Ten protokół demonstruje dokładny i powtarzalny pomiar zużycia tlenu w wyspach trzustkowych naczelnych innych niż ludzie. Techniki ładowania wysepek i powlekania mikropłytki zapewniają ramy dla skutecznego pomiaru oddychania w innych typach sferoid hodowlanych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza zużycia tlenu przez wyspy trzustkowe naczelnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pomiar zużycia tlenu w sferoidalnych skupiskach komórek, takich jak wyspy trzustkowe ex vivo, był historycznie trudny. Demonstrujemy pomiar zużycia tlenu w wyspach trzustkowych za pomocą 96-dołkowej mikropłytki przeznaczonej do pomiaru zużycia tlenu w sferoidach. W tym teście mikropłytki sferoidalne są powlekane klejem komórkowym i tkankowym w dniu poprzedzającym badanie. Używamy niewielkiej objętości roztworu kleju, aby zachęcić wysepki do przylegania tylko do dna studni. W dniu testu 15 wysepek jest ładowanych bezpośrednio do podstawy każdej studzienki przy użyciu techniki, która zapewnia optymalne ustawienie wysepek i dokładny pomiar zużycia tlenu. Różne aspekty oddychania mitochondrialnego są badane farmakologicznie na wyspach wysepek naczelnych innych niż ludzie, w tym oddychanie zależne od ATP, oddychanie maksymalne i wyciek protonów. Metoda ta pozwala na uzyskanie spójnych, powtarzalnych wyników przy użyciu tylko niewielkiej liczby wysepek na studzienkę. Teoretycznie można go zastosować do dowolnych hodowanych sferoid o podobnej wielkości.
Wprowadzenie
Aby utrzymać prawidłowy poziom glukozy we krwi, komórka β trzustki musi wyczuwać wzrost poziomu glukozy i odpowiednio wydzielać insulinę. Sprzężenie wydzielania insuliny z poziomem glukozy jest bezpośrednio związane z metabolizmem glukozy i wytwarzaniem ATP poprzez mitochondrialną fosforylację oksydacyjną. Tak więc mitochondria odgrywają kluczową rolę w sprzężeniu bodziec-wydzielanie1. Ocena funkcji mitochondriów komórek β może ujawnić defekty, które prowadzą do upośledzenia wydzielania insuliny. Wydzielanie glukagonu przez komórki α trzustki jest również ściśle związane z funkcją mitochondriów2. Chociaż unieśmiertelnione linie komórkowe wysp trzustkowych okazały się przydatne w niektórych typach testów, fizjologia tych komórek nie podsumowuje dokładnie funkcji całych wysp trzustkowych, co ilustruje nasilenie wydzielania insuliny przez glukagon3,4 oraz hamowanie wydzielania glukagonu przez insulinę/somatostatynę5,6 w nienaruszonych wysepkach. Świadczy to o potrzebie pomiaru zużycia tlenu na całych, nienaruszonych wysepkach.
Techniki pomiaru respirometrii komórek wysp trzustkowych ewoluowały z biegiem czasu, od stosowania wrażliwych na tlen barwników fluorescencyjnych7 do czujników półprzewodnikowych, które bezpośrednio mierzą zużycie tlenu8. Powszechnie stosowane systemy płytek do hodowli komórkowych, początkowo zaprojektowane dla jednowarstwowych, przylegających komórek, okazały się nieskuteczne w przypadku wysp trzustkowych. Ponieważ wysepki nie przylegają naturalnie do studni, są podatne na wypchnięcie na obrzeża studni hodowlanej, co skutkuje niedokładnym pomiarem zużycia tlenu9. Aby zwalczyć ten problem, opracowano specjalistyczne 24-dołkowe płytki z centralnym zagłębieniem, które może zawierać wysepki9. Jednak system płytek 24-dołkowych był ograniczony przez dużą liczbę wymaganych wysepek (50-80 na studzienkę) oraz liczbę warunków, które można było testować jednocześnie10. Niedawny rozwój 96-dołkowych mikropłytek zaprojektowanych specjalnie do analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w sferoidach pokonał te bariery, umożliwiając pomiar respirometrii wysp trzustkowych z 20 lub mniej wyspami na studzienkę10.
Tutaj pokazujemy użycie tego systemu do pomiaru zużycia tlenu w wysepkach makaka japońskiego (Macaca fuscata), modelu zwierzęcego o podobnej biologii wysp do ludzkiej11,12. W tym protokole analizowanych jest 15 wysepek makaków na studnię. W naszych rękach 15 wysepek na studzienkę powodowało wyższe wyjściowe zużycie tlenu niż mniejsza liczba wysp trzustkowych, z silną aktywacją i tłumieniem oddychania w odpowiedzi na manipulację farmakologiczną. Zwracamy uwagę na etapy przygotowania do testu, skuteczną metodę konsekwentnego ładowania wysepek w środku każdej studni oraz typowe wyzwania związane z wykonywaniem tego testu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie mikropłytki i wkładu z czujnikiem w dniu poprzedzającym przeprowadzenie testu
Wysepki zostały wyizolowane od trzyletnich makaków japońskich, jak opisano wcześniej13. Ta metoda jest bardzo podobna do tej stosowanej do izolowania ludzkich wysp trzustkowych od dawców zwłok, ale różni się od myszy, u których trzustka jest często napompowywana roztworem kolagenazy, gdy zwierzę jest w sedacji i przed usunięciem narządu. Odzyskiwanie wysepek zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Narodowego Centrum Badań nad Naczelnymi w Oregonie (ONPRC) oraz Oregon Health and Science University i zostało zatwierdzone przez ONPRC IACUC. ONPRC przestrzega Ustawy o dobrostanie zwierząt i przepisów egzekwowanych przez Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA) oraz Polityki Publicznej Służby Zdrowia w zakresie humanitarnej opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych opublikowanym przez National Institutes of Health.
- Przygotowanie mikropłytki sferoidalnej
- Przygotować 3 ml 0,1 M roztworu wodorowęglanu sodu. Filtruj wysterylizuj roztwór. Zastosowaliśmy filtr 0,45 μm (Tabela Materiałów).
- W kapturze do hodowli komórkowej dodaj 200 μl kleju komórkowego i tkankowego (tabela materiałów) do 2,8 ml 0,1 M wodorowęglanu sodu. Następnie dodać 20 μl tego roztworu na dno każdej studzienki 96-dołkowej mikropłytki sferoidalnej (tabela materiałów). Upewnij się, że pęcherzyki powietrza zostały usunięte z końcówki pipety i że tylko spód płytki jest zakryty. Powłoka mikropłytki zapobiega przesuwaniu się wysepek po bokach studzienek, gdy leki są dodawane i mieszane ze studzienką podczas testu.
UWAGA: Konieczne jest pokrycie tylko tylu studzienek, ile zostanie użytych dla wysepek podczas przeprowadzania testu. Jeśli zostanie użytych tylko kilka studzienek, roztwór kleju komórkowego można odpowiednio zmniejszyć. Klej komórkowy stosowany w teście jest sformułowanym roztworem białkowym ekstrahowanym z małży morskich. Alternatywnie, studzienki mikropłytkowe można pokryć 20 μl 100 μg/ml poli-D-lizyny. - Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, bez zawartościCO2 2 przez jedną godzinę.
- W sterylnym środowisku odessać roztwór kleju komórkowego z płytki. Umyć każdą studzienkę dwa razy 400 μl sterylnej wody o temperaturze 37 °C za pomocą pipety wielokanałowej. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
- Po 30-40 minutach przykryj talerz i przechowuj przez noc w temperaturze 4 °C.
- Nawodnienie wkładu czujnika
- W sterylnym środowisku otwórz opakowanie wkładu z czujnikiem (tabela materiałów) i wyjmij jego zawartość. Umieść wkład czujnika do góry nogami obok tabliczki użytkowej.
- Napełnij każdą studzienkę płytki użytkowej sterylną wodą o pojemności 200 μl i opuść wkład czujnika z powrotem do płytki użytkowej. Umieść zmontowany wkład czujnika i płytkę narzędziową w inkubatorze o temperaturze 37 °C bezCO2 2 na noc.
- Przygotowanie Calibrant
- Podamy 25 ml kalibru (tabela materiałów) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Umieścić probówkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C bez zawartościCO2 na noc.
2. Protokół przygotowania podłoża, załadunku wysepek i załadunku wkładu z czujnikiem w dniu próby
- Przygotowanie pożywek
- Do 48,5 ml pożywki bazowej (minimalny DMEM, patrz tabela materiałów) dodać po 500 μl 1 mM pirogronianu sodu i 2 mM glutaminy. Dodatkowo dodać 496 μl 200 mg/ml glukozy (końcowe stężenie glukozy w pożywce wynosi 5,5 mM).
UWAGA: Wyjściowe stężenie glukozy było utrzymywane na stałym poziomie dla tych eksperymentów. Jednak glukoza może być również używana do stymulacji oddychania oprócz opisanych manipulacji farmakologicznych blow10. - Upewnij się, że pH wynosi 7,4 +/- 0,1, dostosowując w razie potrzeby.
- Do 48,5 ml pożywki bazowej (minimalny DMEM, patrz tabela materiałów) dodać po 500 μl 1 mM pirogronianu sodu i 2 mM glutaminy. Dodatkowo dodać 496 μl 200 mg/ml glukozy (końcowe stężenie glukozy w pożywce wynosi 5,5 mM).
- Przygotowanie wkładu czujnika
- Wyjmij wkład czujnika z inkubatora, zdejmij pokrywę wkładu czujnika i wylej wodę ze studzienek. Umieść 200 ml wstępnie podgrzanego kalibru w każdym dołku i załóż pokrywę wkładu czujnika.
- Umieść wkład z czujnikiem z powrotem w inkubatorze na około 1 godzinę (do momentu, gdy będzie potrzebny).
- Przygotowanie leków do oznaczania stresu mitochondrialnego
- Otwórz zestaw do testów warunków skrajnych (tabela materiałów) i wyjmij jego zawartość. Uzupełnić roztwory podstawowe i robocze oligomycyny, cyjanku karbonylu-4-(trifluorometoksy)fenylohydrazonu (FCCP) i rotenonu/antymycyny A (AA) w następujący sposób.
- Oligomycyna: dodać 630 μl zmontowanych pożywek do probówki, aby uzyskać 100 μM bulionu. Następnie rozcieńczyć do 45 μM pożywką w celu uzyskania stężenia portu (końcowe stężenie studzienki po wstrzyknięciu wyniesie 4,5 μM)
- FCCP: dodać 720 μl zmontowanych pożywek do probówki, aby uzyskać 100 μM zapasu. Rozcieńczyć do 10 μM pożywką w celu uzyskania stężenia portu (końcowe stężenie w studzience wyniesie 1 μM)
UWAGA: BSA i/lub FBS nie powinny być dodawane do pożywki, ponieważ może to wpłynąć na działanie rozprzęgaczy mitochondrialnych14. - Rotenon/AA: dodać 540 μl zmontowanych pożywek do probówki, aby uzyskać 50 μM bulionu. Rozcieńczyć do 25 μM pożywką w celu uzyskania stężenia portu (końcowe stężenie w studzience wyniesie 2,5 μM)
UWAGA: Powyższe stężenia przyniosły spójne wyniki w naszych rękach. Dodatkowe FCCP nie prowadziło do dalszego zwiększania oddychania. Jednak stężenie leku może wymagać dostosowania w zależności od wielkości wysepek, a zwłaszcza w przypadku wysepek należących do różnych gatunków lub sferoid niebędących wyspami trzustkowymi. Dla porównania, średnia średnica wysepki naczelnych wynosi około 150 μm15.
- Otwórz zestaw do testów warunków skrajnych (tabela materiałów) i wyjmij jego zawartość. Uzupełnić roztwory podstawowe i robocze oligomycyny, cyjanku karbonylu-4-(trifluorometoksy)fenylohydrazonu (FCCP) i rotenonu/antymycyny A (AA) w następujący sposób.
- Przygotowanie płytki sferoidalnej i przeniesienie wysepek
- Ręcznie pobieraj wyspy trzustkowe do naczynia do hodowli komórkowej o wymiarach 60 mm x 15 mm zawierającego zmontowane podłoża, aby uzyskać czystość bliską 100%.
UWAGA: Wysepki powinny wydawać się zaokrąglone, z wyraźnie zaznaczonym obrzeżem i wydawać się gęstsze niż zewnątrzwydzielnicze zanieczyszczenia tkankowe. Unikaj wysepek, które wyglądają na uszkodzone lub postrzępione. W tym eksperymencie wielkość wysepek nie została bezpośrednio zmierzona, chociaż próbowaliśmy wybrać wysepki o mniej więcej równoważnej wielkości dla każdej studni i próbki. - Załadować każdą studzienkę mikropłytki sferoidalnej 175 μl zmontowanych pożywek za pomocą pipety wielokanałowej.
- Za pomocą pipety P20 ustawionej na 15 μl odessać 15 wysepek z naczynia do hodowli komórkowych. Wysepki powinny być widoczne gołym okiem na końcówce pipety.
- Aby przenieść wysepki na mikropłytkę sferoidalną, opuść końcówkę pipety do dna studzienki, ledwo podnieś i powoli odpipetuj bardzo małą objętość (~5 μL). Upewnij się, że wszystkie wysepki opuściły końcówkę pipety. Każda studnia powinna otrzymać 15 wysepek. Od czasu do czasu sprawdzaj mikropłytkę sferoidalną pod mikroskopem, aby upewnić się, że wysepki znajdują się na dnie każdej studzienki, a nie są przyklejone po bokach.
UWAGA: Unikaj obciążania studni narożnych wysepkami. Podczas testu może wystąpić przepływ tlenu i pH z tworzywa sztucznego, który nasila się w czterech studzienkach narożnych. - Po przeniesieniu wszystkich wysp trzustkowych na mikropłytkę sferoidalną, należy inkubować mikropłytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C bez emisjiCO2, wykonując poniższe czynności.
- Ręcznie pobieraj wyspy trzustkowe do naczynia do hodowli komórkowej o wymiarach 60 mm x 15 mm zawierającego zmontowane podłoża, aby uzyskać czystość bliską 100%.
- Ładowanie wkładu czujnika i uruchamianie testu
- Wyjmij wkład z czujnikiem z inkubatora. Porty A-C dla każdej studzienki muszą być załadowane lekiem lub pożywką. Studnie zawierające wysepki i cztery studnie narożne powinny być załadowane narkotykiem. Studnie inne niż narożne bez wysepek powinny być załadowane mediami. Port D można pozostawić pusty. Załaduj port A (w lewym górnym rogu każdego czujnika) 20 μl oligomycyny lub pożywki. Załaduj port B (u góry po prawej) 22 μl FCCP lub nośnika. Załaduj port C (na dole po lewej) 25 μl rotenonu/AA lub nośnika.
- Zaprogramować test analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego na 30-minutowy podstawowy okres oddychania (5 cykli 3-minutowego mieszania, 3-minutowy pomiar), 42-minutowy okres pomiaru oligomycyny (7 cykli 3-minutowego mieszania, 3-minutowy pomiar), 30-minutowy FCCP (5 cykli 3-minutowego mieszania, 3-minutowy pomiar) i 30-minutowy rotenon/AA (5 cykli 3-minutowego mieszania, Środek 3-minutowy).
- Uruchom test i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby skalibrować czujnik i włożyć mikropłytkę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby przenieść wyspki do mikropłytki, należy pobrać 15 wyspek w 15 µL medium, jak pokazano na Rysunku 1A. Wyspki naturalnie osiądą na dnie końcówki pipety w ciągu kilku sekund. Następnie końcówkę pipety opuszcza się do dna dołka. Końcówkę należy bardzo delikatnie unieść i wypipecieć niewielką objętość (około 5 µL) wraz z wyspkami. Technika ta pozwala na spójne rozmieszczenie wyspki na dnie dołka mikropłytki (Rysunek 1
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Badania nad zużyciem tlenu przez wysepki były wcześniej utrudnione ze względu na kulisty kształt wysepek, ich brak przylegania do powierzchni hodowlanych oraz liczbę wysepek wymaganych na studzienkę. W tym protokole podkreślamy skuteczność 96-dołkowej mikropłytki sferoidalnej do pomiaru zużycia tlenu przez wysepki na niewielkiej liczbie wysepek i demonstrujemy technikę obsługi i załadunku wysepek, która jest technicznie wykonalna i daje spójne wyniki.
Aby wysepki przylegały do dna mikropłytki ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Vanderbilt High Throughput Screening Core za korzystanie z ich obiektów, Agilent Biotechnologies, Dr. Paulowi Kievitowi (Oregon Health and Science University) za izolację wysepek naczelnych innym niż człowiek, oraz Ericowi Donahue (Vanderbilt University) za pomoc przy Rysunku 1. J.M.E. był wspierany przez NIGMS z National Institutes of Health pod numerem nagrody T32GM007347. M.G. był wspierany przez NIH/NIDDK (R24DK090964-06) i Departament ds. Weteranów (BX003744).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Naczynie do hodowli komórkowych, 60 mm X 15 mm | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Klej do komórek i tkanek | Corning | 354240 | |
| Probówka stożkowa, 50 ml | Falcon | 352070 | |
| Dekstroza bezwodna | Fisher Scientific | BP350-1 | Do roztworu glukozy, 200 mg/ml, sterylne filtrowane |
| Jednorazowe zbiorniki (sterylne), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | do ładowania pipety wielokanałowej |
| EZFlow Sterylne 0,45 μ m Filtr strzykawkowy PES, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamina | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Wielokanałowe końcówki do pipet | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| 15-1250 μ L | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Zalecane |
| pipety P20, P200 i P1000 | Eppendorf | 2231000602 | |
| Sonda pH | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Końcówki do pipet, 20 μ L, 200 μ L, 1000 μ L | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Zawiera oligomycynę, FCCP i rotenon/antymycynę Analizator |
| Seahorse XFe96 | Agilent | S7800B | W tym stacja przygotowawcza z 37 stopniami; Inkubator C bez CO2 |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Zawiera wkład czujnika, mikropłytkę sferoidalną i kaliber |
| Wodorowęglan sodu | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pirogronian sodu | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Mikroskop stereoskopowy | Olympus | SZX9 | |
| Strzykawka (sterylna), 5 ml | BD | 309603 | Do sterylnej filtracji |
| Woda (sterylna) | Sigma | W3500-500mL |
Bibliografia
- Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
- Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).
- Curry, D. L. Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas. Diabetes. 19 (6), 420(1970).
- Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D'Argenio, D. Z. Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice. Peptides. 88, 74-79 (2017).
- Vergari, E., et al. Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion. Nature Communications. 10 (1), 139(2019).
- Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).
- Sweet, I. R., et al. Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets. Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).
- Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide. , Agilent Technologies. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019).
- Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PLoS One. 7 (5), e33023(2012).
- Taddeo, E. P., et al. Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors. Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).
- Conrad, E., et al. The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells. American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Elsakr, J. M., et al. Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition. Molecular Metabolism. , (2019).
- Soutar, M. P. M., et al. FBS/BSA media concentration determines CCCP's ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy. Autophagy. , 1-10 (2019).
- Hirshberg, B., et al. Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site. Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Papas, K. K., et al. Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation. PLoS One. 10 (8), e0134428(2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
