Ten protokół opisuje eksperymentalny proces wytwarzania zakaźnych cząsteczek pseudotypowych wirusa o wysokim mianie (pp) z glikoproteinami otoczkowymi z dwóch szczepów grypy A i jak określić ich zakaźność. Protokół ten jest wysoce elastyczny do tworzenia pps dowolnego innego typu wirusów otoczkowych z różnymi glikoproteinami otoczki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Produkcja zakaźnych cząstek pseudotypowanych grypy zakaźnej o wysokim mianie z glikoproteinami otoczkowymi z wysoce zjadliwych wirusów H5N1 i ptasich H7N9
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Sporadyczne bezpośrednie przenoszenie wirusa wysoce zjadliwej grypy ptaków A H5N1 (HPAI H5N1) i H7N9 na ludzi oraz ich śmiertelność są poważnymi problemami zdrowia publicznego i sugerują możliwość wystąpienia epidemii. Jednak nasza wiedza molekularna na temat wirusa jest szczątkowa i konieczne jest zbadanie właściwości biologicznych jego białek otoczki jako celów terapeutycznych oraz opracowanie strategii kontrolowania infekcji. Opracowaliśmy platformę do badania wirusa ptasiej grypy (pp) w postaci stałych cząstek pseudotypowanych wirusów, w tym analizy funkcjonalnej jego glikoprotein otoczki hemaglutyniny (HA) i neuraminidazy (NA), charakterystyki reasortacji HA i NA, receptorów, tropizmów, przeciwciał neutralizujących, diagnozy, zakaźności, w celu opracowania leków i projektowania szczepionek. W tym miejscu opisujemy procedurę eksperymentalną mającą na celu ustalenie pps z glikoproteinami otoczki (HA, NA) z dwóch szczepów grypy A (HAPI H5N1 i 2013 ptasi H7N9). Ich wytwarzanie opiera się na zdolności niektórych wirusów, takich jak wirus białaczki myszy (MLV), do włączania glikoprotein otoczki do pp. Ponadto szczegółowo opisujemy, w jaki sposób te pps są oznaczane ilościowo za pomocą RT-qPCR oraz wykrywanie zakaźności natywnych i niedopasowanych wirusów pps w zależności od pochodzenia HA i NA. System ten jest bardzo elastyczny i adaptowalny i może być używany do tworzenia wirusowych pps z glikoproteinami otoczkowymi, które mogą być włączone do dowolnego innego typu wirusa otoczkowego. W ten sposób ta platforma cząstek wirusowych może być wykorzystywana do badania dzikich wirusów w wielu badaniach naukowych.
Wprowadzenie
Misją cząsteczki wirusa jest transport jej genomu z zainfekowanej komórki gospodarza do niezainfekowanej komórki gospodarza i dostarczenie go do cytoplazmy lub jądra w formie zdolnej do replikacji1. Proces ten jest początkowo wywoływany przez wiązanie się z receptorami komórek gospodarza, a następnie fuzję wirionu i błon komórkowych. W przypadku wirusów otoczkowych, takich jak wirusy grypy, glikoproteiny kolców są odpowiedzialne za wiązanie receptorów i fuzję1,2. Glikoproteiny otoczki wirusa (np. pirogeny, antygeny) biorą udział w wielu ważnych właściwościach i zdarzeniach, takich jak inicjacja cykl....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Dzień 1: Hodowla komórkowa i wysiew
- Hodować ludzkie komórki embrionalne nerki (HEK) 293T/17 w 60-milimetrowych szalkach ze zmodyfikowaną pożywką egzogenną (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny (DMEM Complete Medium, DCM) w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% dwutlenku węgla (CO2) do około 80% konfluencji.
UWAGA: Zalecane są ogniwa niskoprzelotowe HEK 293T/17. - Ostrożnie umyć komórki 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 1x,
UWAGA: Ręczne obchodzenie się z ogniwami HEK 293T/17 musi być bardzo delikatne, ponieważ łatwo się odłączają. ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W zależności od opisanego powyżej ogólnego sposobu postępowania, wygenerowaliśmy 10 typów pps łączących dwie HA/NA z grupy H lub glikoproteinę VSV-G lub glikoproteiny bezotoczkowe (przedstawione w Tabela 1). Siedem z nich jest zakaźnych. Pseudotypowane cząstki (pps), które nie posiadały glikoproteiny otoczki lub posiadały wyłącznie NA, nie wykazały w tym przypadku zdolności do zakażania. Procedura produkcji pps grypy została przedstawiona w Rysunek 1Mikrografie z transmisyjn.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym protokole opisujemy metodę wytwarzania pseudotypowanych cząstek wirusa grypy (pp) w warunkach BSL-2. Plazmid reporterowy pcDNA-GFP jest włączony do pps i może być wykorzystany do ilościowego oznaczania pps za pomocą FACS w teście zakaźności. Wybraliśmy dwa rodzaje podatnych linii komórkowych, ponieważ są one szeroko stosowane w badaniach nad grypą. Komórki MDCK zapewniłyby dobrą kontrolę nad zmiennymi, unieśmiertelnionymi komórkami ludzkimi używanymi w tych badaniach.
Protokół ten opiera.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty z Planu Medycyny i Technologii Prowincji Zhejiang (numery grantów, 2017KY538), Miejskiego Planu Medycyny i Technologii Zdrowotnej w Hangzhou (numery grantów, OO20190070), kluczowego projektu Nauki i Technologii Medycznej w Hangzhou (numery grantów, 2014Z11) oraz projektu autonomicznego zastosowania samorządu miejskiego w Hangzhou w zakresie rozwoju społecznego i badań naukowych (numery grantów, 20191203B134).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nukleaza benzonazowa | Millipore | 70664 | Skuteczna redukcja lepkości i usuwanie kwasów nukleinowych z roztworów białkowych |
| Przezroczyste polistyren z płaskim dnem Mikropłytki poddane TC (96-dołkowe) | Corning | 3599 | Impregnowane w celu optymalnego przylegania komórek Sterylizowane promieniowaniem gamma i certyfikowane jako niepirogenne Indywidualne kody alfanumeryczne do identyfikacji |
| odwiertówPrzezroczyste płytki wielodołkowe (6-dołkowe) z powłoką TC | Costar | 3516 | Indywidualne kody alfanumeryczne do identyfikacji studni Poddawane obróbce w celu optymalnego przylegania komórek Sterylizowane przez promieniowanie gamma |
| Zmodyfikowana pożywka egzogenna Dulbecco (DMEM) | Gibco | 11965092 | Szeroko stosowana pożywka podstawowa wspomagająca wzrost wielu różnych komórek ssaków |
| Surowica bydlęca | płodu Excell | FND500 | płodowe surowice bydlęce, które mogą zaoferować doskonałą wartość dla podstawowej hodowli komórek, specjalistycznych badań i specyficznych testów |
| Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Ludzki gruczolakorak pęcherzyków płucnych Komórki A549 | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Ludzka nerka embrionalna (HEK) HEK-293T/17 komórki | ATCC | CRL-11268 | Wszechstronny odczynnik do transfekcji, który, jak wykazano, skutecznie transfekuje najszerszą gamę linii komórkowych przylegających i zawiesinowych |
| Odwrócony fluorescencyjny mikroskop biologiczny | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Mikroskop światła odwróconego | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcji | Invitrogen | 11668019 | Szybka, czuła i precyzyjna detekcja qPCR za pomocą sondy i ilościowe oznaczanie docelowych celów RNA. |
| Uniwersalna sonda Luna Jednoetapowy zestaw RT-qPCR | NEB | E3006L | Wytrzyma do 14 000 RCF Wolne od RNaz/DNaz Niepirogenne |
| komórki nerki psów Madin-Darby (MDCK) | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Probówka mikrowirówkowa (1,5 ml) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, sterylizowana promieniami gamma |
| filtrująca strzykawkę Millex-HV, 0,45 i mikro; m, PVDF | Millipore | SLHV033RS | ulepszone Minimal Essential Medium (MEM), które pozwala na zmniejszenie suplementacji płodowej surowicy bydlęcej o co najmniej 50% bez zmiany tempa wzrostu lub morfologii komórek. Pożywka Opti-MEM I jest również zalecana do stosowania z kationowymi odczynnikami do transfekcji lipidów, takimi jak odczynnik Lipofectamina. |
| Opti-MEM I Obniżona surowica | Gibco | 11058021 | Antybiotyki penicylina i streptomycyna są stosowane w celu zapobiegania zanieczyszczeniu bakteryjnemu kultur komórkowych ze względu na ich skuteczne połączone działanie przeciwko bakteriom Gram-dodatnim i Gram-ujemnym. |
| penicylina-streptomycyna | Gibco | 15140122 | Maksymalny RCF wynosi 12 500 xg Zakres temperatur od -80 ° C do 120 ° C Wolne od RNaz/DNaz Sterylne |
| probówki wirówkowe PP (15 ml) | Corning | 430791 | stabilną i wysoce reaktywną proteazę serynową |
| Proteinaza K | Beyotime | ST532 | Poddana obróbce w celu optymalnego przylegania komórek Sterylizowane promieniowaniem gamma i certyfikowane niepirogenne |
| Naczynie hodowlane z powłoką TC (60 mm) | Corning | 430166 | Trypsyna z trzustki bydlęcej TPCK Traktowana, zasadniczo bez soli, liofilizowany proszek, ≥ 10 000 jednostek BAEE / mg białka |
| TPCK-trypsyna | Sigma | T1426 | Ta płynna formuła trypsyny zawiera EDTA i czerwień fenolową. Gibco Trypsin-EDTA jest wytwarzany z trypsyny w proszku, napromieniowanej mieszaniny proteaz pochodzących z trzustki świni. Ze względu na swoją siłę trawienną trypsyna jest szeroko stosowana do dysocjacji komórek, rutynowego pasażowania hodowli komórkowych i pierwotnej dysocjacji tkanek. Stężenie trypsyny wymagane do dysocjacji różni się w zależności od typu komórki i wymagań eksperymentalnych. |
| Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa | Gibco | 25200056 |
Bibliografia
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme.....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
