Wykorzystanie błony chorio-omoczniowej kurczaka w modelu in vivo do badania nowotworów ginekologicznych i urologicznych

Podsumowanie

Prezentujemy model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka jako alternatywny, nadający się do przeszczepu, model in vivo do wszczepiania ginekologicznych i urologicznych linii komórkowych raka oraz guzów pochodzących od pacjentów.

Streszczenie

Modele mysie są testami porównawczymi dla badań in vivo nad rakiem. Jednak koszty, czas i względy etyczne doprowadziły do wezwań do alternatywnych modeli raka in vivo. Model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka (CAM) stanowi niedrogą, szybką alternatywę, która umożliwia bezpośrednią wizualizację rozwoju guza i nadaje się do obrazowania in vivo. W związku z tym staraliśmy się opracować zoptymalizowany protokół wszczepiania nowotworów ginekologicznych i urologicznych do tego modelu, który tutaj prezentujemy. Około 7 dni po zapłodnieniu komórka powietrzna jest przenoszona na unaczynioną stronę jaja, gdzie w skorupce tworzy się otwór. Następnie można przeszczepić guzy z mysich i ludzkich linii komórkowych oraz tkanek pierwotnych. Są one zwykle wysiewane w mieszaninie macierzy zewnątrzkomórkowej i pożywki, aby uniknąć dyspersji komórkowej i zapewnić wsparcie odżywcze, dopóki komórki nie zrekrutują zapasu naczyniowego. Guzy mogą wtedy rosnąć do dodatkowych 14 dni przed wykluciem się jaj. Poprzez wszczepianie komórek stabilnie transdukowanych lucyferazą świetlika, obrazowanie bioluminescencyjne może być wykorzystywane do czułego wykrywania wzrostu guza na błonie i komórek rakowych rozprzestrzeniających się po zarodku. Model ten może być potencjalnie wykorzystany do badania rakotwórczości, inwazji, przerzutów i skuteczności terapeutycznej. Model CAM kurczaka wymaga znacznie mniej czasu i środków finansowych w porównaniu z tradycyjnymi modelami mysimi. Ponieważ jaja mają obniżoną odporność i tolerują odporność, tkanki z dowolnego organizmu mogą być potencjalnie wszczepione bez kosztownych zwierząt transgenicznych (np. myszy) wymaganych do implantacji tkanek ludzkich. Jednak wiele zalet tego modelu może potencjalnie być również ograniczeniami, w tym krótki czas generowania guza i status osoby z obniżoną odpornością/tolerancją immunologiczną. Dodatkowo, chociaż wszystkie przedstawione tutaj typy nowotworów wszczepiają się w model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka, robią to z różnym stopniem wzrostu guza.

Wprowadzenie

Myszy służyły jako klasyczny organizm modelowy do badania ludzkich chorób, w tym nowotworów złośliwych. Jako ssaki mają wiele podobieństw z ludźmi. Ich wysoki stopień podobieństwa genetycznego pozwolił transgenicznej manipulacji genomem myszy na dostarczenie ogromnego wglądu w genetyczną kontrolę chorób ludzkich¹. Bogate doświadczenie w obchodzeniu się z myszami i eksperymentowaniu na nich sprawiło, że są one modelem z wyboru w badaniach biomedycznych. Jednak oprócz problemów etycznych i naukowych związanych z modelami mysimi, mogą one być również dość kosztowne i czasochłonne^2,3. Rozwój nowotworów może trwać tygodnie, a nawet miesiące. Zakwaterowanie w samej typowej instytucji może kosztować od setek do tysięcy dolarów, podczas gdy nowotwory się rozwijają. Rak jajnika jest przykładem tej wady, ponieważ jego wzrost w modelach mysich może z łatwością trwać miesiące. Opóźnienia w postępie badań potencjalnie wpływają na utrzymujący się niski wskaźnik 5-letniego przeżycia pacjentek z rakiem jajnika, wynoszący zaledwie 47% (tj. wzrost przeżycia tylko o 10% w ciągu 30 lat)⁴. Podobnie, nowotwory urologiczne (rak nerki, prostaty i pęcherza moczowego) stanowią 19% wszystkich przypadków raka w Stanach Zjednoczonych i 11% zgonów związanych z rakiem⁴. W związku z tym nowatorskie podejście in vivo do badania nowotworów ginekologicznych i urologicznych może zaoszczędzić laboratorium znacznej ilości czasu, pracy i pieniędzy, nawet jeśli model ten zostanie zastosowany tylko do wstępnych eksperymentów przesiewowych. Dodatkowo, wynikające z tego przyspieszenie wyników badań może znacząco wpłynąć na 177 000 osób, u których rocznie diagnozuje się te nowotwory.

Model CAM dla kurczaków oferuje wiele zalet, które rozwiązują wyżej wymienione problemy. Popularny model do badania angiogenezy^5,6, inwazja komórek nowotworowych^7,8, and metastasis7^,9, model CAM zarodka pisklęcia został już wykorzystany do badania wielu form nowotworów, w tym glejaka^10,11,12, głowa i szyja Rak płaskonabłonkowy ^13,14, leukemia^15,16, rak trzustki¹⁷, oraz rak jelita grubego¹⁸. Dodatkowo wygenerowano modele CAM dla neuroblastoma¹⁹, Burkitt lymphoma²⁰, melanoma²¹ oraz filine fibrosarcoma²². Wcześniejsze badania również przedstawiały wszczepienie raka pęcherza moczowego²³ i linii komórkowych raka prostaty²⁴, ale z ograniczonymi szczegółami protokołu. Jaja są nie tylko znacznie tańsze niż myszy, ale także dają bardzo powtarzalne wyniki^25,26. Wykazują szybki rozwój naczyń krwionośnych, a wszczepienie guza może nastąpić w ciągu zaledwie kilku dni i być uwidocznione wzdłużnie przez otwarte okno. Dzięki 21-dniowym ramom czasowym między zapłodnieniem jaj a wykluciem, eksperymenty można zakończyć w ciągu kilku tygodni. Co więcej, niski koszt, ograniczone potrzeby mieszkaniowe i niewielkie rozmiary pozwalają na eksperymenty na dużą skalę, które byłyby zaporowe dla badań na myszach.

Dlatego staraliśmy się zoptymalizować model CAM do wszczepiania nowotworów ginekologicznych i urologicznych. Ze względu na obniżoną odporność wczesnego stadium zarodka kurzego²⁷, zarówno komórki mysie, jak i ludzkie mogą być łatwo wszczepiane. W związku z tym z powodzeniem wszczepiliśmy raka jajnika, nerki, prostaty i pęcherza moczowego. Dla każdego z tych typów nowotworów CAM z łatwością akceptuje ustalone mysie i/lub ludzkie linie komórek nowotworowych. Co ważne, świeżo pobrane pierwotne ludzkie tkanki nowotworowe mogą również zostać przeszczepione z strawionych komórek lub kawałków tkanek stałych z dużym powodzeniem. Każdy z tych typów nowotworów i źródeł komórek wymaga optymalizacji, którą tutaj się dzielimy.

Protokół

Wszystkie eksperymenty przedstawione tutaj zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednie komisje etyczne na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles (UCLA). Stosowanie pozbawionych identyfikacji, pierwotnych nowotworów ludzkich zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną UCLA (numery protokołów 17-000037, 17-001169 i 11-001363). Na UCLA przegląd Komitetu Badań nad Zwierzętami nie jest wymagany w przypadku eksperymentów z wykorzystaniem zarodków kurczaka; Zatwierdzenie protokołu jest wymagane tylko wtedy, gdy jaja zostaną wyklute. Jednak najlepsze praktyki, takie jak wytyczne AVMA dotyczące eutanazji zwierząt, zostały wykorzystane do etycznego obchodzenia się z zarodkami kurczaków i unikania bólu w jak największym stopniu. Zachęca się badaczy do zweryfikowania wymagań dotyczących nadzoru w swojej instytucji przed rozpoczęciem badań z wykorzystaniem modeli CAM.

1. Przygotowanie jajek

1. Przed otrzymaniem jaj zmontuj i wyrównaj inkubator do jaj do 37.8 °C (100 °F) przy wilgotności 60-70% zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia, do kontrolowania wilgotności można używać wody w autoklawie.
2. Po otrzymaniu zapłodnionych jaj kurzych Rhode Island Red od certyfikowanego dostawcy jaj klasy laboratoryjnej, wytrzyj na sucho powierzchnię skorupek ręcznikami papierowymi. Do usunięcia przyklejonego materiału można użyć lekko zwilżonego ręcznika papierowego. Suszyć natychmiast.
   UWAGA: Zwilżenie skorupki płynem o temperaturze poniżej 43,3 °C może wprowadzić bakterie do jaja. Jeśli ktoś zdecyduje się umyć lub zdezynfekować jajka, temperatura płynu musi wynosić od 43,3 do 48,9 °C. Wyższe temperatury mogą ugotować jajka. Wybór środka dezynfekującego powinien być dokonany na podstawie mikroorganizmów budzących obawy.
3. Użyj ołówka lub markera, aby oznaczyć datę na jajku. Jest to traktowany jako dzień rozwoju 0.
4. Umieścić jaja w inkubatorze do jaj i inkubować przez co najmniej 7 dni z rotacją, aby umożliwić rozwój CAM. Można użyć automatycznego rotatora lub jaj można obracać o 180° 2-3 razy dziennie.

2. Otwieranie jaj

UWAGA: Otwieranie jaj powinno nastąpić, gdy CAM jest już w pełni rozwinięty. Zazwyczaj ma to miejsce w 7 lub 8 dniu programowania.

1. Zdezynfekuj komorę bezpieczeństwa biologicznego za pomocą 70% etanolu. Podobnie zdezynfekuj i umieść w szafie bezpieczeństwa biologicznego stojak na jajka, świecznik do jajek, marker, akumulatorowe narzędzie obrotowe z kamieniem szlifierskim z węglika krzemu i okrągłą tarczą tnącą, igłę 18 G, kontroler pipet z ćwierćcalową rurką próżniową, taśmę pakową, nożyczki biurowe, zakrzywione nożyczki, kleszcze Semken (lub podobne), waciki i przezroczysty opatrunek foliowy o wymiarach 6 x 7 cm. Jeśli to możliwe, używaj narzędzi sterylnych, jednorazowych lub sterylizowanych w autoklawie.
2. Wyłącz rotator jaj. Umieść około 1-3 jaj w szafie bezpieczeństwa biologicznego na stojaku na jajka. W ciemności przyłóż świecę do jajka przy skorupce jajka, aby zidentyfikować komórkę powietrzną. Zaznacz położenie komory powietrznej.
   UWAGA: Intensywność oświetlenia z świecznika do jajek ma kluczowe znaczenie dla wizualizacji wnętrza jajka. Jeśli komórka powietrzna lub układ naczyniowy są stale trudne do zobaczenia, spróbuj wymienić baterie świecy do jajek.
3. Przesuń świecę do jajek po skorupce, aby znaleźć dużą sieć naczyń krwionośnych. W razie potrzeby obróć jajko. Idealne unaczynienie będzie rozgałęziać się w pobliżu środka jaja. Użyj markera, aby narysować naczynia krwionośne, które mają być użyte do implantacji.
4. Włącz światło w masce. Za pomocą akumulatorowego narzędzia obrotowego wyposażonego w kamień szlifierski z węglika krzemu wywierć mały otwór w skorupie bezpośrednio nad środkiem komory powietrznej. Wiercić, aż większość skorupy zostanie usunięta, ale biała, wewnętrzna membrana jest nienaruszona.
   UWAGA: Wiercenie nad komórką powietrzną przed skierowaniem na układ naczyniowy pozwala określić grubość tej konkretnej skorupki jaja nad komórką powietrzną, a nie nad CAM i naczyniem. Jeśli CAM lub unaczynienie zostanie zakłócone, komórka jajowa nie nadaje się do implantacji.
5. Wywierć i otwórz kolejny mały otwór, w którym okno naczyniowe zostanie otwarte, tak jak to zostało zrobione w przypadku komórki powietrznej (krok 2.4).
6. Za pomocą igły 18 G delikatnie przebić przez białą, wewnętrzną błonę nad komórką powietrzną i naczyniami krwionośnymi. Jeśli nie możesz przebić skorupy, ostrożnie wywierć trochę więcej. Upewnij się, że biała, wewnętrzna membrana (ale nie CAM) jest uszkodzona na całym wierconym obszarze. Demontaż elementu membrany nie jest konieczny.
   UWAGA: Jeśli na tym etapie CAM lub układ krwionośny zostanie zakłócony, wyrzuć jajo. Uszkodzenie jest widoczne, jeśli z wywierconego otworu wycieka krew lub albumina.
7. Wyłącz oświetlenie maski. Za pomocą świecy do jaj sprawdź, czy komórka powietrzna została przeniesiona z końca jajka do obszaru nad naczyniami krwionośnymi. W razie potrzeby umieść rurkę próżniową włożoną do sterownika pipet wokół otworu nad oryginalną komórką powietrzną i delikatnie zasysaj w krótkich seriach, aby przesunąć komórkę powietrzną.
8. Użyj markera, aby obrysować nowe położenie komórki powietrznej około 0.5 cm wewnątrz granicy air-CAM. Przymocuj kawałek taśmy pakowej tuż nad nową komorą powietrzną. W razie potrzeby użyj standardowych nożyczek biurowych, aby przyciąć taśmę do odpowiedniego rozmiaru.
   UWAGA: Taśma może zakłócać przepływ powietrza przez powłokę i nie powinna być większa niż jest to konieczne do pełnego zakrycia komory powietrznej.
9. Włóż jaja z powrotem do inkubatora, aby się ogrzały bez obracania, z nową komorą powietrzną skierowaną do góry. Powtórz kroki 2.2-2.9 dla pozostałych jaj, które mają zostać otwarte.
   UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany. W przypadku braku pewności co do jakości rozwoju CAM, niewielka liczba jaj powinna przejść przez krok 2.16 przed otwarciem pozostałych jaj.
10. Umieść około 1-3 jaj z przeniesionymi komórkami powietrznymi na stojaku na jajka w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby nie dopuścić do przedostania się zanieczyszczenia do otwartego jaja. Dlatego zawsze otwieraj jaja w komorze bezpieczeństwa biologicznego i używaj sterylnych narzędzi i sprzętu, gdy tylko jest to możliwe.
11. Za pomocą akumulatorowego narzędzia obrotowego wyposażonego w okrągłą tarczę tnącą wytnij małą linię nad granicą komórki powietrznej narysowaną w kroku 2.8. Upewnij się, że znajduje się on około 0.5 cm wewnątrz rzeczywistej granicy powietrze-CAM, aby uniknąć zakłócenia CAM lub układu krwionośnego. Przeciąć całkowicie skorupę, ale uważaj, aby nie wniknąć wystarczająco głęboko, aby zakłócić CAM lub układ krwionośny.
12. Za pomocą zakrzywionych nożyczek przetnij pozostałą komórkę powietrzną, aby utworzyć okno w skorupie.
    UWAGA: Jeśli na usuniętej skorupce znajduje się krew lub błona, oznacza to, że komórka jajowa nie nadaje się do implantacji. Jeśli duża część jaj nie zostanie czysto otwarta, należy rozważyć odczekanie co najmniej 1 dodatkowego dnia na otwarcie pozostałych jaj, aby umożliwić lepsze tworzenie się CAM. Jeżeli skorupki pozostałych jaj nie zostały przekłute, należy wznowić obracanie jaj w inkubatorze.
13. Sprawdź żywotność zarodka. Zdolne do życia zarodki będą wykazywać rozległe unaczynienie, czystą albuminę, ruchy zarodka lub widoczne bicie serca.
14. Za pomocą kleszczyków Semken wyciągnij małe kawałki bawełny ze sterylnego wacika. Delikatnie osusz powierzchnię CAM, aby usunąć kurz i zanieczyszczenia z powłoki.
    UWAGA: Usunięcie zanieczyszczeń musi być wykonane tego samego dnia, w którym jaja są otwarte.
15. Przykryj otwór muszli jedną czwartą kawałka przezroczystego opatrunku foliowego o wymiarach 6 x 7 cm.
16. Włóż jaja z powrotem do inkubatora. Upewnij się, że jajko jest bezpiecznie osadzone z otwartym oknem skierowanym do góry, a CAM nie dotyka przezroczystego opatrunku foliowego. Użyj kawałka stojaka na jajka, krawędzi rotatora do jaj lub innego odpowiedniego przedmiotu, aby podeprzeć jajka, które się toczą.
17. Powtórz kroki 2.10-2.16 dla wszystkich pozostałych jaj, które mają zostać otwarte.
    UWAGA: Otwieranie komórek jajowych nie musi być zakończone w tym samym dniu co implantacja. Odczekanie co najmniej 1 dnia może pomóc w wyeliminowaniu jaj, których żywotność została zagrożona przez otwarcie skorupki.

3. Przygotowanie zawiesiny komórek rakowych do przeszczepienia (opcja 1)

UWAGA: To powinno być zakończone tuż przed implantacją, która powinna mieć miejsce między 7 a 10 dniem. Proszę zapoznać się z uwagami na początku kroku 5 lub 6 w celu uzyskania dalszych informacji na temat daty implantacji. Podejście to zastosowano dla wszystkich linii komórkowych i hodowlanych trawień guza raka nerki.

1. Rozmrozić roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie.
2. Stosując trawienie mechaniczne i/lub enzymatyczne, należy uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki przy użyciu metody odpowiedniej dla typu wszczepianej komórki.
3. Zawiesić całkowitą liczbę komórek, które mają zostać wszczepione, w odpowiednim podłożu do implantacji. Typowe są implanty 1-2 x 10⁶ komórek na jajo.
   UWAGA: Pożywka używana do implantacji linii komórkowych jest zazwyczaj kompletną pożywką używaną do hodowli komórek, zawierającą FBS lub wymianę surowicy. Implantacja trawień nowotworowych zazwyczaj wykorzystuje kompletną pożywkę używaną do hodowli linii komórkowych tego samego typu raka. Jednakże w razie potrzeby eksperymentalnie można wprowadzić zmiany w składzie pożywki. Wpływ na rozwój i wzrost guza musiałby zostać określony empirycznie.
4. Granulować komórki, używając prędkości wirówki i czasu odpowiedniego dla używanych komórek. Typowe prędkości to 250-300 x g, a czasy to 5-10 min.
5. Usunąć supernatant z granulowanych komórek za pomocą pipetowania. Mechanicznie zawiesić komórki w pozostałym podłożu za pomocą trzepotania lub pipetowania. Ułóż na lodzie do ostygnięcia. Odmierz objętość komórek i pożywki za pomocą pipety o odpowiedniej wielkości.
6. Obliczyć objętości implantacji w taki sposób, aby 1-2 x 10⁶ komórek wszczepia się w objętości 20-100 μl na jajo o końcowym stężeniu w macierzy zewnątrzkomórkowej 2,7-4 mg/ml białka. Dodaj pożywkę, dowolne pożądane czynniki wzrostu lub dodatki i roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej zgodnie z tym obliczeniem. Przechowywać na lodzie, aż będzie gotowy do implantacji.
   UWAGA: Do obliczeń w krokach 3.3 i 3.6 należy włączyć dodatkową objętość co najmniej połowy implantu jajowego, aby zapewnić odpowiednią objętość dla wszystkich jaj w grupie. W celu implantacji linii komórkowych raka jajnika (tj. SKOV3 i ID8) wszczepiono 10⁶ komórek z komórki jajowej. Do implantacji linii komórkowej raka nerkowokomórkowego RENCA wszczepiono hodowane komórki pochodzące z strawionego pierwotnego ludzkiego raka nerkowokomórkowego, linii komórkowych raka prostaty (tj. CWR, C4-2 i MyC-CaP) oraz linii komórkowych raka pęcherza moczowego (tj. HT-1376 i T24), wszczepiono 2 x 10⁶ komórek.

4. Przygotowanie fragmentów guza do implantacji (opcja 2)

UWAGA: To powinno być zakończone tuż przed implantacją, która powinna mieć miejsce między 7 a 10 dniem. Proszę zapoznać się z uwagami na początku kroku 5 lub 6 w celu uzyskania dalszych informacji na temat daty implantacji. Pierwotne nowotwory jajnika i pęcherza moczowego wszczepiano w postaci fragmentów guza.

1. Rozmrozić roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie. Rozcieńczyć do końcowego stężenia białka 2,7-4 mg/ml w odpowiednim podłożu zawierającym pożądane czynniki wzrostu lub dodatki. Przechowywać na lodzie.
   UWAGA: Implantacja fragmentów guza zazwyczaj wykorzystuje kompletną pożywkę używaną do hodowli linii komórkowych tego samego typu raka. Jednakże w razie potrzeby eksperymentalnie można dokonać zmian w postaci podłoża. Wpływ na wszczepienie i wzrost guza musiałby zostać empirycznie określony.
2. Za pomocą skalpela lub nożyczek wyciąć kawałki świeżego guza. Idealne rozmiary wahają się od 2 do 5 mm z każdej strony. Utrzymuj tkanki zanurzone w pożywce, aż będą gotowe do implantacji.

5. Implantacja za pomocą pierścienia zapobiegającego przywieraniu (opcja 1)

UWAGA: Komórki mogą być wszczepiane począwszy od 7 dnia rozwoju, jeśli CAM jest w pełni rozwinięty. Implantacja może nastąpić w dowolnym momencie przed wykluciem, który zapewnia odpowiedni czas na rozwój guza i pożądany eksperyment, ale należy pamiętać, że komórki odpornościowe zarodka zaczynają być obecne około 10 dnia po zapłodnieniu²⁷. Tempo wzrostu guza różni się znacznie w zależności od typu komórki i musi być empirycznie określone dla typu komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Komórki raka jajnika i raka prostaty wszczepiono metodą pierścienia zapobiegającego przywieraniu. Należy pamiętać, że jeśli pierścień zapobiegający przywieraniu nie jest dostępny, końcówkę pipety można przyciąć do podobnego rozmiaru i użyć.

1. Użyj 70% etanolu do dezynfekcji szafki bezpieczeństwa biologicznego i wszystkich wymaganych narzędzi: stojaka na jajka, zakrzywionych kleszczyków do tęczówki, nieprzywierających pierścieni (średnica wewnętrzna 1/4 cala), szklanego pręta do mieszania, pipet i końcówek o odpowiedniej objętości, przezroczystego opatrunku foliowego o wymiarach 6 x 7 cm, nożyczek biurowych oraz markera lub ołówka. Jeśli to możliwe, należy używać narzędzi sterylnych, jednorazowych lub autoklawowanych.
2. Umieść jaja do zagnieżdżenia na stojaku na jajka w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Wybierz możliwą do opanowania liczbę jaj. Typowo jest do sześciu. Unikaj dopuszczenia do znacznego ostygnięcia jaj podczas pracy z nimi.
3. Usuń przezroczysty opatrunek foliowy z muszli, zwijając krawędzie w kierunku otwartego okna, aby uniknąć odrywania kawałków skorupy. Sprawdź, czy jaja są żywotne i zdrowe. Idealne jaja będą miały duże naczynie pośrodku otwartego obszaru, z którego odgałęziają się mniejsze naczynia.
4. Za pomocą zakrzywionych kleszczyków do tęczówki umieść sterylny, nieprzywierający pierścień na CAM nad naczyniem, najlepiej nad punktem rozgałęzienia. Użyj sterylnego szklanego pręta mieszającego, aby delikatnie zetrzeć CAM.
5. Odpipetować zawiesinę ogniw z kroku 3.6 do środka pierścienia zapobiegającego przywieraniu. Alternatywnie, użyj kleszczy, aby umieścić kawałek guza z kroku 4.2 w środku nieprzywierającego pierścienia i przykryć 20-50 μl roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej wygenerowanego w kroku 4.1.
6. Uszczelnij otwór jedną czwartą kawałka przezroczystego opatrunku foliowego o wymiarach 6 x 7 cm. Oznacz jaja odpowiednim oznaczeniem implantu.
   UWAGA: Numerowanie jaj w grupie ułatwia obserwacje podłużne.
7. Włóż jajo z powrotem do inkubatora. Upewnij się, że otwór skorupki jest ustawiony pionowo, a jajko jest bezpieczne.
   UWAGA: Jaja można umieścić z powrotem w inkubatorze bez rotacji. Alternatywnie, wysoką żywotność po implantacji można uzyskać za pomocą inkubatora komórkowego o temperaturze 37-38 °C z dezaktywowanym CO₂ i higrometrem do monitorowania wilgotności, która powinna wynosić 50%-80%.

6. Implantacja bez pierścienia zapobiegającego przywieraniu (opcja 2)

UWAGA: Komórki mogą być wszczepiane począwszy od 7 dnia rozwoju, jeśli CAM jest w pełni rozwinięty. Implantacja może nastąpić w dowolnym momencie przed wykluciem, który zapewnia odpowiedni czas na rozwój guza i pożądany eksperyment, ale należy pamiętać, że komórki odpornościowe zarodka zaczynają być obecne około 10 dnia po zapłodnieniu²⁷. Metodę tę zastosowano do wszczepienia komórek raka nerkowokomórkowego i komórek raka pęcherza moczowego.

1. Użyj 70% etanolu do dezynfekcji szafki bezpieczeństwa biologicznego i wszystkich wymaganych narzędzi: pipet i końcówek o odpowiedniej objętości, sterylnych 10-centymetrowych naczyń do hodowli tkankowych, stojaka na jajka, przezroczystego folii o wymiarach 6 x 7 cm, nożyczek biurowych i markera.
2. Odessać objętość inokulacji zawiesiny komórkowej wytworzonej w kroku 3.6 do końcówki pipety o odpowiedniej wielkości (typowo 200 μl). Trzymając górną część końcówki, ostrożnie wysuń końcówkę pipety i umieść poziomo w sterylnym, 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowych.
3. Powtórzyć krok 6.2 dla wszystkich próbek w grupie, z jednym naczyniem dla każdej grupy.
4. Umieść końcówki w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 15-30 minut, aby umożliwić częściową polimeryzację macierzy zewnątrzkomórkowej.
5. Po 15 minutach inkubacji rozpocznij sprawdzanie polimeryzacji. Niewielka ilość płynu zwykle wycieka z końcówki po umieszczeniu na naczyniu. Polimeryzacja tej cieczy może być wykorzystana do oszacowania stopnia polimeryzacji cieczy w końcówce.
6. Umieść jaja do zagnieżdżenia na stojaku na jajka w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Wybierz możliwą do opanowania liczbę jaj. Typowo jest do sześciu. Unikaj dopuszczenia do znacznego ostygnięcia jaj podczas pracy z nimi.
7. Usuń przezroczysty opatrunek foliowy z powłoki, zwijając krawędzie w kierunku otwartego okna. Pozwala to uniknąć odrywania kawałków skorupy.
8. Sprawdź, czy jaja są żywotne i zdrowe. Idealne jaja będą miały duże naczynie pośrodku otwartego obszaru, z którego odgałęziają się mniejsze naczynia.
9. Umieścić jedną końcówkę pipety na pipecie o odpowiedniej wielkości. Wciśnij tłok, aby wcisnąć częściowo spolimeryzowaną zawiesinę komórek do CAM nad dużym, dobrze rozwiniętym naczyniem, najlepiej nad punktem rozgałęzienia.
10. Uszczelnij otwór jedną czwartą kawałka przezroczystego opatrunku foliowego o wymiarach 6 x 7 cm.
11. Oznacz komórkę jajową odpowiednim oznaczeniem implantu.
    UWAGA: Numerowanie jaj w grupie ułatwia obserwacje podłużne.
12. Włóż jajo z powrotem do inkubatora. Upewnij się, że otwór skorupki jest ustawiony pionowo, a jajko jest bezpieczne.
    UWAGA: Jaja można zwrócić do dedykowanego inkubatora jaj bez rotacji. Alternatywnie, wysoką żywotność po implantacji można uzyskać za pomocą inkubatora komórkowego o temperaturze 37-38 °C z dezaktywowanym CO₂ i higrometrem do monitorowania wilgotności, która powinna wynosić 50%-80%.

7. Obrazowanie bioluminescencyjne guzów oznaczonych lucyferazy świetlika

UWAGA: Jeśli wszczepione komórki zostały stabilnie transdukowane genem kodującym lucyferazy świetlika lub innymi czynnikami obrazowania, powstałe guzy mogą być wizualizowane za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. Obrazowanie fluorescencyjne nie jest zalecane w przypadku nienaruszonych jaj ze względu na wysokie tło od skorupki jaja. Jest to analiza końcowa, ponieważ otwarcie powłoki drastycznie skraca przeżycie. Guzy mogą być obrazowane w dowolnym momencie, który jest odpowiedni dla potrzeb eksperymentalnych i szybkości wzrostu guza. Jednak średnio jaja wykluwają się 21 dni po zapłodnieniu. W związku z tym 18. dzień rozwoju jest odpowiednim punktem końcowym, aby uniknąć niepożądanego wykluwania.

1. W razie potrzeby przetransportować jaja do zakładu obrazowania. Przyklej jaja do 10-centymetrowych szalek do hodowli tkankowych. Umieść je z powrotem w inkubatorze jaj o temperaturze 37.8 °C (100 °F) z wyjętym lub dezaktywowanym mechanizmem obrotowym. Wilgotność nie ma kluczowego znaczenia dla transportu i obrazowania.
2. Używając zakrzywionych kleszczyków do tęczówki, delikatnie odepchnij CAM od skorupy, aż CAM zrówna się z albuminą i zarodkiem. Używając kleszczyków do próbek z szeroką końcówką, oderwij kawałki skorupy, aby odpowiednio rozszerzyć otwór skorupy w celu wizualizacji guza.
3. Wstrzyknąć co najmniej 50 μl 30 mg/ml D-lucyferyny do albuminy jaja. Podobną objętość D-lucyferyny można również pipetować do pierścienia zapobiegającego przywieraniu lub na powierzchnię CAM w obszarze zawierającym wszczepione komórki. Zapewnia to optymalną bioluminescencję przy braku idealnego zaopatrzenia w naczynia krwionośne. Inkubować przez 8 minut.
4. Wstrzyknąć 20-50 μl izofluranu do albuminy jaja w celu znieczulenia jaja. Inkubuj przez dodatkowe 2 minuty. Alternatywnie jajo można umieścić w komorze indukcyjnej zawierającej 2-2,5% odparowanego izofluranu. Odpowiednią głębokość znieczulenia uzyskuje się, gdy ruch zarodka ustaje.
   UWAGA: Większe objętości izofluranu (100 μL) można użyć do eutanazji komórki jajowej.
5. Umieść jaja w urządzeniu do obrazowania bioluminescencyjnego i zobrazuj przy użyciu odpowiednich ustawień, zgodnie z instrukcjami producenta. W tym badaniu zastosowano czas ekspozycji wynoszący 1 minutę.
6. Aby zobrazować pozostałą CAM i zarodek, otwórz komórkę jajową w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej.
   1. Chwyć jajko palcami obu rąk na spodniej stronie jajka w pobliżu środka jajka i kciukami po obu stronach otworu skorupki.
   2. Delikatnie rozsuń kciukami dwie połówki jajka, jednocześnie delikatnie wciskając palcami w jajko.
   3. Gdy skorupa jest mniej więcej w połowie oddzielona od CAM i zarodka, odwróć jajo do góry nogami na 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej.
   4. Kontynuuj oddzielanie połówek skorupy. Jeśli CAM przyklei się do wnętrza skorupy, delikatnie palcami odepchnij CAM od skorupy.
   5. W razie potrzeby zarodek można przerzucić do innego naczynia
   .
   6. W razie potrzeby można podać dodatkowy izofluran, jak opisano w kroku 7.4.

8. Pobieranie nowotworów

UWAGA: Guzy mogą być pobierane w dowolnym momencie, który jest odpowiedni dla potrzeb eksperymentalnych i szybkości wzrostu guza. Jednak średnio jaja wykluwają się 21 dni po zapłodnieniu. W związku z tym 18. dzień rozwoju jest odpowiednim punktem końcowym, aby uniknąć niepożądanego wykluwania.

1. Chwyć guz kleszczami. Za pomocą nożyczek (dobrze sprawdzają się nożyczki do sprężystej tęczówki) lub skalpela, ostrożnie wytnij guz z CAM.
2. Jeśli guz został transdukowany genem lucyferazy świetlika, można przeprowadzić ponowne obrazowanie w celu sprawdzenia pomyślnego usunięcia trudnych do wizualizacji guzów.
   UWAGA: Wycięte guzy mogą być analizowane dowolną metodą odpowiednią dla danego eksperymentu. Guzy mogą być również ponownie wszczepiane do CAM lub myszy. Aby potwierdzić tożsamość guza, guzy można naprawić, zatopić parafinę i zbadać za pomocą hematoksyliny i eozyny lub barwienia immunohistochemicznego.

Wyniki

Do tej pory odkryliśmy, że ta metoda implantacji jest skuteczna w przypadku raka jajnika, nerki, prostaty i pęcherza moczowego. Każdy z nich został zoptymalizowany pod kątem określenia określonych warunków implantacji, chociaż może istnieć elastyczność. Spośród badanych typów nowotworów, wzrost raka jajnika był znacznie mniej wyraźny i zazwyczaj nie był widoczny bez pomocy obrazowania bioluminescencyjnego (Ryc. 1). Jednak usztywnienie CAM można było wyczuć za pomocą kl...

Dyskusja

Ekspansja i wszczepienie guza przy użyciu modelu CAM pozwala na szybszy i bardziej bezpośrednio obserwowalny wzrost guza niż istniejące modele zwierzęce in vivo. Ponadto koszty są znacznie niższe po zakończeniu początkowego zakupu sprzętu, zwłaszcza w porównaniu z kosztem myszy z obniżoną odpornością. Początkowy, obniżony immunologicznie stan zarodków kurczaków z łatwością pozwala na wszczepienie tkanki ludzkiej i mysjej. Nawet przy tych mocnych stronach, model CAM ma ograniczenia. Krótki czas, który może być korzystny, ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
-010 Teflon (PTFE) Biały 55 O-ringi Duro Shore D O-ring	Store	TEF010	Nieprzywierający pierścień do wysiewu komórek. 1/4 "ID X 3/8" OD X 1/16" CS Politetrafluoroetylen (PTFE).
C4-2	ATCC	CRL-3314	Linia komórkowa ludzkiego raka prostaty.
Komórki CWR CWR22Rv1			były miłym prezentem dr Davida Agusa (Keck Medicine z Uniwersytetu Południowej Kalifornii)
Przeciwciało cytokeratyny 8/18 (C-51)	Novus Biologicals	NBP2-44929-0,02 mg	Używane w rozcieńczeniu 1:100 do analizy immunohistochemicznej guzów CAM ludzkiego jajnika.
D-Luciferin Firefly, sól potasowa	Goldbio	LUCK-1G
Delikatne nożyczki operacyjne; Zakrzywiony; ostry-ostry; 30mm Długość ostrza; 4-3/4 cala Całkowita długość	Roboz Surgical	RS6703	Jest to podane jako przykład. Wszelkie podobne zakrzywione nożyczki również by się sprawdziły.
Zestaw narzędzi Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max	Dremel	8050-N/18	Ten zestaw zawiera wszystkie niezbędne narzędzia.
Zapłodnione jaja kurze (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade)	AA Lab Eggs Inc.	Nie dotyczy	Konieczne byłoby znalezienie lokalnego dostawcy jaj, ponieważ ten dostawca dostarcza jaja tylko regionalnie.
HT-1376	ATCC	CRL-1472	Linia komórkowa ludzkiego raka pęcherza moczowego.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit	Inkubator Magazyn	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	Można stosować inne inkubatory do jaj, ale ich niezawodność musiałaby zostać zweryfikowana. Po implantacji można również zastosować inkubator komórkowy z wyłączonym CO2
ID8			Niedostępne na rynku, zobacz PMID: 10753190.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Inkubator Magazyn	1102	Można użyć innych świec, jednak jest to preferowane spośród tych, które testowaliśmy. Ten świecownik znajduje się we wspomnianym zestawie inkubatora.
Kleszczyki do przysłony, 10cm, zakrzywione, ząbkowane, końcówki 0,8 mm	World Precision Instrument	15915	To jest podany jako przykład. Wszelkie podobne zakrzywione kleszcze również by się sprawdziły. Do tej metody użyto wielu marek.
Maszynka do strzyżenia	izofluranu	0010250
IVIS Lumina II System obrazowania in vivo	Perkin Elmer
Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free	Corning	354248	Roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej
MyC-CaP	ATCC	CRL-3255	Mysia linia komórkowa raka prostaty.
Przenośny kontroler pipet Pipet-Aid XP	Drummond Scientific	4-000-101	Każdy podobny kontroler pipet byłby odpowiedni.
Igły podskórne PrecisionGlide	BD	305196	Jest to podany jako przykład. Każda igła 18G będzie działać podobnie.
RENCA	ATCC	CRL-2947
Kleszcze Semken	Narzędzia do nauki	11008-13	Jest to podane jako przykład. Odpowiednie byłyby wszelkie podobne kleszcze lub inny styl, który odpowiada preferencjom badacza.
SKOV3	ATCC	HTB-77	Linia komórkowa ludzkiego raka jajnika.
Kleszcze do próbek	Mikroskopia elektronowa Nauki	72914	Jest to podane jako przykład. Kleszcze służące do odciągania skorupy do obrazowania bioluminescencyjnego mają około 12,8 cm długości i końcówki o szerokości 3 mm.
Sterylne waciki	Fisherbrand	22-456-885	Jest to podane jako przykład. Wystarczyłyby dowolne sterylne waciki.
Pręty mieszające z gumą Policeman; Średnica 5 mm, długość 6 cali	United Scientific Supplies	GRPL06	To jest podane jako przykład. Wszelkie podobne szklane pręty do mieszania również by się sprawdziły.
T24	ATCC	HTB-4	Linia komórkowa ludzkiego raka pęcherza moczowego.
Przezroczysty opatrunek Tegaderm Oryginalny styl ramy 2 3/8 "x 2 3/4"	Moore Medical	21272
Naczynia do hodowli tkankowych, średnica 10 cm	Corning	353803	Jest to podane jako przykład. Można użyć dowolnego podobnego, sterylnego 10-centymetrowego naczynia. Leczenie hodowlą tkankową nie jest konieczne.
Przezroczyste rurki laboratoryjne Tygon - ścianka 1/4 x 3/8 x 1/16 (50 stóp)	Tygon	AACUN017	To jest podany jako przykład. Wszelkie rurki o podobnej wielkości również by się sprawdziły.