Artykuł metodologiczny

Nowatorski, modulowany fibroblastami zrębu model sferoidalny 3D guza do badania interakcji guz-zręb i odkrywania leków

11.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60660

⸱

28 lutego 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Miami School of Medicine, 2Analytical Imaging Core Facility, University of Miami School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Powstaje nowy trójwymiarowy model sferoidalny oparty na heterotypowym oddziaływaniu komórek nowotworowych i fibroblastów zrębu. Tutaj prezentujemy kokulturę komórek nowotworowych i fibroblastów zrębu, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną w celu wizualizacji powstawania sferoid. Ten trójwymiarowy model stanowi istotną platformę do badania interakcji między guzem a zrębem i testowania terapii przeciwnowotworowych.

Streszczenie

Interakcje między guzem a zrębem odgrywają ważną rolę w postępie nowotworu. Trójwymiarowe (3D) sferoidalne modele guza są najczęściej stosowanym modelem in vitro w badaniu komórek macierzystych/inicjujących raka, przedklinicznych badaniach nad rakiem i badaniach przesiewowych leków. Modele sferoidalne 3D są lepsze od konwencjonalnych hodowli komórek nowotworowych i odtwarzają niektóre ważne cechy prawdziwych guzów litych. Jednak konwencjonalne sferoidy guza 3D składają się wyłącznie z komórek nowotworowych. Brakuje im udziału komórek zrębu nowotworowego i mają niewystarczające odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), dzięki czemu tylko częściowo naśladują warunki in vivo tkanek nowotworowych. Stworzyliśmy nowy wielokomórkowy model sferoidalny 3D składający się z komórek nowotworowych i fibroblastów zrębu, który lepiej naśladuje heterogenne mikrośrodowisko guza in vivo i jego natywną desmoplazję. Powstawanie sferoid jest ściśle regulowane przez fibroblasty zrębu guza i jest determinowane przez aktywność pewnych kluczowych wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych (np. Sygnalizacji Notch) w fibroblastach zrębu. W tym artykule przedstawiamy techniki kokultury komórek nowotworowych - fibroblastów zrębu, obrazowania poklatkowego w celu wizualizacji interakcji komórka-komórka oraz mikroskopii konfokalnej w celu przedstawienia cech architektonicznych 3D sferoid. Pokazujemy również dwa przykłady praktycznego zastosowania tego sferoidalnego modelu 3D. Ten nowatorski wielokomórkowy model sferoidalny 3D stanowi użyteczną platformę do badania interakcji guz-zręb, wyjaśniając, w jaki sposób fibroblasty zrębu regulują komórki macierzyste/inicjujące raka, które determinują progresję i agresywność guza, a także badając udział reakcji zrębu we wrażliwości i oporności na leki przeciwnowotworowe. Platforma ta może być również odpowiednim modelem in vitro do odkrywania leków.

Wprowadzenie

Guzy lite reprezentują złożone tkanki złożone z komórek nowotworowych i dużej różnorodności komórek zrębu1,2,3,4. Fibroblasty zrębu lub fibroblasty związane z rakiem (CAF) są jedną z głównych populacji komórek zrębu w większości typów guzów litych. Są krytycznie zaangażowane w regulację wzrostu guza, pnia, przerzutów, angiogenezy i oporności na leki poprzez produkcję czynników wzrostu, cytokin/chemokin, syntezę ECM i enzymów remodelujących (np. kolagen, fibronektynę i metaloproteazy macierzy), uwalnianie egzosomów i bezpośrednią heterotypową interakcję komórka-komórka5,6,7,8,9,10,11. CAF bierze również udział w określaniu przerzutów specyficznych dla narządów nowotworowych poprzez wstępną selekcję podzbioru klonów nowotworowych z heterogenicznych populacji komórek nowotworowych w pierwotnej zmianie i wspieranie tych wybranych klonów do przygotowania do przerzutów do określonego odległego narządu, którego mikrośrodowisko jest optymalne do rekolonizacji wybranych klonów12. Co więcej, fibroblasty i wydzielane przez nie czynniki rozpuszczalne oraz ECM uczestniczą w modulacji angiogenezy nowotworów13,14, przeciwnowotworowa odpowiedź immunologiczna15, a nawet biorą udział w lekooporności i nawrotach nowotworów16,17.

In vitro 3D sferoidalne modele guzów zostały opracowane i wykorzystane w badaniach nad rakiem jako model pośredni między hodowlami komórek rakowych in vitro a modelami nowotworów in vivo18,19,20,21. Sferoidalne modele guzów 3D zyskały popularność w badaniach nad rakowymi komórkami macierzystymi, przedklinicznych badaniach nad rakiem i badaniach przesiewowych leków, ponieważ modele te odtwarzają niektóre ważne cechy prawdziwych guzów, które są nieobecne w tradycyjnych monowarstwach 2D22. Wiele istniejących 3D sferoidalnych modeli guza składa się wyłącznie z komórek nowotworowych i brakuje im udziału komórek zrębu guza. Często powoduje to, że sferoidy guza mają niewystarczające odkładanie ECM i brak heterotypowych interakcji komórka-komórka. Konwencjonalne sferoidy 3D utworzone wyłącznie przez komórki nowotworowe i homotypową adhezję komórka-komórka mogą tylko częściowo naśladować warunki in vivo tkanek nowotworowych. Aby przezwyciężyć niektóre z tych ograniczeń, badacze zaproponowali włączenie wielu typów komórek zrębu do kokultur 3D i opracowali kilka heterotypowych modeli sferoidalnych guzów 3D23,24,25,26,27. Ponadto badacze wykorzystali egzogenne matryce 3D, w tym naturalne hydrożele lub syntetyczne polimery, takie jak glikol polietylenowy, poli(laktyd-ko-glikolid) i poli(N-izopropyloakrylamid), aby osadzić jednokomórkowe i wielokomórkowe modele sferoidalne, tworząc środowisko wspierające komórkę i odtwarzając interakcje komórka-macierz28,29, dzięki czemu systemy te są bardziej istotne biologicznie30. Jednak włączenie niektórych typów komórek zrębu, takich jak komórki śródbłonka, do kokultur 3D powoduje dodatkową złożoność systemu in vitro i utrudnia badanie heterotypowych interakcji komórka-komórka między dwoma określonymi typami komórek, takimi jak interakcje komórka-fibroblasty rakowe. Co więcej, komórki śródbłonka w prawdziwych tkankach nie zawsze bezpośrednio oddziałują z komórkami rakowymi i innymi komórkami zrębu, ponieważ na zewnątrz naczyń włosowatych znajduje się warstwa błony podstawnej, która zapobiega bezpośredniej interakcji komórek śródbłonka z komórkami rakowymi i innymi komórkami zrębu. W tych sferoidalnych modelach 3D włączone komórki śródbłonka w rzeczywistości nie tworzą naczyń krwionośnych, ale oddziałują bezpośrednio z komórkami rakowymi i innymi komórkami zrębu, co rzadko występuje in vivo. Podobnie, matryce egzogenne zastosowane w niektórych modelach sferoidalnych 3D nie są identyczne z ECM w rzeczywistych tkankach nowotworowych pod względem struktury i składu. Wszystkie te sztuczne warunki mogą skutkować wprowadzającymi w błąd danymi.

Niedawno stworzyliśmy nowy wielokomórkowy model sferoidalny 3D złożony z komórek nowotworowych i CAF. W naszym modelu powstawanie sferoid guza 3D jest całkowicie zdeterminowane przez CAF. CAF indukują i regulują fenotyp komórek macierzystych / inicjujących nowotwór. ECM wytwarzany przez CAF jest naturalny i pozwala strukturze desmoplastycznej lepiej naśladować mikrośrodowisko guza in vivo. Ten nowatorski model 3D może być użytecznym narzędziem do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych i oferuje unikalną platformę do badania interakcji guz-zręb, wyjaśnienia, w jaki sposób CAF reguluje komórki macierzyste/inicjujące raka oraz zbadania udziału interakcji zrębu we wrażliwości i oporności na leki przeciwnowotworowe.

Protokół

1. Hodowla komórek czerniaka i fibroblastów skóry

  1. Hodowla ludzkich komórek czerniaka
    1. Hodowla ludzkich komórek czerniaka, C816131 w konwencjonalnych warunkach hodowli komórek przylegających w kompletnym podłożu W489 (patrz krok 1.2) w inkubatorze o temperaturze 37 °C zasilanym 5% CO2, jak opisano wcześniej32. Podziel komórki w stosunku 1:5, gdy osiągną ~90% zbieżności.
  2. Pożywka do hodowli komórek czerniaka (W489)
    1. W przypadku kompletnej pożywki W489 należy użyć 80% pożywki MCDB153, 20% pożywki L-15 (patrz tabela materiałów), 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 μg/ml insuliny, 1,68 mM CaCl2 i 0,11% wodorowęglanu sodu. W przypadku kokultury nie należy dodawać FBS, insuliny i CaCl2.
  3. Izolacja fibroblastów skóry myszy
    1. Wytnij fragment skóry myszy o wymiarach 1 cm x 1 cm zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt (IACUC).
    2. Trawić skórę przez dyspazę (patrz Tabela Materiałów) w temperaturze 4 °C przez noc. Usunąć skórę właściwą z naskórka i dalej trawić kolagenazą (1 mg/ml w DMEM, patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej (RT) przez noc.
  4. Hodowla fibroblastów skóry myszy
    1. Przemyć osady tkanek PBS i wyhodować je w DMEM z 10% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną w temperaturze 37 °C/5% CO2 . Podziel komórki w stosunku 1:2, gdy osiągną ~90% konfluencji.
    2. Transdukuj fibroblasty skóry za pomocą GFP / lentiwirusa przy użyciu standardowych metod przed kokulturą.
  5. Charakterystyka fibroblastów skóry myszy za pomocą barwienia immunologicznego
    1. Przygotowanie komórek do barwienia
      1. Wysiewaj fibroblasty skóry w 24-dołkowej płytce o gęstości 2 x 104 komórek / dołek. W dniu 2 umyj komórki PBS 2x i utrwal je w 2% neutralnej buforowanej formalinie na 10 minut. Usuń formalinę i dwukrotnie umyj utrwalone komórki PBS.
    2. Barwienie immunologiczne
      1. Dodać 200 μl roztworu blokującego do każdej studzienki i inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej, następnie dodać mysi anty-α-SMA rozcieńczony w stosunku 1:200 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Przemyć PBS 3x, po 5 minut każdy.
      2. Dodać Alex Fluor 488 kozi anty-mysi IgG w rozcieńczeniu 1:400 i inkubować w temperaturze RT przez 1 godzinę. Wypłukać przeciwciała 3x PBS każde, po 5 minut.
      3. Dodać 1 μg/ml DAPI i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Usunąć roztwór DAPI i dodać 500 μl PBS do każdej studzienki.
      4. Obserwuj komórki i rób zdjęcia za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.
  6. Wstępne znakowanie fibroblastów i komórek czerniaka
    1. Nasiona fibroblastów umieszcza się w naczyniu o średnicy 100 mm w pierwszym dniu, tak aby zbieg komórek osiągnął ~60% następnego dnia. W dniu 2 usuń pożywkę hodowlaną i dodaj GFP/lentiwirusa (~1:3–1:5 rozcieńczony z bulionu) do zwykłej pożywki hodowlanej z 4 μg/ml polibrenu. Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 6 godzin, usunąć pożywkę i zastąpić świeżą, zwykłą pożywką hodowlaną. Po 2 dniach obserwuj sygnał GFP z komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Transdukuj komórki C8161 za pomocą DsRed / lentiwirusa w podobnych warunkach. Protokoły przygotowania GFP/lentivirus i DsRed/lentivirus zostały opisane wcześniej14,34.

2. Kokultura komórkowa

  1. Zasiej kokulturę C8161-fibroblastów.
    1. W dniu 0 testu tworzenia sferoidów odłącz zarówno C8161, jak i fibroblasty skóry za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA. Odwiruj komórki w masie 250 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i przemyj raz PBS.
    2. Ponownie zawiesić komórki w pożywce do kokultury komórkowej (pożywka W489 bez surowicy, bez insuliny i bez wapnia zmieszana z DMEM wolnym od surowicy w stosunku 1:1). Dostosuj stężenie komórek do 2 x 104 komórek/ml.
    3. Wymieszaj komórki C8161 z fibroblastami w stosunku 1:1 i dodaj 2 ml mieszanin komórek do każdego dołka na 24-dołkowej płytce. Każda studzienka powinna zawierać 2 x 104 komórek każdego typu. Każdy warunek należy wykonać w trzech egzemplarzach.
      UWAGA: Ważne jest, aby używać płytki niepoddanej hodowli tkankowej (patrz Tabela materiałów). W przeciwnym razie komórki będą silnie przyczepiać się do płytki i nie będą w stanie zawiesić sferoid.
  2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 4 godziny, aż komórki przyczepią się do płytki, a następnie wykonać obrazowanie poklatkowe lub skanowanie konfokalne we wskazanych punktach czasowych dla każdego testu.

3. Obrazowanie poklatkowe na żywo komórek

  1. Przed kokulturacją włączyć system obrazowania poklatkowego (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta i pozwolić inkubatorowi osiągnąć temperaturę 37 °C i 5%CO2. Zwykle potrzeba 1 godziny, aby system osiągnął równowagę. Ostrożnie umieść płytkę hodowlaną na stoliku mikroskopu wewnątrz inkubatora i bezpiecznie zablokuj drzwiczki.
  2. Otwórz oprogramowanie systemu obrazowania poklatkowego (patrz Tabela materiałów) i wybierz typ płytki oraz producenta, aby mikroskop mógł dokładnie zlokalizować obszar skanowania. Wybierz interesujące Cię studnie i soczewkę obiektywową 10x. Wybierz ustawienia obszaru skanowania, odstęp czasu między skanowaniami oraz czas rozpoczęcia i zakończenia. W tym protokole maksymalny numer formatu dla obszaru skanowania dla 1 dołka wynosi 36, a czas interwału wynosi 1 godzinę.
  3. Nagrywaj obrazowanie poklatkowe od 4 do 52 godz.
    UWAGA: Czas rozpoczęcia, czas zakończenia i czas trwania powinny być zoptymalizowane pod kątem typu komórki i celu eksperymentu.
  4. Po zakończeniu nagrywania obrazu użyj oprogramowania systemu obrazowania poklatkowego, aby pobrać dane i wyeksportować filmy lub zestawy obrazów.

4. Mikroskopia konfokalna i filmy 3D

  1. Umieścić płytkę kokultury komórkowej na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów) i użyć czerwonych i zielonych wiązek laserowych. Obserwuj komórki pod soczewką obiektywu 5x lub 10x i wybierz sferoidę, aby rozpocząć skanowanie.
  2. Użyj kroku Z 1 μm, aby zeskanować od dołu do góry sferoidy. Przetwarzaj dane za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu (patrz tabela materiałów), aby zrekonstruować obraz 3D, który można dalej obracać i zapisywać jako film 3D.

5. Indywidualna hodowla komórek czerniaka i tworzenie klastrów/agregatów 2D

  1. Wysiewać 2 x 104 komórki czerniaka C8161 do każdej studzienki 24-dołkowej płytki, jak opisano w sekcji 2.1. Hoduj komórki przez 7-10 dni i fotografuj je za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.

6. Sprawdzanie, czy sferoidy 3D i klastry/agregaty komórek 2D są zawieszone w medium lub przymocowane do płyt

  1. W przypadku kokultury komórkowej sprawdź sferoidy 3D utworzone w dniu 7. W przypadku hodowli jednokomórkowej należy sprawdzić klastry/agregaty 2D utworzone w dniu 10.
  2. Ustaw płytki do hodowli komórkowych na platformie odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Umieścić wygiętą igłę ze strzykawką w studzience i delikatnie zasysać pożywkę hodowlaną do środka i na zewnątrz, aby zakłócić działanie pożywki w studzienkach. Nagraj ten proces w trybie filmowania w oprogramowaniu filmowym (patrz Spis materiałów). Sferoidy 3D będą ruchome, ale skupiska/agregaty komórek 2D pozostaną niezmienne.

7. Konfokalny obraz sferoid 3D

UWAGA: Hodowane komórki zaczynają tworzyć sferoidy od 48 do 72 godzin, w zależności od rodzaju użytych fibroblastów. Ogólnie rzecz biorąc, sferoidy powiększają się stopniowo z czasem. Małe sferoidy mogą łączyć się, tworząc większe sferoidy do 7 dnia. Po ustabilizowaniu wielkości sferoidy mogą trwać dłużej niż 10 dni. Następnie sferoidy często odrywają się od dna płytki hodowlanej i gromadzą się w środku studni. Podczas powiększania się sferoid komórki w środku zwykle umierają z powodu niewystarczającego odżywiania i/lub toksycznego mikrośrodowiska. W związku z tym szczyt powstawania sferoidów 3D i czas obrazowania dojrzałych sferoid powinny być zoptymalizowane za pomocą eksperymentów pilotażowych. W przypadku tego protokołu mikroskopię konfokalną wykonano około 7 dnia, kiedy sferoidy były dojrzałe, a komórki w środku sferoid były nadal żywe, zgodnie z fluorescencją i morfologią komórek w środku.

  1. Aby wykonać mikroskopię konfokalną, użyj zielonego i czerwonego lasera do zeskanowania sferoid. Określ obszar skanowania pod obiektywem 10x i przesuwaj się od dołu do góry sferoidy za pomocą kroku Z 1 μm.
  2. Generuj filmy 3D dotyczące powstawania i obracania sferoid za pomocą funkcji projekcji 3D w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu (np. ImageJ).

8. Aktywność wewnątrzkomórkowego szlaku sygnałowego Notch1 w określaniu regulacji zrębu komórek macierzystych raka/inicjujących

  1. Izolacja i charakterystyka fibroblastów skóry u myszy Notch1 ze wzmocnieniem i utratą funkcji
    1. Wyizoluj fibroblasty skóry od dwóch par genetycznie zmodyfikowanych myszy: Gain-Of-Function Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-;ROSALSL-N1IC+/+) myszy kontra ich odpowiednik kontrolny (GOFctrl : FSP1. Cre-/-; ROSALSL-N1IC+/+) myszy i Notch1 z funkcją utraty funkcji1 (LOFNotch1: Fsp1.Cre+/-;Myszy Notch1LoxP/LoxP+/+) kontra ich odpowiednik kontrolny (LOFctrl : FSP1. Cre-/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) myszy31, odpowiednio. Wyizolować i scharakteryzować fibroblasty skóry za pomocą protokołu opisanego w punktach 1.3-1.5.
  2. Transdukuj fibroblasty skóry myszy za pomocą GFP / lentiwirusa.
    1. Patrz punkt 1 w celu zapoznania się z metodą transdukcji komórek za pomocą wektora lentiwirusowego.
  3. Kokultura fibroblastów i komórek czerniaka
    1. Przeprowadzić doświadczenie z kokulturą komórkową zgodnie z opisem w sekcji 2.
  4. Ocena wpływu wewnątrzkomórkowej aktywności szlaku Notch1 w fibroblastach na określenie regulacji zrębu komórek macierzystych/inicjujących raka poprzez pomiar rozmiarów sferoid 3D
    1. Przeprowadzić kwantyfikację powstawania sferoidów w każdych warunkach, fotografując sferoidy w czasie, gdy sferoidy są dojrzałe (wskazywane przez zatrzymanie wzrostu około 5-7 dnia, w zależności od typów fibroblastów). Zmierz rozmiary sferoid 3D za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.

9. Testowanie odpowiedzi na lek komórek macierzystych/inicjujących raka za pomocą testu sferoidalnego 3D

UWAGA: CAF może regulować heterogeniczność nowotworów i indukować fenotyp komórek macierzystych/inicjujących raka. CAF wspiera również komórki macierzyste / inicjujące raka, aby wytrzymać leczenie kliniczne. Wykazano, że rakowe komórki macierzyste są odpowiedzialne za oporność na leki. Dlatego wykorzystaliśmy ten sferoidalny model 3D do oceny odpowiedzi na lek komórek macierzystych/inicjujących raka. Wynik może dobrze ocenić potencjalną skuteczność kliniczną leków przeciwnowotworowych.

  1. Podawanie leków
    1. Bezpośrednio po kokulturacji komórek na 24-dołkowej płytce należy przygotować leki w seryjnym rozcieńczaniu w pożywce hodowlanej, aby osiągnąć 5-krotność pożądanego zakresu stężeń na podstawie eksperymentów pilotażowych (tj. 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM i 25 nM).
      Dodać 0,5 ml odpowiednich roztworów leków do każdej studzienki współhodowanych komórek. Potraktuj grupę kontrolną zwykłymi pożywkami kokulturowymi, jak wspomniano powyżej.
    2. UWAGA: Inhibitor MEK jest rozpuszczalny w pożywkach do hodowli komórkowych. Dlatego ślepa próba kontrolna to 2,5 ml pożywki do hodowli komórkowych. Jeśli jednak lek nie jest rozpuszczalny w roztworze wodnym i wymaga rozpuszczalników, takich jak DMSO, wówczas do grupy kontrolnej należy zastosować pożywkę do hodowli komórkowych o tym samym stężeniu DMSO.
  2. Kwantyfikacja odpowiedzi na lek poprzez zliczanie sferoid
    1. Obserwuj leczone komórki i nieleczone komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i fotografuj komórki każdego dnia. Określ ilościowo powstawanie sferoidów w różnych grupach eksperymentalnych i porównaj zdolność kultur komórkowych do tworzenia sferoid przy różnych stężeniach leków.
      UWAGA: Sferoidy pojawiają się zwykle ~5−7 dni po kokulturze. Efekty działania leku staną się zauważalne w tym momencie.
    2. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby zobrazować/sfotografować sferoidy i komórki w studzienkach, a następnie użyj oprogramowania do obrazowania, aby obliczyć średni rozmiar sferoid i liczbę sferoid utworzonych w polu o małej mocy (LPF x 4) w każdej grupie badanej w czasie.
      UWAGA: Komórki, które otrzymują skuteczne leczenie farmakologiczne, powinny tworzyć mniej sferoid lub nie tworzyć ich wcale w porównaniu z grupą kontrolną. Jest to wskaźnik skuteczności badanego leku w hamowaniu nowotworowych komórek macierzystych.

Wyniki

Opracowaliśmy nową metodę generowania sferoidów 3D z wykorzystaniem in vitro heterotypowego systemu kokultury komórek, który naśladuje in vivo mikrośrodowisko guza. Fibroblasty pochodzą z fibroblastów skóry mysiej. Fibroblasty skóry wygenerowano zgodnie z powyższym opisem i scharakteryzowano jako komórki α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+. Ludzkie przerzutowe komórki czerniaka (C8161) hodowano w pożywce W489 zgodnie z opisem32. Aby umożliwić wizualizację i odróżnienie fibroblastów od komórek nowotworowych, przed kokulturą komórek fibroblasty i komórki czerniaka poddano odpowiednio transdukcji GFP/lentiwirusem oraz DsRed/lentiwirusem34,36.

Rysunek 1 przedstawia przykład wielokomórkowych sferoidów 3D powstałych w wyniku kokultury komórek czerniaka i fibroblastów. Komórki czerniaka hodowane bez fibroblastów nie tworzyły typowych sferoidów 3D, choć niektóre z nich tworzyły skupiska/agregaty 2D wraz z przedłużeniem czasu hodowli. Średnia wielkość sferoidów w dniach ~5−7 wynosiła około 170–360 μm średnicy (średnia = 275, SD = 37). Wykorzystując obrazowanie time-lapse, zaobserwowaliśmy, że fibroblasty i komórki nowotworowe w kokulturze wchodziły w interakcje i zaczęły tworzyć sferoidy 3D około 36 h kokultury, co pokazano w Wideo 1. Obrazowanie time-lapse zarejestrowało dynamiczny proces interakcji międzykomórkowych oraz początkową fazę tworzenia sferoidów w czasie ~4–52 h kokultury. Szczyt tworzenia sferoidów 3D wystąpił około 5–7 dnia. Powstałe sferoidy 3D składały się z fibroblastów i komórek czerniaka, przy czym większość (~80%) stanowiły komórki nowotworowe. Wideo 2 pokazuje dynamiczny proces tworzenia skupisk/agregatów komórkowych przez pojedynczo hodowane komórki czerniaka (DsRed+/C8161), rozpoczynający się od ~4–52 h w hodowli pojedynczej. Tworzenie skupisk/agregatów 2D osiągnęło szczyt około 7–10 dnia. Wideo 3 oraz Wideo 4 przedstawiają odpowiednio strukturę sferoidu 3D i skupiska komórek nowotworowych 2D zwizualizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Sferoid 3D i skupiska komórek nowotworowych 2D zostały zbadane za pomocą mikroskopii konfokalnej w 7 dniu kokultury komórek. Wideo 5 pokazuje, że sferoidy 3D były zawieszone w pożywce hodowlanej i mobilne, podczas gdy Wideo 6 pokazuje, że skupisko komórek nowotworowych 2D było przytwierdzone do płytki hodowlanej i nieruchome. Zawieszenie w pożywce jest cechą sferoidów 3D, która odróżnia je od skupisk 2D. Gdy pożywka w naczyniu lub dołku hodowlanym zostanie poruszona poprzez upuszczenie lub delikatne pipetowanie pożywki, zawieszone sferoidy 3D poruszają się, natomiast skupiska komórkowe 2D pozostają nieruchome. Mobilne są jedynie nieliczne pojedyncze martwe komórki.

Rysunek 2A przedstawia przykład tego modelu 3D, który służy jako unikalna platforma do badania interakcji między guzem a zrębem oraz do wyjaśnienia, w jaki sposób aktywność wewnątrzkomórkowej ścieżki sygnałowej Notch1 w CAF reguluje komórki macierzyste/inicjujące nowotworu oraz tworzenie sferoidów. Wykorzystano dwie pary fibroblastów (Fb) wyizolowanych ze skóry myszy z funkcją wzmocnioną Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-;ROSALSL-N1IC+/+) w porównaniu z odpowiadającą im grupą kontrolną (GOFctrl: FSP1.Cre-/-;ROSALSL-N1IC+/+) oraz myszy z funkcją utraconą Notch1 (LOFNotch1: Fsp1.Cre+/-;Notch1LoxP/LoxP+/+) w porównaniu z odpowiadającą im grupą kontrolną (LOFctrl: FSP1.Cre-/-; Notch1LoxP/LoxP+/+)35. Wszystkie fibroblasty zostały przetransdukowane lentiwirusem GFP i współhodowane z komórkami czerniaka C8161 uprzednio przetransdukowanymi lentiwirusem DsRed. Obrazowanie time-lapse wykazuje, że Fb-GOFNotch1 zahamowały tworzenie sferoidów 3D przez komórki czerniaka C8161 w porównaniu do Fb-GOFctrl podczas pierwszych ~4-52 h współhodowli komórek. Przeciwnie, Fb-LOFNotch1 promowały tworzenie sferoidów 3D przez komórki czerniaka C8161 w porównaniu do Fb-LOFctrl. Rysunek 2B, góra, przedstawia reprezentatywne obrazy sferoidów 3D utworzonych w 7. dniu współhodowli komórek z różnymi fibroblastami o zróżnicowanej aktywności ścieżki Notch. Rysunek 2B, dół, przedstawia dane ilościowe dotyczące średniej wielkości sferoidów 3D utworzonych w 7. dniu współhodowli komórek z różnymi fibroblastami o zróżnicowanej aktywności ścieżki Notch.

Rysunek 3 przedstawia przykład wykorzystania tego modelu 3D do badania odpowiedzi komórek macierzystych/inicjujących nowotwór na lek. Wykazano, że komórki macierzyste/inicjujące nowotwór są odpowiedzialne za lekooporność i nawroty nowotworu. Dlatego ocena odpowiedzi na lek z wykorzystaniem tego modelu 3D może lepiej ujawnić potencjalną skuteczność kliniczną leku w leczeniu nowotworów. Komórki czerniaka C8161 polegają na aktywnym sygnałowaniu MAPK w celu wzrostu i inwazji komórek. Wykazują one również wysoki poziom ekspresji CDK4/Kit, ale nie posiadają mutacji BRAF. Aby przetestować odpowiedź komórek macierzystych/inicjujących nowotwór na inhibitor MAPK z wykorzystaniem tego modelu 3D, przeprowadzono kokulturę komórek czerniaka C8161 i fibroblastów w płytkach 24-dołkowych. PD0325901 (patrz Tabela materiałów), inhibitor MAPK, został przygotowany w rozcieńczeniach szeregowych w zakresie stężeń od 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM do 25 nM. PD0325901 dodawano do kokultur komórek podczas wysiewania mieszanin komórkowych. Jako kontrolę wykorzystano nieleczone komórki w kokulturze. Oceńiono zdolność kokultur komórkowych do tworzenia sferoidów przy różnych stężeniach leku i porównano ją z nieleczoną kontrolą. Rysunek 3A przedstawia reprezentatywne obrazy sferoidów 3D utworzonych w 5. dniu kokultury komórek przy różnych stężeniach leku. Rysunek 3B zawiera dane ilościowe dotyczące średniej wielkości pojedynczego sferoidu oraz liczby utworzonych sferoidów 3D na pole widzenia przy małym powiększeniu (LPF x 4) w 5. dniu kokultury komórek przy różnych stężeniach leku.

Porównanie wzrostu hodowli komórek fibroblastów i C8161, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, dzień 0 i dzień 7.
Rysunek 1: Formowanie sferoidów 3D i klastrów 2D. (A) Reprezentatywny obraz sferoidów 3D powstałych w wyniku kokultury ludzkich komórek czerniaka C8161 i fibroblastów skóry myszy. Sferoidy 3D sfotografowano w 7. dniu kokultury komórek czerniaka i fibroblastów. Średnia wielkość sferoidów w dniach ~5−7 wynosiła ok. 170–360 μm średnicy (średnia = 275, SD = 37). Średnia liczba sferoidów wynosiła 18–26 (20,5 ± 3,6) na pole widzenia przy małym powiększeniu (LPF x4). (B) Reprezentatywny obraz 2D klastrów komórek nowotworowych powstałych w monokulturze komórek czerniaka C8161. 2D klastry komórek czerniaka sfotografowano w 7. dniu monokultury komórek czerniaka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki testu agregacji komórek z wykresami słupkowymi; kontrola vs. Notch1 w komórkach Fb (leczenie C8161).
Rysunek 2: Wyjaśnienie roli aktywności wewnątrzkomórkowej ścieżki sygnałowej Notch1 w CAF w regulacji nowotworowych komórek macierzystych/inicjujących z wykorzystaniem modelu sferoidów 3D. (A) Aktywność wewnątrzkomórkowej ścieżki sygnałowej Notch1 w CAF determinowała tworzenie sferoidów przez komórki czerniaka w kokulturze komórkowej. Film time-lapse pokazuje, że Fb-GOFNotch1 zahamował tworzenie sferoidów 3D przez komórki czerniaka C8161, podczas gdy Fb-LOFNotch1 promował tworzenie większej liczby sferoidów 3D przez komórki czerniaka C8161 podczas pierwszych 4–52 h kokultury komórkowej. (B) Góra: Reprezentatywne obrazy sferoidów 3D utworzonych w 7. dniu kokultury komórkowej z różnymi fibroblastami o zróżnicowanych funkcjach ścieżki Notch. Dół: Dane ilościowe dotyczące średniego rozmiaru (średnica [μm]/sferoid) sferoidów 3D utworzonych w 7. dniu kokultury komórkowej z różnymi fibroblastami o zróżnicowanej aktywności ścieżki Notch. Do analizy statystycznej zastosowano dwustronny test t studenta. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Test żywotności komórek, analiza mikroskopowa fluorescencyjna, liczba i wielkość sferoidów, wyniki zależne od stężenia.
Rycina 3: Ocena odpowiedzi leku w nowotworowych komórkach macierzystych/inicjujących z wykorzystaniem modelu 3D sferoidów. (A) Reprezentatywne obrazy sferoidów 3D utworzonych w 5. dniu kokultury komórek przy różnych stężeniach leku. (B) Dane ilościowe dotyczące średniej wielkości (średnica [μm]/sferoid) oraz liczby sferoidów 3D na pole widzenia przy małym powiększeniu (LPF x 4) utworzonych w 5. dniu kokultury komórek przy różnych stężeniach leku. Dane ilościowe przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej hodowli komórkowych, przedstawiający zielone i czerwone markery fluorescencyjne.
Wideo 1: Dynamiczny proces tworzenia się sferoidów 3D we wczesnej fazie kokultury komórek. Obrazowanie time-lapse pokazuje dynamiczne interakcje międzykomórkowe między fibroblastami a komórkami nowotworowymi w kokulturze oraz tworzenie się sferoidów 3D w ciągu pierwszych ~4–52 h kokultury komórek. Komórki zaczęły tworzyć sferoidy 3D około 48 h po rozpoczęciu kokultury. Szczyt tworzenia się sferoidów 3D nastąpił w dniu ~5−7 (nie pokazano tutaj). Sferoidy 3D składały się z fibroblastów i komórek czerniaka, z czego większość (~80%) stanowiły komórki nowotworowe. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej; rozkład komórkowy; spektroskopia optyczna; analiza w dniu 0.
Wideo 2: Dynamiczny proces tworzenia się klastrów 2D we wczesnej fazie kokultury komórek. Obrazowanie time-lapse przedstawia dynamiczny proces tworzenia się klastrów 2D przez komórki czerniaka C8161 w kulturze pojedynczej. Tworzenie klastrów 2D nastąpiło około 7–10 dnia. Obrazowanie time-lapse rejestruje okres ~4–52 h w kulturze pojedynczej komórek czerniaka DsRed+/C8161. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Obraz z konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej; struktura komórkowa; czerwone i zielone białka fluorescencyjne.
Wideo 3: Architektura i rotacja sferoidu 3D w wizualizacji mikroskopii konfokalnej. Architektura i rotacja sferoidu 3D. Do skanowania sferoidów utworzonych w 7. dniu kokultury komórkowej wykorzystano lasery zielony i czerwony. Obszar skanowania określono przy użyciu obiektywu 10x. Skanowanie przebiegało od dołu do góry sferoidu z krokiem z wynoszącym 1 µm. Film przedstawiający rotację sferoidu 3D został utworzony w oprogramowaniu Fiji. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Mikroskopia fluorescencyjna, struktury komórkowe w kolorze czerwonym, wzbudzenie optyczne, analiza obrazowania komórkowego.
Wideo 4: Architektura i rotacja 2D klastra komórek nowotworowych w obrazowaniu mikroskopem konfokalnym. Architektura i rotacja klastra 2D. Obrazy konfokalne klastrów komórek wykonano w 7. dniu monokultury komórek czerniaka. Obszar skanowania określono przy użyciu obiektywu 10x. Skanowanie rozpoczęto od dołu do góry sferoidu z krokiem z wynoszącym 1 µm. Film z rotacją klastra 2D został stworzony przy użyciu oprogramowania Fiji. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej komórek z czerwonym barwieniem jąder do badań nad analizą komórkową.
Wideo 5: Ruch sferoidów 3D. Sferoidy 3D pozostawały w zawiesinie w medium hodowlanym i nie przylegały do naczynia/dołka hodowlanego. Po delikatnym pipetowaniu, które zakłóciło spokój medium w dołku hodowlanym, zawieszone sferoidy 3D zaczęły się poruszać. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Mikroskopia fluorescencyjna: analiza emisji struktur komórkowych; kolor fioletowo-czerwony, eksperyment obrazowania komórkowego.
Wideo 6: Stabilność dwuwymiarowych (2D) skupisk komórek nowotworowych. Skupisko komórek nowotworowych 2D było zakotwiczone do płytki hodowlanej i pozostało nieruchome pomimo zaburzeń w medium hodowlanym. Kilka pojedynczych martwych komórek było ruchomych. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Dyskusja

Techniki hodowli komórkowych 3D in vitro są szeroko stosowane od dziesięcioleci w badaniach nad rakiem. W porównaniu z konwencjonalnymi systemami hodowli komórkowych 2D, mikrośrodowisko 3D podsumowuje interakcje komórka-komórka i/lub komórka-macierz i umożliwia naśladowanie rzeczywistych warunków obserwowanych w tkankach nowotworowych. Jednak system 3D utworzony tylko przez komórki nowotworowe i homotypowe interakcje komórka-komórka nie bierze pod uwagę znaczenia heterotypowych przesłuchów i może dostarczać niedokładnych wyników badań. Niedawno opracowaliśmy nowatorski system 3D łączący komórki rakowe i CAF, aby lepiej naśladować in vivo heterogeniczne mikrośrodowisko guza oraz jego natywną i sztywną reakcję desmoplastyczną.

Fibroblasty są głównymi składnikami zrębu guza. CAF biorą udział w regulacji progresji guza poprzez wywoływanie czynników rozpuszczalnych, ECM / enzymów remodelujących10,11 i egzosomów. Dodatkowo CAF odgrywają rolę w lekooporności i nawrotach nowotworów16,17. Nasz wielokomórkowy system sferoidalny 3D może być wykorzystany do badania molekularnych mechanizmów interakcji guz-zręb oraz do rozwiązywania problemów związanych z opornością na leki i nawrotami nowotworów. CAF pochodzą głównie z aktywowanych miejscowych fibroblastów w stanie spoczynku i rekrutowanych krążących MSC szpiku kostnego, które ulegają różnicowaniu in situ do CAF w tkance nowotworowej 37,38,39. W obecnym badaniu wykorzystaliśmy fibroblasty skóry do stworzenia wielokomórkowego modelu sferoidalnego 3D. Jednak inny rodzaj fibroblastów (np. MSC-DF) również działa w bardzo podobny sposób jak fibroblasty skóry, regulując tworzenie sferoidów 3D komórek nowotworowych34. MSC-DF może być wytwarzany z mysiego szpiku kostnego MSC, który jest wzbogacany przez hodowlę jednojądrzastych komórek szpiku kostnego w pożywce do hodowli komórek MSC przez około 10 dni z okresowymi zmianami pożywki co 3 dni. Te MSC są scharakteryzowane jako CD73+/CD105+/Lin-. Aby zróżnicować MSC na fibroblasty, MSC są następnie hodowane z kompletnym DMEM przez dodatkowe 2 tygodnie. MSC-DF są scharakteryzowane jako komórki α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+ 36. MSC-DF może być ważnym regulatorem nowotworu. Ponieważ frakcja CAF w wielu typach guzów litych różni się od rekrutowanego krążącego MSC uwalnianego ze szpiku kostnego36, MSC-DF może być obiecującym celem leczenia. Są one również znacznie łatwiejsze do terapeutycznego manipulowania lub ukierunkowania, zanim zostaną zrekrutowane do tkanek nowotworowych i zróżnicowane w CAF. Dzięki temu nasz model 3D oferuje idealny system do badania i testowania nie tylko komórek nowotworowych, ale także różnych frakcji lub subpopulacji CAF. Metoda tworzenia sferoid 3D jest prosta. Krytyczne etapy obejmują użycie pożywki wolnej od surowicy do kokultury, zastosowanie odpowiedniego stosunku fibroblastów do komórek nowotworowych oraz użycie odpowiednich płytek hodowlanych do kokultury. Potencjalnym ograniczeniem naszej metody jest to, że tworzenie sferoid 3D jest w dużej mierze zależne od linii komórek rakowych. Nasz protokół tworzenia sferoidów może wymagać optymalizacji stosunku między fibroblastami a komórkami rakowymi, jeśli stosowane są różne linie komórek rakowych. Należy zauważyć, że do tworzenia sferoid 3D użyliśmy modelu kokultury ludzkich komórek czerniaka i mysich komórek fibroblastów, ponieważ znacznie łatwiej jest stworzyć komórki GOF lub LOF w fibroblastach myszy w celu zbadania roli cząsteczki lub szlaku sygnałowego w regulacji tworzenia sferoidów guza. Zdolność ludzkich komórek czerniaka i fibroblastów myszy do tworzenia sferoid wskazuje, że cząsteczki wymagane do komunikacji komórka-komórka działają międzygatunkowo. Niedawno przetestowaliśmy kokulturę ludzkich fibroblastów z ludzkimi komórkami czerniaka i stwierdziliśmy, że ludzkie fibroblasty mogą również regulować ludzkie komórki czerniaka, tworząc sferoidy 3D.

Zastosowaliśmy ludzkie komórki czerniaka z przerzutami, C8161, w naszym wielokomórkowym modelu sferoidalnym 3D. Przetestowaliśmy również inne ludzkie komórki czerniaka, na przykład 1205Lu32, który jest nosicielem mutacjiBRAF V600E , i MeWo, który wyraża wysoki poziom CDK4 / Kit (ATCC HTB-65) i stwierdziliśmy, że są one również zdolne do tworzenia sferoid 3D w kokulturze. Wskazuje to, że tworzenie sferoid 3D przez komórki nowotworowe jest niezależne od typów mutacji onkogennych. Chociaż nie sprawdziliśmy, czy inne typy komórek nowotworowych innych niż czerniak są zdolne do tworzenia sferoid 3D z fibroblastami, nasze odkrycia wskazują, że tworzenie sferoid 3D nie jest ograniczone do linii komórkowej czerniaka i może nie zależeć od określonej linii komórek rakowych.

Pokazaliśmy dwa przykłady praktycznych zastosowań naszego modelu sferoidalnego 3D. Jednym z przykładów było wyjaśnienie aktywności wewnątrzkomórkowego szlaku sygnałowego Notch w regulacji fenotypu komórek macierzystych raka / komórek inicjujących i tworzeniu sferoidów 3D. Wykazaliśmy, że wewnątrzkomórkowy szlak sygnałowy Notch w CAF jest przełącznikiem molekularnym kontrolującym fenotyp komórek macierzystych / inicjujących raka za pomocą tego sferoidalnego modelu 3D. Nasze odkrycia nie tylko odkrywają mechanizm molekularny leżący u podstaw regulacji zrębu komórek macierzystych/inicjujących raka i heterogeniczności raka, ale także podkreślają, że szlak Notch w CAF jest krytycznym celem terapii czerniaka. Ten przykład wskazuje, że nasz model sferoidalny 3D jest bardzo przydatny do badania mechanizmów interakcji komórek rakowych z fibroblastami zrębu i identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych. Innym przykładem było przetestowanie odpowiedzi nowotworowych komórek macierzystych/inicjujących w obecności CAF. Powszechnie wiadomo, że odpowiedź na lek komórek nowotworowych, w tym komórek macierzystych raka/inicjujących, różni się w zależności od obecności i braku CAF. Obecność CAF w tym systemie in vitro sprawia, że model ten jest bardziej istotny klinicznie, a generowane wyniki testów bardziej wiarygodne. Co więcej, nasz system sferoidalny 3D jest wszechstronny. Może być używany do różnych celów. Na przykład, jeśli w tym modelu 3D zostaną wykorzystane lekooporne komórki rakowe, można go zmienić, aby rozwiązać problem oporności na leki i być może nawrotu nowotworu. Można go również zmodyfikować w celu testowania lub badań przesiewowych leków, które są głównie ukierunkowane na CAF w leczeniu raka. CAF stały się ostatnio obiecującymi celami terapeutycznymi. Kierowanie na CAF ma swoje zalety. Po pierwsze, w porównaniu z komórkami nowotworowymi, które są nieprawidłowe (często ze zmianami genetycznymi) i inteligentne (łatwo uzyskują oporność na chemo- i radioterapię), CAF w tkance nowotworowej są normalnymi komórkami i genetycznie bardziej stabilnymi, więc jest mniej prawdopodobne, że rozwiną oporność na leczenie. Po drugie, celowanie w CAF nie zależy od rodzaju mutacji onkogennych w komórkach nowotworowych. Po trzecie, celowanie w CAF może osiągnąć wiele efektów trafienia poprzez zależne od fibroblastów przeciwnowotworowe, antyangiogenezę i / lub modulowanie odpowiedzi immunologicznej raka. Nasz model sferoidalny 3D jest potężnym narzędziem do odkrywania różnych zestawów strategii terapeutycznych w leczeniu raka.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy dr Omaida C. Velazquez (University of Miami) za pomocną współpracę, konsultacje i dyskusję; dr Jie Li (University of Miami) za dostarczenie komórek MeWo; oraz dr Meenhard Herlyn (The Wistar Institute) za dostarczenie wszystkich innych komórek czerniaka. Dziękujemy również dr Marci Boulinie, dyrektorowi Analytical Imaging Core Facility na Uniwersytecie w Miami, za analizę obrazową. Zhao-Jun Liu był wspierany przez granty z Bankhead-Coley Cancer Research Program (Award# 09BN-11), Women's Cancer Association (53. roczny grant) oraz fundusze wewnętrzne z University of Miami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Trypsyna-EDTACorning25-253-CI
Płytka 24-dołkowaCorning351147Płytka niepoddana hodowli tkankowej, 24-dołkowa, z płaskim dnem i pokrywką o niskiej parowaniu
Fluor 488 kozia anty-mysia IgGLife TechnologyA21202
CaCl2 1,5 MSigma-AldrichC5670-500G
Kolagenaza, typ 1ASigma-AldrichC-2674500 mg, stężenie 1 mg/ml w DMEM.
DakoCytomationDakox0909
DAPI
Dispase Grade IIRoche Diagnostics165859
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Corning10-013-CV
Płodowa surowica bydlęcaVMR97068-085Premium Grade
Fidżi (ImageJ)NIHBezpłatnie dla Pobieranie, licencja nie jest wymagana.
IncuCyte Zoom 2016AEssen Bioscience
IncuCyte Zoom SystemEssen Bioscience
InsulinaSigma-AldrichI1882
L-15 Medium (Leibovitz)Sigma-AldrichL1518
Leica SP5 Odwrócony mikroskop konfokalnyLeica
MCDB 153 ŚredniSigma-AldrichM7403-10X1L
Mysz anty α-SMA (aktyna mięśni gładkich), monoklonAbcamab18640
Mikroskop odwróconej fluorescencji OlympusIX51
Olymupus CellSensOlympus
PD0325901Selleckchem ChemicalsS1036
Penicylina Streptomycyna RoztwórCorning30-002- CI100 x
Wodorowęglan sodu 7,5%Corning25-035-CI
Alex

Bibliografia

  1. Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1091-1103 (2008).
  2. Anton, K., Glod, J. Targeting the tumor stroma in cancer therapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 10, 185-191 (2009).
  3. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  4. Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
  5. Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
  6. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  7. Lynch, C. C., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases in tumor-host cell communication. Differentiation. 70, 561-573 (2002).
  8. Midwood, K. S., Williams, L. V., Schwarzbauer, J. E. Tissue repair and the dynamics of the extracellular matrix. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 36, 1031-1037 (2004).
  9. Olumi, A. F., et al. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Research. 59, 5002-5011 (1999).
  10. Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5, 1597-1601 (2006).
  11. Luga, V., et al. Exosomes mediate stromal mobilization of autocrine Wnt-PCP signaling in breast cancer cell migration. Cell. 151, 1542-1556 (2012).
  12. Zhang, X. H., et al. Selection of bone metastasis seeds by mesenchymal signals in the primary tumor stroma. Cell. 154, 1060-1073 (2013).
  13. Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
  14. Shao, H., et al. Activation of Notch1 signaling in stromal fibroblasts inhibits melanoma growth by upregulating WISP-1. Oncogene. 30, 4316(2011).
  15. Ziani, L., Chouaib, S., Thiery, J. Alteration of the Antitumor Immune Response by Cancer-Associated Fibroblasts. Frontier in Immunology. 9, 414(2018).
  16. Kraman, M., et al. Suppression of antitumor immunity by stromal cells expressing fibroblast activation protein-alpha. Science. 330, 827-830 (2010).
  17. Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
  18. Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 3 (1), 1-10 (2007).
  19. Santiago-Walker, A., Li, L., Haass, N. K., Herlyn, M. Melanocytes: from morphology to application. Skin Pharmacology and Physiology. 22, 114-121 (2009).
  20. Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling melanoma in vitro and in vivo. Healthcare (basel). 2, 27-46 (2013).
  21. Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3D melanoma spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486(2015).
  22. Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17, 1-15 (2015).
  23. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14, (2017).
  24. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31, 108-115 (2013).
  25. Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery. Advanced Drug Delivery Review. 69-70, 29-41 (2014).
  26. Bulin, A. L., Broekgaarden, M., Hasan, T. Comprehensive high-throughput image analysis for therapeutic efficacy of architecturally complex heterotypic organoids. Scientific Reports. 7, 16645(2017).
  27. Lazzari, G., et al. Multicellular spheroid based on a triple coculture: A novel 3D model to mimic pancreatic tumor complexity. Acta Biomaterialia. 78, 296-307 (2018).
  28. Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
  29. Gu, L., Mooney, D. J. Biomaterials and emerging anticancer therapeutics: engineering the microenvironment. Nature Reviews Cancer. 16, 56-66 (2016).
  30. Tevis, K. M., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Embedded Spheroids as Models of the Cancer Microenvironment. Advanced Biosystems. 1, (2017).
  31. Welch, D. R., et al. Characterization of a highly invasive and spontaneously metastatic human malignant melanoma cell line. International Journal of Cancer. 47, 227-237 (1991).
  32. Balint, K., et al. Activation of Notch1 signaling is required for beta-catenin-mediated human primary melanoma progression. Journal of Clinical Investigation. 115, 3166-3176 (2005).
  33. Meier, F., et al. Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF. the American Journal of Pathology. 156, 193-200 (2000).
  34. Du, Y., et al. Intracellular Notch1 Signaling in Cancer-Associated Fibroblasts Dictates the Plasticity and Stemness of Melanoma Stem/Initiating Cells. Stem Cells. 37, 865-875 (2019).
  35. Shao, H., et al. Notch1 Pathway Activity Determines the Regulatory Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Melanoma Growth and Invasion. PLoS One. 10, 0142815(2015).
  36. Shao, H., et al. Notch1-WISP-1 axis determines the regulatory role of mesenchymal stem cell-derived stromal fibroblasts in melanoma metastasis. Oncotarget. 7, 79262-79273 (2016).
  37. Kalluri, R., Neilson, E. G. Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 112, 1776-1784 (2003).
  38. Price, J. E. Xenograft models in immunodeficient animals : I. Nude mice: spontaneous and experimental metastasis models. Methods in Molecular Medicine. 58, 205-213 (2001).
  39. Spaeth, E. L., et al. Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression. PLoS One. 4, 4992(2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Trójwymiarowy sferoid nowotworukokultura fibroblastówc stromalnychobrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnejobrazowanie poklatkowe (time-lapse)hodowla komórek czerniakaszlak sygnałowy Notchnowotworowe komórki macierzysteplatforma do odkrywania lekówdepozycja macierzy zewnątrzkomórkowej
Nowatorski, modulowany fibroblastami zrębu model sferoidalny 3D guza do badania interakcji guz-zręb i odkrywania leków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.