Artykuł metodologiczny

Znakowanie zbliżeniowe oparte na TurboID do identyfikacji sieci interakcji białko-białko in planta

DOI:

10.3791/60728

⸱

17 maja 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Agro-Biotechnology and Ministry of Agriculture Key Laboratory of Soil Microbiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj jest metoda etykietowania zbliżeniowego do identyfikacji partnerów interakcji domeny TIR receptora immunologicznego NLR w tkance liścia Nicotiana benthamiana. Podano również szczegółowy protokół identyfikacji interakcji między innymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania przy użyciu tej techniki u Nicotiana i innych gatunków roślin.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki znakowania zbliżeniowego (PL) z użyciem zmodyfikowanej peroksydazy askorbinianowej (APEX) lub ligazy biotyny Escherichia coli BirA (znanej jako BioID) zostały z powodzeniem wykorzystane do identyfikacji interakcji białko-białko (PPI) w komórkach ssaków. Jednak wymagania dotyczące toksycznego nadtlenku wodoru (H2O2) w PL na bazie APEX, dłuższy czas inkubacji z biotyną (16–24 h) i wyższa temperatura inkubacji (37 °C) w PL na bazie BioID poważnie ograniczają ich zastosowanie w roślinach. Niedawno opisana PL oparta na TurboID rozwiązuje wiele ograniczeń BioID i APEX. TurboID umożliwia szybkie znakowanie zbliżeniowe białek w zaledwie 10 minut w warunkach temperatury pokojowej (RT). Chociaż użyteczność TurboID została zademonstrowana w modelach zwierzęcych, ostatnio wykazaliśmy, że PL oparty na TurboID działa lepiej u roślin w porównaniu z BioID do znakowania białek, które są proksymalne do białka będącego przedmiotem zainteresowania. Poniżej przedstawiono protokół krok po kroku do identyfikacji partnerów interakcji białkowych przy użyciu N-końcowej domeny receptora Toll / interleukiny-1 (TIR) rodziny białek bogatych w nukleotydy (NLR) jako modelu. Metoda opisuje budowę wektorów, agroinfiltrację konstruktów ekspresji białek, obróbkę biotyną, ekstrakcję i odsalanie białek, kwantyfikację i wzbogacanie biotynylowanych białek poprzez oczyszczanie powinowactwa. Opisany tutaj protokół można łatwo dostosować do badania innych interesujących białek Nicotiana i innych gatunków roślin.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PPI są podstawą różnych procesów komórkowych. Tradycyjne metody identyfikacji IPP obejmują badania przesiewowe drożdży z dwoma hybrydami (Y2H) i immunoprecypitację sprzężoną ze spektrometrią mas (IP-MS)1. Jednak oba mają pewne wady. Na przykład badanie przesiewowe Y2H wymaga dostępności biblioteki Y2H docelowych gatunków roślin lub zwierząt. Budowa tych bibliotek jest pracochłonna i kosztowna. Ponadto podejście Y2H przeprowadza się na heterologicznych jednokomórkowych drożdżach organizmów eukariotycznych, które mogą nie reprezentować statusu komórkowego wyższych komórek eukariotycznych.

Dla kontrastu, IP-MS wykazuje ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Przegląd metody jest pokazany w Rysunek 1.

1. Przygotowanie materiału roślinnego

  1. Nasiona N. benthamiana należy uprawiać w wilgotnej glebie o dużej gęstości i utrzymywać w komorze klimatycznej z 16 godzinami światła (około 75 μmol/m2s) i 8 godzinami ciemnego fotoperiodu w temperaturze 23–25 °C.
  2. Około 1 tydzień później ostrożnie przenieś każdą młodą sadzonkę do doniczek o wymiarach 4 'x 4' i trzymaj sadzonki w tej samej komorze.
  3. Utrzymuj rośliny w komorze przez około 4 tygodnie, aż osiągną fazę liści 4–8 w celu późniejszej agroinfiltracji

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne dane, które ilustrują oczekiwane wyniki na podstawie opisanego protokołu, są zaadaptowane z Zhang et al11. Rysunek 1 podsumowuje procedury wykonywania PL opartego na TurboID u N. benthamiana. Rysunek 2 pokazuje ekspresję białka i biotynylację w infiltrowanych liściach N. benthamiana. Rysunek 3 pokazuje, że biotynylowane białka w naciekanych liściach zostały skutecznie wzbogac.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ligaza biotyny TurboID jest generowana w wyniku ukierunkowanej ewolucji BioID10 opartej na wyświetlaczu drożdży. Ma wiele zalet w porównaniu z innymi enzymami PL. TurboID pozwala na zastosowanie PL do innych systemów modelowych, w tym much i robaków, których optymalna temperatura wzrostu wynosi około 25 °C10. Chociaż podejście PL jest szeroko stosowane w systemach zwierzęcych, jego zastosowanie w roślinach jest ograniczone. Opisany tutaj protokół zawiera procedurę krok po k.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z National Transgenic Science and Technology Program (2019ZX08010-003 dla Y.Z.), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31872637 do Y.Z.) oraz Funduszy Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych (2019TC028 do Y.Z.), oraz NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 i NIH-GM132582-01 dla S.P.D.K.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
721 SpektrofotometrMetash, wyprodukowany w ChinachQ / SXFZ6do pomiaru OD600
Wodorowęglan amonuSigmaA6141-500G
BiotynaSigmaB4639-1G50 mM Wirówka
EppendorfWirówka 5702
Wirówka Eppendorf5417R
cOmcomplete Protease Inhibitor CocktailRoche11697489001
Kwas deoksycholowySigmaD2510-100G
DL-Ditiothreitol (DTT)VWR Life Science0281-25G
Dynabeads MyOne Streptawidyna C1Invitrogen65001Do oczyszczania powinowactwa
EDTASigmaE6758-500G
Tabliczka ELISACorningCostar 3590
HEPESSigmaH3375-1KG
Kwas solny (HCl)Fisher ScientificA144S-212
Membrana PVDF Immobilon-PMiliporowyIPVH00010Do analizy Western blot
Roztwór chlorku litu (LiCl), 8MSigmaL7026-500ML
Chłodzenie o niskiej prędkości wirówkaZonkia, wyprodukowana w ChinachKDC-2046Do odsalania
chlorku magnezu, sześciowodnego (MgCl2· 6H2O)SigmaM9272-500G
Stojak magnetycznyInvitrogen123.21DDo adsorpcji perełkowej
Multiskan FC Fotometr mikropłytkowy ThermoFisher ScientificN07710Do pomiaru OD595
NP-40 (IGEPAL CA-630)SigmaI8896-100ML
Szczur anty-HARoche11867423001
Mikser rotacyjnyKylin-Bell Lab InstrumentWH-986do
inkubatora szokowegoLabotery, wyprodukowany w ChinachZQPZ-228
Chlorek sodu (NaCl)Fisher ScientificS271-3
Deoksycholan soduSigmaD2510-100G
Dodecylosiarczan sodu (SDS)SigmaL4390-1KG
Streptawidyna-HRPAbcamab7403
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Baza TrizmaSigmaT1503-1KG
VortexScientific IndustriesG-560E
Inkubator z płaszczem wodnymNiebieski pard, wyprodukowany w ChinachGHP-9080Do inkubacji
AgrobacteriumKolumna odsalająca Zeba SpinThermo Fisher Scientific89893Do usuwania biotyny
IP

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Bio....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Labelowanie blisko ciowe TurboIDoddzia ywania bia ko bia koreceptory immunologiczne NLRNicotiana benthamianaprotok agroinfiltracjitraktowanie biotynwzbogacanie streptawidynanaliza Western blotspektrometria masekstrakcja bia ek ro linnych

Powiązane artykuły