Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Humanizowane myszy NOG do dopochwowej ekspozycji na HIV i leczenia zakażenia HIV

7.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60723

⸱

31 stycznia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 2Department of Infectious Diseases, Aarhus University Hospital, 3Department of Biomedicine, Aarhus University, 4Department of Gynecology and Obstetrics, Aarhus University Hospital, 5Department of Biology, University of Nebraska at Omaha

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy protokół do generowania i oceny humanizowanego i ludzkiego modelu myszy NOG zakażonego wirusem niedoboru odporności na podstawie przeszczepu komórek macierzystych, dopochwowej ekspozycji na ludzkiego wirusa niedoboru odporności i kropelkowej cyfrowej kwantyfikacji RNA PCR.

Streszczenie

Humanizowane myszy stanowią zaawansowaną platformę do badania wirusologii ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) i testowania leków przeciwwirusowych. Protokół ten opisuje ustanowienie ludzkiego układu odpornościowego u dorosłych myszy NOG. W tym miejscu wyjaśniamy wszystkie praktyczne kroki, od izolacji ludzkich komórek CD34 + pochodzących z krwi pępowinowej i ich późniejszego dożylnego przeszczepu myszom, po manipulację modelem poprzez zakażenie wirusem HIV, skojarzoną terapię antyretrowirusową (cART) i pobieranie próbek krwi. Około 75 000 komórek hCD34 + jest wstrzykiwanych dożylnie myszom, a poziom ludzkiego chimeryzmu, znanego również jako humanizacja, we krwi obwodowej jest szacowany podłużnie przez miesiące za pomocą cytometrii przepływowej. W sumie 75 000 komórek hCD34+ daje 20%-50% ludzkich komórek CD45+ we krwi obwodowej. Myszy są podatne na wewnątrzpochwowe zakażenie wirusem HIV, a krew może być pobierana raz w tygodniu do analizy i dwa razy w miesiącu przez dłuższy czas. Protokół ten opisuje test do ilościowego oznaczania miana wirusa w osoczu za pomocą kropelkowego cyfrowego PCR (ddPCR). Pokazujemy, w jaki sposób myszy mogą być skutecznie leczone za pomocą standardowego schematu opieki cART w diecie. Dostarczenie cART w postaci zwykłej karmy dla myszy jest znaczącym udoskonaleniem modelu eksperymentalnego. Model ten może być wykorzystywany do analizy przedklinicznej zarówno ogólnoustrojowych, jak i miejscowych związków profilaktyki przedekspozycyjnej, a także do testowania nowych metod leczenia i strategii leczenia HIV.

Wprowadzenie

Ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) jest przewlekłą infekcją, która dotyka ponad 37 milionów zakażonych osób na całym świecie1. Skojarzona terapia przeciwwirusowa (cART) jest terapią ratującą życie, ale wyleczenie jest nadal uzasadnione. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na modele zwierzęce, które odzwierciedlają ludzki układ odpornościowy i jego reakcje, aby ułatwić kontynuowanie badań nad wirusem HIV. Wiele typów humanizowanych myszy, które są zdolne do podtrzymywania wszczepienia komórek i tkanek, zostało opracowanych poprzez przeszczepienie ludzkich komórek myszom z poważnym niedoborem odporności2. Takie humanizowane myszy są podatne na zakażenie wirusem HIV i stanowią ważną alternatywę dla modeli małpiego wirusa niedoboru odporności u naczelnych, ponieważ są tańsze i prostsze w użyciu niż naczelne. Humanizowane myszy ułatwiły badania nad przenoszeniem, patogenezą, profilaktyką i leczeniem wirusa HIV3,4,5,6,7,8,9,10,11.

Prezentujemy elastyczny, humanizowany system modelowy do badań nad HIV, opracowany przez przeszczepianie ludzkich komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej myszom o pochodzeniu NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac (NOG). Oprócz tego, że są pochodzenia niepłodowego, praktyczna bioinżynieria tych myszy jest mniej wymagająca technicznie w porównaniu z procedurami mikrochirurgicznymi związanymi z przeszczepem konstruktu krew-wątroba-grasica (BLT).

Pokazujemy, jak wykryć zakażenie wirusem HIV poprzez transmisję dopochwową i jak monitorować wiremię w osoczu za pomocą czułego systemu kropelkowego opartego na cyfrowym PCR (ddPCR). Następnie opisujemy ustalanie standardowego cART podawanego w ramach codziennej diety myszy. Celem tych połączonych metod jest zmniejszenie stresu u zwierząt i ułatwienie eksperymentów na dużą skalę, w których czas spędzony na obchodzeniu się z każdym zwierzęciem jest ograniczony12.

U ludzi genotyp CCR5Δ32/wt lub CCR5Δ32/ Δ32 powoduje zmniejszoną podatność na zakażenie wirusem HIV wirusami przekaźnika/założyciela13, a pewne środki ostrożności muszą być podjęte podczas bioinżynierii humanizowanych myszy za pomocą komórek macierzystych na potrzeby badań nad HIV. Jest to szczególnie prawdziwe w naszym regionie, ponieważ naturalnie występujące warianty genu CCR5, zwłaszcza delecje Δ32, są bardziej rozpowszechnione w rodzimych populacjach skandynawskich i bałtyckich w porównaniu z resztą świata14,15. W związku z tym nasz protokół obejmuje łatwy, wysokoprzepustowy test do badań przesiewowych krwiotwórczych komórek macierzystych dawcy pod kątem wariantów CCR5 przed przeszczepem.

Do ekspozycji dopochwowej wybraliśmy przekaźnik/założyciela wirusa R5 RHPA4259, wyizolowanego od kobiety we wczesnym stadium infekcji, która została zakażona dopochwowo16. Wystawiliśmy myszy na działanie dawki wirusa, która była wystarczająca do pomyślnej transmisji u większości myszy, ale poniżej 100% szybkości transmisji. Wybór takiej dawki umożliwia uzyskanie wystarczającego zakresu dynamicznego szybkości transmisji, tak aby działanie przeciwwirusowe kandydata na lek mogło skutkować ochroną zwierząt w eksperymentach dotyczących zapobiegania HIV i zmniejszeniem wiremii w badaniach nad leczeniem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie próbki krwi pępowinowej zostały pobrane w ścisłej zgodności z lokalnie zatwierdzonymi protokołami, w tym świadomą zgodą anonimowego oddawania krwi przez rodziców. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone w ścisłej zgodności z duńskimi przepisami krajowymi na podstawie licencji 2017-15-0201-01312.

UWAGA: Z myszami i krwią narażoną na HIV należy obchodzić się z najwyższą ostrożnością. Wszystkie powierzchnie i płyny, które miały kontakt z wirusem HIV, należy odkazić środkiem dezynfekującym o potwierdzonym zakażeniu wirusem HIV (tabela materiałów).

1. Izolacja ludzkich komórek macierzystych CD34+

  1. Próbki krwi pępowinowej należy pobrać w probówkach do pobierania krwi pokrytych EDTA po planowanym cesarskim cięciu lub porodzie naturalnym i zgodnie z lokalnymi zezwoleniami etycznymi.
  2. Wyizolować PMBC od krwi pępowinowej poprzez separację gradientu gęstości zgodnie z protokołem producenta.
  3. Wyizoluj komórki CD34 + z populacji PBMC, najpierw wstępnie wzbogacając je w przeciwciała przeciwko powszechnym markerom dla dojrzałych komórek, co indukuje sieciowanie komórek niepożądanych linii z czerwonymi krwinkami. Następnie następuje wzbogacanie komórek CD34+ za pomocą kulek magnetycznych, zgodnie z protokołem producenta.
    1. Oznaczyć liczbę żywych komórek przez standardowe wykluczenie błękitu trypanowego poprzez ponowne zawieszenie 10 μl zawiesiny komórek w 90 μl błękitu trypanowego. Dodaj 10 μl tego roztworu do hemacytometru i policz inne niż niebieskie krwinki, zgodnie z protokołem producenta.
    2. Żywotna kriokonserwacja komórek CD34 + w 1 ml 10% DMSO w płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do dnia przeszczepu myszy.
    3. Wykonalna kriokonserwacja niewielkiej frakcji zarówno izolowanych (CD34+), jak i komórek przepływowych (CD34-) oddzielnie w celu oceny czystości komórek macierzystych CD34+ (~ 30 000 komórek z każdej próbki). Alternatywnie, przetestuj czystość na świeżo wzbogaconych komórkach (patrz krok 2 poniżej).
    4. Zamrozić frakcję niegranulowanego produktu przepływowego (CD34-) w celu określenia statusu CCR5Δ32. Komórki można zamrażać bezpośrednio bez kondycjonowanego roztworu do zamrażania, ale obecność czerwonych krwinek w granulce może hamować późniejszy PCR, jeśli przepływ jest granulowany.

2. Ocena czystości komórek macierzystych CD34+ za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Rozmrozić izolowane komórki (CD34+) i komórki przepływowe (CD34-). Umyć komórki, ponownie zawieszając komórki z każdej fiolki w 9 ml buforu FACS o temperaturze pokojowej (RT), składającego się z 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS).
  2. Wirować przez 5 minut przy 300 x g przy temperaturze pokojowej do osadzania komórek.
  3. Odlewać supernatant, ponownie zawiesić komórki w pozostałym płynie i przenieść do probówek FACS. Powtórz etap płukania z 3 ml buforu FACS. Po drugim odwirowaniu odlej supernatant i ponownie zawieś komórki w pozostałej cieczy.
  4. Dodać 5 μl roztworu blokującego receptor Fc (tabela materiałów) i pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej Nie zmywać roztworu blokującego receptor Fc.
  5. Dodać mieszaninę zawierającą z góry określone objętości przeciwciał przeciwko ludzkiemu CD3 (klon SK7) BUV395, CD34 (klon AC136), FITC i CD45 (klon 2D1) APC (Tabela 1). Pozostaw ogniwa na 30 minut w RT w ciemności. Fluorofory muszą być wybrane na podstawie parametrów, które można ocenić za pomocą dostępnych cytometrów przepływowych bez konieczności stosowania matrycy kompensacyjnej.
  6. Umyj komórki 3 ml buforu FACS.
  7. Wirować przez 5 minut przy 300 x g w suchej temperaturze w celu osadzenia komórek.
  8. Odlewać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pozostałym płynie.
    1. Powtórz ten krok mycia 2 razy, aby upewnić się, że wszystkie niezwiązane przeciwciała zostały usunięte.
  9. Zapisać próbki na cytometrze przepływowym (tabela materiałów) i przeprowadzić analizę danych za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Strategia bramkowania jest przedstawiona w Rysunek 1A–F.

3. Genetyczne badania przesiewowe w kierunku wariantów CCR5Δ32 we krwi pępowinowej

  1. Inkubować 1,25 μl niegranulowanego płynu z 11,25 μl mieszanki PCR zawierającej 200 μM mieszaniny dNTP, 0,01 U/μL polimerazy DNA o wysokiej wierności oraz starterami do przodu i do tyłu wyszczególnionymi w tabeli 2.
    1. Dostosuj objętość wodą wolną od nukleaz do około 12,5 μl dla każdej reakcji PCR.
  2. Amplifikować fragmenty genomu za pomocą programu cyklicznego PCR wyszczególnionego w Tabeli 3.
  3. Oddziel produkty PCR na 2% żelu agarozowym13.
    1. Produkty PCR z alleli typu dzikiego i alleli Δ32 dają fragmenty PCR składające się odpowiednio ze 196 par zasad i 164 par par zasad, dzięki czemu można je łatwo odróżnić za pomocą elektroforezy żelowej13 (Rysunek 1G).

4. Dożylny przeszczep komórek macierzystych

UWAGA: Posiadanie jednej osoby przygotowującej komórki w laboratorium, a drugiej osoby przygotowującej myszy i przestrzeń roboczą do przeszczepów, jest skutecznym podejściem.

  1. W zwierzęclni, na 4–6 godzin przed planowanym przeszczepieniem komórek macierzystych, należy napromienić 6–7 tygodniową samicę NOD. Myszy Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac (NOG) (Tabela materiałów) z 0,75 Gy ze źródłem Cs137. Najlepsza dawka kondycjonująca może się różnić w zależności od wieku myszy, źródła promieniowania i innych czynników. Proces ten warunkuje zwierzęta do udanego wszczepienia ludzkich komórek macierzystych.
  2. W pomieszczeniu dla zwierząt należy przygotować przestrzeń roboczą stołu przepływowego i wszystkie odczynniki przed wprowadzeniem myszy lub komórek do miejsca pracy.
    1. Umieść sterylną niebieską podkładkę, aby przykryć powierzchnię roboczą stołu przepływowego. Przygotuj sterylną gazę i pojemnik na ostre przedmioty.
    2. Umieść lampę grzewczą zdezynfekowaną 70% etanolem w ławce przepływowej z pustą sterylną klatką dla myszy pod ogniem.
  3. W laboratorium rozmrozić wyizolowane komórki CD34+ i rozcieńczyć je w 9 ml zwykłego RPMI o temperaturze 37 °C.
  4. Odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatant przez aspirację i ponownie zawiesić osad w 1 ml zwykłego RPMI w temperaturze 37 °C.
  5. Określ liczbę komórek przez wykluczenie trypana niebieskiego i dostosuj głośność do 200 μl na mysz. Zrób dodatkowe, aby wziąć pod uwagę możliwe straty spowodowane kolejnymi krokami obsługi.
    1. Przygotuj się do przeszczepienia 75 000 komórek CD34+ na 200 μl każdej myszy.
    2. Komórki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C podczas transportu do zakładu dla zwierząt przed przeszczepem. Unikaj trzymania komórek na lodzie, aby zmniejszyć agregację lub zbrylanie.
  6. W obiekcie dla zwierząt przenieś klatkę z myszami do ławki przepływowej i przenieś myszy do klatki pod lampą grzewczą, aby rozszerzyć naczynia krwionośne. Pozostaw jeden koniec klatki z dala od źródła ciepła, aby myszy mogły odsunąć się od ciepła po rozgrzaniu. Myszy, które przeniosły się na koniec klatki, z dala od źródła ciepła, są wystarczająco ciepłe, aby pomyślnie wstrzyknąć żyłę ogonową.
  7. Załaduj nasmarowaną strzykawkę o pojemności 1 ml powyżej oznaczenia 800 μl z zawieszonymi komórkami CD34+. Użycie nasmarowanej strzykawki o pojemności 1 ml znacznie ułatwi wstrzyknięcie dożylne i zwiększy precyzję tej techniki.
  8. Założyć igłę 30 G 13 mm i przygotować igłę i strzykawkę do wstrzyknięcia. Taka kolejność operacji pozwala na szybsze ładowanie strzykawki przy jednoczesnej ochronie integralności komórek, które mają być przeszczepione, biorąc pod uwagę możliwe uszkodzenia, które mogą wystąpić podczas szybkiego aspiracji komórek za pomocą igły o tak małej średnicy. Napełnić piastę igły płynem, naciskając tłok i usunąć płyn do oznaczenia 200 μl na igle.
  9. Umieść podgrzaną mysz (krok 4.6) w ograniczniku używanym do podawania zastrzyków dożylnych. Ostrożnie wstrzyknąć 200 μl zawiesiny komórkowej do żyły ogonowej myszy. Poświęć 2 s na wykonanie zanurzenia i przytrzymaj igłę włożoną przez około 2 sekundy po zakończeniu wstrzyknięcia. Gwarantuje to, że komórki przeniosły się odpowiednio daleko od miejsca wstrzyknięcia przed usunięciem igły.
  10. W razie potrzeby przetrzyj ogon myszy sterylną gazą, aby usunąć widoczną krew. Umieść mysz z powrotem w nieogrzewanej klatce domowej. Powtórzyć procedurę wstrzykiwania z pozostałymi myszami.

5. Pobieranie i przetwarzanie krwi do analizy

UWAGA: Przeszczepienie komórek ludzkich do krwi obwodowej można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej 3-5 miesięcy po przeszczepie ludzkich komórek macierzystych.

  1. Pobrać próbki krwi od myszy przy użyciu lokalnych technik zatwierdzonych przez IACUC.
  2. Zebrać maksymalnie 70–100 μl całkowitej krwi do sterylnych probówek mikrowirówkowych PCR zawierających 10 μl 0,5 M EDTA (pH = 8,0), aby uniknąć krzepnięcia krwi.

6. Ocena ludzkiego wszczepienia za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Przenieś 40–50 μl krwi do probówek FACS.
  2. Dodać 5 μl roztworu blokującego receptor Fc, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał i pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Dodać mysią mieszaninę przeciwciał anty-ludzkich zawierającą CD4 (klon SK3) BUV 496, CD8 (klon RPA-T8) BV421, CD3 (klon OKT3) FITC, CD19 (klon sj25c1) PE-Cy7, CD45 (klon 2D1) APC (Tabela 4) i pozostawić do barwienia w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Fluorofory należy wybrać na podstawie parametrów, które można ocenić za pomocą dostępnych cytometrów przepływowych bez konieczności stosowania matrycy kompensacyjnej.
  4. Dodać 2 ml odpowiedniego buforu do lizy czerwonych krwinek do każdej probówki w celu lizy czerwonych krwinek. Należy użyć buforu do lizy specjalnie opracowanego do barwienia przeciwciał przed lizą krwinek czerwonych (odpowiedni przykład znajduje się w Tabeli Materiałów). Krótko przemieszać, aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek w roztworze lizującym i pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej. Ważne jest równomierne rozłożenie komórek.
  5. Dodać 2 ml buforu FACS, aby zatrzymać reakcję lizy.
  6. Wirować przez 5 minut przy 300 x g w suchej temperaturze w celu osadzenia komórek.
  7. Odlej supernatant i delikatnie wiruj, aż komórki zostaną ponownie zawieszone.
  8. Dodać 3 ml buforu FACS i wirować przez 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej.
  9. Odlewać supernatant i ponownie zawiesić komórki.
  10. Zapisać próbki na odpowiednim cytometrze przepływowym i przeanalizować je za pomocą odpowiedniego oprogramowania (Tabela materiałów). Reprezentatywna analiza i wyniki są przedstawione na Rysunek 2 i Rysunek 3.

7. Dopochwowe narażenie na HIV

UWAGA: Wirus używany do dopochwowego naświetlania myszy może być wytwarzany przy użyciu wcześniej opublikowanych protokołów17. Wirus jest przechowywany w temperaturze -80 °C i transportowany między lokalizacjami podczas przechowywania na suchym lodzie zgodnie z lokalnie zatwierdzonymi protokołami. Wirus jest przechowywany na suchym lodzie do momentu bezpośrednio przed ekspozycją myszy. Wirus może być rozcieńczony do zwykłego RPMI (unikaj RPMI, który zawiera antybiotyki lub dodatki do surowicy) w celu osiągnięcia odpowiedniego stężenia bezpośrednio przed ekspozycją (do tej ekspozycji na IVAG użyto 21 400 IU). Po wytworzeniu rozcieńczony wywar należy przechowywać na mokrym lodzie przez cały czas trwania procedury, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania, które miałyby miejsce, gdyby rozcieńczony wirus został ponownie umieszczony na suchym lodzie po rozmrożeniu.

  1. Przygotuj cały sprzęt i przestrzeń roboczą stanowiska przepływowego, jak pokazano w Rysunek 4 przed wprowadzeniem myszy lub wirusa do stołu przepływowego (podobnie jak w kroku 4.2).
    1. Umieść lampę grzewczą na środku przestrzeni roboczej, w której będzie znajdować się mysz podczas procedury ekspozycji na HIV. Lampa grzewcza zadba o to, aby nie spadła temperatura ciała myszy. Można również użyć innego sprzętu kontrolującego temperaturę (np. podgrzewanej podkładki żelowej lub koca z ciepłą wodą, zgodnie z lokalnymi przepisami IACUC18).
    2. Przynieść na stół sterylne końcówki do pipet o pojemności 20 μl i odpowiednią pipetę. Umieść pojemnik z płynnym środkiem dezynfekującym (Tabela materiałów) na stole w celu natychmiastowej dezaktywacji materiałów i płynów, które miały kontakt z wirusem.
  2. Umieść mysz w komorze z 3% gazem izofluranowym i ręcznikami papierowymi. Ten procent gazu znieczuli zwierzęta w ciągu 2-4 minut. Podobnie jak w przypadku wszystkich innych materiałów stosowanych u myszy z niedoborem odporności, aparat anestezjologiczny musi być odpowiednio zdezynfekowany przed użyciem.
  3. Po znieczuleniu przenieś mysz na sterylną niebieską podkładkę pod lampą grzewczą. Włóż pysk myszy do maski dostarczającej ciągły 3% gaz izofluranowy w celu utrzymania znieczulenia. Trzymaj mysz u nasady ogona, brzuchem skierowanym do góry, ręką podtrzymując mysz do tyłu, jak pokazano na Rysunek 4.
  4. Za pomocą sterylnej końcówki pipety stymuluj okolice narządów płciowych, delikatnie głaszcząc w górę w kierunku odbytu, aby wywołać opróżnienie odbytnicy, zmniejszając nacisk na pochwę.
  5. Ostrożnie odsłoń otwór pochwy, owijając ogon myszy na palcach tak, aby srom naturalnie się otworzył, być może z lekkim szturchnięciem za pomocą sterylnej końcówki pipety.
  6. Zmień końcówkę pipety i atraumatycznie odpipetuj 20 μl wirusa do pochwy myszy, nie tworząc pęcherzyków. Nie wkładaj końcówki głęboko do pochwy. Zamiast tego, przy otwartym sromie, umieść końcówkę pipety na poziomie otworu pochwy, unikaj wchodzenia głębiej, aby wyeliminować potencjalne otarcia podczas procesu zaszczepiania, uwolnić wirusa i pozwolić, aby grawitacja wciągnęła wirusa do pochwy. Alternatywnie, użyj prostej igły 22 G 1,25 mm z końcem, zgodnie z opisem w Veselinovic et al.6.
  7. Trzymaj mysz w tej pozycji z pochwą skierowaną do góry przez 5 minut po ekspozycji, aby uniknąć grawitacyjnego wycieku zawiesiny wirusa.
    1. Ostrożnie umieść mysz w klatce domowej, uważając, aby położyć ją na plecach.

8. Przetwarzanie próbek krwi przed analizą wiremii

  1. Pobrać krew w sposób opisany w punkcie 5 powyżej.
  2. Odwirować próbki krwi przez 5 minut przy 500 x g w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia osocza i komórek.
  3. Zebrać 40 μl osocza do pomiaru wiremii do nowej sterylnej probówki mikrowirówkowej zatwierdzonej przez PCR i przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 godzinę do czasu dalszego przetwarzania. Ważne jest, aby zamrozić wszystkie próbki przed ekstrakcją RNA, aby uniknąć ryzyka błędu systematycznego wynikającego z porównywania poziomów RNA w próbkach, które nie zostały zamrożone przed izolacją RNA, z próbkami zamrożonymi przed izolacją RNA.
  4. Dostosuj objętość krwi z powrotem do pierwotnej objętości, dodając 40 μl pożywki zawiesinowej (PBS z 2,5% albuminą surowicy bydlęcej, 50 U/ml penicyliny G i streptomycyny oraz 10 U/ml DNazy, sterylnie przefiltrowanej przy 0,22 μm).
  5. Przenieść 15 μl skorygowanej objętości krwi do nowej probówki mikrowirówkowej zatwierdzonej przez PCR.
  6. Dodać 1 ml 1x roztwór do lizy RBC (tabela materiałów), wirować i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Wirować przez 1 minutę przy 9 600 x g przy RT do granulowania komórek.
  8. Odessać supernatant i pozostawić tylko maleńki osad białych krwinek, ponieważ zanieczyszczenie czerwonymi krwinkami może hamować PCR.
  9. Przechowywać granulat w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 godzinę do czasu dalszej obróbki.
    UWAGA: Opcjonalnie pozostałą krew z kroku 8.4 można wykorzystać do analizy cytometrii przepływowej, jak opisano powyżej w kroku 6.

9. Ekstrakcja DNA metodą ekstrakcji proteinazy K

  1. Ekstrahować DNA z osadów komórek obwodowych (wygenerowanych w kroku 8.8) przy użyciu metody ekstrakcji proteinazy K, jak opisano poniżej. Wykazano, że metoda ta pozwala na ekstrakcję najwyższej wydajności DNA z niewielkiej objętości krwi, takiej jak ta wymagana do seryjnych pobrań krwi wykorzystanych w tym badaniu19.
  2. Dodaj 25 μl proteinazy K (20 μg/ml) do 1 ml 0,1M buforu Tris.
  3. Krótko przemieszaj roztwór proteinazy K.
  4. Dodać 50 μl roztworu proteinazy K do każdej osadki komórkowej, która ma być strawiona.
  5. Wymieszać pipetując w górę i w dół i potwierdzić ponowne zawieszenie osadu komórkowego.
  6. Wstrząsać na termowstrząsarce (tabela materiałów) z prędkością 400 obr./min (w zależności od instrumentu) w temperaturze 56 °C przez 1 godzinę. W razie potrzeby przyklej rurki taśmą w dół, aby utrzymać je na miejscu.
  7. Natychmiast i w tym samym termoshakerze dezaktywować proteinazę K ze zmianą temperatury do 95 °C, podczas gdy wstrząsanie trwa przez dodatkowe 20 minut.
  8. Odwiruj każdą próbkę.
  9. Umieścić każdą próbkę w temperaturze -80 °C na co najmniej 30 minut.
  10. Rozmrozić, a następnie odwirować próbki o masie 17 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w celu osadzenia niepożądanych fragmentów komórkowych.
  11. Umieścić supernatant zawierający DNA w nowej probówce do mikrowirówki.
  12. Matryca DNA jest gotowa do PCR. Matryce DNA mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C.

10. Ekstrakcja RNA, synteza cDNA i kwantyfikacja ddPCR wirusowego RNA

  1. Wyizolować RNA z rozmrożonego osocza myszy za pomocą zestawu do izolacji RNA wirusa zgodnie z protokołem producenta (tabela materiałów).
  2. Po dodaniu próbki do kolumny należy dodać etap obróbki DNazą na kolumnie, aby zapewnić usunięcie całego DNA z próbki osocza.
    1. Do każdej próbki dodać 95 μl roztworu DNazy wolnego od RNaz (zmieszać 2 μl DNazy wolnej od RNAzy i 98 μl buforu reakcyjnego) do kolumny i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Próbki RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 godzinę przed dalszym przetwarzaniem. Ważne jest, aby zamrozić wszystkie próbki po ekstrakcji RNA, aby uniknąć ryzyka błędu systematycznego podczas porównywania próbek, które nie zostały zamrożone, z próbkami, które zostały zamrożone.
  4. Zsyntetyzuj cDNA za pomocą etapu odwrotnej transkryptazy przy użyciu odczynników, jak opisano wcześniej20. Upewnij się, że dodałeś 0,5 μl inhibitora RNazy do reakcji cDNA, aby uniknąć degradacji RNA.
    1. Przeprowadzić syntezę cDNA za pomocą programu opisanego w Tabeli 5.
  5. Próbki cDNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 godzinę. Ważne jest, aby zamrozić wszystkie próbki po syntezie cDNA, aby uniknąć ryzyka błędu systematycznego podczas porównywania próbek, które nie zostały zamrożone, z próbkami, które zostały zamrożone.
  6. Przygotuj próbki do ddPCR w następujący sposób20:
    1. Wymieszaj 3 μl próbki cDNA z 11 μl mieszaniny sondy ddPCR (bez dUTP)20, 250 nM sonda wiążąca rowek do przodu i 900 nM każdego ze starterów do przodu i do tyłu, jak wyszczególniono w Tabeli 6.
    2. Dostosuj całkowitą objętość PCR do 22 μl za pomocą wody wolnej od nukleaz.
  7. Emulguj mieszaniny PCR z olejem do generowania kropel do sond na generatorze kropel zgodnie z protokołem producenta i wcześniejszymi opisami20.
  8. Uruchom program PCR zgodnie z opisem w tabeli 7.
    UWAGA: Wyświetlane tutaj sekwencje startera/sondy i programy PCR zostały specjalnie zaprojektowane i zoptymalizowane pod kątem czułego wykrywania szczepu HIV RHPA4259. Sekwencje starterów i sond można łatwo dostosować do wykrywania dowolnego innego wybranego szczepu HIV.
  9. Wykryj fluorescencję kropelek z próbek na czytniku kropelkowym i przeanalizuj wyniki za pomocą odpowiedniego oprogramowania zgodnie z protokołem producenta.

11. Leczenie karmą zawierającą cART

  1. Karm myszy granulkami zawierającymi standardowy schemat cART zawierający 4,800 mg/kg raltegrawiru (RAL), 720 mg/kg fumaranu dizoproksylu tenofowiru (TDF) i 520 mg/kg emtrycytabiny (FTC)21 (Tabela 8). Dawki te zostały określone przy założeniu, że mysz waży 25 g i zjada 4 g karmy dziennie. Odpowiada to dawce dobowej 768 mg/kg RAL, 2,88 mg/kg TDF i 83 mg/kg FTC21.
  2. Stosuj dietę cART, która została przygotowana przez zewnętrznego dostawcę (patrz tabela materiałów) leków na receptę. Inne firmy mogą potencjalnie również produkować ten schemat. Użyj diety cART w kolorze czerwonym, aby łatwo odróżnić ją od zwykłej karmy dla myszy.
    1. Wyprodukuj karmę kontrolną bez cART w standardowym brązowym kolorze dla łatwego odróżnienia.
  3. Do zainicjowania cART należy przygotować sterylne klatki dla myszy z dodatkiem diety karmy zawierającej cART, a następnie przenieść myszy ze starej klatki do nowej.
    1. Monitoruj wagę myszy i spożycie karmy zawierającej cART poprzez oględziny, aby upewnić się, że myszy dostosowują się do zmiany.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Strategia bramkowania dla analizy czystości komórek macierzystych przedstawiona jest na Rysunku 1. Rysunek 1A–C pokazuje oczyszczoną populację CD34+, a Rysunek 1D–F frakcję przepuszczoną CD34-, aby zilustrować, że podczas procesu izolacji tracona jest minimalna ilość populacji CD34+. Czystość wyizolowanych komórek macierzystych CD34+ wynosiła od 85% do 95%, przy zanieczyszczeniu limfocytami T poniże...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Szczep myszy z poważnie obniżoną odpornością NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac (NOG) doskonale nadaje się do przeszczepiania ludzkich komórek i tkanek. Zarówno wrodzone, jak i adaptacyjne szlaki odpornościowe u tych myszy są naruszone. Myszy NOG i NSG są nosicielami mutacjiPrkdc scid, która powoduje wadliwą funkcję komórek T i B. Ponadto myszy te nie mają funkcjonalnego γ łańcucha receptora interleukiny-2 (wspólny łańcuch gamma, IL2rg), który jest nie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować pracownikom Biomedicine Animal Facility na Uniwersytecie w Aarhus, szczególnie Pani Jani Kær za utrzymanie kolonii i śledzenie wagi myszy. Autorzy pragną podziękować profesorowi Florianowi Kleinowi za opracowanie standardu opieki nad pacjentem cART oraz za wskazówki. Następujący odczynnik został uzyskany za pośrednictwem NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (cat# 11744) od dr Johna Kappesa i dr Christiny Ochsenbauer.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Niebieska podkładkaVWR56616-031Należy wysterylizować przed użyciem
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA8022
CD19 (klon sj25c1) PE-Cy7BD Bioscience557835
CD3 (klon OKT3) FITCBiolegend317306
CD3 (klon SK7) BUV395BD Bioscience564001
CD34 (klon AC136) FITCMiltenyi130-113-740
CD4 (klon SK3) BUV 496BD Bioscience564652/51
CD45 (klon 2D1) APCBiolegend368511/12
CD8 (klon RPA-T8) BV421BD Bioscience562428
ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)Bio-Rad1863025
DMSOMerck10,02,95,21,000
DNAseSigmaD4263Do buforu zawiesinowego
dNTP mixLife TechnologiesR0192
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbeccos (PBS)BiowestL0615-500
EasySep Ludzka krew pępowinowa CD34 Zestaw do pozytywnej selekcji IIStemcell17896
EDTAInvitrogen15575-038
FACS Roztwór lizujący 10XBD349202Rozcieńczyć w stosunku 1:10 w dH20 bezpośrednio przed użyciem
Probówki FACS (Falcon 5 ml round-botton)Falcon352052
Roztwór blokujący receptor Fc (Human Trustain FcX)Biolegend422302
Płodowa surowica bydlęcaSigmaF8192-500
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17144002
Flowjo v.10
Gauze Mesoft157300Należy wysterylizować przed użyciem
Lampa grzewczaWykonany na zamówienie
hemacytometr (Bü rker-Tü rk)VWRDOWC1597418
Izofluran gazowyOrion Pharma9658
LSR Fortessa X20 cytometr przepływowyBD
Probówki do mikrowirówek, zatwierdzone przez PCR-PTSarstedt72692405
Mouse cARTfood sniff Spezialdiä ten GmbHProdukt
OgranicznikProdukt
Igła, Microlance 3, 30G i frac12; "Myszy BD304000
NOG NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTacTaconicNOG-F
Woda wolna od nukleazChemikalia VWR436912C
Nucleospin 96 Zestaw do izolacji DNA i RNA wirusaMacherey-Nagel740691
zatwierdzone przez PCR probówki wirówkoweSarstedt72.692.405
Roztwór penicyliny-streptomycyny 100XBiowestL0022-100
Phusion Hot Start II Polimeraza DNALife TechnologiesF549S Końcówki
do pipet, sterylne, ART 20P BarrierThermoScientific2149P
Proteinaza KNEB100005398
Oprogramowanie QuantaSoftBio-Rad
QX100 Generator kropelBio-Rad1886-3008
QX100 Czytnik kropelBio-Rad186-3003
Roztwór do lizy RBCBiolegend420301
DNAzy, wolne od RNaz wielkości F + bufor reakcyjnyMacherey-Nagel740963
RNAseOUT Rekombinowany inhibitor rybonukleazyThermoScientific10777-019
RPMIBiowestL0501-500Rozpuścić w
strzykawce H20 Softject 1 mlHenke Sass Wolf5010-200V0
Indeks górny III Odwrotna transkryptazaThermoFisher Scientific18080044
WytrząsarkaVWR89370-910
Trypane niebieskieSigmaT8154
Ultrapure 0,5 EDTA, pH 8,0ThermoFisher Scientific15575-020
Virkon S (środek do dezynfekcji wirusów)DupontNumer telefonu 7511
na zamówienie myszy na zamówienie

Bibliografia

  1. WHO. GHO | By category | Antiretroviral therapy coverage - Data and estimates by WHO region (2018). World Health Organization. , Available from: http://apps.who.int/gho/data/node.main.626 (2018).
  2. Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154 (1), 50-61 (2018).
  3. Denton, P. W., Krisko, J. F., Powell, D. A., Mathias, M., Kwak, Y. T. Systemic Administration of Antiretrovirals Prior to Exposure Prevents Rectal and Intravenous HIV-1 Transmission in Humanized BLT Mice. PLoS ONE. 5 (1), 8829(2010).
  4. Zou, W., et al. Nef functions in BLT mice to enhance HIV-1 replication and deplete CD4 + CD8 + thymocytes. Retrovirology. 9 (1), 44(2012).
  5. Berges, B. K., Akkina, S. R., Folkvord, J. M., Connick, E., Akkina, R. Mucosal transmission of R5 and X4 tropic HIV-1 via vaginal and rectal routes in humanized Rag2 -/- γc -/- (RAG-hu) mice. Virology. 373 (2), 342-351 (2008).
  6. Veselinovic, M., Charlins, P., Akkina, R. Modeling HIV-1 Mucosal Transmission and Prevention in Humanized Mice. Methods Mol Biol. , 203-220 (2016).
  7. Neff, C. P., Kurisu, T., Ndolo, T., Fox, K., Akkina, R. A topical microbicide gel formulation of CCR5 antagonist maraviroc prevents HIV-1 vaginal transmission in humanized RAG-hu mice. PLoS ONE. 6 (6), 20209(2011).
  8. Neff, P. C., Ndolo, T., Tandon, A., Habu, Y., Akkina, R. Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model. PLoS ONE. 5 (12), 15257(2010).
  9. Veselinovic, M., et al. HIV pre-exposure prophylaxis: Mucosal tissue drug distribution of RT inhibitor Tenofovir and entry inhibitor Maraviroc in a humanized mouse model. Virology. 464-465, 253-263 (2014).
  10. Akkina, R., et al. Humanized Rag1-/-γc-/- mice support multilineage hematopoiesis and are susceptible to HIV-1 infection via systemic and vaginal routes. PLoS ONE. 6 (6), 20169(2011).
  11. Zhou, J., et al. Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice. Molecular Therapy. 19 (12), 2228-2238 (2011).
  12. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
  13. Trecarichi, E. M., et al. Partial protective effect of CCR5-Delta 32 heterozygosity in a cohort of heterosexual Italian HIV-1 exposed uninfected individuals. AIDS Research and Therapy. 3 (1), (2006).
  14. Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. The geographic spread of the CCR5 Δ32 HIV-resistance allele. PLoS Biology. 3 (11), 1954-1962 (2005).
  15. Solloch, U. V., et al. Frequencies of gene variant CCR5-Δ32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers. Human Immunology. 78 (11-12), 710-717 (2017).
  16. Ochsenbauer, C., et al. Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages. Journal of Virology. 86 (5), 2715-2728 (2012).
  17. Andersen, A. H. F., et al. Long-Acting, Potent Delivery of Combination Antiretroviral Therapy. ACS Macro Letters. 7 (5), 587-591 (2018).
  18. Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 52 (5), 577-583 (2013).
  19. Gatlin, J., Padgett, A., Melkus, M. W., Kelly, P. F., Garcia, J. V. Long-term engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice with human CD34+ cells transduced by a self-inactivating human immunodeficiency virus type 1 vector. Human Gene Therapy. 12 (9), 1079-1089 (2001).
  20. Leth, S., et al. HIV-1 transcriptional activity during frequent longitudinal sampling in aviremic patients on antiretroviral therapy. AIDS. 30 (5), 713-721 (2016).
  21. Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
  22. Rothenberger, M. K., et al. Large number of rebounding/founder HIV variants emerge from multifocal infection in lymphatic tissues after treatment interruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (10), 1126-1134 (2015).
  23. Rongvaux, A., et al. Human Hemato-Lymphoid System Mice: Current Use and Future Potential for Medicine. Annual Review of Immunology. 31 (1), 635-674 (2013).
  24. Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 12 (1), 187-215 (2017).
  25. Denton, P. W., García, J. V. Humanized mouse models of HIV infection. AIDS Reviews. 13 (3), 135-148 (2011).
  26. Denton, P. W., Søgaard, O. S., Tolstrup, M. Using animal models to overcome temporal, spatial and combinatorial challenges in HIV persistence research. Journal of Translational Medicine. 14 (1), (2016).
  27. Andersen, A. H. F., et al. cAIMP administration in humanized mice induces a chimerization-level-dependent STING response. Immunology. 157 (2), 163-172 (2019).
  28. Tanaka, S., et al. Development of Mature and Functional Human Myeloid Subsets in Hematopoietic Stem Cell-Engrafted NOD/SCID/IL2r KO Mice. The Journal of Immunology. 188 (12), 6145-6155 (2012).
  29. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. DPCR: A technology review. Sensors (Switzerland). 18 (4), (2018).
  30. Denton, P. W., et al. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  31. Li, Y., et al. A human immune system mouse model with robust lymph node development. Nature Methods. 15 (8), 623-630 (2018).
  32. Satheesan, S., et al. HIV Replication and Latency in a Humanized NSG Mouse Model during Suppressive Oral Combinational Antiretroviral Therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118(2018).
  33. Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Beauchamp, G. K., Tordoff, M. G. Food intake, water intake, and drinking spout side preference of 28 mouse strains. Behavior Genetics. 32 (6), 435-443 (2002).
  34. Shultz, L. D., et al. Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class I expressing NOD/SCID/IL2r null humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 13022-13027 (2010).
  35. Willinger, T., et al. Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (6), 2390-2395 (2011).
  36. Hanazawa, A., et al. Generation of human immunosuppressive myeloid cell populations in human interleukin-6 transgenic NOG mice. Frontiers in Immunology. 9, FEB (2018).
  37. Huntington, N. D., et al. IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 206 (1), 25-34 (2009).
  38. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model zakażenia HIVkomórki CD34+ z krwi pępowinowejanaliza cytometrycznacyfrowy PCR kropelkowyskojarzona terapia antyretrowirusowaprzesiewowe badanie CCR5 Delta 32ilościowe oznaczanie ładunku wirusaocena chimeryzmu ludzkiego
Humanizowane myszy NOG do dopochwowej ekspozycji na HIV i leczenia zakażenia HIV
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.