pirofosfatazy związane z błoną (mPPazy), to dimeryczne enzymy, które pompują proton i/lub jon sodu przez błonę poprzez hydrolizę pirofosforanu do dwóch ortofosforanów⁴. MPPazy można znaleźć w różnych organizmach⁵, takich jak bakterie, archeony, rośliny i pasożyty protistów, z wyjątkiem ludzi i zwierząt⁴. U pasożytów protistów, na przykład Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii i Trypanosoma brucei, mPPazy są niezbędne dla zjadliwości pasożytów⁶, a nokaut tego wyrażenia u pasożytów prowadzi do niepowodzenia w utrzymaniu wewnątrzkomórkowego pH po ekspozycji na zewnętrzne podstawowe pH ⁷. Ze względu na ich znaczenie i brak homologicznego białka obecnego u kręgowców, mPPazy mogą być uważane za potencjalne cele leków na choroby protistalne³.

Badania in vitro inhibitorów mPPazy w tej pracy opierają się na systemie modelowym TmPPazy. TmPPaza jest pompującą jonami sodu i zależną od jonów potasu mPPazą z T. maritima i ma optymalną aktywność w temperaturze 71 °C⁸. Zaletami tego enzymu są na przykład łatwość produkcji i oczyszczania, dobra stabilność termiczna i wysoka aktywność właściwa. TmPPaza wykazuje zarówno wysokie podobieństwo, jak i pełne zachowanie pozycji, jak i identyczność wszystkich reszt katalitycznych do protistycznych mPPaz^3,9 oraz do rozwiązanej struktury Vigna radiata¹⁰ mPPase. Dostępne struktury TmPPazy w różnych konformacjach są również przydatne w eksperymentach z projektowaniem leków w oparciu o strukturę (jako wirtualne badania przesiewowe i projektowanie de novo).

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół badań przesiewowych inhibitorów TmPPazy w formacie płytki 96-dołkowej (Rysunek 1). Protokół opiera się na metodzie kolorymetrycznej reakcji błękitu molibdenowego, która została po raz pierwszy opracowana przez Fiske i Subbarow¹¹. Metoda ta polega na wytworzeniu kwasu 12-fosfomolibdenowego z ortofosforanu i molibdenianu w warunkach kwaśnych, który następnie jest redukowany do uzyskania charakterystycznych gatunków fosfomolibdenu o niebieskim zabarwieniu¹².

Protokół

1. Przygotowanie białka

UWAGA: Ekspresja i oczyszczanie TmPPase zostały opisane w innej publikacji¹³.

1. Przygotować 10 mL roztworu buforu do reaktywacji zawierającego 20 mM kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) pH 6.5, 3,5% (v/v) glicerolu, 2 mM ditiotreitolu (DTT) oraz 0,05% dodecylomaltosydy (DDM).
2. Przygotować 10 mL mieszaniny reakcyjnej zawierającej 200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8,0 mM MgCl₂, 333 mM KCl i 67 mM NaCl.
   UWAGA: Mg²⁺ jest niezbędny do chelatowania pirofosforanu jako substratu mPPase, K⁺ jest wymagany do zwiększenia aktywności enzymatycznej, ponieważ TmPPase jest mPPase zależną od potasu, a Na⁺ jest potrzebny do aktywności enzymu podczas translokacji jonów sodu przez TmPPase.
3. Przygotować liposomy o stężeniu 30 mg/mL do reaktywacji enzymu.
   1. Dodać 10 mL 20 mM Tris-HCl pH 8.0 z 1 mM DTT do 0,3 g L-α-fosfatydylocholiny z soi w 10 mL 20 mM Tris-HCl pH 8.0 z 1 mM DTT.
   2. Umieścić liposomy w lodzie i poddać sonikacji z 1-sekundowymi impulsami przez 1 minutę, zrobić 1-minutową przerwę i powtarzać czynność, aż roztwór stanie się przezroczysty i żółty.
   3. Rozdzielić liposomy na alikwoty, zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
4. Zreaktywować enzym.
   1. Wymieszać 40 µL roztworu liposomów z 22,5 µL 20% DDM.
   2. Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 55 °C przez 15 min, a następnie pozwolić jej ostygnąć do temperatury pokojowej.
   3. Dodać 36,5 µL roztworu buforu do reaktywacji, wymieszać i dodać 1 µL stężonego białka (13 mg/mL), aby uzyskać całkowite stężenie 0,13 mg/mL.
      UWAGA: Białko jest zazwyczaj mrożone w alikwotach po 10 µL po oczyszczeniu i rozmrażane na lodzie przed użyciem.
5. Odlać 20 µL zreaktywowanego enzymu i dodać do 1 480 µL mieszaniny reakcyjnej, a następnie delikatnie wymieszać.
   UWAGA: Dodanie zreaktywowanego enzymu do mieszaniny reakcyjnej powinno zostać wykonane bezpośrednio przed użyciem.

2. Przygotowanie związku

1. Rozpuścić związki w dimetylosulfoksydzie (DMSO), aby przygotować roztwory zapasowe o stężeniu 25−100 mM w objętości 50−200 µL, zależnie od dostępności związków.
   UWAGA: Wszystkie użyte tutaj związki (Rysunek 2A) zostały opisane w poprzednich publikacjach⁹. Jeśli rozpuszczalność związku jest niska, stężenie zapasowe można odpowiednio dostosować.
2. Przygotować trzy różne stężenia każdego związku w wodzie.
   UWAGA: Końcowe stężenia w mieszaninie reakcyjnej wyniosą odpowiednio 1, 5 i 50 mikromol na litr dla związków dobrze rozpuszczalnych oraz 1, 5 i 20 mikromol na litr dla związków słabo rozpuszczalnych.
   1. Rozcieńczyć roztwór zapasowy wodą do 1 mL w mikroprowetkach, aby uzyskać stężenia 2 µM, 10 µM i 100 µM dla związków rozpuszczalnych lub alternatywnie 2 µM, 10 µM i 40 µM dla związków słabo rozpuszczalnych.
   2. Niezwłocznie po rozcieńczeniu roztworu zapasowego wymieszać roztwór związku za pomocą wortexa.
3. Sprawdzić obecność agregatów związków za pomocą nefelometru.
   UWAGA: Badanie przeprowadzono w trzech powtórzeniach dla trzech stężeń (1 µM, 5 µM i 20 µM) i znormalizowano względem próbki ślepej na płytce 96-dołkowej.
   1. Napełnić każdy dołek 75 µL mieszaniny reakcyjnej przy użyciu pipety wielokanałowej.
   2. Dodać 75 µL każdego związku (w przypadku próbki ślepej użyć 75 µL wody) i wymieszać, pipetując w górę i w dół 5×.
   3. Zmierzyć każdy dołek przy napięciu 300 V za pomocą mikropłytkowego nefelometru.

3. Odczynniki do przygotowania testu

1. Przygotowanie roztworu arsenitu-cytrynianu.
   1. Odważyć 5 g arsenitu sodu i 5 g cytrynianu trisodu dwuwodnika.
      OSTRZEŻENIE: Arsenit sodu jest toksyczny, dlatego należy stosować odpowiedni sprzęt ochronny i obchodzić się z nim ze szczególną ostrożnością. W ramach środków ostrożności nie należy go używać, dopóki wszystkie niezbędne zasady bezpieczeństwa nie zostaną przeczytane i zrozumiane. Pracować wyłącznie w dygestorium, aby uniknąć wdychania pyłów/oparów związku lub jego roztworów. W przypadku wdychania przenieść poszkodowanego na świeże powietrze i wezwać pomoc medyczną. Nosić odpowiednie gogle ochronne, rękawice i odzież ochronną, aby uniknąć połknięcia oraz kontaktu z oczami/skórą. W przypadku połknięcia natychmiast skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem. W przypadku kontaktu ze skórą lub oczami przemyć obficie wodą i wezwać pomoc medyczną.
   2. Rozpuścić w 100 mL wody.
   3. Dodać 5 mL lodowatego kwasu octowego, wymieszać i uzupełnić wodą do objętości 250 mL.
   4. Przechowywać w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
      UWAGA: Roztwór jest stabilny przez ponad rok.
2. Przygotowanie roztworu A i roztworu B.
   1. W celu przygotowania roztworu A dodać 10 mL lodowatego 0.5 M HCl do 0.3 g kwasu askorbinowego. Rozpuścić kwas askorbinowy za pomocą vortexu.
   2. W celu przygotowania roztworu B dodać 1 mL lodowatej wody do 70 mg heptamolibdanu amonu tetrahydratu i wymieszać na vortexie do rozpuszczenia.
      UWAGA: Oba roztwory należy przechowywać w lodzie do momentu użycia. Dla zachowania spójności wyników analizy oba roztwory można przechowywać w lodzie maksymalnie przez jeden tydzień.
3. Przygotowanie standardów fosforanowych (P_i) o stężeniach 0 µM, 62.5 µM, 250 µM i 500 µM do kalibracji.
   1. Dodać odpowiednio 0 µL, 25 µL, 50 µL i 100 µL 5 mM Na₂HPO₄ dwuwodnika do czterech mikroprobówek zawierających 370 µL mieszaniny reakcyjnej.
   2. Uzupełnić wodą do objętości 1 mL.

4. Analiza aktywności dla jednej płytki 96-dołkowej

UWAGA: Schematyczny przebieg analizy przedstawiono na Rysunku 1.

1. Do 10 mL roztworu A dodać 1 mL roztworu B, wymieszać za pomocą wortexa i przechowywać roztwór w lodzie.
   UWAGA: Roztwór ten powinien być przejrzysty i żółty. Roztwór A + B należy przechowywać w lodzie przez co najmniej 30 min przed użyciem. Należy jednak zużyć roztwór w ciągu 3 h, ponieważ ulegnie on degradacji po długotrwałym przechowywaniu.
2. Do pasków z probówkami nanieść w trzech powtórzeniach po 40 µL standardów P_i o stężeniach 0 µM, 62,5 µM, 250 µM i 500 µM, używając pipety wielokanałowej.
   UWAGA: Mieszanina reakcyjna bez dodatku P_i będzie służyć jako ślepa próba.
3. Do pasków z probówkami nanieść 25 µL roztworu związku za pomocą pipety wielokanałowej.
   UWAGA: Dla każdego związku zastosowano trzy różne stężenia w trzech powtórzeniach, co jest wystarczające do wstępnej oceny połowy stężenia hamującego maksymalnie (IC₅₀). Do dokładniejszego wyznaczenia IC₅₀ można użyć ośmiu różnych stężenia związku. W przypadku enzymu niehamowanego roztwór związku zastępuje się równą ilością wody. Jako kontrole pozytywne zastosowano sól sodową imidodifosforanu (IDP) w stężeniach 2,5 µM, 25 µM i 250 µM.
4. Do pasków z probówkami (z wyjątkiem tych zawierających standard P_i) nanieść 15 µL mieszaniny roztworu mPPase za pomocą pipety wielokanałowej.
5. Uszczelnić paski z probówkami za pomocą folii uszczelniającej. Odciąć folię, aby oddzielić poszczególne paski.
6. Próbki inkubować wstępnie przez 5 min w temperaturze 71 °C. Próbki umieszczać na bloku grzewczym w odstępach 20 s między poszczególnymi paskami, aby zminimalizować czas trwania kolejnych etapów.
7. Dla każdego paska usunąć folię uszczelniającą. Dodać 10 µL 2 mM pirofosforanu sodu dwuzasadowego za pomocą pipety wielokanałowej i wymieszać, pipetując w górę i w dół 5 razy. Ponownie uszczelnić pasek z probówkami tą samą folią.
   UWAGA: Ten etap może być początkowo trudny do wykonania w ciągu 20 s; stanie się on jednak łatwiejszy po przeprowadzeniu kilku analiz.
8. Inkubować w temperaturze 71 °C przez 5 min.
9. Próbki umieszczać na urządzeniu chłodzącym w odstępach 20 s między poszczególnymi paskami. Chłodzić przez 10 min, przy czym każdy pasek należy krótko odwirować po 5 min chłodzenia, aby odprowadzić krople wody pod folię uszczelniającą, następnie ponownie umieścić w urządzeniu chłodzącym i usunąć folię.
   UWAGA: Urządzenie chłodzące można wykonać po prostu umieszczając płytkę PCR 96-dołkową na polistyrenowej szalce Petriego (wymiary 150 mm × 15 mm) wypełnionej wodą i zamrożonej przez co najmniej 1 h. Urządzenie należy wyjąć z zamrażarki około 5 min przed rozpoczęciem analizy. Nie należy wyjmować urządzenia chłodzącego bezpośrednio przed chłodzeniem próbek, ponieważ zamrozi ono mieszaninę reakcyjną i utrudni rozwój barwy.
10. Po 10 min chłodzenia dodać 60 µL roztworu A + B, wymieszać, pipetując w górę i w dół 5 razy, i pozostawić paski z probówkami w urządzeniu chłodzącym na 10 min.
11. Dodać 90 µL roztworu arsenianu-cytrynianu i pozostawić w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 min, aby uzyskać trwały niebieski kolor.
    OSTROŻNIE: Ze względu na toksyczność wszystkie roztwory zawierające arsenian sodu należy przez cały czas obchodzić się z wyjątkową ostrożnością. W związku z tym dodawanie roztworu arsenianu-cytrynianu powinno odbywać się w dygestorium.
12. Przenieść 180 µL każdej mieszaniny reakcyjnej do przezroczystej polistyrenowej mikropłytki 96-dołkowej.
13. Zmierzyć absorbancję każdego dołka przy 860 nm za pomocą spektrofotometru do mikropłytek.

5. Analiza wyników

1. Oblicz średnią z trzech powtórzeń dla każdej próbki oraz wartość P_i standardy. Następnie odjąć wartość próbki ślepej, aby wyeliminować sygnał tła.
2. Stwórz krzywą kalibracyjną, nanosząc absorbancję (A₈₆₀) wartości w funkcji ilości P_i standardu (nmol) i przeprowadź regresję liniową, aby uzyskać funkcję linii trendu, korzystając z następującego wzoru:
   
3. Oblicz ilość fosforanu (nmol) uwolnionego w reakcji enzymatycznej na podstawie powyższego wzoru regresji liniowej.
4. Oblicz aktywność właściwą, korzystając z następującego wzoru:
   
   gdzie nP_i jest ilością fosforanu uwolnionego w reakcji (nmol), t jest czasem reakcji (min), a m_TmPPaza jest ilością czystej TmPPazy użytej w teście (mg).
5. Oblicz procentową aktywność dla każdego stężenia inhibitora, korzystając z następującego wzoru:
   
   gdzie SA_i ijest aktywność właściwa próbki z inhibitorem i SA_{Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.} jest aktywnością właściwą próbki niehamowanej.
6. Oblicz logIC50₅₀ (szacunek) i IC₅₀ (oszacować) za pomocą dopasowania regresji nieliniowej z czteroparametrowej krzywej dawka-odpowiedź, korzystając z następującego wzoru:
   
   gdzie X to logarytm stężenia ( µM), Y to aktywność (%), Top i Bottom to plateau w tej samej jednostce co Y (odpowiednio 100% i 0%), logIC₅₀ ma te same jednostki logarytmiczne co X, a HillSlope = współczynnik nachylenia lub nachylenie funkcji Hilla, które jest bezwymiarowe.
   UWAGA: Oprogramowanie (Tabela materiałów) jest wykorzystywany do dopasowania. Należy użyć stężenia 0.01 µM (zamiast 0.00 µM) dla próbki bez inhibitora, ponieważ logarytm z zera nie jest określony.

Wyniki

W niniejszym protokole przetestowano osiem związków (1−8) (Rycyna 2A) wraz z IDP, powszechnie stosowanym inhibitorem pirofosfataz, jako kontrolą dodatnią. Każdy związek badano w trzech różnych stężeniach (1 µM, 5 µM i 20 µM) w trzech powtórzeniach. Schemat przebiegu przesiewania przedstawiono na Rycynie 1, obejmując etapy od przygotowania próbek i odczynników aż po pomiar absorbancji przy 860 nm.

Pod koniec tego protokołu, po dodaniu ...

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół prostego badania przesiewowego inhibitorów pirofosfatazy związanej z błoną T. maritima w formacie płytki 96-dołkowej na podstawie Vidilaseris i wsp.14. Protokół ten jest niedrogi i oparty na kwasie 12-fosfomolibdenowym, który jest tworzony z ortofosforanu i molibdenianu w kwaśnych warunkach i redukowany do form fosfomolibdenu o wyraźnym niebieskim kolorze¹². Ta metoda jest preferowana w stosunku do innych protokołów,...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Samoprzylepny arkusz uszczelniający	Thermo Scientific	AB0558
Tetrahydrat heptamolibdenianu amonu	Merck	F1412481 636
Kwas askorbinowy	Sigma-Aldrich	95212-250G
BioLite 96Well Multidish	Thermo Scientific	130188
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Merck	1167431000
8-dołkowe paski probówki do PCR 0,2 ml bez nakrętek (120)	Nippon genetics	FG-028
Dodecyl maltozyd (DDM)	Melford	B2010-100G
Etanol	Merck	1009901001
Lodowaty kwas octowy	Merck	1000631011
Kwas solny	Sigma-Aldrich	258148-500ML
Imidodifosforan sodu sól	Sigma-Aldrich	I0631-1G
L-&alfa;-fosfatydylocholina z lecytyny sojowej	Sigma	429415-100GM
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	8147330500
Multiplate 96-dołkowe płytki PCR	Bio-Rad	MLL9651
MultiSkan	Go Thermo Scientific	10680879
Nepheloskan Ascent (Typ 750)	Labsystems
Polistyrenowa szalka Petriego (rozmiar 150 mm x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5981-100EA
Chlorek potasu	Merck	104936
Prism 6	Blok grzewczy GraphPad
QBT2	Grant Instruments
Meta-arsenin sodu	Fisher Chemical
Fosforan sodu dwuzasadowy (Pi)	Sigma	S0876-1KG
Pirofosforan sodu dwuzasadowy	Fluka	71501-100G
Cytrynian trisodowy dwuwodny	Fluka	71404-1KG

Oprogramowanie 12897692