Artykuł metodologiczny

Znakowanie zbliżeniowe oparte na TurboID do identyfikacji sieci interakcji białko-białko in planta

DOI:

10.3791/60728

⸱

17 maja 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Agro-Biotechnology and Ministry of Agriculture Key Laboratory of Soil Microbiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj jest metoda etykietowania zbliżeniowego do identyfikacji partnerów interakcji domeny TIR receptora immunologicznego NLR w tkance liścia Nicotiana benthamiana. Podano również szczegółowy protokół identyfikacji interakcji między innymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania przy użyciu tej techniki u Nicotiana i innych gatunków roślin.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki znakowania zbliżeniowego (PL) z użyciem zmodyfikowanej peroksydazy askorbinianowej (APEX) lub ligazy biotyny Escherichia coli BirA (znanej jako BioID) zostały z powodzeniem wykorzystane do identyfikacji interakcji białko-białko (PPI) w komórkach ssaków. Jednak wymagania dotyczące toksycznego nadtlenku wodoru (H2O2) w PL na bazie APEX, dłuższy czas inkubacji z biotyną (16–24 h) i wyższa temperatura inkubacji (37 °C) w PL na bazie BioID poważnie ograniczają ich zastosowanie w roślinach. Niedawno opisana PL oparta na TurboID rozwiązuje wiele ograniczeń BioID i APEX. TurboID umożliwia szybkie znakowanie zbliżeniowe białek w zaledwie 10 minut w warunkach temperatury pokojowej (RT). Chociaż użyteczność TurboID została zademonstrowana w modelach zwierzęcych, ostatnio wykazaliśmy, że PL oparty na TurboID działa lepiej u roślin w porównaniu z BioID do znakowania białek, które są proksymalne do białka będącego przedmiotem zainteresowania. Poniżej przedstawiono protokół krok po kroku do identyfikacji partnerów interakcji białkowych przy użyciu N-końcowej domeny receptora Toll / interleukiny-1 (TIR) rodziny białek bogatych w nukleotydy (NLR) jako modelu. Metoda opisuje budowę wektorów, agroinfiltrację konstruktów ekspresji białek, obróbkę biotyną, ekstrakcję i odsalanie białek, kwantyfikację i wzbogacanie biotynylowanych białek poprzez oczyszczanie powinowactwa. Opisany tutaj protokół można łatwo dostosować do badania innych interesujących białek Nicotiana i innych gatunków roślin.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PPI są podstawą różnych procesów komórkowych. Tradycyjne metody identyfikacji IPP obejmują badania przesiewowe drożdży z dwoma hybrydami (Y2H) i immunoprecypitację sprzężoną ze spektrometrią mas (IP-MS)1. Jednak oba mają pewne wady. Na przykład badanie przesiewowe Y2H wymaga dostępności biblioteki Y2H docelowych gatunków roślin lub zwierząt. Budowa tych bibliotek jest pracochłonna i kosztowna. Ponadto podejście Y2H przeprowadza się na heterologicznych jednokomórkowych drożdżach organizmów eukariotycznych, które mogą nie reprezentować statusu komórkowego wyższych komórek eukariotycznych.

Dla kontrastu, IP-MS wykazuje niską skuteczność w wychwytywaniu przejściowych lub słabych IPP, a także nie nadaje się do białek o niskiej obfitości lub wysokiej hydrofobowości. Wiele ważnych białek biorących udział w roślinnych szlakach sygnałowych, takich jak kinazy receptoropodobne (RLK) lub rodzina receptorów immunologicznych NLR, ulega ekspresji na niskich poziomach i często przejściowo oddziałuje z innymi białkami. W związku z tym znacznie ogranicza to zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw regulacji tych białek.

Ostatnio, metody etykietowania zbliżeniowego (PL) oparte na zmodyfikowanej peroksydazie askorbinianowej (APEX) i zmutowanej ligazie biotyny Escherichia coli BirAR118G (znanej jako BioID) zostały opracowane i wykorzystane do badania IPP2,3,4. Zasada działania PL polega na tym, że białko docelowe będące przedmiotem zainteresowania jest łączone z enzymem, który katalizuje tworzenie labilnego biotynyl-AMP (bio-AMP). Te wolne bio-AMP są uwalniane przez enzymy PL i dyfundują w okolice białka docelowego, umożliwiając biotynylację białek proksymalnych na pierwszorzędowych aminach w szacowanym promieniu 10 nm5.

To podejście ma znaczące zalety w porównaniu z tradycyjnymi metodami Y2H i IP-MS, takie jak możliwość wychwytywania przejściowych lub słabych PPI. Ponadto PL umożliwia znakowanie białek proksymalnych białka docelowego w ich natywnym środowisku komórkowym. Różne enzymy PL mają unikalne wady przy stosowaniu ich do różnych układów. Na przykład, chociaż APEX oferuje wyższą kinetykę znakowania w porównaniu z BioID i jest z powodzeniem stosowany w systemach ssaków, wymóg toksycznego nadtlenku wodoru (H2O2) w tym podejściu sprawia, że nie nadaje się on do badań PL na roślinach.

W przeciwieństwie do tego, PL oparte na BioID unika użycia toksycznego H2O2, ale tempo znakowania jest powolne (wymaga 18-24 godzin do zakończenia biotynylacji), co sprawia, że wychwytywanie przejściowych IPP jest mniej efektywne. Co więcej, wyższa temperatura inkubacji (37 °C) wymagana do skutecznego PL przez BioID wprowadza stres zewnętrzny do niektórych organizmów, takich jak rośliny4. W związku z tym zgłoszono ograniczone zastosowanie PL opartego na BioID w roślinach (tj. protoplastach ryżowych, Arabidopsis i N. benthamiana)6,7,8,9. Niedawno opisany enzym TurboID przezwycięża braki PL opartego na APEX i BioID. TurboID wykazał wysoką aktywność, która umożliwia osiągnięcie PL w ciągu 10 minut przy RT10. PL oparty na TurboID został z powodzeniem zastosowany w komórkach ssaków, much i robaków10. Ostatnio wraz z innymi grupami badawczymi niezależnie zoptymalizowaliśmy i rozszerzyliśmy zastosowanie PL opartego na TurboID do badania IPP w różnych systemach roślinnych, w tym w roślinach N. benthamiana i Arabidopsis oraz owłosionych korzeniach pomidorów11,12,13,14. Analizy porównawcze wykazały, że TurboID działa lepiej w przypadku PL w roślinach w porównaniu do BioID11,14. Wykazano również odporność PL na bazie TurboID w roślinach, identyfikując szereg nowych interakcji z receptorem immunologicznym NLR11, białkiem, którego partnerzy w interakcji są zwykle trudni do uzyskania przy użyciu tradycyjnych metod.

Ten protokół ilustruje PL oparty na TurboID w planta, opisując identyfikację białek interakcji N-końcowej domeny TIR receptora immunologicznego NLR w roślinach N. benthamiana. Metodę można rozszerzyć na dowolne białka będące przedmiotem zainteresowania N. benthamiana. Co ważniejsze, stanowi ważne odniesienie do badania IPP w innych gatunkach roślin, takich jak Arabidopsis, pomidor i inne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Przegląd metody jest pokazany w Rysunek 1.

1. Przygotowanie materiału roślinnego

  1. Nasiona N. benthamiana należy uprawiać w wilgotnej glebie o dużej gęstości i utrzymywać w komorze klimatycznej z 16 godzinami światła (około 75 μmol/m2s) i 8 godzinami ciemnego fotoperiodu w temperaturze 23–25 °C.
  2. Około 1 tydzień później ostrożnie przenieś każdą młodą sadzonkę do doniczek o wymiarach 4 'x 4' i trzymaj sadzonki w tej samej komorze.
  3. Utrzymuj rośliny w komorze przez około 4 tygodnie, aż osiągną fazę liści 4–8 w celu późniejszej agroinfiltracji15.

2. Budowa fuzji TurboID

  1. Użyj standardowej techniki klonowania molekularnego, aby wygenerować fuzję docelowego białka z TurboID (PCR TurboID z plazmidu Addgene #107177). Tutaj użyliśmy N-końcowej domeny TIR receptora immunologicznego NLR jako białka docelowego i skonstruowaliśmy TIR połączony z TurboID pod kontrolą promotora 35S wirusa mozaiki kalafiora (p35S::TIR-TurboID).
    UWAGA: Fuzja enzymu TurboID z końcem karboksylowym lub aminokońcem białka docelowego będzie zależeć od białka będącego przedmiotem zainteresowania. Zwykle w przypadku białka cytoplazmatycznego oba końce powinny być akceptowalne, o ile fuzja TurboID nie wpływa na funkcję białka docelowego. Jednak w przypadku białka zlokalizowanego w błonie, topologia białka powinna być scharakteryzowana z wyprzedzeniem przed określeniem, który koniec jest najlepszy dla fuzji TurboID.
  2. Skonstruuj cytryn ze stopionym TurboID pod tym samym promotorem, aby służył jako kontrola do późniejszej ilościowej analizy proteomicznej.
    UWAGA: Ważne jest, aby skonstruować kontrolę TurboID w celu identyfikacji proteomu proksymalnego do białka docelowego. Kontrola fuzji TurboID powinna wykazywać poziom ekspresji podobny do poziomu białka docelowego połączonego z TurboID. Można to empirycznie określić, dostosowując stężenie Agrobacterium podczas agroinfiltracji. Ponadto ważne jest, aby białko kontrolne miało subkomórkowy wzorzec lokalizacji podobny do białka docelowego będącego przedmiotem zainteresowania.

3. Agroinfiltracja

  1. Przemiana plazmidów w Agrobacterium
    1. Dodaj 0,5 μg plazmidów wygenerowanych w krokach 2.1 i 2.2 do 50 μl komórek kompetentnych szczepu Agrobacterium tumefaciens GV3101, przygotowanych zgodnie z wcześniejszym opisem16.
      UWAGA: Można również stosować inne szczepy Agrobacterium, takie jak GV2260.
    2. Inkubować na lodzie przez 30 minut.
    3. Szok cieplny w łaźni wodnej w temperaturze 42 °C przez 60 s.
    4. Dodać 400 μl pożywki LB (10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 10 g/l NaCl; pH = 7,0) do Agrobacterium i inkubować w temperaturze 28 °C przez 90 min.
    5. Umieść całą zawartość w probówce na agarze LB uzupełnionym odpowiednimi antybiotykami w celu wyselekcjonowania plazmidu, a także dla Agrobacterium (dla GV3101: 50 mg/L gentamycyny i 50 mg/L ryfampicyny).
    6. Inkubować płytki w temperaturze 28 °C przez 36–48 godzin, aż do momentu, gdy widoczne będą poszczególne kolonie.
  2. Zebrać i rozprowadzić kilka pojedynczych kolonii na świeżej płytce agarowej LB z antybiotykami (patrz krok 3.1.5) i rosnąć w temperaturze 28 °C przez noc.
    UWAGA: Bardziej optymalne jest przeprowadzenie PCR kolonii w celu potwierdzenia obecności specyficznego konstruktu binarnego w Agrobacterium. Z naszego doświadczenia wynika, że ponad 95% kolonii zawiera wprowadzone konstrukty binarne.
  3. Zaszczepić 3 ml pożywki LB plus odpowiednie antybiotyki (patrz krok 3.1.4) kolonią Agrobacterium zawierającą interesujący konstrukt i inkubować przez wytrząsanie przez noc w temperaturze 28 °C, aż OD600 kultury Agrobacterium osiągnie 2,0.
  4. Odwirować komórki przy 3 000 x g i ponownie zawiesić je do OD600 = 1,0 w buforze agroinfiltracyjnym (10 mM MgCl2, 10 mM MES [pH = 5,6], 250 μM acetosyringonu).
    UWAGA: Chociaż optymalna jest inkubacja inokulum przez 2 godziny w temperaturze pokojowej przed agroinfiltracją, z naszego doświadczenia ze szczepem GV3101 nie było dużej różnicy między ekspresją białka docelowego z inkubacją a bez niej.
  5. Użyj strzykawki bezigłowej o pojemności 1 ml, aby nacieknąć inokulum w (abaksyjnym) naskórku w pełni dojrzałych liści N. benthamiana.
    UWAGA: Aby przygotować wystarczającą ilość materiału liściowego dla trzech kontrprób biologicznych: zwykle infiltrowany jest cały liść, trzy liście są infiltrowane na roślinę, a do każdej konstrukcji używa się od trzech do czterech roślin. Na każdy liść wystarczy 1,5–2,0 ml zawieszonych agrobakterii.
  6. Po 36 godzinach po infiltracji (hpi) naciekać 200 μM biotyny (w 10 mM roztworze MgCl2) do liści wstępnie infiltrowanych konstruktami TurboID.
  7. Utrzymuj roślinę przez dodatkowe 3–12 godzin przed zbiorem tkanki liściowej, jak opisano w sekcji 4.
    UWAGA: Powodem wyboru 36 hpi do infiltracji biotyny jest to, że ekspresja białka docelowego osiąga szczyt w tym punkcie czasowym, zgodnie z poprzednimi badaniami11. Zaleca się określenie czasu potrzebnego do optymalnej ekspresji białka docelowego będącego przedmiotem zainteresowania. Czas inkubacji po infiltracji biotyny zależy od projektu eksperymentalnego i badanego białka docelowego. Zwykle 3-12 godzin leczenia biotyną pozwala na znakowanie większości białek proksymalnie do białka docelowego za pomocą fuzji TurboID.

4. Pobieranie próbek liści

UWAGA: Do późniejszego przetwarzania próbek liści, noś sterylne rękawice, aby uniknąć zanieczyszczenia próbek keratyną. Wszystkie odczynniki powinny być również jak najbardziej wolne od keratyny.

  1. Przeciąć naciekane liście u podstawy ogonka liściowego, usunąć nerwę liścia, a następnie błyskawicznie zamrozić tkankę liścia w ciekłym azocie.
  2. Zmiel tkankę liściową za pomocą tłuczka i moździerza i przechowuj proszek z liści w probówkach sokoła o pojemności 15 ml lub 50 ml w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.
    UWAGA: Weź od trzech do czterech kawałków liści dla każdej z trzech replik biologicznych z różnych roślin. W tym miejscu protokół można wstrzymać. Przed przystąpieniem do kolejnych etapów zaleca się ocenę ekspresji białka i biotynylacji białka docelowego za pomocą analiz immunoblot. Typowe western bloty są pokazane w Rysunek 2.

5. Ekstrakcja całkowitego białka liściowego

  1. Przenieś około 0,35 g proszku z liści do probówki o pojemności 2 ml. Przygotować dwie probówki dla każdej próbki.
    UWAGA: Nosić rękawice podczas dotykania jakichkolwiek przedmiotów chłodzonych ciekłym azotem.
  2. Dodać 700 μl buforu do lizy RIPA (50 mM Tris-HCl [pH = 7,5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [v/v], 0,1% SDS [w/v], 0,5% deoksycholanu sodu [w/v], 1 mM DTT, 1 tabletka koktajlu inhibitorów proteazy) do 0,35 g sproszkowanego liścia.
  3. Wirować rurki przez 10 minut.
  4. Pozostawić próbki na lodzie na 30 minut.
  5. Mieszaj zawartość co 4-5 minut, kilkakrotnie obracając probówki do góry nogami.

6. Usuwanie wolnej biotyny przez odsalanie

UWAGA: Ta sekcja zajmuje około 50 minut.

  1. Zrównoważyć kolumnę odsalającą.
    1. Usuń uszczelniacz z dna kolumny odsalającej i umieść kolumnę w probówce o pojemności 50 ml.
    2. Usunąć roztwór do przechowywania przez odwirowanie w temperaturze 1000 x g i temperaturze 4 °C przez 2 minuty i upewnić się, że nakrętka jest poluzowana.
    3. Umieść kolumnę odsalającą w probówce o pojemności 50 ml. Wyrównać kolumnę 3x z 5 ml buforu do lizy RIPA, za każdym razem odwirowując w temperaturze 1000 x g i 4 °C przez 2 minuty i odrzucając przepływ.
    4. Przenieść kolumnę odsalającą do nowej probówki o pojemności 50 ml i przechowywać tymczasowo w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.
  2. Wirować probówki z kroku 5.4 w temperaturze 16 500 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut, a następnie przenieść supernatant z dwóch probówek do nowej probówki o pojemności 2 ml.
  3. Dodać 1 500 μl ekstraktu białkowego do górnej części żywicy zrównoważonej kolumny odsalającej (od kroku 6.1.4). Gdy ekstrakt białkowy dostanie się do żywicy, dodaj kolejne 100 μl buforu do lizy RIPA.
    UWAGA: Chociaż do ekstrakcji białka z liści użyto 1 400 μl buforu do lizy RIPA, całkowita objętość po ekstrakcji białka i odsoleniu była niezmiennie do pewnego stopnia zwiększona w stosunku do pierwotnej objętości. W związku z tym połączenie próbek z każdej grupy, jak opisano w krokach 5.1 i 5.4, może dać co najmniej 1 500 μl ekstraktu białkowego na próbkę.
  4. Odwirować w temperaturze 1000 x g i temperaturze 4 °C przez 2 minuty i pozostawić odsolone próbki na lód.

7. Kwantyfikacja odsolonych ekstraktów białkowych za pomocą testu Bradforda

  1. Przygotować 50 μl każdego gradientowego roztworu BSA: 0 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/mL, 0,8 mg/ml i 1 mg/ml.
  2. Rozcieńczyć odsolony ekstrakt białkowy przez zmieszanie próbki o objętości 5 μl z 45 μl ddH2O.
  3. Przygotuj 1x regent Bradforda, rozcieńczając 5x regenta Bradforda (100 mg błękitu brylantowego Coomassie G250, 47 ml metanolu, 100 ml 85% kwasu fosforowego, 53 ml ddH2O).
  4. Dodaj 50 μl każdego gradientowego roztworu BSA i 50 μl rozcieńczonego ekstraktu białkowego do 2,5 ml 1x Bradford regent.
  5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  6. Dodać 200 μl roztworu z każdej próbki do jednego dołka na płytce ELISA (trzy kontrpróby techniczne na próbkę).
  7. Zmierz średnicę zewnętrzną595 za pomocą czytnika mikropłytek.
  8. Narysować krzywą wzorcową na podstawie wartości gradientowego roztworu BSA i obliczyć stężenie odsolonych próbek białka. Zwykle całkowite stężenie białka uzyskane z 0,7 g liści waha się w granicach 3–6 mg/ml.
  9. Przygotuj 6–8 mg odsolonego ekstraktu białkowego do późniejszego oczyszczania powinowactwa.

8. Wzbogacanie białek biotynylowanych

  1. Weź 200 μl kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidn-C1 do probówki o pojemności 2 ml.
  2. Zrównoważyć kulki magnetyczne sprzężone streptawidn-C1 z 1 ml buforu do lizy RIPA przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  3. Po każdym myciu użyj stojaka magnetycznego, aby zaadsorbować kulki przez 3 minuty i delikatnie usuń roztwór przez pipetowanie.
  4. Powtórz kroki 8.2 i 8.3.
  5. Przenieś odsolony ekstrakt białkowy do zrównoważonych kulek magnetycznych sprzężonych streptavidn-C1.
  6. Inkubować probówkę w temperaturze 4 °C przez 12 godzin (lub przez noc) na rotatorze w celu oczyszczenia biotynylowanych białek pod względem powinowactwa.
  7. Chwyć kulki na stojaku magnetycznym przez 4 minuty w temperaturze suchej, aż kulki zbiorą się po jednej stronie probówki, a następnie delikatnie usuń supernatant za pomocą pipety.
  8. Dodać 1,7 ml buforu do przemywania I (2% SDS w wodzie) do probówki i trzymać go na rotatorze w temperaturze pokojowej przez 8 minut. Powtórz krok 8.3.
  9. Dodać 1,7 ml buforu do przemywania II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% kwasu deoksycholowego [w/v], 1% Triton X-100) do probówki i trzymać ją na rotatorze w temperaturze RT przez 8 minut. Powtórz krok 8.3.
  10. Dodać 1,7 ml buforu do przemywania III (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% kwasu deoksycholowego [w/v], 1% NP40 [v/v]) do probówki i trzymać go na rotatorze w temperaturze RT przez 8 minut. Powtórzyć krok 8.3.
  11. Dodać 1,7 ml 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), aby usunąć detergent, a następnie powtórzyć krok 8.3.
  12. Przenieś kulki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i powtórz kroki 8.11 i 8.3.
  13. Przemyć kulki 6x przez 5 minut każdy za pomocą 50 mM buforu wodorowęglanu amonu w temperaturze pokojowej.
  14. Dodaj 1 ml 50 mM buforu wodorowęglanu amonu do kulek magnetycznych i dobrze wymieszaj.
  15. Usuń 100 μl kulek do analizy immunoblot, aby potwierdzić wzbogacenie biotynylowanych białek. Typowy western blot jest pokazany w Rysunek 3.
  16. Pozostałe próbki białek należy błyskawicznie zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C lub natychmiast wysłać do analizy LC-MS/MS na suchym lodzie.
    UWAGA: Typowe wyniki stwardnienia rozsianego są przedstawione w poprzedniej publikacji (Zhang i wsp. 2019; Rysunek 2, Dane uzupełniające 1 i Dane uzupełniające 2)11. Całe zestawy danych są dostępne w serwisie MassIVE (znajdującym się pod adresem ) pod identyfikatorem: MSV000083018 i MSV000083019.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne dane, które ilustrują oczekiwane wyniki na podstawie opisanego protokołu, są zaadaptowane z Zhang et al11. Rysunek 1 podsumowuje procedury wykonywania PL opartego na TurboID u N. benthamiana. Rysunek 2 pokazuje ekspresję białka i biotynylację w infiltrowanych liściach N. benthamiana. Rysunek 3 pokazuje, że biotynylowane białka w naciekanych liściach zostały skutecznie wzbogac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ligaza biotyny TurboID jest generowana w wyniku ukierunkowanej ewolucji BioID10 opartej na wyświetlaczu drożdży. Ma wiele zalet w porównaniu z innymi enzymami PL. TurboID pozwala na zastosowanie PL do innych systemów modelowych, w tym much i robaków, których optymalna temperatura wzrostu wynosi około 25 °C10. Chociaż podejście PL jest szeroko stosowane w systemach zwierzęcych, jego zastosowanie w roślinach jest ograniczone. Opisany tutaj protokół zawiera procedurę krok po k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z National Transgenic Science and Technology Program (2019ZX08010-003 dla Y.Z.), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31872637 do Y.Z.) oraz Funduszy Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych (2019TC028 do Y.Z.), oraz NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 i NIH-GM132582-01 dla S.P.D.K.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
721 SpektrofotometrMetash, wyprodukowany w ChinachQ / SXFZ6do pomiaru OD600
Wodorowęglan amonuSigmaA6141-500G
BiotynaSigmaB4639-1G50 mM Wirówka
EppendorfWirówka 5702
Wirówka Eppendorf5417R
cOmcomplete Protease Inhibitor CocktailRoche11697489001
Kwas deoksycholowySigmaD2510-100G
DL-Ditiothreitol (DTT)VWR Life Science0281-25G
Dynabeads MyOne Streptawidyna C1Invitrogen65001Do oczyszczania powinowactwa
EDTASigmaE6758-500G
Tabliczka ELISACorningCostar 3590
HEPESSigmaH3375-1KG
Kwas solny (HCl)Fisher ScientificA144S-212
Membrana PVDF Immobilon-PMiliporowyIPVH00010Do analizy Western blot
Roztwór chlorku litu (LiCl), 8MSigmaL7026-500ML
Chłodzenie o niskiej prędkości wirówkaZonkia, wyprodukowana w ChinachKDC-2046Do odsalania
chlorku magnezu, sześciowodnego (MgCl2· 6H2O)SigmaM9272-500G
Stojak magnetycznyInvitrogen123.21DDo adsorpcji perełkowej
Multiskan FC Fotometr mikropłytkowy ThermoFisher ScientificN07710Do pomiaru OD595
NP-40 (IGEPAL CA-630)SigmaI8896-100ML
Szczur anty-HARoche11867423001
Mikser rotacyjnyKylin-Bell Lab InstrumentWH-986do
inkubatora szokowegoLabotery, wyprodukowany w ChinachZQPZ-228
Chlorek sodu (NaCl)Fisher ScientificS271-3
Deoksycholan soduSigmaD2510-100G
Dodecylosiarczan sodu (SDS)SigmaL4390-1KG
Streptawidyna-HRPAbcamab7403
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Baza TrizmaSigmaT1503-1KG
VortexScientific IndustriesG-560E
Inkubator z płaszczem wodnymNiebieski pard, wyprodukowany w ChinachGHP-9080Do inkubacji
AgrobacteriumKolumna odsalająca Zeba SpinThermo Fisher Scientific89893Do usuwania biotyny
IP

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
  3. Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
  4. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
  5. Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
  6. Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
  7. Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212(2018).
  8. Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
  9. Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326(2019).
  10. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
  11. Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252(2019).
  12. Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
  13. Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
  14. Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864(2019).
  15. Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468(2011).
  16. McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
  17. Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
  18. Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
  19. Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
  20. Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Labelowanie blisko ciowe TurboIDoddzia ywania bia ko bia koreceptory immunologiczne NLRNicotiana benthamianaprotok agroinfiltracjitraktowanie biotynwzbogacanie streptawidynanaliza Western blotspektrometria masekstrakcja bia ek ro linnych

Powiązane artykuły