Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Łączne wykorzystanie testów przerzutów do żył ogonowych i obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia kolonizacji przerzutowej raka piersi i obciążenia płuc

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60687

⸱

19 grudnia 2019

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

Opisane podejście łączy eksperymentalne testy przerzutów do żył ogonowych z obrazowaniem żywych zwierząt in vivo, aby umożliwić monitorowanie w czasie rzeczywistym powstawania i wzrostu przerzutów raka piersi, a także ilościowe określenie liczby i wielkości przerzutów w płucach.

Streszczenie

Przerzuty są główną przyczyną zgonów związanych z rakiem i istnieją ograniczone możliwości terapeutyczne dla pacjentów z chorobą przerzutową. Identyfikacja i testowanie nowych celów terapeutycznych, które ułatwią opracowanie lepszych metod leczenia choroby przerzutowej, wymaga przedklinicznych modeli in vivo. Zademonstrowano tutaj syngeniczny model myszy do oznaczania kolonizacji raka piersi z przerzutami i późniejszego wzrostu. Przerzutowe komórki rakowe są stabilnie transdukowane wektorami wirusowymi kodującymi lucyferazy świetlika i białka ZsGreen. Geny kandydujące są następnie stabilnie manipulowane w komórkach rakowych wykazujących ekspresję lucyferazy / ZsGreen, a następnie komórki są wstrzykiwane myszom przez boczną żyłę ogonową w celu zbadania kolonizacji i wzrostu przerzutów. Urządzenie do obrazowania in vivo jest następnie wykorzystywane do pomiaru bioluminescencji lub fluorescencji komórek nowotworowych u żywych zwierząt w celu ilościowego określenia zmian obciążenia przerzutami w czasie. Ekspresja białka fluorescencyjnego pozwala na ilościowe określenie liczby i wielkości przerzutów w płucach pod koniec eksperymentu bez konieczności cięcia lub barwienia histologicznego. Podejście to oferuje stosunkowo szybki i łatwy sposób testowania roli genów kandydujących w kolonizacji i wzroście przerzutów oraz dostarcza znacznie więcej informacji niż tradycyjne testy przerzutów do żył ogonowych. Stosując to podejście, pokazujemy, że jednoczesny knockdown białka związanego z Yes (YAP) i koaktywatora transkrypcji z motywem wiążącym PDZ (TAZ) w komórkach raka piersi prowadzi do zmniejszenia obciążenia przerzutami w płucach i że to zmniejszone obciążenie jest wynikiem znacznie upośledzonej kolonizacji przerzutów i zmniejszonego wzrostu przerzutów.

Wprowadzenie

Rak pozostaje drugą najczęstszą przyczyną zgonów na świecie1, a przerzuty są odpowiedzialne za większość tych zgonów2,3. Jednak ograniczone zrozumienie mechanizmów molekularnych, które rządzą kolonizacją przerzutów i późniejszym wzrostem, utrudniło opracowanie skutecznych metod leczenia choroby przerzutowej. Identyfikacja nowych celów terapeutycznych wymaga przeprowadzenia testu w celu sprawdzenia, w jaki sposób zaburzona ekspresja lub funkcja genu kandydującego wpływa na powstawanie i wzrost przerzutów. Chociaż autochtoniczne modele myszy mają swoje zalety, są czasochłonne i kosztowne w generowaniu, co czyni je bardziej odpowiednimi do walidacji celu niż do odkrywania celu. Systemy modelowe do przeszczepów, w których gen kandydujący jest zaburzony w komórkach nowotworowych in vitro, a następnie wpływ na potencjał przerzutowy jest oceniany in vivo, są tańsze i mają wyższą przepustowość niż modele autochtoniczne. Ponadto wektory wirusowe do stabilnego dostarczania RNAi, CRISPR/CAS9 i transgenów są powszechnie dostępne, co sprawia, że stosunkowo łatwo jest zakłócić praktycznie każdy gen lub geny będące przedmiotem zainteresowania w liniach komórkowych raka. Podejście to można również wykorzystać do zbadania roli genów kandydujących w kolonizacji i wzroście przerzutów w ludzkich liniach komórkowych raka poprzez przeszczepienie komórek myszom z obniżoną odpornością lub humanizowanym.

Dwa rodzaje testów używanych do badania tworzenia przerzutów przez przeszczepione komórki rakowe in vivo to spontaniczne testy przerzutów i eksperymentalne testy przerzutów. W testach spontanicznych przerzutów4,5, komórkom rakowym wstrzykuje się myszy, pozwala im utworzyć guz pierwotny, a następnie bada się spontaniczne tworzenie przerzutów i późniejszy wzrost. Siłą tego modelu jest to, że komórki muszą przejść wszystkie etapy procesu przerzutowego, aby utworzyć guzy przerzutowe. Jednak wiele linii komórek rakowych nie daje przerzutów skutecznie w modelach spontanicznych przerzutów, a każda manipulacja komórkami, która wpływa na wzrost guza pierwotnego, może zakłócić wyniki testu przerzutów. Aby uniknąć tych pułapek, stosuje się eksperymentalne testy przerzutowe, w których komórki rakowe są wstrzykiwane bezpośrednio do krążenia. Typowe eksperymentalne testy przerzutów obejmują wstrzyknięcie do żyły ogonowej6,7,8 (i pokazane tutaj), iniekcja dosercowa9 i wstrzyknięcie do żyły wrotnej10.

Celem przedstawionego tutaj protokołu jest dostarczenie eksperymentalnego testu przerzutów in vivo, który pozwala badaczowi monitorować powstawanie i wzrost przerzutów w czasie rzeczywistym, a także określić ilościowo liczbę i wielkość przerzutów w płucach tej samej myszy. Aby to osiągnąć, tradycyjne eksperymentalne testy przerzutów do żył ogonowych 6,7,8 są łączone z obrazowaniem żywych zwierząt przy użyciu urządzenia do obrazowania in vivo9,11,12,13,14. Komórki nowotworowe stabilnie eksprymujące zarówno lucyferazy, jak i białko fluorescencyjne są wstrzykiwane myszom przez boczną żyłę ogonową, a następnie urządzenie do obrazowania in vivo służy do pomiaru zmian obciążenia przerzutami w płucach w czasie (Figura 1). Jednak urządzenie do obrazowania żywych zwierząt in vivo nie jest w stanie rozróżnić ani zmierzyć wielkości poszczególnych przerzutów. Tak więc, pod koniec eksperymentu, fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy jest używany do policzenia liczby i zmierzenia wielkości fluorescencyjnych przerzutów w płucach bez potrzeby sekcji i histologii lub immunohistochemii (Ryc. 1). Protokół ten można wykorzystać do zbadania, w jaki sposób zmiana ekspresji lub funkcji genu kandydującego wpływa na powstawanie i wzrost przerzutów. Można również testować potencjalne związki terapeutyczne, takie jak małe cząsteczki lub przeciwciała blokujące działanie.

Aby zademonstrować to podejście, najpierw przeprowadziliśmy eksperyment potwierdzający słuszność koncepcji, w którym główny czynnik replikacji, białko replikacyjne A3 (RPA3) jest niszczone w przerzutowych komórkach raka piersi u myszy. Pokazujemy, że myszy, którym wstrzyknięto komórki knockdown RPA3, mają znacznie mniejsze obciążenie przerzutowe w każdym punkcie czasowym w porównaniu z myszami, którym wstrzyknięto komórki kontrolne. Analiza płuc zawierających przerzuty pokazuje, że to zmniejszone obciążenie przerzutami jest wynikiem znacznie zmniejszonej kolonizacji przerzutów i upośledzonego wzrostu tworzących się przerzutów. Aby jeszcze bardziej zademonstrować tę technikę, sprawdziliśmy, czy jednoczesne znokautowanie białka związanego z Yes (YAP) i koaktywatora transkrypcji z motywem wiążącym PDZ (TAZ) upośledza kolonizację przerzutową lub późniejszy wzrost. YAP i TAZ to dwa powiązane koaktywatory transkrypcji, które są krytycznymi efektorami szlaku hipopotama. We15,16 i inni powiązali YAP i TAZ z przerzutami (przejrzane w17,18,19), sugerując, że te białka są dobrymi celami terapeutycznymi. Konsekwentnie stwierdziliśmy, że myszy, którym wstrzyknięto komórki knockdown YAP / TAZ, znacznie zmniejszyły obciążenie przerzutami. Analiza płuc wykazała, że komórki knockdown YAP/TAZ tworzyły znacznie mniej przerzutów, a przerzuty, które się utworzyły, były mniejsze. Eksperymenty te pokazują, w jaki sposób eksperymentalne testy przerzutów pozwalają badaczowi szybko i niedrogo przetestować rolę genu kandydującego w tworzeniu i wzroście przerzutów. Pokazują ponadto, w jaki sposób połączone wykorzystanie obrazowania żywych zwierząt i fluorescencyjnej kwantyfikacji przerzutów w całych płucach pozwala badaczowi lepiej zrozumieć etapy kolonizacji przerzutów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół obejmuje użycie myszy i materiałów biologicznych i wymaga zatwierdzenia przez odpowiednie instytucjonalne komitety bezpieczeństwa. Wszystkie opisane tutaj prace in vivo są zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki i użytkowania zwierząt w Albany Medical College (IACUC).

UWAGA: Aby zapoznać się z przeglądem protokołu, zobacz schemat w Rysunek 1.

1. Pakowanie wszystkich wymaganych retrowirusów i lentiwirusów

UWAGA: Opisany protokół wykorzystuje wektory lentiwirusowe lub retrowirusowe do stabilnej ekspresji enzymu lucyferazy i białka fluorescencyjnego, a także do manipulowania ekspresją genu kandydującego. Wirusy te są upakowane w komórkach HEK-293FT, jak opisano poniżej.

  1. Dzień 1: Umieść komórki HEK-293FT na 6-dołkowych płytkach w 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej (10% FBS w DMEM z 1% penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy) tak, aby w 2 dniu były w 40-60% zlewne. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.
  2. Dzień 2: Dla każdego wektora wirusowego, który ma być zapakowany, należy przetransfekować 40-60% zlewającą się studzienkę komórek HEK-293FT z wektorem retrowirusowym lub lentiwirusowym i odpowiednimi wektorami kodującymi płaszcz wirusowy i białka pakujące.
    UWAGA: Ten protokół wykorzystuje VSVG jako białko płaszcza, psPAX2 do pakowania lentiwirusowego i gag-pol do pakowania retrowirusowego (patrz Tabela uzupełniająca 1 dla listy wektorów).
  3. Przygotować mieszaninę kotransfekcji dla każdej studzienki w następujący sposób:
    1. Połączyć 4 μl roztworu lipidowego do transfekcji (patrz tabela materiałów) i 96 μl buforu do transfekcji i inkubować przez 5 minut.
    2. Dodać 1 μg wektora wirusowego, 0,5 μg wektora białka płaszcza (VSVG) i 0,5 μg wektora białka opakowania (psPAX2 lub gag-pol) i inkubować przez 20 minut.
    3. Delikatnie dodać mieszaninę kotransfekcji z etapu 1.3.2 do komórek HEK-293FT posianych w kroku 1.1 i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.
  4. Dzień 3: Usuń pożywkę zawierającą transfekcję z każdej studzienki i delikatnie dodaj 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez około 24 godziny.
  5. Dzień 4: Zebrać supernatant wirusa z każdej studzienki za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i przefiltrować przez filtr 0,45 μm do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml.
  6. Fakultatywnie: Jeżeli pożądane jest zebranie drugiej partii wirusa, delikatnie dodać 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez około 24 godziny.
  7. Dzień 5 (opcjonalnie): Zebrać drugą rundę supernatantu wirusa, jak w kroku 1.5.
    UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany przez zamrożenie supernatantu wirusa.

2. Generowanie komórek rakowych stabilnie wyrażających lucyferazy i białko fluorescencyjne

UWAGA: Poniższy protokół opisuje, jak najpierw stabilnie oznaczyć komórki 4T1 lucyferazyą świetlika i białkiem fluorescencyjnym (ZsGreen) za pomocą dwóch wektorów z unikalnymi genami selekcyjnymi. Następnie 3rd wektor wirusowy jest używany do manipulowania ekspresją genu kandydującego. Jednak wektory wirusowe, które jednocześnie dostarczają białko fluorescencyjne i manipulację genetyczną, mogą być również stosowane jako alternatywa (jak w reprezentatywnych eksperymentach poniżej). Można użyć innych komórek nowotworowych, ale liczba komórek powinna być zoptymalizowana dla kroków 2.1 i 2.7.1.

  1. Umieść komórki 4T1 w 1,5 x 10 5 komórek/basenie na 12-dołkowej płytce w kompletnym pożywce wzrostowej (10% FBS w DMEM z 1% penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy) i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.
  2. Zainfekuj komórki 4T1 supernatantem wirusowym wygenerowanym w kroku 1 w następujący sposób.
    1. Odessać pożywkę wzrostową z komórek i dodać 500 μl supernatantu wirusa lucyferazy i 500 μl supernatantu wirusa białka fluorescencyjnego, aby jednocześnie zainfekować komórki zarówno supernatantem wirusa lucyferazy, jak i białka fluorescencyjnego.
    2. Dodać 1 μl 8 mg/ml bromku heksadimetryny (patrz tabela materiałów).
    3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% aż do 75-90% zlewania (zwykle 24-48 godzin).
  3. Trypsynizuj komórki 4T1 za pomocą 500 μl trypsyny przez 2-5 minut (komórki powinny swobodnie spłukiwać dno studzienki). Przenieś wszystkie komórki do 6-centymetrowego naczynia w 4 ml pożywki selekcyjnej (kompletna pożywka wzrostowa zawierająca odpowiednie antybiotyki), wygaszając w ten sposób trypsynę. Umieścić 6-centymetrowe naczynie z niezakażonymi komórkami kontrolnymi w tym samym pożywce selekcyjnej.
    UWAGA: Odpowiednie stężenie antybiotyku należy określić z wyprzedzeniem, testując kilka dawek. Dodatkowo, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją może być również wykorzystane do selekcji komórek znakowanych fluorescencyjnie zamiast wyboru leków.
  4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w pożywce selekcyjnej i w razie potrzeby dzielić komórki, aż wszystkie niezakażone komórki kontrolne będą martwe (w zależności od genu selekcyjnego i linii komórkowej).
  5. Upewnij się, że zakażone komórki 4T1 wyrażają białko fluorescencyjne ZsGreen za pomocą filtra zielonego wzbudzenia (450-490 nm)/emisji (500-550 nm) ustawionego na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym w powiększeniu 50-100x.
  6. Potwierdź, że zakażone komórki 4T1 wyrażają lucyferazy, używając dostępnego na rynku zestawu aktywności lucyferazy w następujący sposób.
    1. Użyj minimalnej objętości 1x pasywnego buforu do lizy komórek 4T1 wykazujących ekspresję lucyferazy i kontroluj komórki 4T1, które nie wykazują ekspresji lucyferazy, delikatnie wstrząsając przez 30 minut.
    2. Dodać 20 μl lizatu komórkowego do 96-dołkowej płytki z białym dnem, a następnie 50 μl odczynnika do oznaczania lucyferazy z zestawu do aktywności lucyferazy.
    3. Użyj czytnika płytek, aby zmierzyć luminescencję komórek na wszystkich długościach fal w widmie przy użyciu ustawienia luminescencji.
      UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany przez zamrożenie stabilnie transdukowanych komórek.
  7. Manipuluj ekspresją genu kandydującego w następujący sposób:
    1. Płytka 6 x 105 znakowane komórki 4T1 z kroku 2.6 na szalce o średnicy 60 mm w 4 ml kompletnej pożywki wzrostowej i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.
    2. Odessać pożywkę wzrostową z każdej studzienki i dodać 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej zawierającej 4 μl bromku heksadimetryny o stężeniu 8 mg/ml.
    3. Dodać 2 ml supernatantu wirusa z etapu 1 do komórek posianych z kroku 2.7.2 i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.
    4. Trypsynizuj komórki 4T1 za pomocą 500 μl trypsyny przez 2-5 minut (komórki powinny swobodnie spłukiwać dno studzienki). Przenieś wszystkie komórki do 10-centymetrowego naczynia w 10 ml pożywki selekcyjnej (kompletnej pożywki wzrostowej zawierającej odpowiednie antybiotyki), wygaszając w ten sposób trypsynę. Umieść kilka niezainfekowanych komórek kontrolnych oznaczonych 4T1 w tym samym pożywce selekcyjnej.
    5. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w pożywce selekcyjnej i w razie potrzeby dzielić komórki, aż wszystkie niezakażone komórki umrą.
    6. Upewnij się, że ekspresja genu kandydującego jest zmieniona przy użyciu standardowego podejścia, takiego jak western blot20 lub qPCR21.
    7. Oznacz luminescencję i fluorescencję jak w krokach 2.5-2.6, aby określić, jak bardzo są podobne w komórkach kontrolnych i knockdown, ponieważ może się to zmienić (patrz Dyskusja).
      UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany przez zamrożenie stabilnie transdukowanych komórek.

3. Optymalizacja projektu eksperymentalnego in vivo

  1. Zoptymalizuj odpowiednią liczbę komórek i czas trwania eksperymentu dla pożądanego obciążenia przerzutami w następujący sposób.
    1. Rozpręż fluorescencyjne i bioluminescencyjne komórki 4T1 z kroku 2.6 w kompletnej pożywce wzrostowej, tak aby nadmiar komórek był dostępny w pożądanym dniu wstrzyknięcia.
    2. Przygotować komórki do wstrzyknięć do żyły ogonowej zgodnie z opisem w kroku 4.2. Aby określić optymalną liczbę komórek do wstrzyknięć, należy ponownie zawiesić komórki w kilku różnych stężeniach w 100 μl 1x PBS.
      UWAGA: Zalecamy przetestowanie zakresu numerów komórek/myszy od 25 000 do 500 000.
    3. Zawiesiny komórkowe należy przechowywać na lodzie do czasu wstrzyknięcia.
    4. Wstrzyknąć każde rozcieńczenie komórek 4T1 z kroku 3.1.2 3-4 myszom przez boczną żyłę ogonową opisaną w kroku 4.3 (patrz poniżej).
    5. Umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj przez 15 minut, aby zapewnić pełne wyzdrowienie. Myszy należy sprawdzać pod kątem oznak bólu lub niepokoju 3 razy w tygodniu.
    6. Monitoruj myszy pod kątem tworzenia i wzrostu przerzutów przez 3-6 tygodni (w zależności od linii komórkowej i szczepu myszy) za pomocą urządzenia do obrazowania żywych zwierząt in vivo (patrz kroki 5 i 6).
      1. Poddaj myszy eutanazji 3-6 tygodni po wstrzyknięciu żyły ogonowej zgodnie ze standardowymi wytycznymi instytucjonalnymi.
      2. Przygotuj płuca i oceń wielkość i liczbę przerzutów opisanych w kroku 7.
      3. Wybierz odpowiedni czas, w którym przerzuty rosną dla pożądanego obciążenia przerzutami (patrz dyskusja).

4. Iniekcja do żyły ogonowej oznaczonych komórek rakowych

UWAGA: Krok 4.2.4 został zoptymalizowany pod kątem wzrostu komórek 4T1 u syngenicznych myszy BALB/c. Jeśli stosowane są inne linie komórek rakowych i szczepy myszy, należy najpierw zoptymalizować liczbę wstrzykiwanych komórek i długość testu.

  1. Rozwiń linie komórkowe 4T1 wygenerowane w kroku 2 na dwóch 15-centymetrowych szalkach w kompletnych pożywkach wzrostowych, tak aby nadmiar komórek był dostępny w dniu wstrzyknięcia.
  2. Przygotuj komórki do wstrzyknięcia żyły ogonowej w następujący sposób:
    1. Odessać pożywkę i przepłukać płytki komórkowe 1x PBS.
    2. Trypsynizuj komórki 5 ml trypsyny na 15 cm płytkę przez 2-5 minut (komórki powinny swobodnie spłukiwać dno studzienki). Przenieś wszystkie komórki do stożkowej rurki. Umyj pozostałe komórki z naczynia do hodowli tkankowej wystarczającą ilością kompletnego podłoża wzrostowego, aby ugasić trypsynę i dodaj popłuczynę do tej samej stożkowej probówki.
    3. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek, aby określić całkowitą liczbę komórek.
    4. Odwirować komórki przy stężeniu 122 x g przez 3 minuty, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1x PBS w żądanym stężeniu. W tym przypadku każdej myszy wstrzykuje się 2,5 x 104 komórki w 100 μl PBS, a więc komórki ponownie zawieszone w ilości 2,5 x 105 komórek/ml. Zawiesiny komórek należy przechowywać na lodzie do momentu wstrzyknięcia.
      UWAGA: ważne jest, aby ograniczyć czas między trypsynizacją komórek a wstrzyknięciem żyły ogonowej do około 1 godziny.
  3. Wstrzyknąć komórki 4T1 z kroku 4.2.5 myszom przez boczną żyłę ogonową w następujący sposób:
    1. Pracując w kapturze w pomieszczeniu dla zwierząt, delikatnie, ale dokładnie wymieszaj komórki, odwracając probówkę lub używając strzykawki o pojemności 1 ml, aby upewnić się, że są one równomiernie zawieszone. Zawsze upewnij się, że komórki są ponownie zawieszone przed załadowaniem strzykawki.
    2. Załadować strzykawkę Luer-lock o pojemności 1 ml z zawiesiną komórek i usunąć nadmiar pęcherzyków powietrza. Umieść igłę o średnicy 1/2 cala o rozmiarze 30 na strzykawce skosem do góry i usuń pęcherzyki powietrza.
    3. Delikatnie umieść mysz w uchwycie dla gryzoni.
    4. Boczne żyły ogonowe powinny być widoczne i rozszerzone. Jeśli nie, delikatnie uszczypnij podstawę ogona i zanurz ogon w ciepłej wodzie z kranu, aby rozszerzyć żyły.
      UWAGA: Rozszerzenie żył można również osiągnąć, umieszczając klatkę myszy pod lampą grzewczą i/lub na poduszce grzewczej.
    5. Użyj chusteczki nasączonej alkoholem, aby wyczyścić ogon. Wprowadzić igłę do żyły ogonowej, skośnie do góry i wstrzyknąć 100 μl zawiesiny komórek.
      UWAGA: Jeśli igła jest prawidłowo wprowadzona do żyły, powinna łatwo przesuwać się lekko do przodu i do tyłu, a przy naciskaniu tłoka nie powinno być oporu. Udane wstrzyknięcia powinny również spowodować "uderzenie", w którym niebieski kolor żyły zmienia kolor na biały na kilka sekund po wstrzyknięciu.
  4. Powoli wyjąć igłę i za pomocą jałowej gazy uciskać miejsce wstrzyknięcia, aby zatamować krwawienie.
  5. Umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj przez 15 minut, aby zapewnić pełne wyzdrowienie. Myszy należy sprawdzać pod kątem oznak bólu lub niepokoju 3 razy w tygodniu.
  6. Monitoruj myszy pod kątem tworzenia i wzrostu przerzutów przez 3-6 tygodni (w zależności od linii komórkowej i szczepu myszy) za pomocą urządzenia do obrazowania żywych zwierząt in vivo (patrz kroki 5 i 6).

5. Monitorowanie obciążenia przerzutami za pomocą fluorescencji za pomocą urządzenia do obrazowania in vivo żywych zwierząt

UWAGA: Nie obrazuj zwierząt pod kątem fluorescencji z aktywnym sygnałem luminescencyjnym.

  1. Jeśli obrazujesz tylko bioluminescencję, przejdź do kroku 6.
  2. Włącz urządzenie do obrazowania żywych zwierząt in vivo.
  3. Skonfiguruj system znieczulenia do obrazowania żywych zwierząt in vivo zgodnie z wytycznymi producenta, aby dostarczyć od 1,5% do 2% izofluranu do komory anestezjologicznej i komory obrazowania.
  4. Znieczulenie myszy z fluorescencyjnie znakowanymi przerzutami z kroku 4 umieszcza je w komorze anestezjologicznej i dostarcza 1,5-2,5% izofluranu.
  5. Otwórz oprogramowanie do tworzenia obrazów (patrz Spis materiałów) i zaloguj się.
  6. Kliknij przycisk Inicjalizuj i poczekaj na zainicjowanie urządzenia.
  7. Zmień pole widzenia na D.
    UWAGA: Pole widzenia C może być również używane, jeśli wymagane jest bliższe przyjrzenie się myszy, ale ogranicza to liczbę myszy, które można obrazować jednocześnie.
  8. Gdy oprogramowanie wskaże, że aparat osiągnął odpowiednią temperaturę, kliknij przycisk Imaging Wizard (Kreator obrazowania), wybierz opcję Fluorescencja, a następnie wybierz odpowiednią parę filtrów z menu rozwijanego.
    UWAGA: Jeśli używany fluorofor nie jest opcją, wybierz Wejście EX/EM i wpisz wymagane wzbudzenie i emisję.
  9. Umieść mysz w komorze zgodnie z opisem w kroku 3.2.4.
  10. Kliknij przycisk Pobierz sekwencję.
  11. Po obrazowaniu umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj przez 15 minut, aby zapewnić pełną regenerację.
  12. Powtórz kroki 5.2 i 5.7-5.9 z co najmniej jedną myszą, która nie zawiera przerzutów. UWAGA: Ta mysz będzie używana do ilościowego określania i odejmowania sygnału tła podczas analizy (krok 8).
  13. Obraz 2-3 razy w tygodniu przez cały czas trwania eksperymentu.

6. Monitorowanie obciążenia przerzutami za pomocą bioluminescencji za pomocą urządzenia do obrazowania żywych zwierząt in vivo

  1. Włącz urządzenie do obrazowania żywych zwierząt in vivo i skonfiguruj program w następujący sposób.
    1. Otwórz oprogramowanie do tworzenia obrazów (patrz Spis materiałów) i zaloguj się. Kliknij przycisk Inicjalizuj i poczekaj na zainicjowanie urządzenia. Zmień pole widzenia na D.
      UWAGA: Pole widzenia C może być używane do bliższego widoku, aby zobrazować całą obudowę myszy; Ogranicza to jednak liczbę myszy, które można obrazować jednocześnie.
    2. Przy pierwszym użyciu edytuj ustawienia ekspozycji w następujący sposób: kliknij Edytuj | Preferencje | Akwizycja | Automatyczna ekspozycja i zmień maksymalny czas ekspozycji z domyślnych 60 sekund na 300 sekund, a następnie kliknij OK.
      UWAGA: Nie zmieniaj żadnych innych parametrów na karcie automatycznej ekspozycji.
  2. Ustaw system anestezjologiczny zgodnie z wytycznymi producenta, aby dostarczyć od 1,5% do 2% izofluranu do komory anestezjologicznej i komory obrazowania.
  3. Upewnij się, że kamera osiągnęła odpowiednią temperaturę przed przejściem do kroku 6.4.
  4. Znieczulenie myszy z przerzutami z kroku 4 należy umieścić w komorze anestezjologicznej i dostarczyć 1,5-2,5% izofluranu.
  5. Przygotuj myszy do obrazowania bioluminescencyjnego w następujący sposób.
    1. Załaduj strzykawkę o pojemności 1 ml z D-lucyferyną (30 mg / ml w D-PBS), a następnie dodaj igłę 1/2 cala o rozmiarze 30 do strzykawki i usuń pęcherzyki powietrza.
    2. Zmierz i zapisz masę znieczulonej myszy.
    3. Powstrzymaj mysz, szczypiąc kark za pomocą kciuka i palców wskazujących oraz chwytając ogon między małym palcem a podstawą dłoni. Odwróć mysz pod kątem 45 stopni, z głową skierowaną w dół.
    4. Włóż igłę, skośną stroną do góry, w przestrzeń dootrzewnową (IP) myszy po lewej stronie. Potwierdź wejście do przestrzeni IP, pobierając z powrotem mały wolumin. Nie powinno być koloru u podstawy igły podczas cofania się w przestrzeni IP.
    5. Wstrzyknąć odpowiednią objętość D-lucyferyny w dawce 150 mg/kg.
    6. Natychmiast po podaniu D-lucyferyny uruchom minutnik i umieść mysz płasko na plecach w urządzeniu do obrazowania z nosem w stożku nosa i upewnij się, że podawane jest 1,5-2,5% izofluranu. Umieść separatory między każdą myszą w przypadku obrazowania wielu myszy. Upewnij się, że myszy są ustawione tak płasko, jak to możliwe (tj. nie przechylają się na jedną stronę).
    7. Kliknij pola Luminescencyjny i Fotografia, a następnie kliknij przycisk Uzyskaj w Panelu sterowania pobierania.
  6. Ciągłe pozyskiwanie obrazów bioluminescencyjnych aż do osiągnięcia sygnału szczytowego i wykorzystanie obrazu z szczytowym sygnałem bioluminescencyjnym do analizy.
  7. Po obrazowaniu umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj przez 15 minut, aby zapewnić pełną regenerację.
  8. Obraz 2-3 razy w tygodniu przez cały czas trwania eksperymentu.

7. Kwantyfikacja liczby i wielkości przerzutów

UWAGA: Czas wzrostu przerzutów powinien być określony dla każdej linii komórkowej i szczepu myszy, a liczba wstrzykniętych komórek będzie miała na niego wpływ.

  1. Poddaj myszy eutanazji zgodnie ze standardowymi wytycznymi instytucjonalnymi.
  2. Odizoluj i usuń płuca od każdej myszy i spłucz 1x PBS, aby usunąć nadmiar krwi.
  3. Delikatnie rozdziel płuca na płaty.
  4. Uzyskaj obrazy przerzutów ZsGreen w płatach przy 10x w jasnym polu i fluorescencji za pomocą stereoskopu fluorescencyjnego z filtrem szerokopasmowym GFP (wzbudzenie 470/40x).
    UWAGA: Zachowaj to samo powiększenie i jasność dla wszystkich próbek. Zastosowane powiększenie może się różnić w zależności od wielkości, liczby i jasności przerzutów, a także pola widzenia używanego mikroskopu.
  5. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby określić ilościowo rozmiar i liczbę przerzutów na obrazach.
    UWAGA: Protokół analizy obrazu jest zależny od oprogramowania i może być zoptymalizowany pod kątem nowotworów z kroku 3. Alternatywnie, policz liczbę przerzutów w każdym płucu ręcznie za pomocą fluorescencyjnego stereoskopu. Protokół można wstrzymać w tym miejscu, a krok 8 można wykonać w dowolnym momencie po zebraniu wszystkich obrazów in vivo.

8. Przetwarzanie i analiza danych z obrazów uzyskanych za pomocą urządzenia do obrazowania żywych zwierząt in vivo

  1. Otwórz wszystkie pliki obrazów dla każdej myszy w oprogramowaniu obrazu.
    UWAGA: Do analizy należy użyć obrazu ze szczytowym sygnałem bioluminescencyjnym
  2. Upewnij się, że jednostki są w opcji Radiance dla danych bioluminescencyjnych i Efficiency dla danych fluorescencyjnych, klikając strzałkę w lewym górnym rogu okna obrazu i zmieniając ją na odpowiednią jednostkę.
  3. Użyj obrazu z ostatniego punktu czasu, aby utworzyć obszar zainteresowania (ROI) w następujący sposób.
    1. Kliknij opcję ROI Tools (Narzędzia ROI) w oknie Tool Palette (Paleta narzędzi). Wstaw jeden zwrot akcji, klikając strzałkę i wybierając pozycję 1.
    2. Kliknij obramowanie ROI i przesuń go nad klatką piersiową myszy. Dostosuj rozmiar ROI tak, aby zakrywał klatkę piersiową myszy i nie wykluczał sygnału.
  4. Kliknij opcję Zmierz zwrot z inwestycji i skopiuj lub wpisz nieprzetworzoną liczbę do arkusza Excel.
    UWAGA: W przypadku danych bioluminescencyjnych wybierz całkowity strumień (fotony/sekundę), który jest sumą całego promieniowania w ROI. Ponieważ przerzuty niekoniecznie rosną równomiernie, całkowity strumień jest preferowany w stosunku do średniego promieniowania, ponieważ mierzy sumę obciążenia przerzutami. Podobnie, w przypadku danych fluorescencyjnych, zamiast średniej sprawności należy zastosować całkowity % sprawności (światło emisyjne (fotony/sekundę)/światło wzbudzenia (fotony/sekundę)).
  5. Kliknij prawym przyciskiem myszy plik obrazu, aby skopiować zwrot z inwestycji użyty w kroku 8.3 i wklej go do każdego pliku obrazu.
    UWAGA: Podczas ilościowego określania obrazów fluorescencyjnych należy określić ilościowo ten sam region na myszy, który został zobrazowany bez przerzutów. Użyj tego sygnału jako sygnału tła i odejmij go od każdego uzyskanego obrazu myszy zawierającego przerzuty fluorescencyjne
    6. .
  6. Przenieś wklejone ROI na ten sam region wybrany w kroku 8.3.4 dla każdego obrazu i powtórz krok 8.4.
  7. Wykreśl i przeanalizuj dane pierwotne w następujący sposób (patrz Tabela uzupełniająca 2).
    1. Wykonaj transformację logarytmiczną10 surowych danych dla każdej myszy, korzystając ze wskazanego wzoru (Tabela uzupełniająca 2) i wykreśl jak w Rysunek 2D i Rysunek 4F. Transformacja logarytmu10 linearyzuje krzywą wzrostu, która ma tendencję do bycia geometryczną i minimalizuje heteroskedastyczność.
    2. Korzystając z regresji liniowej, oblicz nachylenie dopasowanej linii do logarytmu10 przekształconych danych dla każdej myszy wykreślonej w kroku 8.7.1 (Tabela uzupełniająca 2). Zapoznaj się ze wzorem w tabeli uzupełniającej 2, aby dopasować linię i obliczyć nachylenie w jednym kroku.
    3. Wykreśl wartości liczbowe nachyleń jak w Rysunek 2E i Rysunek 4G. Użyj testu t-Studenta lub jednokierunkowej ANOVA (dla więcej niż 2 grup) na stokach, aby określić istotność statystyczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zademonstrować powyższe podejście, przeprowadziliśmy eksperyment typu proof of concept, w którym dokonano wyciszenia krytycznego czynnika replikacji, RPA3, w linii komórkowej przerzutowego raka gruczołowego piersi myszy (4T12). Chociaż protokół opisuje znakowanie komórek zarówno lucyferazą, jak i białkami fluorescencyjnymi przed manipulacją genetyczną, zastosowaliśmy zmodyfikowane podejście, ponieważ wektory RNAi dostarczają również ZsGreen (Rycina 2A

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Krytyczne etapy metody
Bardzo ważne jest zoptymalizowanie liczby wstrzykiwanych komórek (krok 3) dla danej linii komórkowej i szczepu myszy, ponieważ może to znacznie wpłynąć na liczbę powstających przerzutów i długość eksperymentu. Jeśli wstrzyknie się zbyt wiele komórek lub przerzuty rosną zbyt długo, przerzuty mogą być trudne do policzenia, co utrudnia ocenę skutków manipulacji genetycznej. Jeśli jednak wstrzyknie się zbyt mało komórek, może powstać niewiele przerzutów lub nie ma ich wcale. Dlate...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Emily Norton za pomoc w walce z infekcjami wirusowymi i krytyczne przeczytanie manuskryptu. Dziękujemy również Ryanowi Kanai za pomoc w uzyskaniu obrazów płuc oraz Kate E. Tubbesing za pomoc w analizie obrazu zielonych przerzutów do płuc. Dziękujemy personelowi ośrodka badawczego na zwierzętach za wsparcie i pomoc w przygotowaniu tego filmu. Praca ta została wsparta grantem Susan G. Komen Career Catalyst Grant, który został przyznany J.M.L. (#CCR17477184).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% SDS-PAGE ŻelDo western blot
2,5% TrypsynaGibco15090-046Trypsyna do hodowli tkankowej
96-dołkowa biała płytka testowa z płaskim dnemCorning3922Do pomiaru lucyferazy i sygnału renilli w hodowanych komórkach
Chusteczki nasączone alkoholemDo sterylizacji miejsca wstrzyknięcia przed wszczepieniem żyły ogonowej
Myszy BALB/C ( samica, 6 tygodni)TaconicBALB-FDo kolonizacji przerzutów do żył ogonowych i testów obciążenia
BSA regularVWR Ameresco97061-416Do western blot
Bufor do lizy komórekSygnalizacjaDo zbierania próbek protien
Filtry strzykawkowe Celltreat, PES 30mm, 0,45 i mu; mCelltreat40-229749-CSDo filtrowania wirusowego supernatantu
CO2 i komoryeutanazyjnej Do eutanazji myszy Zestaw do eutanazji
reporterowej z podwójną lucyferazyPromegaE1960Do pomiaru sygnału lucyferazy i renilli w hodowanych komórkach
Dulbecco& 39; s sól fizjologiczna buforowana fosforanamiHimediaTS1006Dla PBS
EDTAVWR97061-406Służy do rozcieńczania trypsyny do hodowli tkankowej
FBS 100% pochodzenia amerykańskiegoVWR97068-085Składnik kompletnych pożywek wzrostowych
Obrazownik żelowy Fujifilm LAS-3000FujifilmDo western blot
GAPDH (14C10) Rabibit mAbSygnalizacja komórkowa2118Dla western blot
Kozia anty-królicza IgG (H+L) Przeciwciało drugorzędowe, koniugat HRPThermo Scientific31460Dla western blot
Ludzkie embrionalne komórki nerkowe, HEK-293FTInvitrogenR70007Linia komórkowa używana do pakowania wirusa
HyClone DMEM / High ClucoseGE Healthcare nauki przyrodniczeSH30243.01Składnik kompletnej pożywki wzrostowej
Higromycyna B, Ultra Pure GradeVWR Ameresco97064-810Do selekcji antybiotyków zakażonych komórek
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EAUrządzenia molekularneDo pomiaru lucyferazy i sygnału renilla w hodowanych komórkach
ImagejSłuży do analizy obrazu przerzutów do płuc: próg ustawiony na 25 i 100
Immuno-Blot Membrana PVDFBiorad1620177Dla western blot
IzofluranDo znieczulenia myszy
IVIS Lumina XRMS System obrazowania in vivo (urządzenie do obrazowania żywych zwierząt in vivo)PerkinElmerCLS136340Do obrazowania in vivo obciążenia przerzutowego
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP i filtry jasnego pola)Mikroskopi kamera Leica Microsystems do wizualizacji, liczenia i pobierania próbek przerzutów do płuc; 10-krotne powiększenie, 3,5 sekundy ekspozycji, zysk 1,4
Living Image 3.2 (oprogramowanie do obrazowania)Oprogramowanie PerkinElmerdla komórek raka piersi myszy IVIS
, 4T1Karmanos Cancer InstituteAslakson, CJ i wsp., 1992Linia komórek kancelaryjnych piersi z przerzutami myszy
Multi-Gauge wersja 3.0Oprogramowanie Fujifilmdo ilościowego określania intensywności pasma Western blot
Opti-MEM (bufor transfekcyjny)Gibco31985-062Do pakowania wirusów i transfekcji
Penicylina StreptomycynaGibco15140-122Składnik kompletnych pożywek wzrostowych
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo Scientific23225Do ilościowego określania stężenia białka
Inhibitor fosfatazy Pierce Mini tabletkiThermo ScientificA32957Dodany do buforu do lizy komórek
Inhibitor proteazy Pierce Mini tabletkiThermo ScientificA32953Dodano do buforu do lizy komórek
Polybrene (bromek heksadimetryny)Sigma-Aldrich45-H9268Do infekcji
PuromycinSigma-Aldrich45-P7255Do antybiotykowej selekcji zakażonych komórek
Środek odstraszającyDo krępowania myszy podczas injeciton
żyły ogonowej Bufor biegowyNa western blot
TAZ (V3886)Sygnalizacja komórkowa4883Do buforu
blot TBST
automatycznego licznika komórek Western blot TC20Bio-RadDo liczenia komórek
WektoryPełna lista wektorów
odwróconej fluorescencji VWRVWR89404-464Do wizualizacji fluorescencji w Komórki znakowane ZSGreen
Zachodni buforDla Western blot
XenoLight D-Luciferin K+ SólPerkinElmer122799Substrate wstrzykiwany myszom w celu uzyskania bioluminescencyjnych obrazów IVIS in vivo
Odczynnik do transfekcji DNA X-tremeGENE 9 (roztwór lipidowy do transfekcji)Roche6365787001Do pakowania wirusa
YAP (D8H1X) XP Sygnalizacja komórkowa mAb królika14074Do western blot
komórkowa L-glutaminy Gibco 25030-081 Składnik kompletnych pożywek wzrostowych Lipofectamina 3000 Life technologies L3000008 Do transfekcji reporterskiej YAP/TAZ-TEAD gryzonie SDS-PAGE przeciwciała Western Do znajduje się w Tabeli 1 Mikroskop transferowy

Bibliografia

  1. Ferlay, J. S. I., et al. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11. , Available from: http://globocan.iarc.fr (2013).
  2. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  3. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  4. Wendt, M. K., Molter, J., Flask, C. A., Schiemann, W. P. In vivo dual substrate bioluminescent imaging. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  5. Moret, R., et al. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
  6. Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  7. Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  8. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clinical and Experimental Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
  9. Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  10. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  11. Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  12. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  13. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  14. Oshima, G., et al. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  15. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  16. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (37), 2441-2450 (2012).
  17. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers (Basel). 10 (4), (2018).
  18. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cell Signal. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  19. Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 114 (4), 457-467 (2003).
  20. Journal of Visualized Experiments Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  21. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  22. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Ressearch. 52 (6), 1399-1405 (1992).
  23. Fellmann, C., et al. Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell. 41 (6), 733-746 (2011).
  24. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nature Communications. 3, 1122(2012).
  25. Sun, Z., et al. Prognostic Value of Yes-Associated Protein 1 (YAP1) in Various Cancers: A Meta-Analysis. Public Library of Science One. 10 (8), 0135119(2015).
  26. Feng, J., Ren, P., Gou, J., Li, Z. Prognostic significance of TAZ expression in various cancers: a meta-analysis. Onco Targets and Therapy. 9, 5235-5244 (2016).
  27. Ge, L., et al. Yes-associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma nodal metastasis. Public Library of Science One. 6 (11), 27529(2011).
  28. Zhang, X., et al. The Hippo pathway transcriptional co-activator, YAP, is an ovarian cancer oncogene. Oncogene. 30 (25), 2810-2822 (2011).
  29. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  30. Kim, T., et al. MRTF potentiates TEAD-YAP transcriptional activity causing metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 36 (4), 520-535 (2017).
  31. Nallet-Staub, F., et al. Pro-invasive activity of the Hippo pathway effectors YAP and TAZ in cutaneous melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 134 (1), 123-132 (2014).
  32. Hsu, Y. L., et al. Angiomotin decreases lung cancer progression by sequestering oncogenic YAP/TAZ and decreasing Cyr61 expression. Oncogene. 34 (31), 4056-4068 (2015).
  33. Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 33 (5), 468-481 (2014).
  34. Gu, J. J., et al. Inactivation of ABL kinases suppresses non-small cell lung cancer metastasis. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (21), 89647(2016).
  35. Diepenbruck, M., et al. Tead2 expression levels control the subcellular distribution of Yap and Taz, zyxin expression and epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Science. 127, Pt 7 1523-1536 (2014).
  36. Han, S., et al. Suppression of miR-16 promotes tumor growth and metastasis through reversely regulating YAP1 in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 8 (34), 56635-56650 (2017).
  37. Yin, K., et al. Netrin-1 promotes metastasis of gastric cancer by regulating YAP activity. Biochemical Biophysical Research Communications. 496 (1), 76-82 (2018).
  38. Guo, L., et al. Knockdown of TAZ modifies triple-negative breast cancer cell sensitivity to EGFR inhibitors by regulating YAP expression. Oncology Reports. 36 (2), 729-736 (2016).
  39. Liu, Y. N., et al. Loss of Androgen-Regulated MicroRNA 1 Activates SRC and Promotes Prostate Cancer Bone Metastasis. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1940-1951 (2015).
  40. Bartucci, M., et al. TAZ is required for metastatic activity and chemoresistance of breast cancer stem cells. Oncogene. 34 (6), 681-690 (2015).
  41. Wang, T., et al. YAP promotes breast cancer metastasis by repressing growth differentiation factor-15. Biochimica et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1864, 5 Pt A 1744-1753 (2018).
  42. Wang, J., Rouse, C., Jasper, J. S., Pendergast, A. M. ABL kinases promote breast cancer osteolytic metastasis by modulating tumor-bone interactions through TAZ and STAT5 signaling. Science Signaling. 9 (413), (2016).
  43. Sun, S., Irvine, K. D. Cellular Organization and Cytoskeletal Regulation of the Hippo Signaling Network. Trends in Cell Biology. 26 (9), 694-704 (2016).
  44. Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
  45. Li, C., et al. A ROR1-HER3-lncRNA signalling axis modulates the Hippo-YAP pathway to regulate bone metastasis. Nature Cell Biology. 19 (2), 106-119 (2017).
  46. Pei, T., et al. YAP is a critical oncogene in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 6 (19), 17206-17220 (2015).
  47. Qiao, Y., et al. YAP Regulates Actin Dynamics through ARHGAP29 and Promotes Metastasis. Cell Reports. 19 (8), 1495-1502 (2017).
  48. Zhou, W., Li, X., Premont, R. T. Expanding functions of GIT Arf GTPase-activating proteins, PIX Rho guanine nucleotide exchange factors and GIT-PIX complexes. Journal of Cell Science. 129 (10), 1963-1974 (2016).
  49. Haemmerle, M., et al. Platelets reduce anoikis and promote metastasis by activating YAP1 signaling. Nature Communcations. 8 (1), 310(2017).
  50. Liu, Y., et al. Increased TEAD4 expression and nuclear localization in colorectal cancer promote epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a YAP-independent manner. Oncogene. 35 (21), 2789-2800 (2016).
  51. Hiemer, S. E., et al. A YAP/TAZ-Regulated Molecular Signature Is Associated with Oral Squamous Cell Carcinoma. Molecular Cancer Research. 13 (6), 957-968 (2015).
  52. Lee, H. J., et al. Fluid shear stress activates YAP1 to promote cancer cell motility. Nature Communications. 8, 14122(2017).
  53. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  54. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388, Pt 1 217-225 (2005).
  55. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210(2005).
  56. Chen, M. B., Lamar, J. M., Li, R., Hynes, R. O., Kamm, R. D. Elucidation of the Roles of Tumor Integrin beta1 in the Extravasation Stage of the Metastasis Cascade. Cancer Resesearch. 76 (9), 2513-2524 (2016).
  57. Labelle, M., Begum, S., Hynes, R. O. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis. Cancer Cell. 20 (5), 576-590 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Przerzuty raka piersikolonizacja płucobrazowanie bioluminescencyjneobrazowanie fluorescencyjneobciążenie przerzutowewyciszenie YAP TAZkwantyfikacja przerzutówprojekt eksperymentalny in vivo
Łączne wykorzystanie testów przerzutów do żył ogonowych i obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia kolonizacji przerzutowej raka piersi i obciążenia płuc
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.