Wywoływanie ostrego uszkodzenia wątroby u szczurów poprzez ekspozycję na czterochlorek węgla (CCl4) przez sondę ustno-żołądkową

Podsumowanie

Ten protokół opisuje powszechną i wykonalną metodę wywoływania ostrego uszkodzenia wątroby (ALI) poprzez ekspozycję na CCl₄ przez sondę ustno-żołądkową. Ekspozycja na_{CCl 4} indukuje ALI poprzez tworzenie reaktywnych form tlenu podczas jego biotransformacji w wątrobie. Metoda ta służy do analizy patofizjologii ALI i badania różnych strategii hepatoprotekcyjnych.

Streszczenie

Ostre uszkodzenie wątroby (ALI) odgrywa kluczową rolę w rozwoju niewydolności wątroby, która charakteryzuje się ciężką dysfunkcją wątroby, w tym powikłaniami takimi jak encefalopatia wątrobowa i upośledzona synteza białek. Odpowiednie modele zwierzęce są niezbędne do zbadania mechanizmu i patofizjologii ALI oraz zbadania różnych strategii hepatoprotekcyjnych. Ze względu na swoją zdolność do przeprowadzania przemian chemicznych, czterochlorek węgla (CCl₄) jest szeroko stosowany w wątrobie do indukowania ALI poprzez tworzenie reaktywnych form tlenu. Ekspozycja na_{CCl 4} może być wykonywana dootrzewnowo, wziewnie lub przez sondę nosowo-żołądkową lub ustno-żołądkową. Tutaj opisujemy model gryzonia, w którym ALI jest indukowany przez ekspozycję na_{CCl 4} przez sondę ustno-żołądkową. Ta metoda jest niedroga, łatwa do wykonania i wiąże się z minimalnym ryzykiem zagrożenia. Model jest wysoce powtarzalny i może być szeroko stosowany do określania skuteczności potencjalnych strategii hepatoprotekcyjnych i oceny markerów uszkodzenia wątroby.

Wprowadzenie

Częstotliwość toksycznych uraz wątroby, zwłaszcza z powodu nadużywania alkoholu i narkotyków, wzrasta. Ostre uszkodzenie wątroby (ALI) wiąże się z wysoką śmiertelnością i powoduje problemy kliniczne^1,2. Toksyczne uszkodzenie prowadzi do szlaków sygnalizacyjnych śmierci w wątrobie, powodując apoptozę hepatocytów, martwicę lub piroptozę. ALI odgrywa kluczową rolę w rozwoju niewydolności wątroby, która charakteryzuje się ciężką dysfunkcją wątroby, w tym powikłaniami, takimi jak encefalopatia wątrobowa i upośledzona synteza białek^3,4. Choć ostatnie badania poszerzyły naszą wiedzę na temat zmian fizjologicznych i patologicznych towarzyszących niewydolności wątroby, nie wyjaśniły one w pełni cech patomolekularnych, które wpływają na mechanizmy śmierci komórki. Co więcej, obecnie nie są dostępne żadne leki, które mogłyby odwrócić postępujące pogorszenie stanu zdrowia u pacjentów z ALI . Obecnie jedynym znacząco skutecznym leczeniem jest przeszczepienie wątroby^5,6.

W celu zbadania mechanizmu i patofizjologii ALI oraz przetestowania różnych strategii hepatoprotekcyjnych, do indukcji ALI wykorzystywane są różne modele zwierzęce. Preferowany model zwierzęcy ALI powinien naśladować patologiczny proces choroby za pomocą niezawodnej, zwalidowanej, niedrogiej i łatwej do zastosowania metody. Przykłady modeli eksperymentalnych obejmują czynniki hepatotoksyczne, zabiegi chirurgiczne, takie jak całkowita lub częściowa hepatektomia, całkowita lub przejściowa dewaskularyzacja oraz procedury infekcyjne^7,8,9. Znane substancje hepatotoksyczne to galaktozamina, paracetamol, tioacetamid, azoksymetan i_{CCl 4}. Spośród nich CCl₄ jest szeroko stosowany, chociaż nie został jeszcze dobrze scharakteryzowany^10,11,12,13.

CCl₄ to organiczny, bezbarwny płynny związek o słodkim zapachu i prawie zerowej palności w niższych temperaturach. Narażenie na wysokie stężenia_{CCl 4} może powodować uszkodzenie ośrodkowego układu nerwowego, w tym pogorszenie stanu wątroby i nerek. CCl₄ indukuje ALI poprzez jego biotransformację w wątrobie, która tworzy reaktywne formy tlenu. Dzieje się to za pośrednictwem enzymu cytochromu P450 2E1, tworząc aktywny metabolit i powodując uszkodzenie komórek przez wiązanie makrocząsteczek, zwiększenie peroksydacji lipidów i zaburzenie wewnątrzkomórkowej homeostazy wapnia¹⁴. Ponadto model CCl₄ może być wykorzystany do stymulacji astrocytów na poziomie syntezy RNA¹⁵. Ta hepatotoksyna była podawana drogą dootrzewnową, wewnątrzwrotną, doustną i dożołądkową¹⁶.

W tym protokole szczegółowo opisujemy indukowaną przez CCl₄ ALI u szczurów przez sondę ustno-żołądkową. Metoda ta indukuje solidny i powtarzalny ALI, który można wykorzystać do zbadania patogenezy ALI. Określenie nasilenia choroby wątroby jest monitorowane poprzez pomiar aminotransferazy glutaminiano-pirogronianowej (GPT) w surowicy, enzymów aminotransferazy szczawowooctowej glutaminowej (GOT) i bilirubiny całkowitej (TB), a także ostateczne rozpoznanie histologiczne za pomocą tkanek wątroby barwionych hematoksyliną i eozyną (H&E). Narażenie na CCl₄ przez dostęp dożołądkowy pozwala na praktyczną, niedrogą, minimalnie inwazyjną metodę o minimalnym ryzyku zagrożenia.

Protokół

Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Deklaracji z Helsinek i Tokio oraz z Wytycznymi Wspólnoty Europejskiej dotyczącymi wykorzystania zwierząt doświadczalnych. Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Ben-Guriona w Negev.

UWAGA: Model CCl₄ został wygenerowany i wykorzystany w poprzednim badaniu¹⁷. Harmonogram protokołu przedstawiono w tabeli 1.

1. Przygotowanie szczurów do procedury doświadczalnej

UWAGA: Wybierz dorosłego samca szczura Sprague Dawley o wadze 300−350 g.

1. Uzyskanie zgody na eksperymenty od Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania (IACUC).
2. Utrzymuj szczury w temperaturze pokojowej (22 °C ± 1 °C), z 12 godzinnymi cyklami światła i 12 godzinami ciemności. Zapewnij karmę dla szczurów i wodę ad libitum.
3. Wszystkie eksperymenty wykonuj w godzinach od 6:00 do 12:00.
4. Ogol szczura i zdezynfekuj skórę alkoholem.

2. Oznaczanie wyjściowych poziomów GOT, GPT i TB w surowicy

1. znieczulenie
   1. Przygotować system ciągłego podawania izofluranu w celu wywołania znieczulenia. Upewnij się, że system parownika jest wypełniony izofluranem.
   2. Znieczulij szczura 2% izofluranem. Upewnij się, że szczur jest w pełni znieczulony, obserwując ruch i odruch pedałowania w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne.
      UWAGA: Użyj 1-5% izofluranu do indukcji znieczulenia i konserwacji.
2. Kankaniuluj żyłę ogonową za pomocą cewnika 22 G.
3. Pobrać 0,5 ml próbki krwi na początku badania. Upewnij się, że pobrana objętość krwi nie przekracza wytycznych IACUC.
4. Wykonaj analizę biochemiczną krwi, w tym pomiary GOT, GPT i TB w surowicy, zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁸.
   UWAGA: Badania enzymów wątrobowych i poziomu gruźlicy przeprowadzono w laboratorium biochemicznym Centrum Medycznego Soroka. Próbki krwi analizowano metodą fluorescencyjną na analizatorze biochemicznym (Tabela materiałów).

3. Indukcja ostrego uszkodzenia wątroby u szczurów

UWAGA: Narażenie na wysokie stężenia_{CCl 4}, w tym absorpcja przez parę lub skórę, może mieć negatywny wpływ na ośrodkowy układ nerwowy i powodować zwyrodnienie wątroby i nerek. Długotrwałe narażenie może spowodować śpiączkę lub śmierć.

1. Przygotować 50% roztwór_{CCl 4} (tabela materiałów), mieszając CCl₄ z oliwą z oliwek jako nośnikiem w stosunku 1:1.
   UWAGA: Roztwór należy przygotować zgodnie z wytycznymi IACUC dla związków niefarmaceutycznych.
2. Wywołać hepatotoksyczność in vivo przez podanie CCl₄ przez zgłębnik jamy ustnej i żołądka.
   1. Włóż rurkę ustno-żołądkową o pojemności 16 G (głębokość 3 cali) przez jamę ustną szczura.
   2. Wystawić szczura na działanie różnych dawek_{CCl 4}, wstrzykując strzykawkę z jednym z następujących rozcieńczonych roztworów do żołądka szczura: 1 ml/kg (łagodne ALI), 2,5 ml/kg (umiarkowane ALI) lub 5 ml/kg (ciężkie ALI) 50% roztworu. W przypadku grupy kontrolnej operowanej pozorem należy wystawić szczura na działanie tylko 5 ml/kg oliwy z oliwek.

4. Oznaczanie poziomów GOT, GPT i TB w surowicy po 24 godzinach

1. znieczulenie
   1. Przygotować system ciągłego podawania izofluranu w celu wywołania znieczulenia. Upewnij się, że system parownika jest wypełniony izofluranem.
   2. Znieczulij szczury 2% izofluranem. Upewnij się, że szczur jest w pełni znieczulony, obserwując ruch i odruch pedałowania w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne.
2. Pobrać próbki krwi po 24 godzinach od ekspozycji na_{CCl 4}.
3. Wykonaj analizę biochemiczną krwi, w tym pomiary GOT, GPT i gruźlicy w surowicy.

5. Pobranie wątroby do badania histologicznego

1. Poddaj szczura eutanazji, zastępując wdychaną mieszaninę gazów 20% O₂ / 80% CO_{2 .} Upewnij się, że CO₂ jest dostarczany w określonej ilości zgodnie z wytycznymi IACUC.
2. Upewnij się, że nastąpi śmierć, sprawdzając, czy nie ma bicia serca i potwierdź metodą wtórną zgodnie z wytycznymi IACUC.
3. Umieść szczura na desce preparacyjnej z powierzchnią grzbietową skierowaną w dół i brzuchem skierowanym do góry. Ogol brzuch szczura.
4. Skalpelem naciąć skórę na całej długości brzusznej od odbytu do podbródka. Oddziel skórę. Naciąć ścianę brzucha skalpelem od odbytu do chrząstki ksyloidalnej, odsłaniając wnętrzności brzuszne.
5. Za pomocą nożyczek i kleszczy odizoluj wątrobę, wycinając ją z więzadeł i przyczepów. Zaczynając od wnęki wątroby, ostrożnie wykonaj hepatektomię, uwalniając wszystkie płaty wątroby z przyczepów. Wypreparuj i odetnij wszystkie więzadła i naczynia krwionośne.
6. Przenieś wątrobę na szalkę Petriego. Utrwalić wątrobę w 4% buforowanym roztworze formaldehydu (tabela materiałów) przez co najmniej 24 godziny.

6. Badanie histologiczne

1. Przygotowanie próbki
   1. Po utrwaleniu pokrój próbkę na serie plastrów o grubości 5 μm przez cięcie mikrotomem.
   2. Delikatnie ułóż plastry na szklanych szkiełkach miękką szczoteczką, po 1 plasterku na szkiełko.
   3. Wykonaj barwienie H&E zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁹.
2. Zbadaj plastry pod mikroskopem przy 200-krotnym powiększeniu za pomocą soczewki obiektywowej 20 mm (tabela materiałów).
   UWAGA: Skrawki wątroby powinny być oceniane przez wyspecjalizowanego patologa ślepego na protokół leczenia. Wynik 0 oznacza brak nieprawidłowości wątroby, 1–2 oznacza łagodne uszkodzenie wątroby, 3–4 oznacza umiarkowane uszkodzenie wątroby, a 5–6 oznacza poważne uszkodzenie wątroby^20,21,22.

Wyniki

Poziomy TB, GOT i GPT znacznie wzrosły 24 h po wywołaniu ALI (bardziej przy wyższych dawkach CCl₄) w porównaniu z grupą kontrolną poddaną zabiegowi pozornemu (p < 0,001) (Rysunek 1). Poziomy TB, GOT i GPT w punkcie wyjściowym były prawidłowe i nie różniły się znacząco od grupy kontrolnej poddanej zabiegowi pozornemu. Po 24 h wszystkie trzy grupy interwencyjne: 1 mL/kg CCl₄ (1, 1−2), 2,5 mL/kg CCl₄ (3, 3−4) oraz 5 mL/kg CCl₄ (4, 4−5,75) miały zna...

Dyskusja

W tym protokole CCl₄ jest stosowany jako toksyna wątrobowa do indukcji ALI u szczurów. ALI charakteryzuje się utratą miąższu wątroby i wynikającym z niej rozregulowaniem funkcji metabolicznych i syntetycznych wątroby. Leki, wirusy, toksyny, choroby autoimmunologiczne, choroby metaboliczne i zaburzenia naczyniowe indukują śmierć hepatocytów, a późniejsza reakcja zapalna przyczynia się do patogenezy ALI.

Początkowe uszkodzenie wątroby prowadzi do produkcji cytokin, uwalniania chemokin...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cewnik 22 G BD Neoflon TM	Becton Dickinson Infusion Therapy AB
4% buforowany roztwór formaldehydu	Sigma - Technologie materiałów
Aldrich Probówki BD Microtainer SST TM Becton	Dickinson and Company
Tetrachlorek węgla	Sigma - Technologie materiałów laboratoryjnych Aldrich	CAS 56-23-5
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc
Olympus AU2700 Chemia-Analizator immunologiczny	Olympus (MN, USA)		Analizę próbek krwi wykonano metodą fluorescencyjną
Mikroskop Olympus BX 40	Olympus
Igły do karmienia RAT	ORCHID SCIENTIFICS
ZESTAW STRZYKAWEK 1 i 2 ml MEDI -PLUS	Shandong Zibo Shanchuan Medical Instrumenty Co., Sp. z o.o

laboratoryjnych.