Artykuł metodologiczny

Metoda CryoAPEX do analizy mikroskopii elektronowej lokalizacji białek błonowych w komórkach zachowanych ultrastrukturalnie

DOI:

10.3791/60677

⸱

27 lutego 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 3Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease, Purdue University, 4Bindley Biosciences Center, Purdue University, 5Purdue Institute of Integrative Neuroscience, Purdue University, 6Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę cryoAPEX, w której białko błonowe oznaczone znacznikiem APEX2 może być zlokalizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w optymalnie zachowanej ultrastrukturze komórki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe zdarzenia komórkowe, takie jak transdukcja sygnału i transport błonowy, polegają na prawidłowym rozmieszczeniu białek w kompartmentach komórkowych. Zrozumienie precyzyjnej lokalizacji subkomórkowej białek jest zatem ważne dla udzielenia odpowiedzi na wiele pytań biologicznych. Poszukiwanie solidnej etykiety do identyfikacji lokalizacji białek w połączeniu z odpowiednią konserwacją i barwieniem komórek było historycznie trudne. Ostatnie postępy w obrazowaniu za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) doprowadziły do opracowania wielu metod i strategii mających na celu zwiększenie zachowania komórek i znakowanie białek docelowych. Stosunkowo nowy znacznik genetyczny oparty na peroksydazie, APEX2, jest obiecującym liderem w dziedzinie klonowalnych znaczników aktywnych EM. W ostatnich latach nastąpił również postęp w przygotowywaniu próbek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) wraz z pojawieniem się kriofiksacji przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem (HPF) oraz odwadniania i barwienia w niskiej temperaturze poprzez substytucję przez wymrażanie (FS). HPF i FS zapewniają doskonałe zachowanie ultrastruktury komórkowej do obrazowania TEM, ustępując jedynie bezpośredniemu krioobrazowaniu próbek ciała szklistego. Poniżej przedstawiamy protokół dla metody cryoAPEX, który łączy w sobie wykorzystanie znacznika APEX2 z HPF i FS. W tym protokole białko będące przedmiotem zainteresowania jest oznaczane APEX2, po którym następuje utrwalenie chemiczne i reakcja peroksydazy. Zamiast tradycyjnego barwienia i odwadniania alkoholem w temperaturze pokojowej, próbka jest kriofiksowana i poddawana odwadnianiu i barwieniu w niskiej temperaturze za pomocą FS. Korzystając z cryoAPEX, można nie tylko zidentyfikować interesujące białko w przedziałach subkomórkowych, ale także uzyskać dodatkowe informacje dotyczące jego topologii w strukturalnie zachowanej błonie. Pokazujemy, że ta metoda może zapewnić wystarczająco wysoką rozdzielczość, aby rozszyfrować wzorce dystrybucji białek w świetle organelli i odróżnić kompartmentalizację białka w jednej organelli w bliskiej odległości od innych nieznakowanych organelli. Co więcej, cryoAPEX jest proceduralnie prosty i podatny na komórki hodowane w hodowli tkankowej. Nie jest to trudniejsze technicznie niż typowe metody kriofiksacji i substytucji przez zamrożenie. CryoAPEX ma szerokie zastosowanie w analizie TEM dowolnego białka błonowego, które można znakować genetycznie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania biologiczne często obejmują kwestie rozwiązania lokalizacji białek subkomórkowych w komórkach i organellach. Mikroskopia immunofluorescencyjna dostarcza użytecznego obrazu lokalizacji białek w niskiej rozdzielczości, a ostatnie postępy w obrazowaniu superrozdzielczym przesuwają granice rozdzielczości dla białek znakowanych fluorescencyjnie1,2,3. Jednak mikroskopia elektronowa (EM) pozostaje złotym standardem w obrazowaniu ultrastruktury komórkowej o wysokiej rozdzielczości, chociaż znakowanie białek jest wyzwaniem.

Historycznie, kilka metod EM było używanych do podejścia do kwestii lokalizacji białek ultrastrukturalnych. Jedną z najczęściej stosowanych metod jest mikroskopia immunoelektronowa (IEM), w której do wykrycia białka stosuje się przeciwciała pierwotne specyficzne dla antygenu. Sygnał EM jest generowany przez zastosowanie przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z cząstkami o dużej gęstości elektronów, najczęściej złotem koloidalnym4,5. Alternatywnie, przeciwciała sprzężone z enzymami, takimi jak peroksydaza chrzanu (HRP), mogą być używane do wytwarzania osadu o dużej gęstości elektronów6,7,8. Istnieją dwa główne podejścia do IEM, nazywane etykietowaniem przed osadzaniem i po osadzaniu. W przypadku wstępnego osadzania IEM przeciwciała są wprowadzane bezpośrednio do komórek, co wymaga utrwalenia światła i przepuszczalności komórek9,10,11. Oba kroki mogą uszkodzić ultrastructure12,13. Opracowanie istotnie mniejszych przeciwciał składających się z fragmentu przeciwciała Fab sprzężonego z nanozłotem o długości 1,4 nm pozwala na zastosowanie bardzo łagodnych warunków przenikania; jednak nanozłoto jest zbyt małe, aby można je było bezpośrednio zobrazować w ramach TEM i wymaga dodatkowych kroków wzmacniających, aby stało się widoczne14,15,16. W IEM po zatopieniu, przeciwciała są nakładane na cienkie odcinki komórek, które zostały w pełni przetworzone przez utrwalenie, odwodnienie i zatopienie w żywicy17. Chociaż takie podejście pozwala uniknąć etapu przepuszczalności, zachowanie interesującego epitopu podczas przygotowywania próbki jest trudne18,19,20. Metoda Tokuyasu polegająca na utrwalaniu światła, a następnie zamrażaniu, kriosekcji i wykrywaniu przeciwciał zapewnia lepsze zachowanie epitopów21,22. Jednak wymagania techniczne krioultramikrotomii, a także nieoptymalny kontrast osiągany w komórce, są wadami23.

Użycie genetycznie kodowanych znaczników eliminuje wiele trudności związanych z IEM związanych z wykrywaniem interesującego białka. Dostępne są różne tagi, w tym HRP, ferrytyna, ReAsH, miniSOG i metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Każda z nich ma zalety w porównaniu z poprzednimi metodami, ale każda ma również wady uniemożliwiające powszechne stosowanie. Wady te wahają się od braku aktywności HRP w cytozolu do dużego rozmiaru znacznika ferrytyny, wrażliwości ReAsH na światło oraz małego rozmiaru i braku kompatybilności z barwieniem komórkowym metalotioneiny. Ostatnio białko pochodzące z peroksydazy askorbinianowej zostało zaprojektowane jako znacznik EM o nazwie APEX233,34. Jako peroksydaza, APEX2 może katalizować utlenianie 3,3' diaminobenzydyny (DAB), wytwarzając osad, który reaguje z tetratlenkiem osmu, zapewniając lokalny kontrast EM przy minimalnej dyfuzji z białka będącego przedmiotem zainteresowania (mniej niż 25 nm)33,35. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod opartych na HRP, APEX2 jest niezwykle stabilny i pozostaje aktywny we wszystkich przedziałach komórkowych33. Próbki mogą być przetwarzane do TEM przy użyciu tradycyjnego barwienia próbek EM i metod, które pozwalają na dobrą wizualizację otaczających struktur33,34,36. Ze względu na niewielkie rozmiary, stabilność i wszechstronność, APEX2 stał się znacznikiem EM o dużym potencjale.

Wiele z omówionych powyżej podejść nie może być lub jeszcze nie zostało połączonych z obecnym stanem techniki w zakresie konserwacji ultrastrukturalnej, kriofiksacji i niskotemperaturowego substytucji zamrażania. W związku z tym cierpią z powodu braku konserwacji błony i/lub barwienia komórek w celu określenia dokładnej lokalizacji białka. To z konieczności ogranicza rozdzielczość i interpretację danych, które można uzyskać. Kriofiksacja przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem (HPF) polega na szybkim zamrażaniu próbek w ciekłym azocie pod wysokim ciśnieniem (~2,100 bar), co powoduje witryfikację, a nie krystalizację próbek wodnych, zachowując w ten sposób komórki w stanie zbliżonym do natywnego37,38,39. Po HPF następuje substytucja przez wymrażanie (FS), odwadnianie w niskiej temperaturze (-90 °C) w acetonie połączone z inkubacją z typowymi barwnikami EM, takimi jak tetratlenek osmu i octan uranylu. HPF i FS razem zapewniają wyraźną przewagę nad tradycyjnym utrwalaniem chemicznym (dłuższy proces, który może prowadzić do artefaktów) i odwadnianiem alkoholu w temperaturze pokojowej lub na lodzie (co może prowadzić do ekstrakcji lipidów i cukrów), a zatem pożądane jest połączenie z najlepszymi znacznikami EM do wykrywania białek.

Jednym z powodów, dla których HPF/FS nie został połączony z etykietowaniem APEX2, jest to, że lekkie chemiczne utrwalenie jest warunkiem wstępnym dla reakcji peroksydazy, ograniczając dyfuzję produktu reakcji DAB. W dotychczasowych badaniach APEX2 reakcja wiązania i peroksydazy jest stosowana tradycyjnymi metodami EM do barwienia i odwadniania alkoholem33,36. Wykazano jednak, że po utrwaleniu chemicznym za pomocą HPF/FS zapewnia wyraźną przewagę w konserwacji nad tradycyjnym utrwalaniem chemicznym i samym odwadnianiem alkoholem40. Utrata integralności ultrastrukturalnej obserwowana w tradycyjnych próbkach TEM wydaje się być mniej związana z utrwalaniem niż z odwodnieniem, które zwykle odbywa się przy użyciu alkoholu w temperaturze pokojowej lub na lodzie, i może prowadzić do ekstrakcji lipidów i cukrów40,41. Aby opracować metodę cryoAPEX, postawiliśmy hipotezę, że wiązanie chemiczne i reakcja peroksydazy, a następnie HPF i FS, dadzą optymalny wynik pod względem konserwacji ultrastrukturalnej.

Tutaj prezentujemy protokół cryoAPEX, który łączy znakowanie APEX2 z metodami kriofiksacji i substytucji przez zamrożenie (Rysunek 1). Ten prosty protokół składa się z transfekcji białka znakowanego APEX2, chemicznego utrwalenia komórek i reakcji peroksydazy. Następnie wykonywane są HPF i FS, a następnie typowe zatapianie żywicy i cienkie cięcie. Obrazowanie TEM ujawnia doskonałe zachowanie ultrastruktury przy użyciu tej metody. Dodatkowo zaobserwowano subkomórkową lokalizację i dystrybucję przestrzenną białka świetlnego retikulum endoplazmatycznego (ER). Metoda ta jest szeroko przydatna do wykrywania lokalizacji białek błonowych w komórkach do analizy mikroskopii elektronowej. W naszych rękach metoda sprawdziła się w przypadku różnych linii komórkowych hodowanych w hodowlach tkankowych, w tym HEK-293T (ludzka nerka embrionalna), HeLa (ludzki rak szyjki macicy), Cos7 (fibromlast nerki afrykańskiej zielonej małpy) i BHK (nerka chomika). Szczegółowa instrukcja została opisana poniżej przy użyciu ogniw HEK-293T.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa i transfekcja

  1. Komórki HEK-293T należy wysiać na naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm lub większej i osiągnąć konfluencję 60%–90% w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Komórki transfekcyjne z plazmidami ekspresyjnymi ssaków znakowanymi APEX2 przy użyciu odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów) zgodnie ze wskazówkami producenta.
  3. Po 12–15 godzinach od transfekcji przemyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Usuń komórki z naczynia, delikatnie myjąc PBS. Można użyć odczynnika dysocjacyjnego, takiego jak trypsyna, jeśli jest to wymagane dla danego typu komórki. Wirować przy 500 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad.

2. Wiązanie chemiczne i reakcja peroksydazy

  1. Ostrożnie usunąć sklarat nad osadem i ponownie zawiesić osad w 2 ml 2% aldehydu glutarowego (v/v) w 0,1 M buforze kakodylanu sodu o pH 7,4 w temperaturze pokojowej. Umieścić próbkę na lodzie i inkubować przez 30 minut. Osadzać próbkę w masie 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Od tego punktu aż do etapu 2.3.3 należy utrzymywać próbkę i roztwory na lodzie i przeprowadzić odwirowanie w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Zarówno aldehyd glutarowy, jak i bufor kakodylanu sodu (zawierający arsen) są toksyczne. Podczas obchodzenia się z produktem należy stosować odpowiednie procedury bezpieczeństwa i środki ochrony osobistej. Roztwory zawierające aldehyd glutarowy i/lub bufor kakodylanu sodu należy usuwać jako niebezpieczne odpady chemiczne.
  2. Przemyć osad 3x przez 5 minut 2 ml 0,1 M buforu kakodylanu sodu. W przypadku tych i kolejnych płukań delikatnie zawiesić osad komórkowy w wymaganym roztworze, a następnie odwirować przez 5 minut przy 500 x g i ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Należy zachować ostrożność przy powtarzaniu etapów granulowania i ponownego zawieszania, aby zminimalizować utratę próbki.
  3. Przeprowadź reakcję peroksydazy
    1. Przygotować świeży roztwór zawierający 1 mg/ml tetrachlorowodorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) w 0,1 M buforze kakodylanu sodu. Rozpuść DAB przez energiczne wirowanie przez 5–10 min.
      UWAGA: DAB jest toksyczny i potencjalnie rakotwórczy i należy się z nim obchodzić z zachowaniem odpowiednich procedur bezpieczeństwa i środków ochrony osobistej. Roztwory zawierające DAB należy traktować jako niebezpieczne odpady chemiczne.
    2. Przemyć granulki przez ponowne wymieszanie w 3 ml roztworu DAB, a następnie granulować w ilości 500 x g przez 5 minut.
    3. Zawiesić osad w 3 ml roztworu DAB, do którego dodano nadtlenek wodoru, aby osiągnąć końcowe stężenie 5,88 mM. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Osad staje się widocznie brązowy, co wskazuje na obecność nierozpuszczalnego produktu reakcji DAB.
      UWAGA: Może być konieczne zoptymalizowanie czasu inkubacji DAB dla każdej próbki. Zmianę koloru można monitorować pod mikroskopem świetlnym. Z naszego doświadczenia wynika, że 15-45 minutowa inkubacja jest wystarczająca dla większości białek. Nadtlenek wodoru powinien być uzyskany ze świeżo otwartej butelki lub takiej, która po otwarciu była dobrze szczelnie zamknięta.
    4. Osadzać komórki, a następnie przemywać 2x przez 5 minut 0,1 M buforem kakodylanu sodu, a następnie jedno płukanie w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco lub wybranej pożywce komórkowej.
  4. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl krioprotekcyjnego roztworu DMEM (lub innego wybranego podłoża komórkowego) zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej i 15% albuminy surowicy bydlęcej. Ponownie osadzać, nieznacznie zwiększając prędkość wirówki z 500 x g, jeśli jest to wymagane, aby uzyskać osad w gęstym roztworze krioprotekcyjnym. Wyrzucić większość supernatantu, upewniając się, że pozostała wystarczająca ilość płynu, aby osad nie wyschł. Przetransportować granulat komórkowy do wysokociśnieniowego przyrządu do zamrażania.

3. Zamrażanie pod wysokim ciśnieniem

  1. Napełnij wysokociśnieniowy zbiornik zamrażarki ciekłym azotem (LN2) i uruchom pompę, aby napełnić komorę próbki LN2.
    UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem należy stosować odpowiednie procedury bezpieczeństwa i środki ochrony osobistej.
    UWAGA: Te kroki są specyficzne dla zamrażarki wysokociśnieniowej Leica EMPACT2.
  2. Odchować pozostały płyn z osadu komórkowego za pomocą rogu chusteczki laboratoryjnej lub ręcznika papierowego. Powinna pozostać wystarczająca ilość płynu, aby granulka utworzyła pastę o konsystencji podobnej do pasty do zębów. Powinna być na tyle cienka, aby można ją było zassać do końcówki pipety o pojemności 20 μl.
  3. Odessać 2–3 μl osadu komórkowego i umieścić go na nośniku membranowym. Całkowicie napełnij studzienkę nośnika membrany, tak aby napięcie powierzchniowe utworzyło lekką kopułę na górze, ale ciecz nie ze studzienki. Nie powinno być pęcherzyków powietrza.
  4. Wsuń nośnik membrany do wkładu i zabezpiecz. Umieść wkład w urządzeniu HPF, które zostało przygotowane i zagruntowane, a następnie naciśnij Start, aby zamrozić.
  5. Sprawdź wykresy temperatury w funkcji czasu i ciśnienia w funkcji czasu, aby sprawdzić, czy ciśnienie osiągnęło 2100 barów, a temperatura osiągnęła -196 °C w ciągu 200 ms, a oba parametry pozostały stabilne przez 600 ms pomiaru.
  6. Powtarzać kroki od 3.3 do 3.5 aż do momentu, gdy zostanie zużyta osadka z komórek lub zamrożona zostanie żądana liczba próbek.
  7. Trzymając wkłady zanurzone w LN2, wyjmij każdy nośnik membrany z wkładu, umieść go w plastikowej kapsułce i umieść plastikową kapsułkę w kriofiolce pełnej LN2.
    UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany. Kriofiolki z próbkami mogą być przechowywane w LN2 dewar w krio-kanistrach lub krio-pudełkach.

4. Zamrożenie podstawiania

UWAGA: Używaj odpowiednich procedur bezpieczeństwa i środków ochrony osobistej podczas pracy z ciekłym azotem. Ponadto wiele substancji chemicznych użytych w kroku 4 jest toksycznych, w tym kwas garbnikowy, tetratlenek osmu i octan uranylu. Z tymi chemikaliami należy obchodzić się zgodnie z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa i utylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne.

  1. Napełnij automatyczną jednostkę do substytucji zamrażania LN2. Doprowadzić temperaturę do -90 °C.
  2. Przygotuj FS Mix 1 i rozpocznij FS.
    1. W kapturze chemicznym przygotować roztwór 0,2% kwasu garbnikowego (w/v) i 5% wody demineralizowanej w acetonie i podwielokrotności 1 ml na próbkę do fiolek kriogenicznych. Umieść w LN2 do zamrożenia.
    2. Umieścić fiolki FS Mix 1 i kriofiolki zawierające granulki zamrożonych komórek w komorze na próbki jednostki FS. Przenieść kapsułkę wewnętrzną zawierającą nośnik membranowy z fiolki LN2 do odpowiedniej fiolki zawierającej FS Mix 1.
    3. Rozpocznij protokół FS od jego pierwszego kroku to 24 godziny w temperaturze -90°C. Po upływie 24 godzin należy wstrzymać FS i przemywać próbki 3 razy przez 5 minut acetonem schłodzonym do temperatury -90 °C.
  3. Przygotuj FS Mix 2 i kompletny FS
    UWAGA: Tetroksynek osmu jest wysoce toksyczną i utleniającą substancją chemiczną, z którą powinny obchodzić się wyłącznie przeszkolone osoby zgodnie z ustalonymi protokołami bezpieczeństwa. Należy przestrzegać protokołów przechowywania i usuwania roztworów zawierających osm, a także oznakowania obszarów laboratoryjnych, w których stosuje się tetratlenek osmu. Z tetratlenkiem osmu należy obchodzić się w kapturze chemicznym z osobistym wyposażeniem ochronnym, w tym ochroną oczu, fartuchem laboratoryjnym zapewniającym pełną ochronę ramion, podwójnymi rękawicami nitrylowymi i opcjonalnym respiratorem.
    1. W okapie chemicznym przygotuj roztwór 1% tetratlenku osmu, 0,2% octanu uranylu i 5% wody DI w acetonie. Podwielokrotność 1 ml na próbkę przelać do fiolek kriogenicznych i umieścić w LN2 do zamrożenia.
      UWAGA: Roztwory podstawowe kwasu garbnikowego (10% w/v w acetonie), tetratlenku osmu (10% w/v w acetonie) i octanu uranylu (8% w/v w metanolu) mogą być przygotowywane i przechowywane w kriofiolkach w LN2 dewara w celu ułatwienia przygotowania mieszanek FS.
    2. Umieścić kriofiolki z FS Mix 2 w jednostce FS i przenieść kapsułki z trzeciego płukania acetonem do fiolek FS Mix 2. Inkubować w FS Mix 2 przez 72 godziny w temperaturze -90 °C, a następnie stopniowo podgrzewać do 0 °C przez 12-18 godzin.
  4. Utrzymuj temperaturę 0 °C i myj 3x przez 30 min schłodzonym acetonem ze świeżo otwartej butelki.

5. Infiltracja i osadzanie żywicy

UWAGA: Żywica użyta tutaj (zobacz Tabelę Materiałów) jest toksyczna przed polimeryzacją i powinna być traktowana z zachowaniem odpowiednich procedur bezpieczeństwa i środków ochrony osobistej. Każdą niespolimeryzowaną żywicę należy zutylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne.

  1. Naciekać próbki rosnącym stężeniem żywicy rozpuszczonej w acetonie z nowo otwartej butelki. Przygotować mieszaninę składników żywicy A, B i D w plastikowej zlewce zgodnie ze wskazówkami producenta i inkubować próbki w następujących stężeniach żywicy: 2%, 4% i 8% przez 2 godziny każda w temperaturze 0 °C. Inkubować w 15%, 30%, 60%, 90% i 100% żywicy przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Inkubować przez 4 godziny w mieszaninie składników A, B, C i D.
  2. Umieść nośniki membrany granulkami komórkowymi do góry w płaskich foremkach do zatapiania i wypełnij żywicą (A, B, C i D). W tym czasie do studzienek można dodać papierowe etykiety na próbki.
  3. Polimeryzować w piecu w temperaturze 60 °C przez 24-36 h.
    UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany po polimeryzacji.
  4. Wyjmij bloki z formy i ostudź. Aby usunąć nośnik membrany, najpierw umieść próbkę w pionowym uchwycie ultramikrotomu, gdzie można ją uwidocznić w powiększeniu. Oddziel nośnik membrany od bloku poprzez połączenie wklepywania ciekłego azotu w nośnik membrany w celu oddzielenia metalu od tworzywa sztucznego i użycia żyletki do odłupywania żywicy wokół nośnika membrany. Po oddzieleniu delikatnie podnieś nośnik membrany, pozostawiając kopułę granulki ogniw na powierzchni bloku.
  5. Umieść blok z odsłoniętymi granulkami komórkowymi skierowanymi do góry w płaskiej formie do zatapiania, która jest nieco głębsza niż pierwsza forma, i wypełnij żywicą. Polimeryzować w temperaturze 60 °C przez 24–36 h.
    UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany po polimeryzacji.

6. Podział na sekcje

  1. Przytnij blok wokół kulki komórkowej za pomocą żyletki. Następnie umieść blok w uchwycie na próbkę na ramieniu sekcyjnym ultramikrotomu. Za pomocą noża szklanego lub diamentowego przytnij blok do kształtu trapezu ściśle otaczającego granulkę komórki.
  2. Uzyskać ultracienkie sekcje granulki ogniw o długości fali 90 nm za pomocą noża szklanego lub diamentowego.
  3. Podnieś wstążkę sekcji na siatce TEM. Siatki szczelinowe z miedzi powlekane formvarem (1 x 2 mm2 szczeliny) są przydatne do obrazowania sekcji szeregowych. Wysuszyć siatkę, osuszając krawędź na kawałku bibuły filtracyjnej i przechowywać w pudełku do przechowywania siatki TEM.
    UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany po przecięciu na sekcje.

7. Obrazowanie TEM

  1. Zamontuj siatkę na uchwycie TEM i umieść w mikroskopie. Rutynowo używamy Tecnai T12 przy napięciu 80 kV do badań przesiewowych próbek cryoAPEX. Uzyskuj obrazy komórek i struktur subkomórkowych będących przedmiotem zainteresowania dzięki znakowaniu APEX2.
  2. W razie potrzeby uzyskaj dodatkowy kontrast membrany poprzez zastosowanie ołowianego barwienia po wybarwieniu. Zobacz Rysunek 2 dla porównania próbek niebarwionych po barwieniu (Rysunek 2I–K) i ołowianych próbek po barwieniu (Rysunek 2A–H).
    1. Unosić suche kratki przekrojem do dołu na kropli rozcieńczonego roztworu chlorku sodu (~1,5 mM), 2x po 1 min, a następnie 1x przez 10 min.
    2. Spławiać kratki na kropli roztworu ołowiu firmy Sato przez 1 min. Myć unosząc się na roztworze chlorku sodu 3x przez 1 min, a następnie na wodzie DI 3x przez 1 min. Nadmiar płynu zetrzeć z rusztów i przechowywać w pojemniku na siatkę.
      UWAGA: Ołów jest toksyczną substancją chemiczną i należy się z nim obchodzić przy zachowaniu odpowiednich procedur bezpieczeństwa i środków ochrony osobistej. Roztwory zawierające ołów należy utylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne.
  3. Obraz próbek po barwieniu na TEM.
    UWAGA: W tradycyjnym przygotowaniu próbki do TEM etap kontrastowania ołowiu jest wykonywany przed obrazowaniem TEM. Zaleca się jednak, aby w przypadku próbek cryoAPEX obrazowanie przeprowadzać najpierw na próbkach niekontrastowych. Gwarantuje to, że sygnał z tagu może być łatwo zlokalizowany dzięki jego silnemu kontrastowi z jaśniej zabarwionymi strukturami komórkowymi. W przypadku wielu próbek nie będzie wymagane dalsze barwienie; Jeśli jednak pożądany jest dodatkowy kontrast membranowy, można przeprowadzić barwienie ołowiowe (krok 7.2) i ponownie zobrazować próbkę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W celu porównania ultrastrukturalnego zachowania metodą cryoAPEX z tradycyjnym utrwalaniem i odwadnianiem, przygotowaliśmy próbki, w których membrana retikulum endoplazmatycznego (ERM; błona ER) peptyd oznaczono APEX2 i transfekowano do komórek HEK-293T. ERM-APEX2 lokalizuje się na cytoplazmatycznej powierzchni ER i przebudowuje strukturę ER w morfologicznie odrębne struktury znane jako zorganizowane gładkie ER (OSER)34,42,43. M...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół cryoAPEX zapewnia solidną metodę charakteryzowania lokalizacji białek błonowych w środowisku komórkowym. Nie tylko zastosowanie genetycznie kodowanego znacznika APEX2 zapewnia precyzyjną lokalizację białka będącego przedmiotem zainteresowania, ale zastosowanie kriofiksacji i odwodnienia w niskiej temperaturze zapewnia doskonałe zachowanie i barwienie otaczającej ultrastruktury komórkowej. W połączeniu podejścia te są potężnym narzędziem do lokalizacji białka z dużą precyzją w jego subkomórkow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół pochodzi z publikacji Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Praca ta jest wspierana przez granty R01GM10092 (dla S.M.) i AI081077 (R.V.S.) z National Institutes of Health, CTSI-106564 (do SM) z Indiana Clinical and Translational Sciences Institute oraz PI4D-209263 (dla S.M.) z Purdue University Institute for Inflammation, Immunology, and Infectious Disease.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hydrat tetrachlorowodorku 3,3'-diaminobenzydynySigma-AldrichD5637-1G
Aceton (destylowany szkłem)Mikroskopia elektronowa Sciences10016
Zlewki; Plastikowa, jednorazowa mikroskopia elektronowa o pojemności 120 mlNauki60952
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7906-100G
Fiolki do przechowywania kriogenicznego, 2 mlVWR82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's MediumCorning10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, jednoskładnikowa żywica epoksydowa A, MSigma-Aldrich44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, jednoskładnikowy B, utwardzacz 964Sigma-Aldrich44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, jednoskładnikowy C, akcelerator 960 (DY 060)Sigma-Aldrich44613-100ML
Durcupan ACM Fluka, jednoskładnikowy DSigma-Aldrich44614-100ML
Forma do zatapiania, standardowa płaska, 14 mm x 5 mm x 6 mmMikroskopia elektronowa Sciences70901
Forma do zatapiania, standardowa płaska, 14 mm x 5 mm x 4 mmMikroskopia elektronowa Sciences70900
Surowica bydlęca płodu; Nu-Serum IV PożywkaSuplement Corning355104
Szklane nóżki Łódki, 6,4 mmMikroskopia elektronowa Sciences71008
Nóż do szkłaLeica MicrosystemsEM KMR3
Aldehyd glutarowy 10% roztwór wodnyMikroskopia elektronowa Sciences16120
HEK 293 KomórkiATCCCRL-1573
Zamrażarka wysokociśnieniowa z systemem szybkiego transferuLeica MicrosystemsEM PACT2Produkt archiwalny zastąpiony przez Leica EM
ICE Nadtlenek wodoru 30% roztwórFisher Scientific50-266-27
Odczynnik do transfekcji lipofekcaminy 3000ThermoFisher ScientificL3000015
Nośnik membranowy do EM PACT2, 1,5 mm x 0,1 mmMager Scientific16707898
Tetratlenek osmu, krystalicznaMikroskopia elektronowa Sciences19110
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 20X, ultra czystyVWR97062-950
Plastikowe kapsułki do AFS/AFS2, 5 mm x 15 mmMager Scientific16702738
Siatki szczelinowe, 2 x 1 mm miedź z folią nośną FormvarMikroskopia elektronowa SciencesFF2010-Cu
Bufor kakodylanu sodu, 0,2 m, pH 7,4Mikroskopia elektronowa Sciences102090-962
Wodorotlenek sodu, granulka 500 g (ACS)Avantor Macron Fine Chemicals7708-10
Mikroskopia elektronowakwasu garbnikowegoSciences 21710
Naczynia do hodowli tkankowych, polistyren, sterylne, Corning, 100 mmVWR25382-166
Paskinoża do szkła UltraMikroskopia elektronowa Nauki71012
UltramikrotomLeica MicrosystemsEM UC7
Octan uranylu DihydratMikroskopia elektronowa Nauki22400
wzrostowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  2. Sydor, A. M., Czymmek, K. J., Puchner, E. M., Mennella, V. Super-Resolution Microscopy From Single Molecules to Supramolecular Assemblies. Trends in Cell Biology. 25, 730-748 (2015).
  3. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6, 022003(2018).
  4. De Mey, J., Moeremans, M., Geuens, G., Nuydens, R., De Brabander, M. High resolution light and electron microscopic localization of tubulin with the IGS (Immuno Gold Staining) method. Cell Biology International Reports. 5, 889-899 (1981).
  5. Faulk, W., Taylor, G. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Brown, W. J., Constantinescu, E., Farquhar, M. G. Redistribution of Mannose-6-Phosphate Receptors Induced by Tunicamycin and Chloroquine. The Journal of Cell Biology. 99, 320-326 (1984).
  7. Brown, W. J., Farquhar, M. G. The Mannose-6-phosphate Enzymes Is Concentrated Receptor for Lysosomal in Cis Golgi Cisternae. Cell. 36, 295-307 (1984).
  8. Sternberger, L. A., Hardy, P. H., Cuculis, J. J., Meyer, H. G. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 18, 315-333 (1970).
  9. Oliver, C. Pre-embedding Labeling Methods. Immunocytochemical Methods and Protocols. Oliver, C., Jamur, M. C. 588, Humana Press. 381-386 (2010).
  10. Polishchuk, E. V., Polishchuk, R. S. Pre-embedding labeling for subcellular detection of molecules with electron microscopy. Tissue and Cell. 57, 103-110 (2019).
  11. Polishchuk, R. S., Polishchuk, E. V., Luini, A. Visualizing Live Dynamics and Ultrastructure of Intracellular Organelles with Preembedding Correlative Light-Electron Microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy. Mueller-Reichert, T., Verkade, P. 111, Elsevier. 21-35 (2012).
  12. Humbel, B. M., De Jong, M. D. M., Müller, W. H., Verkleij, A. J. Pre-embedding immunolabeling for electron microscopy: An evaluation of permeabilization methods and markers. Microscopy Research and Technique. 42, 43-58 (1998).
  13. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9, 152-158 (2012).
  14. Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New Frontiers in Gold Labeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48, 471-480 (2000).
  15. Hainfeld, J. F., Furuya, F. R. A 1.4-nm Gold Cluster Covalently Attached to Antibodies Improves Immunolabeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40, 177-184 (1992).
  16. Baschong, W., Stierhof, Y. Preparation, Use, and Enlargement of Ultrasmall Gold Particles in Immunoelectron Microscopy. Microscopy Research and Technique. 42, 66-79 (1998).
  17. Roth, J., Bendayan, M., Orci, L. Ultrastructural loclaization of intracellular antigens by the use of Protein A-gold complex. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 26, 1074-1081 (1978).
  18. Armbruster, B. L., et al. Specimen preparation for electron microscopy using low temperature embedding resins. Journal of Microscopy. 126, 77-85 (1982).
  19. Fowler, C. B., Leary, T. J. O., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and histological processing with ribonuclease A effects of ethanol dehydration on reversal of formaldehyde cross-links. Laboratory Investigation. 88, 785-791 (2008).
  20. Newman, G. R., Hobot, J. A. Modern Acrylics for Post-embedding Immunostaining Techniques. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35, 971-981 (1987).
  21. Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. The Journal of Cell Biology. 57, 551-565 (1973).
  22. Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143, 139-149 (1986).
  23. Möbius, W., Posthuma, G. Sugar and ice Immunoelectron microscopy using cryosections according to the Tokuyasu method. Tissue and Cell. 57, 90-102 (2019).
  24. Gaietta, G., et al. Multicolor and Electron Microscopic Imaging of Connexin Trafficking. Science. 296, 503-508 (2002).
  25. Uttamapinant, C., et al. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 10914-10919 (2010).
  26. Porstmann, B., Porstmann, T., Nugel, E., Evers, U. Which of the Commonly Used Marker Enzymes Gives the Best Results in Colorimetric and Fluorimetric Enzyme Immunoassays: Horseradish Peroxidase, Alkaline Phosphatase or Beta-Galactosidase. Journal of Immunological Methods. 79, 27-37 (1985).
  27. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biology. 9, 1001041(2011).
  28. Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160, 70-82 (2007).
  29. Wang, Q., Mercogliano, C. P., Löwe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19, 147-154 (2011).
  30. Risco, C., et al. Specific, sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20, 759-766 (2012).
  31. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. E. Chimeric Molecules Employing Horseradish Peroxidase as Reporter Enzyme for Protein Localization in the Electron Microscope. Methods in Enzymology. Thorner, J., Emr, S. D., Abelson, J. N. 327, 35-45 (2000).
  32. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetrcysteine-tagged proteins in intact cells. Nature Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  33. Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30, 1143-1150 (2012).
  34. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12, (2015).
  35. Ariotti, N., et al. Modular Detection of GFP-Labeled Proteins for Rapid Screening by Electron Microscopy in Cells and Organisms. Developmental Cell. 35, 513-525 (2015).
  36. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12, 1792-1816 (2017).
  37. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130, 877-889 (2008).
  38. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure Freezing for the Preservation of Biological Structure: Theory and Practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
  39. McDonald, K. L. High-Pressure Freezing for Preservation of High Resolution Fine Structure and Antigenicity for Immunolabeling. Electron Microscopy Methods and Protocols. Hajibagheri, N. 117, Humana Press. 77-97 (1999).
  40. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
  41. Korn, E. D., Weisman, R. A. Loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 116, 309-316 (1966).
  42. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. Journal of Cell Biology. 163, 257-269 (2003).
  43. Sandig, G., et al. Regulation of endoplasmic reticulum biogenesis in response to cytochrome P450 overproduction. Drug Metabolism Reviews. 31, 393-410 (1999).
  44. Faber, P. W., et al. Huntingtin interacts with a family of WW domain proteins. Human Molecular Genetics. 7, 1463-1474 (1998).
  45. Worby, C. A., et al. Article The Fic Domain Regulation of Cell Signaling by Adenylylation. Molecular Cell. 34, 93-103 (2009).
  46. Sanyal, A., et al. A Novel Link between Fic (Filamentation Induced by cAMP) - mediated Adenylylation / AMPylation and the Unfolded Protein Response. The Journal of Biological Chemistry. 290, 8482-8499 (2015).
  47. Mattoo, S., et al. Comparative Analysis of Histophilus somni Immunoglobulin-binding Protein A (IbpA) with Other Fic Domain-containing Enzymes Reveals Differences in Substrate and Nucleotide Specificities. The Journal of Biological Chemistry. 286, 32834-32842 (2011).
  48. Sengupta, R., Poderycki, M. J., Mattoo, S. CryoAPEX - an electron tomography tool for subcellular localization of membrane proteins. Journal of Cell Science. 132, 222315(2019).
  49. Tsang, T. K., et al. High-quality ultrastructural preservation using cryofixation for 3D electron microscopy of genetically labeled tissues. eLife. 7, 1-23 (2018).
  50. Giddings, T. H. Freeze-substitution protocols for improved visualization of membranes in high-pressure frozen samples. Journal of Microscopy. 212, 53-61 (2003).
  51. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
  52. McDonald, K. Cryopreparation methods for electron microscopy of selected model systems. Methods in Cell Biology. 79, 23-56 (2007).
  53. Buser, C., Walther, P. Freeze-substitution: the addition of water to polar solvents enhances the retention of structure and acts at temperatures around -60 degrees C. Journal of Microscopy. 230, 268-277 (2008).
  54. Jiménez, N., et al. Tannic acid-mediated osmium impregnation after freeze-substitution A strategy to enhance membrane contrast for electron tomography. Journal of Structural Biology. 166, 103-106 (2009).
  55. Han, Y., et al. Directed Evolution of Split APEX2 Peroxidase. ACS chemical biology. 14, 619-635 (2019).
  56. Kuipers, J., Van Ham, T. J., Kalicharan, R. D., Schnell, U., Giepmans, B. N. G. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Research. 360, 61-70 (2015).
  57. Zhou, Y., et al. Expanding APEX2 Substrates for Spatial-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins in Living Cells. Angewandte Chemie. , International ed. in English (2019).
  58. Joesch, M., et al. Reconstruction of genetically identified neurons imaged by serial-section electron microscopy. eLife. 5, 1-13 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zamra anie pod wysokim ci nieniemsubstytucja zamra aniaznacznik APEX2transmisyjna mikroskopia elektronowakonserwacja kom rkowatopologia bia ekprzedzia y subkom rkowe

Powiązane artykuły