Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Produkcja zakaźnych cząstek pseudotypowanych grypy zakaźnej o wysokim mianie z glikoproteinami otoczkowymi z wysoce zjadliwych wirusów H5N1 i ptasich H7N9

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60663

⸱

15 stycznia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Central Laboratory, Hang Zhou Red Cross Hospital, 2Clinical Laboratory, Yuhang District Maternity and Child Health Care Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje eksperymentalny proces wytwarzania zakaźnych cząsteczek pseudotypowych wirusa o wysokim mianie (pp) z glikoproteinami otoczkowymi z dwóch szczepów grypy A i jak określić ich zakaźność. Protokół ten jest wysoce elastyczny do tworzenia pps dowolnego innego typu wirusów otoczkowych z różnymi glikoproteinami otoczki.

Streszczenie

Sporadyczne bezpośrednie przenoszenie wirusa wysoce zjadliwej grypy ptaków A H5N1 (HPAI H5N1) i H7N9 na ludzi oraz ich śmiertelność są poważnymi problemami zdrowia publicznego i sugerują możliwość wystąpienia epidemii. Jednak nasza wiedza molekularna na temat wirusa jest szczątkowa i konieczne jest zbadanie właściwości biologicznych jego białek otoczki jako celów terapeutycznych oraz opracowanie strategii kontrolowania infekcji. Opracowaliśmy platformę do badania wirusa ptasiej grypy (pp) w postaci stałych cząstek pseudotypowanych wirusów, w tym analizy funkcjonalnej jego glikoprotein otoczki hemaglutyniny (HA) i neuraminidazy (NA), charakterystyki reasortacji HA i NA, receptorów, tropizmów, przeciwciał neutralizujących, diagnozy, zakaźności, w celu opracowania leków i projektowania szczepionek. W tym miejscu opisujemy procedurę eksperymentalną mającą na celu ustalenie pps z glikoproteinami otoczki (HA, NA) z dwóch szczepów grypy A (HAPI H5N1 i 2013 ptasi H7N9). Ich wytwarzanie opiera się na zdolności niektórych wirusów, takich jak wirus białaczki myszy (MLV), do włączania glikoprotein otoczki do pp. Ponadto szczegółowo opisujemy, w jaki sposób te pps są oznaczane ilościowo za pomocą RT-qPCR oraz wykrywanie zakaźności natywnych i niedopasowanych wirusów pps w zależności od pochodzenia HA i NA. System ten jest bardzo elastyczny i adaptowalny i może być używany do tworzenia wirusowych pps z glikoproteinami otoczkowymi, które mogą być włączone do dowolnego innego typu wirusa otoczkowego. W ten sposób ta platforma cząstek wirusowych może być wykorzystywana do badania dzikich wirusów w wielu badaniach naukowych.

Wprowadzenie

Misją cząsteczki wirusa jest transport jej genomu z zainfekowanej komórki gospodarza do niezainfekowanej komórki gospodarza i dostarczenie go do cytoplazmy lub jądra w formie zdolnej do replikacji1. Proces ten jest początkowo wywoływany przez wiązanie się z receptorami komórek gospodarza, a następnie fuzję wirionu i błon komórkowych. W przypadku wirusów otoczkowych, takich jak wirusy grypy, glikoproteiny kolców są odpowiedzialne za wiązanie receptorów i fuzję1,2. Glikoproteiny otoczki wirusa (np. pirogeny, antygeny) biorą udział w wielu ważnych właściwościach i zdarzeniach, takich jak inicjacja cyklu życiowego wirusa (wiązanie i fuzja), patogeneza wirusa, immunogenność, apoptoza komórek gospodarza i tropizm komórkowy, komórkowy szlak endocytarny, a także transmisja międzygatunkowa i reasortacja1,3,4,5,6,7. Badania nad glikoproteinami otoczki wirusowej pomogą nam zrozumieć wiele aspektów procesu infekcji wirusowej. Pseudotypowane cząstki wirusowe (pp), zwane również pseudowirionami lub pseudocząstkami, mogą być generowane za pomocą techniki pseudotypowania8,9,10. Technologia ta została wykorzystana do opracowania pseudotypowanych cząsteczek wielu wirusów, w tym wirusowego zapalenia wątroby typu C11,12, wirusowe zapalenie wątroby typu B13, wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV)14,15 i wirus grypy16,17,18,19. Technologia ta opiera się na białku Gag-Pol lentiwirusów lub innych retrowirusów.

Pseudotypowane cząsteczki wirusa można uzyskać za pomocą systemu trójplazmidowego poprzez kotransfekcję plazmidu ekspresji glikoproteiny otoczki wirusa, plazmidu retrowirusowego bez genu env otoczki i oddzielnego plazmidu reporterowego do komórek producenta pp. Retrowirus jest składany przez białko Gag i pączkuje z zainfekowanej błony komórkowej, która wyraża białko otoczki wirusa1. W związku z tym możliwe jest uzyskanie pps o wysokim mianie grypy przy użyciu białka Gag retrowirusa do produkcji pąków na błonie komórkowej wykazującej ekspresję HA i NA. W naszych poprzednich badaniach HAs/NA we wszystkich kombinacjach były funkcjonalne i zdolne do pełnienia odpowiadających im funkcji w cyklu życiowym wirusa16,17,18,20,21. Te pps są używane do badania cech biologicznych grypy, w tym hemaglutynacji, aktywności neuraminidazy, tropizmu wiążącego receptor HA i zakaźności. Ponieważ kwas hialuronowy i na-czynnik są ważnymi białkami funkcyjnymi powierzchniowo w cyklu życiowym wirusa, niedopasowane HA i NA pochodzące z różnych szczepów grypy mogą częściowo wykazywać reasortację między nimi. W tym przypadku generujemy osiem typów pps grypy, łącząc dwa HA i dwa NA (pochodzące ze szczepu HPAI H5N1 i barwienia H7N9), używając trójplazmidowego systemu pseudotypowania. Te osiem typów pps obejmuje dwa natywne pps, H5N1pp, H7N9pp; dwie niedopasowane pps, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp; i cztery pp zawierające tylko jedną glikoproteinę (HA lub NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Badania nad wirusem grypy, takim jak H5N1 i H7N9, są ograniczone wymogami bezpieczeństwa biologicznego. Wszystkie badania szczepów wirusa dzikiej grypy powinny być przeprowadzane w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL-3). Technologia pseudotypowanych cząstek wirusa może być wykorzystana do pakowania sztucznego wirionu w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Dlatego pps stanowi bezpieczniejsze i użyteczne narzędzie do badania procesów zachodzących w wirusie grypy w zależności od jego dwóch głównych glikoprotein: hemaglutyniny (HA) i neuraminidazy (NA).

Ten protokół opisuje generowanie tych pps za pomocą strategii kotransfekcji trójplazmidowej (omówionej w Rysunek 1), jak określić ilościowo pps i wykrywanie zakaźności. Produkcja pp obejmuje trzy rodzaje plazmidów (Rysunek 1). Gen gag-pol, który koduje białko Gag-Pol retrowirusa, został sklonowany z zestawu do pakowania retrowirusa i umieszczony w plazmidzie pcDNA 3.1 i nazwany pcDNA-Gag-Pol. Gen wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP), który koduje białko zielonej fluorescencji, został sklonowany z wektora pTRE-EGFP, wstawiony do plazmidu pcDNA 3.1 i nazwany pcDNA-GFP. Podczas klonowania sekwencja sygnału pakowania (ψ) została dodana za pomocą startera. Geny HA i NA sklonowano do plazmidu pVRC, nazwanego odpowiednio pVRC-HA i pVRC-NA. Ostatni plazmid koduje białko fuzyjne i może być zastąpiony dowolnym innym białkiem fuzyjnym. Nasza platforma do pseudotypowania obejmuje dwa plazmidy ekspresji glikoprotein: pVRC-HA i pVRC-NA. Może to uprościć badania nad reasortacją między różnymi szczepami wirusa w warunkach BSL-2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Dzień 1: Hodowla komórkowa i wysiew

  1. Hodować ludzkie komórki embrionalne nerki (HEK) 293T/17 w 60-milimetrowych szalkach ze zmodyfikowaną pożywką egzogenną (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny (DMEM Complete Medium, DCM) w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% dwutlenku węgla (CO2) do około 80% konfluencji.
    UWAGA: Zalecane są ogniwa niskoprzelotowe HEK 293T/17.
  2. Ostrożnie umyć komórki 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 1x,
    UWAGA: Ręczne obchodzenie się z ogniwami HEK 293T/17 musi być bardzo delikatne, ponieważ łatwo się odłączają.
  3. Usuń PBS i zdysocjuj komórki za pomocą 1 ml 0,25% roztworu kwasu trypsynowo-etylenodiaminowego (EDTA). Umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na nie dłużej niż 5 minut, aż komórki zostaną rozdzielone.
  4. Dezaktywuj trypsynę, dodając 5 ml DCM. Rozproszyć komórki w zawiesinie jednokomórkowej, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.
  5. Przenieść zawiesiny komórek do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Zdekantować jak najwięcej supernatantu. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 6 ml pożywki DCM i policzyć komórki. Rozcieńczyć komórki do 1 x 106 komórek/ml pożywką DCM.
  7. Zasiej komórki na 6-dołkowej płytce z 1 ml zawiesiny komórek na studzienkę. Delikatnie wklep płytkę, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Inkubować płytkę przez noc (14–16 godzin) w inkubatorze o temperaturze 37 °C i stężeniu 5% CO2 .

2. Dzień 2: Kotransfekcja czteroplazmidowa za pośrednictwem lipofekcji

  1. Sprawdź morfologię i gęstość komórek pod mikroskopem światła odwróconego. Idealnie, komórki powinny być w około 85% zlewające się podczas transfekcji. Zastąp pożywkę 1 ml pożywki DMEM bez surowicy na dołek, a następnie włóż płytkę z powrotem do inkubatora.
    UWAGA: Ręczne obchodzenie się z ogniwami HEK 293T/17 musi być bardzo delikatne, ponieważ łatwo się odłączają.
  2. Dla każdej studzienki z hodowanymi komórkami, które mają być transfekowane, rozcieńczyć 8 μl odczynnika do transfekcji do objętości 150 μl zredukowanym podłożem surowicy (probówka 1). Delikatnie wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT, około 20 °C).
    UWAGA: Dla każdej próbki do transfekcji należy przygotować dwie probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml ponumerowane 1 i 2.
  3. W probówce 2 rozcieńczyć 2,5 μg plazmidowego DNA w 150 μl zredukowanego podłoża surowicy.
    UWAGA: W probówce 2 rozcieńczyć każdy plazmidowy DNA, jak pokazano w Tabeli 1. Jako kontrolę pozytywną zastosowano glikoproteinę G wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej kodującego plazmid (VSV) (plazmid pLP-VSVG), ponieważ VSV jest w stanie zainfekować szeroki zakres komórek. Cząstki kontroli ujemnej, które nie mają glikoprotein otoczki grypy (Δenv pps), zostały wygenerowane przy użyciu plazmidów pcDNA-Gag-Pol i pcDNA-GFP.
  4. Po 5 minutowej inkubacji połączyć rozcieńczone DNA z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji. Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez kolejne 15 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Dodać kompleks DNA-lipid do odpowiedniej studzienki zawierającej komórki i pożywkę wolną od surowicy. Delikatnie wymieszaj, kołysząc talerzem w przód iw tył.
  6. Po inkubacji przez 4–6 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 należy usunąć pożywkę i zastąpić 2 ml DMEM. Inkubować przez kolejne 36–48 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    UWAGA: Zastąp DMEM bez surowicy i przeciwciał. W tym protokole dwa HA i dwa NAs mogą być użyte do wygenerowania ośmiu typów PPS (pokazanych w tabeli 1).

3. Dzień 3: Siew komórek podatnych

  1. W przypadku testu zakaźności należy wysiać każdy rodzaj podatnych komórek w ilości 1 x 104 komórki na studzienkę na płytce 96-dołkowej.
    UWAGA: Do przeprowadzenia testu zakaźności w tym artykule należy użyć dwóch typów komórek docelowych: linii komórek ludzkich pochodzących z pęcherzyków płucnych (komórki A549) i komórek nerki psa Madin-Darby (MDCK). Komórki MDCK są szeroko stosowane w badaniach nad grypą i mogą być dobrą kontrolą. Ten krok jest elastyczny. Wszelkie inne docelowe linie komórkowe mogą być wykorzystane zgodnie z wymaganiami badawczymi.
  2. Inkubować płytkę przez noc (14–16 godzin) w inkubatorze o temperaturze 37 °C i stężeniu 5% CO2 .

4. Dzień 4: Pseudotypowane zbieranie cząstek wirusa, kwantyfikacja i test zakaźności

  1. Pseudotypowany zbiór cząstek wirusa
    1. Sprawdź kolor podłoża. Najlepiej, aby był jasnoróżowy lub lekko pomarańczowy. Zbadaj komórki za pomocą odwróconego fluorescencyjnego mikroskopu biologicznego pod 440–460 nm.
    2. Po 36–48 godzinach od transfekcji zbierz pps, przechodząc przez filtr membranowy z polifluorku winylidenu (PVDF) o grubości 0,45 μm w celu wyeliminowania resztek komórkowych.
    3. Podziel pps na podwielokrotności o małej objętości.
    4. Przechowywać pps w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Nie jest to jednak zalecane, ponieważ zakaźność pps gwałtownie spadnie po zamrożeniu i rozmrożeniu.
  2. Kwantyfikacja pseudotypowanych cząstek wirusa
    1. Przenieść 20 μl oczyszczonych pps do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wolnej od rybonukleazy (RNazy).
    2. Dodać 1 μl nukleazy benzonazy o stężeniu 0,24 j./mL. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu wyeliminowania wszelkich zanieczyszczeń DNA i RNA.
      UWAGA: Docelowy RNA, zwykle obniżony poziom wirusa cytomegalii (CMV)-GFP RNA, jest upakowany w pps i może uniknąć degradacji przez nukleazę benzonazy.
    3. Zamrażać próbkę w temperaturze -70 °C w celu inaktywacji nukleazy benzonazy.
    4. Dodać 2 μl proteinazy K. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 30 minut, aby wytrawić białka otoczki i uwolnić CMV-GFP RNA. Dezaktywować proteinazę K w temperaturze 100 °C przez 3 min.
    5. Określ ilościowo pps za pomocą ilościowej odwrotnej transkrypcji (qRT)-PCR w czasie rzeczywistym za pomocą uniwersalnego zestawu jednoetapowego RT-qPCR z sondą, przy użyciu startera do przodu 5'-AACAAAAGCTGGAGCTCGTTTAA-3', startera odwrotnego 5'-GGGTCCTCAGAGTGATTGACTAC-3' i sondy 5'-FAM-CCCCCAAATGAAAGACCCCCGAG-TAM-3', na termocyklerze Real-Time PCR. Znormalizuj pps dla liczby kopii RNA przed infekcją.
  3. Test zakaźności
    1. Rozcieńczyć każdy rodzaj pps pod względem danych qRT-PCR do 4 x 105 kopii/ml (normalizacja pp).
    2. Dodaj trypsynę chlorometylo-ketonu tozylo-fenyloalaniny (TPCK) do końcowego stężenia 40 μg / ml do pps, które zawierają H7N9 HA. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu utworzenia podjednostek funkcjonalnych HA1 i HA2.
      UWAGA: Nie ma potrzeby traktowania pps, które zawierają H5, trypsyną TPCK, ponieważ mają one wiele reszt argininy i lizyny w miejscu rozszczepienia HA1-HA2. To wieloelementowe miejsce rozszczepienia może zostać rozszczepione przez wszechobecne proteazy komórkowe.
    3. Wymieszaj znormalizowane pps z podłożem DMEM (bez surowicy) w stosunku 1:1 (objętość/objętość).
    4. Przynieś płytkę zawierającą wrażliwe komórki do komory bezpieczeństwa biologicznego.
    5. Odessać supernatant i przemyć komórki raz 0,1 ml podgrzanego PBS.
    6. Dodaj 0,1 ml mieszaniny pps-DMEM do jednego dołka. Trzykrotnie przeprowadź testy zakaźności każdego typu pps na jednej podatnej linii komórkowej (omówione w Rysunek 2).
    7. Inkubować 96-dołkową płytkę przez 4–6 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    8. Odessać supernatant i zastąpić go 0,1 ml DCM.
    9. Inkubować 96-dołkową płytkę przez kolejne 24–36 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

5. Dzień 5 lub 6: Wykrywanie zakaźności

  1. Przynieś 96-dołkową płytkę do szafy bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Odessać supernatant i umyć komórki 1x 0,2 ml podgrzanego PBS.
  3. Usuń PBS i zdysocjuj komórki za pomocą 0,1 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA.
  4. Umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 3 minuty, aż komórki zostaną rozdzielone.
    UWAGA: Unikaj inkubacji dłużej niż 5 minut, ponieważ doprowadzi to do zlepiania się komórek.
  5. Dezaktywuj trypsynę, dodając 0,4 ml DCM.
  6. Rozproszyć komórki w zawiesinie jednokomórkowej, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.
  7. Przenieść zawiesiny komórek do schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  8. Określ komórki reporter-dodatnie GFP za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).
    UWAGA: Aby określić stosunek komórek docelowych reporter-dodatnich GFP, ustaw bramki cytometru przepływowego przy użyciu próbek kontrolnych (komórki A549 nietraktowane pps lub komórki MDCK), a następnie policz komórki reporter-dodatnie GFP po 10 000 komórek na próbkę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W zależności od opisanego powyżej ogólnego sposobu postępowania, wygenerowaliśmy 10 typów pps łączących dwie HA/NA z grupy H lub glikoproteinę VSV-G lub glikoproteiny bezotoczkowe (przedstawione w Tabela 1). Siedem z nich jest zakaźnych. Pseudotypowane cząstki (pps), które nie posiadały glikoproteiny otoczki lub posiadały wyłącznie NA, nie wykazały w tym przypadku zdolności do zakażania. Procedura produkcji pps grypy została przedstawiona w Rysunek 1Mikrografie z transmisyjn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole opisujemy metodę wytwarzania pseudotypowanych cząstek wirusa grypy (pp) w warunkach BSL-2. Plazmid reporterowy pcDNA-GFP jest włączony do pps i może być wykorzystany do ilościowego oznaczania pps za pomocą FACS w teście zakaźności. Wybraliśmy dwa rodzaje podatnych linii komórkowych, ponieważ są one szeroko stosowane w badaniach nad grypą. Komórki MDCK zapewniłyby dobrą kontrolę nad zmiennymi, unieśmiertelnionymi komórkami ludzkimi używanymi w tych badaniach.

Protokół ten opiera...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Planu Medycyny i Technologii Prowincji Zhejiang (numery grantów, 2017KY538), Miejskiego Planu Medycyny i Technologii Zdrowotnej w Hangzhou (numery grantów, OO20190070), kluczowego projektu Nauki i Technologii Medycznej w Hangzhou (numery grantów, 2014Z11) oraz projektu autonomicznego zastosowania samorządu miejskiego w Hangzhou w zakresie rozwoju społecznego i badań naukowych (numery grantów, 20191203B134).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nukleaza benzonazowaMillipore70664Skuteczna redukcja lepkości i usuwanie kwasów nukleinowych z roztworów białkowych
Przezroczyste polistyren z płaskim dnem Mikropłytki poddane TC (96-dołkowe)Corning3599Impregnowane w celu optymalnego przylegania komórek
Sterylizowane promieniowaniem gamma i certyfikowane jako niepirogenne
Indywidualne kody alfanumeryczne do identyfikacji
odwiertówPrzezroczyste płytki wielodołkowe (6-dołkowe) z powłoką TCCostar3516Indywidualne kody alfanumeryczne do identyfikacji studni
Poddawane obróbce w celu optymalnego przylegania komórek
Sterylizowane przez promieniowanie gamma
Zmodyfikowana pożywka egzogenna Dulbecco (DMEM)Gibco11965092Szeroko stosowana pożywka podstawowa wspomagająca wzrost wielu różnych komórek ssaków
Surowica bydlęcapłodu ExcellFND500płodowe surowice bydlęce, które mogą zaoferować doskonałą wartość dla podstawowej hodowli komórek, specjalistycznych badań i specyficznych testów
Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)Beckman coultercytoflex
Ludzki gruczolakorak pęcherzyków płucnych Komórki A549ATCCCRM-CCL-185
Ludzka nerka embrionalna (HEK) HEK-293T/17 komórkiATCCCRL-11268Wszechstronny odczynnik do transfekcji, który, jak wykazano, skutecznie transfekuje najszerszą gamę linii komórkowych przylegających i zawiesinowych
Odwrócony fluorescencyjny mikroskop biologicznyOlympusBX51-32P01-FLB3
Mikroskop światła odwróconegoOlympusCKX31-12PHP
Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcjiInvitrogen11668019Szybka, czuła i precyzyjna detekcja qPCR za pomocą sondy i ilościowe oznaczanie docelowych celów RNA.
Uniwersalna sonda Luna Jednoetapowy zestaw RT-qPCRNEBE3006LWytrzyma do 14 000 RCF
Wolne od RNaz/DNaz Niepirogenne
komórki nerki psów Madin-Darby (MDCK)ATCCCCL-34
MaxyClear Snaplock Probówka mikrowirówkowa (1,5 ml)AxygenMCT-150-C33 mm, sterylizowana promieniami gamma
filtrująca strzykawkę Millex-HV, 0,45 i mikro; m, PVDFMilliporeSLHV033RSulepszone Minimal Essential Medium (MEM), które pozwala na zmniejszenie suplementacji płodowej surowicy bydlęcej o co najmniej 50% bez zmiany tempa wzrostu lub morfologii komórek. Pożywka Opti-MEM I jest również zalecana do stosowania z kationowymi odczynnikami do transfekcji lipidów, takimi jak odczynnik Lipofectamina.
Opti-MEM I Obniżona surowicaGibco11058021Antybiotyki penicylina i streptomycyna są stosowane w celu zapobiegania zanieczyszczeniu bakteryjnemu kultur komórkowych ze względu na ich skuteczne połączone działanie przeciwko bakteriom Gram-dodatnim i Gram-ujemnym.
penicylina-streptomycynaGibco15140122Maksymalny RCF wynosi 12 500 xg
Zakres temperatur od -80 ° C do 120 ° C
Wolne od RNaz/DNaz
Sterylne
probówki wirówkowe PP (15 ml)Corning430791stabilną i wysoce reaktywną proteazę serynową
Proteinaza KBeyotimeST532Poddana obróbce w celu optymalnego przylegania komórek
Sterylizowane promieniowaniem gamma i certyfikowane niepirogenne
Naczynie hodowlane z powłoką TC (60 mm)Corning430166Trypsyna z trzustki bydlęcej
TPCK Traktowana, zasadniczo bez soli, liofilizowany proszek, ≥ 10 000 jednostek BAEE / mg białka
TPCK-trypsynaSigmaT1426Ta płynna formuła trypsyny zawiera EDTA i czerwień fenolową. Gibco Trypsin-EDTA jest wytwarzany z trypsyny w proszku, napromieniowanej mieszaniny proteaz pochodzących z trzustki świni. Ze względu na swoją siłę trawienną trypsyna jest szeroko stosowana do dysocjacji komórek, rutynowego pasażowania hodowli komórkowych i pierwotnej dysocjacji tkanek. Stężenie trypsyny wymagane do dysocjacji różni się w zależności od typu komórki i wymagań eksperymentalnych.
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaGibco25200056
jednostka

Bibliografia

  1. Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
  2. White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
  3. Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501(2008).
  4. Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629(2014).
  5. Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
  6. Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
  7. Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
  8. Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
  9. Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
  10. Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
  11. Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
  12. Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
  13. Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
  14. Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
  15. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  16. Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
  17. Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104(2011).
  18. Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825(2010).
  19. Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
  20. Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
  21. Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
  22. McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
  23. Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
  24. Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70(2006).
  25. Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
  26. Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
  27. Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
  28. Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
  29. Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
  30. Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254(2016).
  31. Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
  32. Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
  33. Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010(2019).
  34. Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
  35. Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
  36. Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).
  37. Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
  38. Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819(2019).
  39. Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza hemaglutyniny i neuraminidazyprodukcja pseudotyp w wirusowychw czanie glikoprotein otoczkiilo ciowe oznaczenie RT qPCRtest wykrywania zaka no cipoziom bezpiecze stwa biologicznego 2transmisyjna mikroskopia elektronowakom rki HEK 293T 17badanie reassortacji wirusa
Produkcja zakaźnych cząstek pseudotypowanych grypy zakaźnej o wysokim mianie z glikoproteinami otoczkowymi z wysoce zjadliwych wirusów H5N1 i ptasich H7N9
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.