Method Article

Humanizowane myszy NOG do dopochwowej ekspozycji na HIV i leczenia zakażenia HIV

DOI:

10.3791/60723

⸱

January 31st, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 2Department of Infectious Diseases, Aarhus University Hospital, 3Department of Biomedicine, Aarhus University, 4Department of Gynecology and Obstetrics, Aarhus University Hospital, 5Department of Biology, University of Nebraska at Omaha

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy protokół do generowania i oceny humanizowanego i ludzkiego modelu myszy NOG zakażonego wirusem niedoboru odporności na podstawie przeszczepu komórek macierzystych, dopochwowej ekspozycji na ludzkiego wirusa niedoboru odporności i kropelkowej cyfrowej kwantyfikacji RNA PCR.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Humanizowane myszy stanowią zaawansowaną platformę do badania wirusologii ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) i testowania leków przeciwwirusowych. Protokół ten opisuje ustanowienie ludzkiego układu odpornościowego u dorosłych myszy NOG. W tym miejscu wyjaśniamy wszystkie praktyczne kroki, od izolacji ludzkich komórek CD34 + pochodzących z krwi pępowinowej i ich późniejszego dożylnego przeszczepu myszom, po manipulację modelem poprzez zakażenie wirusem HIV, skojarzoną terapię antyretrowirusową (cART) i pobieranie próbek krwi. Około 75 000 komórek hCD34 + jest wstrzykiwanych dożylnie myszom, a poziom ludzkiego chimeryzmu, znanego również jako humanizacja, we krwi obwodowej jest szacowany podłużnie przez miesiące za pomocą cytometrii przepływowej. W sumie 75 000 komórek hCD34+ daje 20%-50% ludzkich komórek CD45+ we krwi obwodowej. Myszy są podatne na wewnątrzpochwowe zakażenie wirusem HIV, a krew może być pobierana raz w tygodniu do analizy i dwa razy w miesiącu przez dłuższy czas. Protokół ten opisuje test do ilościowego oznaczania miana wirusa w osoczu za pomocą kropelkowego cyfrowego PCR (ddPCR). Pokazujemy, w jaki sposób myszy mogą być skutecznie leczone za pomocą standardowego schematu opieki cART w diecie. Dostarczenie cART w postaci zwykłej karmy dla myszy jest znaczącym udoskonaleniem modelu eksperymentalnego. Model ten może być wykorzystywany do analizy przedklinicznej zarówno ogólnoustrojowych, jak i miejscowych związków profilaktyki przedekspozycyjnej, a także do testowania nowych metod leczenia i strategii leczenia HIV.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) jest przewlekłą infekcją, która dotyka ponad 37 milionów zakażonych osób na całym świecie1. Skojarzona terapia przeciwwirusowa (cART) jest terapią ratującą życie, ale wyleczenie jest nadal uzasadnione. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na modele zwierzęce, które odzwierciedlają ludzki układ odpornościowy i jego reakcje, aby ułatwić kontynuowanie badań nad wirusem HIV. Wiele typów humanizowanych myszy, które są zdolne do podtrzymywania wszczepienia komórek i tkanek, zostało opracowanych poprzez przeszczepienie ludzkich komórek myszom z poważnym niedoborem odporności2. Takie h....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie próbki krwi pępowinowej zostały pobrane w ścisłej zgodności z lokalnie zatwierdzonymi protokołami, w tym świadomą zgodą anonimowego oddawania krwi przez rodziców. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone w ścisłej zgodności z duńskimi przepisami krajowymi na podstawie licencji 2017-15-0201-01312.

UWAGA: Z myszami i krwią narażoną na HIV należy obchodzić się z najwyższą ostrożnością. Wszystkie powierzchnie i płyny, które miały kontakt z wirusem HIV, należy odkazić środkiem dezynfekującym o potwierdzonym zakażeniu wirusem HIV (tabela materiałów).

1. Izolac....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strategia bramkowania do analizy czystości komórek macierzystych jest przedstawiona w Rysunek 1. Rysunek 1A–C pokazuje oczyszczoną populację CD34+, a Rysunek 1D–F przepływ CD34- używany do zilustrowania, że minimalna ilość populacji CD34+ jest tracona w procesie izolacji. Czystość wyizolowanych komórek macierzystych CD34+ wynosiła od 85% do 95% przy mniej niż 1% zanieczyszczeniu limfocytami T. Rysun.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczep myszy z poważnie obniżoną odpornością NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac (NOG) doskonale nadaje się do przeszczepiania ludzkich komórek i tkanek. Zarówno wrodzone, jak i adaptacyjne szlaki odpornościowe u tych myszy są naruszone. Myszy NOG i NSG są nosicielami mutacjiPrkdc scid, która powoduje wadliwą funkcję komórek T i B. Ponadto myszy te nie mają funkcjonalnego γ łańcucha receptora interleukiny-2 (wspólny łańcuch gamma, IL2rg), który jest nie.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować pracownikom Biomedicine Animal Facility na Uniwersytecie w Aarhus, szczególnie Pani Jani Kær za utrzymanie kolonii i śledzenie wagi myszy. Autorzy pragną podziękować profesorowi Florianowi Kleinowi za opracowanie standardu opieki nad pacjentem cART oraz za wskazówki. Następujący odczynnik został uzyskany za pośrednictwem NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (cat# 11744) od dr Johna Kappesa i dr Christiny Ochsenbauer.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Niebieska podkładkaVWR56616-031Należy wysterylizować przed użyciem
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA8022
CD19 (klon sj25c1) PE-Cy7BD Bioscience557835
CD3 (klon OKT3) FITCBiolegend317306
CD3 (klon SK7) BUV395BD Bioscience564001
CD34 (klon AC136) FITCMiltenyi130-113-740
CD4 (klon SK3) BUV 496BD Bioscience564652/51
CD45 (klon 2D1) APCBiolegend368511/12
CD8 (klon RPA-T8) BV421BD Bioscience562428
ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)Bio-Rad1863025
DMSOMerck10,02,95,21,000
DNAseSigmaD4263Do buforu zawiesinowego
dNTP mixLife TechnologiesR0192
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbeccos (PBS)BiowestL0615-500
EasySep Ludzka krew pępowinowa CD34 Zestaw do pozytywnej selekcji IIStemcell17896
EDTAInvitrogen15575-038
FACS Roztwór lizujący 10XBD349202Rozcieńczyć w stosunku 1:10 w dH20 bezpośrednio przed użyciem
Probówki FACS (Falcon 5 ml round-botton)Falcon352052
Roztwór blokujący receptor Fc (Human Trustain FcX)Biolegend422302
Płodowa surowica bydlęcaSigmaF8192-500
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17144002
Flowjo v.10
Gauze Mesoft157300Należy wysterylizować przed użyciem
Lampa grzewczaWykonany na zamówienie
hemacytometr (Bü rker-Tü rk)VWRDOWC1597418
Izofluran gazowyOrion Pharma9658
LSR Fortessa X20 cytometr przepływowyBD
Probówki do mikrowirówek, zatwierdzone przez PCR-PTSarstedt72692405
Mouse cARTfood sniff Spezialdiä ten GmbHProdukt
OgranicznikProdukt
Igła, Microlance 3, 30G i frac12; "Myszy BD304000
NOG NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTacTaconicNOG-F
Woda wolna od nukleazChemikalia VWR436912C
Nucleospin 96 Zestaw do izolacji DNA i RNA wirusaMacherey-Nagel740691
zatwierdzone przez PCR probówki wirówkoweSarstedt72.692.405
Roztwór penicyliny-streptomycyny 100XBiowestL0022-100
Phusion Hot Start II Polimeraza DNALife TechnologiesF549S Końcówki
do pipet, sterylne, ART 20P BarrierThermoScientific2149P
Proteinaza KNEB100005398
Oprogramowanie QuantaSoftBio-Rad
QX100 Generator kropelBio-Rad1886-3008
QX100 Czytnik kropelBio-Rad186-3003
Roztwór do lizy RBCBiolegend420301
DNAzy, wolne od RNaz wielkości F + bufor reakcyjnyMacherey-Nagel740963
RNAseOUT Rekombinowany inhibitor rybonukleazyThermoScientific10777-019
RPMIBiowestL0501-500Rozpuścić w
strzykawce H20 Softject 1 mlHenke Sass Wolf5010-200V0
Indeks górny III Odwrotna transkryptazaThermoFisher Scientific18080044
WytrząsarkaVWR89370-910
Trypane niebieskieSigmaT8154
Ultrapure 0,5 EDTA, pH 8,0ThermoFisher Scientific15575-020
Virkon S (środek do dezynfekcji wirusów)DupontNumer telefonu 7511
na zamówienie myszy na zamówienie

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. WHO. GHO | By category | Antiretroviral therapy coverage - Data and estimates by WHO region (2018). World Health Organization. , Available from: http://apps.who.int/gho/data/node.main.626 (2018).
  2. Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154 (1), 50-61 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Humanized NOG MiceHIV Infection ModelIntravaginal HIV ExposureCord Blood CD34 CellsFlow Cytometry AnalysisDroplet Digital PCRCombination Antiretroviral TherapyCCR5 Delta 32 ScreeningViral Load QuantificationHuman Chimerism Assessment

Related Articles