Łączne wykorzystanie testów przerzutów do żył ogonowych i obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia kolonizacji przerzutowej raka piersi i obciążenia płuc

Rak pozostaje drugą najczęstszą przyczyną zgonów na świecie¹, a przerzuty są odpowiedzialne za większość tych zgonów^2,3. Jednak ograniczone zrozumienie mechanizmów molekularnych, które rządzą kolonizacją przerzutów i późniejszym wzrostem, utrudniło opracowanie skutecznych metod leczenia choroby przerzutowej. Identyfikacja nowych celów terapeutycznych wymaga przeprowadzenia testu w celu sprawdzenia, w jaki sposób zaburzona ekspresja lub funkcja genu kandydującego wpływa na powstawanie i wzrost przerzutów. Chociaż autochtoniczne modele myszy mają swoje zalety, są czasochłonne i kosztowne w generowaniu, co czyni je bardziej odpowiednimi do walidacji celu niż do odkrywania celu. Systemy modelowe do przeszczepów, w których gen kandydujący jest zaburzony w komórkach nowotworowych in vitro, a następnie wpływ na potencjał przerzutowy jest oceniany in vivo, są tańsze i mają wyższą przepustowość niż modele autochtoniczne. Ponadto wektory wirusowe do stabilnego dostarczania RNAi, CRISPR/CAS9 i transgenów są powszechnie dostępne, co sprawia, że stosunkowo łatwo jest zakłócić praktycznie każdy gen lub geny będące przedmiotem zainteresowania w liniach komórkowych raka. Podejście to można również wykorzystać do zbadania roli genów kandydujących w kolonizacji i wzroście przerzutów w ludzkich liniach komórkowych raka poprzez przeszczepienie komórek myszom z obniżoną odpornością lub humanizowanym.

Dwa rodzaje testów używanych do badania tworzenia przerzutów przez przeszczepione komórki rakowe in vivo to spontaniczne testy przerzutów i eksperymentalne testy przerzutów. W testach spontanicznych przerzutów^4,5, komórkom rakowym wstrzykuje się myszy, pozwala im utworzyć guz pierwotny, a następnie bada się spontaniczne tworzenie przerzutów i późniejszy wzrost. Siłą tego modelu jest to, że komórki muszą przejść wszystkie etapy procesu przerzutowego, aby utworzyć guzy przerzutowe. Jednak wiele linii komórek rakowych nie daje przerzutów skutecznie w modelach spontanicznych przerzutów, a każda manipulacja komórkami, która wpływa na wzrost guza pierwotnego, może zakłócić wyniki testu przerzutów. Aby uniknąć tych pułapek, stosuje się eksperymentalne testy przerzutowe, w których komórki rakowe są wstrzykiwane bezpośrednio do krążenia. Typowe eksperymentalne testy przerzutów obejmują wstrzyknięcie do żyły ogonowej^6,7,8 (i pokazane tutaj), iniekcja dosercowa⁹ i wstrzyknięcie do żyły wrotnej¹⁰.

Celem przedstawionego tutaj protokołu jest dostarczenie eksperymentalnego testu przerzutów in vivo, który pozwala badaczowi monitorować powstawanie i wzrost przerzutów w czasie rzeczywistym, a także określić ilościowo liczbę i wielkość przerzutów w płucach tej samej myszy. Aby to osiągnąć, tradycyjne eksperymentalne testy przerzutów do żył ogonowych ^6,7,8 są łączone z obrazowaniem żywych zwierząt przy użyciu urządzenia do obrazowania in vivo^{9,11,12,13,14}. Komórki nowotworowe stabilnie eksprymujące zarówno lucyferazy, jak i białko fluorescencyjne są wstrzykiwane myszom przez boczną żyłę ogonową, a następnie urządzenie do obrazowania in vivo służy do pomiaru zmian obciążenia przerzutami w płucach w czasie (Figura 1). Jednak urządzenie do obrazowania żywych zwierząt in vivo nie jest w stanie rozróżnić ani zmierzyć wielkości poszczególnych przerzutów. Tak więc, pod koniec eksperymentu, fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy jest używany do policzenia liczby i zmierzenia wielkości fluorescencyjnych przerzutów w płucach bez potrzeby sekcji i histologii lub immunohistochemii (Ryc. 1). Protokół ten można wykorzystać do zbadania, w jaki sposób zmiana ekspresji lub funkcji genu kandydującego wpływa na powstawanie i wzrost przerzutów. Można również testować potencjalne związki terapeutyczne, takie jak małe cząsteczki lub przeciwciała blokujące działanie.

Aby zademonstrować to podejście, najpierw przeprowadziliśmy eksperyment potwierdzający słuszność koncepcji, w którym główny czynnik replikacji, białko replikacyjne A3 (RPA3) jest niszczone w przerzutowych komórkach raka piersi u myszy. Pokazujemy, że myszy, którym wstrzyknięto komórki knockdown RPA3, mają znacznie mniejsze obciążenie przerzutowe w każdym punkcie czasowym w porównaniu z myszami, którym wstrzyknięto komórki kontrolne. Analiza płuc zawierających przerzuty pokazuje, że to zmniejszone obciążenie przerzutami jest wynikiem znacznie zmniejszonej kolonizacji przerzutów i upośledzonego wzrostu tworzących się przerzutów. Aby jeszcze bardziej zademonstrować tę technikę, sprawdziliśmy, czy jednoczesne znokautowanie białka związanego z Yes (YAP) i koaktywatora transkrypcji z motywem wiążącym PDZ (TAZ) upośledza kolonizację przerzutową lub późniejszy wzrost. YAP i TAZ to dwa powiązane koaktywatory transkrypcji, które są krytycznymi efektorami szlaku hipopotama. We^15,16 i inni powiązali YAP i TAZ z przerzutami (przejrzane w^17,18,19), sugerując, że te białka są dobrymi celami terapeutycznymi. Konsekwentnie stwierdziliśmy, że myszy, którym wstrzyknięto komórki knockdown YAP / TAZ, znacznie zmniejszyły obciążenie przerzutami. Analiza płuc wykazała, że komórki knockdown YAP/TAZ tworzyły znacznie mniej przerzutów, a przerzuty, które się utworzyły, były mniejsze. Eksperymenty te pokazują, w jaki sposób eksperymentalne testy przerzutów pozwalają badaczowi szybko i niedrogo przetestować rolę genu kandydującego w tworzeniu i wzroście przerzutów. Pokazują ponadto, w jaki sposób połączone wykorzystanie obrazowania żywych zwierząt i fluorescencyjnej kwantyfikacji przerzutów w całych płucach pozwala badaczowi lepiej zrozumieć etapy kolonizacji przerzutów.

Ten protokół obejmuje użycie myszy i materiałów biologicznych i wymaga zatwierdzenia przez odpowiednie instytucjonalne komitety bezpieczeństwa. Wszystkie opisane tutaj prace in vivo są zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki i użytkowania zwierząt w Albany Medical College (IACUC).

UWAGA: Aby zapoznać się z przeglądem protokołu, zobacz schemat w Rysunek 1.

1. Pakowanie wszystkich wymaganych retrowirusów i lentiwirusów

UWAGA: Opisany protokół wykorzystuje wektory lentiwirusowe lub retrowirusowe do stabilnej ekspresji enzymu lucyferazy i białka fluorescencyjnego, a także do manipulowania ekspresją genu kandydującego. Wirusy te są upakowane w komórkach HEK-293FT, jak opisano poniżej.

1. Dzień 1: Umieść komórki HEK-293FT na 6-dołkowych płytkach w 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej (10% FBS w DMEM z 1% penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy) tak, aby w 2 dniu były w 40-60% zlewne. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez noc.
2. Dzień 2: Dla każdego wektora wirusowego, który ma być zapakowany, należy przetransfekować 40-60% zlewającą się studzienkę komórek HEK-293FT z wektorem retrowirusowym lub lentiwirusowym i odpowiednimi wektorami kodującymi płaszcz wirusowy i białka pakujące.
   UWAGA: Ten protokół wykorzystuje VSVG jako białko płaszcza, psPAX2 do pakowania lentiwirusowego i gag-pol do pakowania retrowirusowego (patrz Tabela uzupełniająca 1 dla listy wektorów).
3. Przygotować mieszaninę kotransfekcji dla każdej studzienki w następujący sposób:
   1. Połączyć 4 μl roztworu lipidowego do transfekcji (patrz tabela materiałów) i 96 μl buforu do transfekcji i inkubować przez 5 minut.
   2. Dodać 1 μg wektora wirusowego, 0,5 μg wektora białka płaszcza (VSVG) i 0,5 μg wektora białka opakowania (psPAX2 lub gag-pol) i inkubować przez 20 minut.
   3. Delikatnie dodać mieszaninę kotransfekcji z etapu 1.3.2 do komórek HEK-293FT posianych w kroku 1.1 i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez noc.
4. Dzień 3: Usuń pożywkę zawierającą transfekcję z każdej studzienki i delikatnie dodaj 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez około 24 godziny.
5. Dzień 4: Zebrać supernatant wirusa z każdej studzienki za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i przefiltrować przez filtr 0,45 μm do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml.
6. Fakultatywnie: Jeżeli pożądane jest zebranie drugiej partii wirusa, delikatnie dodać 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez około 24 godziny.
7. Dzień 5 (opcjonalnie): Zebrać drugą rundę supernatantu wirusa, jak w kroku 1.5.
   UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany przez zamrożenie supernatantu wirusa.

2. Generowanie komórek rakowych stabilnie wyrażających lucyferazy i białko fluorescencyjne

UWAGA: Poniższy protokół opisuje, jak najpierw stabilnie oznaczyć komórki 4T1 lucyferazyą świetlika i białkiem fluorescencyjnym (ZsGreen) za pomocą dwóch wektorów z unikalnymi genami selekcyjnymi. Następnie 3^rd wektor wirusowy jest używany do manipulowania ekspresją genu kandydującego. Jednak wektory wirusowe, które jednocześnie dostarczają białko fluorescencyjne i manipulację genetyczną, mogą być również stosowane jako alternatywa (jak w reprezentatywnych eksperymentach poniżej). Można użyć innych komórek nowotworowych, ale liczba komórek powinna być zoptymalizowana dla kroków 2.1 i 2.7.1.

1. Umieść komórki 4T1 w 1,5 x 10 5 komórek/basenie na 12-dołkowej płytce w kompletnym pożywce wzrostowej (10% FBS w DMEM z 1% penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy) i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez noc.
2. Zainfekuj komórki 4T1 supernatantem wirusowym wygenerowanym w kroku 1 w następujący sposób.
   1. Odessać pożywkę wzrostową z komórek i dodać 500 μl supernatantu wirusa lucyferazy i 500 μl supernatantu wirusa białka fluorescencyjnego, aby jednocześnie zainfekować komórki zarówno supernatantem wirusa lucyferazy, jak i białka fluorescencyjnego.
   2. Dodać 1 μl 8 mg/ml bromku heksadimetryny (patrz tabela materiałów).
   3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% aż do 75-90% zlewania (zwykle 24-48 godzin).
3. Trypsynizuj komórki 4T1 za pomocą 500 μl trypsyny przez 2-5 minut (komórki powinny swobodnie spłukiwać dno studzienki). Przenieś wszystkie komórki do 6-centymetrowego naczynia w 4 ml pożywki selekcyjnej (kompletna pożywka wzrostowa zawierająca odpowiednie antybiotyki), wygaszając w ten sposób trypsynę. Umieścić 6-centymetrowe naczynie z niezakażonymi komórkami kontrolnymi w tym samym pożywce selekcyjnej.
   UWAGA: Odpowiednie stężenie antybiotyku należy określić z wyprzedzeniem, testując kilka dawek. Dodatkowo, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją może być również wykorzystane do selekcji komórek znakowanych fluorescencyjnie zamiast wyboru leków.
4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w pożywce selekcyjnej i w razie potrzeby dzielić komórki, aż wszystkie niezakażone komórki kontrolne będą martwe (w zależności od genu selekcyjnego i linii komórkowej).
5. Upewnij się, że zakażone komórki 4T1 wyrażają białko fluorescencyjne ZsGreen za pomocą filtra zielonego wzbudzenia (450-490 nm)/emisji (500-550 nm) ustawionego na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym w powiększeniu 50-100x.
6. Potwierdź, że zakażone komórki 4T1 wyrażają lucyferazy, używając dostępnego na rynku zestawu aktywności lucyferazy w następujący sposób.
   1. Użyj minimalnej objętości 1x pasywnego buforu do lizy komórek 4T1 wykazujących ekspresję lucyferazy i kontroluj komórki 4T1, które nie wykazują ekspresji lucyferazy, delikatnie wstrząsając przez 30 minut.
   2. Dodać 20 μl lizatu komórkowego do 96-dołkowej płytki z białym dnem, a następnie 50 μl odczynnika do oznaczania lucyferazy z zestawu do aktywności lucyferazy.
   3. Użyj czytnika płytek, aby zmierzyć luminescencję komórek na wszystkich długościach fal w widmie przy użyciu ustawienia luminescencji.
      UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany przez zamrożenie stabilnie transdukowanych komórek.
7. Manipuluj ekspresją genu kandydującego w następujący sposób:
   1. Płytka 6 x 10⁵ znakowane komórki 4T1 z kroku 2.6 na szalce o średnicy 60 mm w 4 ml kompletnej pożywki wzrostowej i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez noc.
   2. Odessać pożywkę wzrostową z każdej studzienki i dodać 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej zawierającej 4 μl bromku heksadimetryny o stężeniu 8 mg/ml.
   3. Dodać 2 ml supernatantu wirusa z etapu 1 do komórek posianych z kroku 2.7.2 i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez noc.
   4. Trypsynizuj komórki 4T1 za pomocą 500 μl trypsyny przez 2-5 minut (komórki powinny swobodnie spłukiwać dno studzienki). Przenieś wszystkie komórki do 10-centymetrowego naczynia w 10 ml pożywki selekcyjnej (kompletnej pożywki wzrostowej zawierającej odpowiednie antybiotyki), wygaszając w ten sposób trypsynę. Umieść kilka niezainfekowanych komórek kontrolnych oznaczonych 4T1 w tym samym pożywce selekcyjnej.
   5. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w pożywce selekcyjnej i w razie potrzeby dzielić komórki, aż wszystkie niezakażone komórki umrą.
   6. Upewnij się, że ekspresja genu kandydującego jest zmieniona przy użyciu standardowego podejścia, takiego jak western blot²⁰ lub qPCR²¹.
   7. Oznacz luminescencję i fluorescencję jak w krokach 2.5-2.6, aby określić, jak bardzo są podobne w komórkach kontrolnych i knockdown, ponieważ może się to zmienić (patrz Dyskusja).
      UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany przez zamrożenie stabilnie transdukowanych komórek.

3. Optymalizacja projektu eksperymentalnego in vivo

1. Zoptymalizuj odpowiednią liczbę komórek i czas trwania eksperymentu dla pożądanego obciążenia przerzutami w następujący sposób.
   1. Rozpręż fluorescencyjne i bioluminescencyjne komórki 4T1 z kroku 2.6 w kompletnej pożywce wzrostowej, tak aby nadmiar komórek był dostępny w pożądanym dniu wstrzyknięcia.
   2. Przygotować komórki do wstrzyknięć do żyły ogonowej zgodnie z opisem w kroku 4.2. Aby określić optymalną liczbę komórek do wstrzyknięć, należy ponownie zawiesić komórki w kilku różnych stężeniach w 100 μl 1x PBS.
      UWAGA: Zalecamy przetestowanie zakresu numerów komórek/myszy od 25 000 do 500 000.
   3. Zawiesiny komórkowe należy przechowywać na lodzie do czasu wstrzyknięcia.
   4. Wstrzyknąć każde rozcieńczenie komórek 4T1 z kroku 3.1.2 3-4 myszom przez boczną żyłę ogonową opisaną w kroku 4.3 (patrz poniżej).
   5. Umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj przez 15 minut, aby zapewnić pełne wyzdrowienie. Myszy należy sprawdzać pod kątem oznak bólu lub niepokoju 3 razy w tygodniu.
   6. Monitoruj myszy pod kątem tworzenia i wzrostu przerzutów przez 3-6 tygodni (w zależności od linii komórkowej i szczepu myszy) za pomocą urządzenia do obrazowania żywych zwierząt in vivo (patrz kroki 5 i 6).
      1. Poddaj myszy eutanazji 3-6 tygodni po wstrzyknięciu żyły ogonowej zgodnie ze standardowymi wytycznymi instytucjonalnymi.
      2. Przygotuj płuca i oceń wielkość i liczbę przerzutów opisanych w kroku 7.
      3. Wybierz odpowiedni czas, w którym przerzuty rosną dla pożądanego obciążenia przerzutami (patrz dyskusja).

4. Iniekcja do żyły ogonowej oznaczonych komórek rakowych

UWAGA: Krok 4.2.4 został zoptymalizowany pod kątem wzrostu komórek 4T1 u syngenicznych myszy BALB/c. Jeśli stosowane są inne linie komórek rakowych i szczepy myszy, należy najpierw zoptymalizować liczbę wstrzykiwanych komórek i długość testu.

1. Rozwiń linie komórkowe 4T1 wygenerowane w kroku 2 na dwóch 15-centymetrowych szalkach w kompletnych pożywkach wzrostowych, tak aby nadmiar komórek był dostępny w dniu wstrzyknięcia.
2. Przygotuj komórki do wstrzyknięcia żyły ogonowej w następujący sposób:
   1. Odessać pożywkę i przepłukać płytki komórkowe 1x PBS.
   2. Trypsynizuj komórki 5 ml trypsyny na 15 cm płytkę przez 2-5 minut (komórki powinny swobodnie spłukiwać dno studzienki). Przenieś wszystkie komórki do stożkowej rurki. Umyj pozostałe komórki z naczynia do hodowli tkankowej wystarczającą ilością kompletnego podłoża wzrostowego, aby ugasić trypsynę i dodaj popłuczynę do tej samej stożkowej probówki.
   3. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek, aby określić całkowitą liczbę komórek.
   4. Odwirować komórki przy stężeniu 122 x g przez 3 minuty, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1x PBS w żądanym stężeniu. W tym przypadku każdej myszy wstrzykuje się 2,5 x 10⁴ komórki w 100 μl PBS, a więc komórki ponownie zawieszone w ilości 2,5 x 10⁵ komórek/ml. Zawiesiny komórek należy przechowywać na lodzie do momentu wstrzyknięcia.
      UWAGA: ważne jest, aby ograniczyć czas między trypsynizacją komórek a wstrzyknięciem żyły ogonowej do około 1 godziny.
3. Wstrzyknąć komórki 4T1 z kroku 4.2.5 myszom przez boczną żyłę ogonową w następujący sposób:
   1. Pracując w kapturze w pomieszczeniu dla zwierząt, delikatnie, ale dokładnie wymieszaj komórki, odwracając probówkę lub używając strzykawki o pojemności 1 ml, aby upewnić się, że są one równomiernie zawieszone. Zawsze upewnij się, że komórki są ponownie zawieszone przed załadowaniem strzykawki.
   2. Załadować strzykawkę Luer-lock o pojemności 1 ml z zawiesiną komórek i usunąć nadmiar pęcherzyków powietrza. Umieść igłę o średnicy 1/2 cala o rozmiarze 30 na strzykawce skosem do góry i usuń pęcherzyki powietrza.
   3. Delikatnie umieść mysz w uchwycie dla gryzoni.
   4. Boczne żyły ogonowe powinny być widoczne i rozszerzone. Jeśli nie, delikatnie uszczypnij podstawę ogona i zanurz ogon w ciepłej wodzie z kranu, aby rozszerzyć żyły.
      UWAGA: Rozszerzenie żył można również osiągnąć, umieszczając klatkę myszy pod lampą grzewczą i/lub na poduszce grzewczej.
   5. Użyj chusteczki nasączonej alkoholem, aby wyczyścić ogon. Wprowadzić igłę do żyły ogonowej, skośnie do góry i wstrzyknąć 100 μl zawiesiny komórek.
      UWAGA: Jeśli igła jest prawidłowo wprowadzona do żyły, powinna łatwo przesuwać się lekko do przodu i do tyłu, a przy naciskaniu tłoka nie powinno być oporu. Udane wstrzyknięcia powinny również spowodować "uderzenie", w którym niebieski kolor żyły zmienia kolor na biały na kilka sekund po wstrzyknięciu.
4. Powoli wyjąć igłę i za pomocą jałowej gazy uciskać miejsce wstrzyknięcia, aby zatamować krwawienie.
5. Umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj przez 15 minut, aby zapewnić pełne wyzdrowienie. Myszy należy sprawdzać pod kątem oznak bólu lub niepokoju 3 razy w tygodniu.
6. Monitoruj myszy pod kątem tworzenia i wzrostu przerzutów przez 3-6 tygodni (w zależności od linii komórkowej i szczepu myszy) za pomocą urządzenia do obrazowania żywych zwierząt in vivo (patrz kroki 5 i 6).

5. Monitorowanie obciążenia przerzutami za pomocą fluorescencji za pomocą urządzenia do obrazowania in vivo żywych zwierząt

UWAGA: Nie obrazuj zwierząt pod kątem fluorescencji z aktywnym sygnałem luminescencyjnym.

1. Jeśli obrazujesz tylko bioluminescencję, przejdź do kroku 6.
2. Włącz urządzenie do obrazowania żywych zwierząt in vivo.
3. Skonfiguruj system znieczulenia do obrazowania żywych zwierząt in vivo zgodnie z wytycznymi producenta, aby dostarczyć od 1,5% do 2% izofluranu do komory anestezjologicznej i komory obrazowania.
4. Znieczulenie myszy z fluorescencyjnie znakowanymi przerzutami z kroku 4 umieszcza je w komorze anestezjologicznej i dostarcza 1,5-2,5% izofluranu.
5. Otwórz oprogramowanie do tworzenia obrazów (patrz Spis materiałów) i zaloguj się.
6. Kliknij przycisk Inicjalizuj i poczekaj na zainicjowanie urządzenia.
7. Zmień pole widzenia na D.
   UWAGA: Pole widzenia C może być również używane, jeśli wymagane jest bliższe przyjrzenie się myszy, ale ogranicza to liczbę myszy, które można obrazować jednocześnie.
8. Gdy oprogramowanie wskaże, że aparat osiągnął odpowiednią temperaturę, kliknij przycisk Imaging Wizard (Kreator obrazowania), wybierz opcję Fluorescencja, a następnie wybierz odpowiednią parę filtrów z menu rozwijanego.
   UWAGA: Jeśli używany fluorofor nie jest opcją, wybierz Wejście EX/EM i wpisz wymagane wzbudzenie i emisję.
9. Umieść mysz w komorze zgodnie z opisem w kroku 3.2.4.
10. Kliknij przycisk Pobierz sekwencję.
11. Po obrazowaniu umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj przez 15 minut, aby zapewnić pełną regenerację.
12. Powtórz kroki 5.2 i 5.7-5.9 z co najmniej jedną myszą, która nie zawiera przerzutów. UWAGA: Ta mysz będzie używana do ilościowego określania i odejmowania sygnału tła podczas analizy (krok 8).
13. Obraz 2-3 razy w tygodniu przez cały czas trwania eksperymentu.

6. Monitorowanie obciążenia przerzutami za pomocą bioluminescencji za pomocą urządzenia do obrazowania żywych zwierząt in vivo

1. Włącz urządzenie do obrazowania żywych zwierząt in vivo i skonfiguruj program w następujący sposób.
   1. Otwórz oprogramowanie do tworzenia obrazów (patrz Spis materiałów) i zaloguj się. Kliknij przycisk Inicjalizuj i poczekaj na zainicjowanie urządzenia. Zmień pole widzenia na D.
      UWAGA: Pole widzenia C może być używane do bliższego widoku, aby zobrazować całą obudowę myszy; Ogranicza to jednak liczbę myszy, które można obrazować jednocześnie.
   2. Przy pierwszym użyciu edytuj ustawienia ekspozycji w następujący sposób: kliknij Edytuj | Preferencje | Akwizycja | Automatyczna ekspozycja i zmień maksymalny czas ekspozycji z domyślnych 60 sekund na 300 sekund, a następnie kliknij OK.
      UWAGA: Nie zmieniaj żadnych innych parametrów na karcie automatycznej ekspozycji.
2. Ustaw system anestezjologiczny zgodnie z wytycznymi producenta, aby dostarczyć od 1,5% do 2% izofluranu do komory anestezjologicznej i komory obrazowania.
3. Upewnij się, że kamera osiągnęła odpowiednią temperaturę przed przejściem do kroku 6.4.
4. Znieczulenie myszy z przerzutami z kroku 4 należy umieścić w komorze anestezjologicznej i dostarczyć 1,5-2,5% izofluranu.
5. Przygotuj myszy do obrazowania bioluminescencyjnego w następujący sposób.
   1. Załaduj strzykawkę o pojemności 1 ml z D-lucyferyną (30 mg / ml w D-PBS), a następnie dodaj igłę 1/2 cala o rozmiarze 30 do strzykawki i usuń pęcherzyki powietrza.
   2. Zmierz i zapisz masę znieczulonej myszy.
   3. Powstrzymaj mysz, szczypiąc kark za pomocą kciuka i palców wskazujących oraz chwytając ogon między małym palcem a podstawą dłoni. Odwróć mysz pod kątem 45 stopni, z głową skierowaną w dół.
   4. Włóż igłę, skośną stroną do góry, w przestrzeń dootrzewnową (IP) myszy po lewej stronie. Potwierdź wejście do przestrzeni IP, pobierając z powrotem mały wolumin. Nie powinno być koloru u podstawy igły podczas cofania się w przestrzeni IP.
   5. Wstrzyknąć odpowiednią objętość D-lucyferyny w dawce 150 mg/kg.
   6. Natychmiast po podaniu D-lucyferyny uruchom minutnik i umieść mysz płasko na plecach w urządzeniu do obrazowania z nosem w stożku nosa i upewnij się, że podawane jest 1,5-2,5% izofluranu. Umieść separatory między każdą myszą w przypadku obrazowania wielu myszy. Upewnij się, że myszy są ustawione tak płasko, jak to możliwe (tj. nie przechylają się na jedną stronę).
   7. Kliknij pola Luminescencyjny i Fotografia, a następnie kliknij przycisk Uzyskaj w Panelu sterowania pobierania.
6. Ciągłe pozyskiwanie obrazów bioluminescencyjnych aż do osiągnięcia sygnału szczytowego i wykorzystanie obrazu z szczytowym sygnałem bioluminescencyjnym do analizy.
7. Po obrazowaniu umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj przez 15 minut, aby zapewnić pełną regenerację.
8. Obraz 2-3 razy w tygodniu przez cały czas trwania eksperymentu.

7. Kwantyfikacja liczby i wielkości przerzutów

UWAGA: Czas wzrostu przerzutów powinien być określony dla każdej linii komórkowej i szczepu myszy, a liczba wstrzykniętych komórek będzie miała na niego wpływ.

1. Poddaj myszy eutanazji zgodnie ze standardowymi wytycznymi instytucjonalnymi.
2. Odizoluj i usuń płuca od każdej myszy i spłucz 1x PBS, aby usunąć nadmiar krwi.
3. Delikatnie rozdziel płuca na płaty.
4. Uzyskaj obrazy przerzutów ZsGreen w płatach przy 10x w jasnym polu i fluorescencji za pomocą stereoskopu fluorescencyjnego z filtrem szerokopasmowym GFP (wzbudzenie 470/40x).
   UWAGA: Zachowaj to samo powiększenie i jasność dla wszystkich próbek. Zastosowane powiększenie może się różnić w zależności od wielkości, liczby i jasności przerzutów, a także pola widzenia używanego mikroskopu.
5. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby określić ilościowo rozmiar i liczbę przerzutów na obrazach.
   UWAGA: Protokół analizy obrazu jest zależny od oprogramowania i może być zoptymalizowany pod kątem nowotworów z kroku 3. Alternatywnie, policz liczbę przerzutów w każdym płucu ręcznie za pomocą fluorescencyjnego stereoskopu. Protokół można wstrzymać w tym miejscu, a krok 8 można wykonać w dowolnym momencie po zebraniu wszystkich obrazów in vivo.

8. Przetwarzanie i analiza danych z obrazów uzyskanych za pomocą urządzenia do obrazowania żywych zwierząt in vivo

1. Otwórz wszystkie pliki obrazów dla każdej myszy w oprogramowaniu obrazu.
   UWAGA: Do analizy należy użyć obrazu ze szczytowym sygnałem bioluminescencyjnym
2. Upewnij się, że jednostki są w opcji Radiance dla danych bioluminescencyjnych i Efficiency dla danych fluorescencyjnych, klikając strzałkę w lewym górnym rogu okna obrazu i zmieniając ją na odpowiednią jednostkę.
3. Użyj obrazu z ostatniego punktu czasu, aby utworzyć obszar zainteresowania (ROI) w następujący sposób.
   1. Kliknij opcję ROI Tools (Narzędzia ROI) w oknie Tool Palette (Paleta narzędzi). Wstaw jeden zwrot akcji, klikając strzałkę i wybierając pozycję 1.
   2. Kliknij obramowanie ROI i przesuń go nad klatką piersiową myszy. Dostosuj rozmiar ROI tak, aby zakrywał klatkę piersiową myszy i nie wykluczał sygnału.
4. Kliknij opcję Zmierz zwrot z inwestycji i skopiuj lub wpisz nieprzetworzoną liczbę do arkusza Excel.
   UWAGA: W przypadku danych bioluminescencyjnych wybierz całkowity strumień (fotony/sekundę), który jest sumą całego promieniowania w ROI. Ponieważ przerzuty niekoniecznie rosną równomiernie, całkowity strumień jest preferowany w stosunku do średniego promieniowania, ponieważ mierzy sumę obciążenia przerzutami. Podobnie, w przypadku danych fluorescencyjnych, zamiast średniej sprawności należy zastosować całkowity % sprawności (światło emisyjne (fotony/sekundę)/światło wzbudzenia (fotony/sekundę)).
5. Kliknij prawym przyciskiem myszy plik obrazu, aby skopiować zwrot z inwestycji użyty w kroku 8.3 i wklej go do każdego pliku obrazu.
   UWAGA: Podczas ilościowego określania obrazów fluorescencyjnych należy określić ilościowo ten sam region na myszy, który został zobrazowany bez przerzutów. Użyj tego sygnału jako sygnału tła i odejmij go od każdego uzyskanego obrazu myszy zawierającego przerzuty fluorescencyjne
.
6. Przenieś wklejone ROI na ten sam region wybrany w kroku 8.3.4 dla każdego obrazu i powtórz krok 8.4.
7. Wykreśl i przeanalizuj dane pierwotne w następujący sposób (patrz Tabela uzupełniająca 2).
   1. Wykonaj transformację logarytmiczną₁₀ surowych danych dla każdej myszy, korzystając ze wskazanego wzoru (Tabela uzupełniająca 2) i wykreśl jak w Rysunek 2D i Rysunek 4F. Transformacja logarytmu₁₀ linearyzuje krzywą wzrostu, która ma tendencję do bycia geometryczną i minimalizuje heteroskedastyczność.
   2. Korzystając z regresji liniowej, oblicz nachylenie dopasowanej linii do logarytmu₁₀ przekształconych danych dla każdej myszy wykreślonej w kroku 8.7.1 (Tabela uzupełniająca 2). Zapoznaj się ze wzorem w tabeli uzupełniającej 2, aby dopasować linię i obliczyć nachylenie w jednym kroku.
   3. Wykreśl wartości liczbowe nachyleń jak w Rysunek 2E i Rysunek 4G. Użyj testu t-Studenta lub jednokierunkowej ANOVA (dla więcej niż 2 grup) na stokach, aby określić istotność statystyczną.

Aby zademonstrować powyższe podejście, przeprowadziliśmy eksperyment potwierdzający słuszność koncepcji, w którym krytyczny czynnik replikacji, RPA3, został powalony w linii komórkowej przerzutowego raka sutka myszy (4T122). Podczas gdy protokół opisuje znakowanie komórek zarówno lucyferazy, jak i białkami fluorescencyjnymi przed manipulacją genetyczną, zastosowaliśmy zmodyfikowane podejście, ponieważ wektory RNAi dostarczają również ZsGreen (Rysunek 2A). Po pierwsze, komórki 4T1 zostały stabilnie transdukowane za pomocą konstruktu lentiwirusowego kodującego lucyferazy świetlika i oporność na higromycynę (pHAGE-lucyferaza-IRES-higro). Po selekcji higromycyny przeprowadzono test lucyferazy, aby potwierdzić stabilną ekspresję lucyferazy świetlika (Rysunek 2A). Następnie komórki lucyferazy 4T1 zostały stabilnie transdukowane wektorami retrowirusowymi, które wyrażają ZsGreen i albo kontrolnym shRNA opartym na miR30, albo shRNA opartym na miR30, jak wcześniej wykazano, skutecznie celującym w myszy RPA316,23,24. Komórki zostały następnie wstrzyknięte myszom przez boczną żyłę ogonową, a sygnał bioluminescencyjny in vivo mierzono dwa razy w tygodniu w celu monitorowania obciążenia przerzutami (Rysunek 2B, C). Przekształcony sygnał logarytmu10 dla każdej myszy został wykreślony jako obciążenie przerzutowe w czasie (Rysunek 2D) i określono nachylenia każdego wykresu (Rysunek 2E). Dane te pokazują, że tempo zmian obciążenia przerzutami jest znacznie zmniejszone w przypadku knockdownu RPA3 w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Chociaż różnice są uderzające, same te dane nie pozwalają nam określić, czy zmniejszone obciążenie przerzutami jest wynikiem mniejszej liczby przerzutów, czy też wolniejszego wzrostu przerzutów. W związku z tym przerzuty do płuc znakowane ZsGreen zostały również przeanalizowane pod koniec eksperymentu. Myszy, którym wstrzyknięto komórki knockdown RPA3, prawie nie miały przerzutów do płuc, podczas gdy myszy kontrolne miały liczne duże przerzuty (Ryc. 3). Co więcej, przerzuty, które powstały z komórek knockdown RPA3, były wyraźnie mniejsze niż przerzuty kontrolne 4T1 (Rysunek 3A). Zgodnie z naszym ręcznym liczeniem ( Rysunek 3B), oprogramowanie do analizy obrazu policzyło znacznie mniej przerzutów u myszy powalających RPA3 ( Rysunek 3C). Dodatkowo, całkowite obciążenie przerzutami w płucach (suma obszarów każdego przerzutu w milimetrach) zostało również drastycznie zmniejszone przez knockdown RPA3 (Rysunek 3D). Wreszcie, rozmiar poszczególnych przerzutów, które utworzyły się u myszy powalających, RPA3, był na ogół znacznie mniejszy niż u myszy kontrolnych (Rysunek 3E). Oprócz dużych przerzutów u myszy kontrolnych, zaobserwowaliśmy również liczne małe przerzuty, ale nie możemy określić, czy są to komórki nowotworowe, które zasiały płuco i nie rosły, czy też są to komórki nowotworowe wyrzucone z jednego z większych przerzutów, które ponownie zasiały płuco w nowym miejscu (Rysunek 3E). Łącznie dane te pokazują, że RPA3 jest wymagany do tworzenia przerzutów przez komórki 4T1. Odkrycia te były oczekiwane, ponieważ nasza poprzednia praca wykazała, że komórki powalające RPA3 miały znacznie zmniejszoną zdolność do tworzenia przerzutów w płucach po wstrzyknięciu do żyły ogonowej16. Jednak eksperyment ten pokazuje, w jaki sposób można wykorzystać obrazowanie żywych zwierząt i fluorescencyjną ocenę ilościową liczby i wielkości przerzutów w celu określenia, czy zmiany w obciążeniu przerzutami są spowodowane różnicami w kolonizacji lub wzroście przerzutów.

Aby pokazać, jak to podejście może być wykorzystane do odpowiedzi na bardziej istotne biologicznie pytanie, zapytaliśmy, czy YAP i TAZ są wymagane do kolonizacji przerzutów i późniejszego wzrostu w tym syngenicznym modelu raka piersi. Ekspresja i aktywność YAP lub TAZ są zwiększone w wielu nowotworach w porównaniu z normalną tkanką, co jest predyktorem złego wyniku pacjenta25,26,27,28,29. Ponadto kilka badań wykazało, że YAP, TAZ lub TEADs, krytyczni partnerzy wiążący YAP/TAZ, w przerzutach15,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49, 50,51,52. Biorąc pod uwagę te dane, zastosowaliśmy nasze podejście do sprawdzenia, czy YAP i TAZ są wymagane do tworzenia i wzrostu przerzutów. W tym celu używamy wektora retrowirusowego z ekspresją tandemowych shRNA opartych na miR30, ukierunkowanych zarówno na YAP, jak i TAZ. Jak pokazano, ten tandemowy shRNA skutecznie zmniejsza ekspresję białek YAP i TAZ oraz aktywność transkrypcyjną w komórkach 4T1 (Figura 4A, B). Komórki lucyferazy 4T1 stabilnie transdukowano za pomocą ekspresji ZsGreen tej tandemowej wektora shRNA YAP / TAZ lub kontrolnego shRNA opartego na miR30 (Figura 4C), a następnie testowano przez wstrzyknięcia żyły ogonowej u syngenicznych myszy BALB / c. Jak pokazano na Rysunek 4, tempo, w jakim wzrastało obciążenie przerzutami, było znacznie szybsze u myszy, którym wstrzyknięto komórki kontrolne w porównaniu do myszy, którym wstrzyknięto komórki knockdown YAP/TAZ (Rysunek 4D-F). Znacznie mniej przerzutów powstało u myszy, którym wstrzyknięto komórki knockdown YAP / TAZ w porównaniu z myszami z komórkami kontrolnymi, niezależnie od tego, czy liczono je ręcznie (Rysunek 5A, B), czy przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu ( Figura 5C). Nie tylko u myszy kontrolnych powstało o wiele więcej przerzutów, ale były one na ogół większe (Ryc. 5E). Konsekwentnie, obciążenie przerzutami w płucach (całkowita powierzchnia przerzutów w mm) zostało również drastycznie zmniejszone przez knockdown YAP / TAZ (Ryc. 5D). Ważne jest, aby pamiętać, że gdy przerzuty są duże i blisko siebie, oprogramowanie może nie być w stanie rozróżnić odrębnych przerzutów. Tak było w przypadku kilku przerzutów u myszy kontrolnych (mysz 3 i mysz 7). Dlatego ważne jest, aby sprawdzić dane wyjściowe oprogramowania do analizy obrazu, aby upewnić się, że dokładnie mierzy powierzchnię pojedynczych guzów. Dlatego też ważne jest, aby zoptymalizować liczbę wstrzykiwanych komórek i czas trwania eksperymentu. Łącznie dane te pokazują, że YAP i TAZ są niezbędne do utrzymania tempa, w którym wzrasta obciążenie przerzutami w syngenicznym mysim modelu przerzutowego raka piersi i że jest to spowodowane niezdolnością do tworzenia się przerzutów i zmniejszonym wzrostem kilku przerzutów, które się utworzyły.

Rysunek 1: Schemat protokołu. Wszystkie niezbędne wirusy są najpierw pakowane w komórki HEK-293FT. Komórki pożądane do badania są następnie jednocześnie infekowane lucyferazy i wirusami fluorescencyjnymi, z których każdy wyraża unikalny gen selekcji leków u ssaków. Zainfekowane komórki są następnie namnażane w odpowiednich pożywkach zawierających oba leki, aby wybrać stabilnie transdukowane komórki wyrażające zarówno lucyferazy, jak i białko fluorescencyjne. Ekspresja obu etykiet jest potwierdzona zgodnie z opisem w protokole. Wyznakowane komórki są następnie transdukowane trzecim wirusem, zawierającym manipulację genetyczną (miR30 shRNA) i trzecim unikalnym genem selekcji leków. Po selekcji z trzecim lekiem komórki są wstrzykiwane myszom przez boczną żyłę ogonową. Obciążenie przerzutami jest monitorowane u myszy przez cały czas trwania eksperymentu za pomocą systemu obrazowania żywych zwierząt in vivo. Pod koniec eksperymentu myszy są poddawane eutanazji, a obrazy całych płuc są wykonywane za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, a następnie wykorzystywane do pomiaru liczby i wielkości przerzutów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Obrazowanie in vivo żywych zwierząt oparte na lucyferazie pokazuje, że knockdown RPA3 zmniejsza obciążenie przerzutami raka piersi. (A) Schemat przedstawiający, w jaki sposób komórki zostały wygenerowane na potrzeby tego badania in vivo. Komórki 4T1 stabilnie transdukowano lentiwirusem kodującym lucyferazy i oporność na higromycynę. Zainfekowane komórki wybrano z 600 μg / ml higromycyny B przez tydzień, a następnie aktywność lucyferazy mierzono w komórkach rodzicielskich lub 4T1-lucyferazy za pomocą zestawu reporterowego lucyferazy i czytnika płytek (n = 1 eksperyment z uśrednionymi dołamkami replikowanymi). Komórki 4T1-lucyferazy zostały następnie zainfekowane retrowirusem, który dostarcza ZsGreen i miR30 shRNA skierowane do mCherry (kontrola) lub mRPA3. Selekcja puromycyny (2,5 μg/ml) przez 3 dni została wykorzystana do selekcji stabilnej integracji wirusa. (B-E) Komórkom lucyferazy 4T1 stabilnie eksprymujące ZsGreen i kontrolne (sh-mCherry) lub mRPA3 (sh-mRPA3-431) shRNA wstrzyknięto myszom i zobrazowano pod kątem bioluminescencji we wskazanych dniach, jak opisano w protokole. (B&C) Obrazy bioluminescencyjne dla reprezentatywnej myszy z każdej grupy we wskazanym dniu po wstrzyknięciu (D) Wykres logarytmu10 przekształconego sygnału lucyferazy zmierzony dla każdej myszy w trakcie eksperymentu. (E) Wykres punktowy ze średnią (linią ciągłą) dla nachyleń każdej myszy w D (n = 6 dla sh-control i 8 dla sh-mRPA3-431). Istotność statystyczna została przetestowana za pomocą testu t Studenta; *p ≤ 0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 3: Kwantyfikacja przerzutów fluorescencyjnych ujawnia, że knockdown RPA3 zapobiega kolonizacji przerzutów, a następnie wzrostowi komórek raka piersi. (A) Obrazy fluorescencyjne (po lewej) i w jasnym polu (po prawej) reprezentatywnych płatów od każdej myszy, której wstrzyknięto na rysunku 2, 21 dni po wstrzyknięciu. Gwiazdki (*) oznaczały zielone autofluorescencyjne oskrzela. (C-E) Oprogramowanie do analizy obrazu (patrz tabela materiałów) zostało wykorzystane do identyfikacji i pomiaru obiektów przy użyciu progu intensywności od 25 do 100 i progu rozmiaru od 0,01mm2 do nieskończoności. (B&C) Wykres punktowy ze średnią (słupek ciągły) całkowitej liczby przerzutów w płucach każdej myszy po zliczeniu (B) przez oprogramowanie do analizy obrazu (C). (D) Całkowita powierzchnia (mm) płuca, która została zmierzona za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, jest wykreślana jako obciążenie przerzutowe ze średnią wskazywaną przez solidny pasek. (E) Wielkość każdego przerzutu jest wykreślana dla każdej myszy. Myszy kontrolne są oznaczone niebieskimi kropkami, a myszy powalające, mRPA3, czerwonymi kropkami. Należy zauważyć, że podziałka jest oddzielona na 1 mm, aby ułatwić wizualizację wielkości i liczby małych przerzutów (n = 6 sh-kontrola, 8 sh-mRPA3-431). Istotność statystyczna została przetestowana za pomocą testu t Studenta; p = 0,06; ** p ≤ 0,01. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Knockdown YAP/TAZ zmniejsza obciążenie przerzutami raka piersi. (A&B) Komórki 4T1 stabilnie eksprymujące kontrolę opartą na miR30 (mCherry) lub tandemowe shRNA YAP / TAZ (sh-mYAP1 / mTAZ6) analizowano za pomocą analizy Western blot (A) lub transfekowano konstruktem reporterowym lucyferazy YAP / TAZ-TEAD i oznaczano pod kątem aktywności transkrypcyjnej YAP / TAZ-TEAD zgodnie z wcześniejszym opisem 15,16 (B) (n = 5 dla kontroli i 4 dla YAP1 / TAZ6). (C) Schemat przedstawiający, w jaki sposób komórki zostały wygenerowane na potrzeby badania in vivo. Komórki 4T1-lucyferazy zostały zakażone retrowirusami, które dostarczają ZsGreen i albo miR30 shRNA skierowane na mCherry (kontrola), albo tandemowe shRNA miR30 skierowane zarówno na mYAP, jak i mTAZ. Zakażone komórki selekcjonowano w Puromycynie (2,5 μg/ml) przez 3 dni. Komórki 4T1-lucyferazy stabilnie eksprymujące ZsGreen i kontrolne (sh-mCherry) lub YAP / TAZ (sh-mYAP1 / mTAZ1) shRNA zostały następnie wstrzyknięte myszom i zobrazowane pod kątem bioluminescencji w dniach, w których wstrzyknięto. (D&E) Obrazy bioluminescencyjne dla reprezentatywnej myszy z każdej grupy we wskazanym dniu po wstrzyknięciu. (F) Wykres logarytmu10 przekształconego sygnału lucyferazy zmierzonego dla każdej myszy w trakcie eksperymentu. (G) Wykres punktowy ze średnią (słupek ciągły) dla nachyleń każdej myszy w F (n = 7 dla sh-control i 8 dla sh-mRPA3-431). Średnia jest oznaczona linią ciągłą. Istotność statystyczna została przetestowana za pomocą testu t Studenta; p = 0,06; #, p ≤ 0,01; ***. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: YAP i TAZ są niezbędne, aby komórki raka piersi z przerzutami skolonizowały płuca. (A) Obrazy fluorescencyjne (po lewej) i w jasnym polu (po prawej) reprezentatywnych płatów od każdej myszy, której wstrzyknięto Ryc. 4 21 dni po wstrzyknięciu. (C-E) Obrazy zostały przetworzone za pomocą oprogramowania do analizy obrazów zgodnie z opisem w Rysunek 3. (B&C) Wykres punktowy ze średnią (słupek pełny) całkowitej liczby przerzutów w płucach każdej myszy liczonej ręcznie (B) lub za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (C). (D) Całkowitą powierzchnię wszystkich przerzutów (mm) zmierzono za pomocą oprogramowania do analizy obrazu i wykreślono jako obciążenie przerzutowe za pomocą średniej (słupek stały). (E) Wielkość każdego przerzutu jest wykreślana dla każdej myszy. Myszy kontrolne są oznaczone niebieskimi kropkami, a myszy knockdown sh-mYAP1 / mTAZ6 czerwonymi kropkami. Należy zauważyć, że podziałka jest oddzielona na 1 mm, aby lepiej uwidocznić wielkość i liczbę małych przerzutów (n = 7 sh-kontrola, 8 sh-mYA1/mTAZ6). Średnia jest oznaczona linią ciągłą. Istotność statystyczna została przetestowana za pomocą testu t Studenta; *p ≤ 0,05, **, p ≤ 0,01; **. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Tabela wektorów. Wszystkie użyte wektory są wymienione i opisane są nowe wektory. Do klonowania nowych wektorów i sekwencji dla nowo opisanych 97-merowych shRNA wykorzystano standardowe techniki biologii molekularnej. Cytaty odnoszą się do: [1]53, [2]16, [3]54 Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 2: Przykład przetwarzania i analizy danych obrazowania żywych zwierząt in vivo. Arkusz kalkulacyjny pokazujący, w jaki sposób surowe dane z obrazów żywych zwierząt in vivo są konwertowane do analizy zgodnie z opisem w krokach 6.7 i 6.8. Surowe dane uzyskane z obrazowania żywych zwierząt in vivo przekształcone przy użyciu transformacji logarytmu10. Szybkość zmian obciążenia przerzutami jest obliczana dla każdej myszy poprzez obliczenie nachylenia wygenerowanego przez log10 przekształconych danych. Przykładem może być analiza lucyferazy z Rysunek 2. Kolumny są oznaczone kolorami, aby wskazać, które dane zostały użyte do wygenerowania każdej wartości nachylenia, a formuły są osadzone w arkuszu kalkulacyjnym. Dwukrotne kliknięcie studni ujawni formułę używaną do przetwarzania danych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.