Method Article

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

DOI:

10.3791/60780

⸱

February 27th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Buck Institute for Research on Aging

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten przepływ pracy opisuje wydajność efektywnego czasowo i kosztowo wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM) jednocześnie dla ilościowej globalnej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje wzbogacanie PTM na poziomie peptydów wieloma sprzężonymi przeciwciałami, a następnie niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu uzyskania biologicznego wglądu w przesłuchy PTM.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie wielu modyfikacji potranslacyjnych (PTM) białek jest kluczowym krokiem do zrozumienia przesłuchów PTM i uzyskania bardziej holistycznego wglądu w funkcję białek. Pomimo znaczenia badań nad wzbogacaniem wielu PTM, niewiele badań bada więcej niż jeden PTM na raz, częściowo ze względu na koszty, czas i duże ilości białka wymagane do przeprowadzenia wielu globalnych analiz proteomicznych PTM. Wzbogacenie powinowactwa "w jednym garnku" wyszczególnione w tym protokole pokonuje te bariery, umożliwiając jednoczesną identyfikację i kwantyfikację peptydów z resztami lizyny zawierającymi PTM acetylacji i sukcynylacji przy niewielkich ilościach wejściowej próbki. Protokół obejmuje przygotowanie lizatu białkowego z wątroby myszy z nokautem SIRT5, przeprowadzenie trawienia trypsyny, wzbogacenie w PTM oraz przeprowadzenie analizy spektrometrii mas przy użyciu przepływu pracy akwizycji niezależnej od danych (DIA). Ponieważ ten przepływ pracy pozwala na jednoczesne wzbogacanie dwóch PTM z tej samej próbki, zapewnia praktyczne narzędzie do badania przesłuchów PTM bez konieczności stosowania dużych ilości próbek i znacznie skraca czas potrzebny na przygotowanie próbki, akwizycję i analizę. Komponent DIA przepływu pracy dostarcza wyczerpujących informacji specyficznych dla PTM. Jest to szczególnie ważne podczas badania lokalizacji miejsc PTM, ponieważ DIA zapewnia kompleksowe zestawy jonów fragmentacyjnych, które można obliczeniowo rozszyfrować w celu rozróżnienia różnych izoform lokalizacji PTM.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niezliczone modyfikacje potranslacyjne dynamicznie regulują białka i szlaki poprzez wpływ na aktywność1, signaling2, and rotation3,4. Na przykład kinazy białkowe są aktywowane lub dezaktywowane przez dodanie grup fosforanowych5, a acetylacja histonów i inne modyfikacje zapewniają mechanizm zmiany struktury chromatyny i służą jako mechanizmy regulacji transkrypcji6,7. W ostatnich latach pojawiło się wiele dowodów na to, że wiele PTM współpracuje lub konkuruje ze sobą, regulując funkcję lub aktywność białek8,9,10,11. Dlatego zrozumienie przesłuchów PTM jest pojawiającą się potrzebą w badaniach nad PTM. Jednak większość dostępnych proteomicznych procesów pracy mających na celu identyfikację i ilościowe określenie miejsc PTM koncentruje się na pojedynczych modyfikacjach, a nie na wzajemnym oddziaływaniu wielu modyfikacji. Opisany przebieg pracy koreluje specyficzne "gorące punkty" modyfikacji białek i reszty lizyny, które są modyfikowane przez wiele różnych PTM.

W środowisku naukowym rośnie zapotrzebowanie na możliwe metody badania wielu PTM jednocześnie12. Większość metod globalnej identyfikacji i ilościowego określania miejsc wielu typów PTM jest trudna ze względu na wysokie koszty i ilość wymaganej tkanki12,13. Eksperymenty z wzbogacaniem wielu PTM są nie tylko czasochłonne pod względem przygotowania próbek, pozyskiwania danych i analizy danych, ale badania te zazwyczaj wymagają dużych i często zaporowych ilości białka11. Opisano tutaj protokół do jednoczesnego wzbogacania i analizy wielu PTM, który również rozwiązuje kilka z tych barier i umożliwia profilowanie PTM na dużą skalę oraz ocenę przesłuchów między różnymi PTM14. Ten jednoetapowy przepływ pracy przedstawia praktyczny sposób, w jaki badacze biomedyczni mogą globalnie profilować wiele PTM, identyfikować współmodyfikowane peptydy i badać przesłuchy PTM w wydajny i opłacalny sposób14,15.

Tutaj ta metoda jest prezentowana poprzez badanie acylacji białek mitochondrialnych, która została po raz pierwszy zbadana ponad 50 lat temu16. W szczególności koncentruje się na acetylacji lizyny17 i sukcynylacji18, w tym na współwystępowaniu tych modyfikacji na białkach, a nawet na komodyfikacji na poziomie peptydu. Ponieważ w badaniu wykorzystano mysi model nokautujący sirtuinę 5 (SIRT5), wybrano go tak, aby skupić się na wzbogacaniu miejsc acetylacji i sukcynylacji. Decyzja ta została podjęta, ponieważ miejsca sukcynylacji są celami desuccinylazy SIRT5 i dlatego oczekuje się, że będą wykazywać znaczną regulację w górę u myszy KO, co czyni je najbardziej odpowiednimi PTM w tym przypadku. Oba PTM są biologicznie istotne, jak niedawno podsumowali Carrico et al.19. Ogólnie rzecz biorąc, acetylacja wykazuje istotny wpływ na ekspresję genów i metabolizm, a sukcynylacja reguluje metabolizm i funkcję serca20.

Opisany protokół może być wykonany z małą ilością materiału wejściowego białka (np. 1 mg lizatu białkowego) i skraca całkowity czas trwania eksperymentu, skracając czas poświęcony na przetwarzanie próbki, akwizycję MS i analizę danych. Schemat przepływu pracy przedstawiono na rysunku 1. Użyliśmy również jeszcze mniejszych ilości materiału wyjściowego (do 100 μg lizatu białkowego, odpowiednio zmniejszając ilość stosowanych kulek), co zgodnie z oczekiwaniami zmniejsza ogólną wydajność zidentyfikowanych acylowanych peptydów; Jednak nadal zapewnia bardzo cenne wyniki i ilościowe acylowane peptydy.

Podczas gdy tak zwane przepływy pracy z góry na dół lub na środku zazwyczaj nie wykorzystują metod trawienia proteolitycznego (i w ten sposób utrzymują łączność wielu PTM w obrębie jednego białka), ten protokół skupia się na podejściu do wzbogacania powinowactwa opartego na peptydach, aby uzyskać dodatkową głębię i czułość dla identyfikacji i kwantyfikacji PTM (Rysunek 1). Ponadto ten skoncentrowany na peptydach przepływ pracy wykorzystuje nowoczesne metody spektrometrii mas, w tym 1) kombinację akwizycji zależnej od danych (DDA) w celu generowania bibliotek spektralnych oraz 2) akwizycję niezależną od danych (DIA) w celu dokładnej kwantyfikacji PTM w przepływie pracy bez etykiet.

DIA pozwala przezwyciężyć stochastyczność próbkowania typowych schematów skanowania DDA poprzez kompleksową fragmentację wszystkich sygnałów peptydowych w próbkowanym zakresie m/z21. Ta cecha jest również niezwykle korzystna z punktu widzenia lokalizacji miejsca, ponieważ łatwiej jest uzyskać informacje o tym, które konkretne jony fragmentacyjne są modyfikowane w peptydzie. Ponadto przepływy pracy DIA umożliwiają identyfikację i kwantyfikację mniejszych izoform peptydu PTM z identycznymi jonami prekursorowymi. Metody DIA mogą również określić określoną lokalizację miejsca PTM w peptydzie na podstawie określonych odpowiadających im jonów fragmentacyjnych, które są kompleksowo mierzone przez cały czas. Jednak podejścia DDA często wykorzystują funkcje "dynamicznego wykluczania", które wykluczają wielokrotne pobieranie próbek MS/MS dla tego samego jonu prekursorowego, pomijając w ten sposób mniejsze izoformy PTM.

Opisana tutaj strategia jednoczesnego wzbogacania idealnie nadaje się do badań, które skorzystają z globalnego profilowania i kwantyfikacji wielu PTM, badania przesłuchów PTM i zrozumienia dynamicznych interakcji modyfikacji potranslacyjnych. Identyfikacja wielu wzbogaconych PTM w jednym połączonym przepływie pracy została opisana przez: globalne, seryjne lub równoległe wzbogacanie PTM zawierających peptydy proteolityczne lub alternatywnie przez analizę nienaruszonych białek. W bezpośrednim porównaniu z seryjnym wzbogacaniem acetylacji i sukcynylacji, skuteczność metodologii jednogarnkowej została ustalona jako bardzo podobna14. Te alternatywne protokoły wymagają znacznych ilości materiału wyjściowego i czasu oraz mogą być zbyt drogie. W przeciwieństwie do tego, protokół jednogarnkowy zapewnia niedrogą i wydajną metodę wzbogacania więcej niż jednego PTM wraz z późniejszą analizą i identyfikacją.

Tkanki wątroby myszy są pozyskiwane od myszy z nokautem SIRT5 i są tutaj używane jako materiał wyjściowy. Protokół ten można również wykonać dla lizatów białkowych z różnych tkanek lub eksperymentów z kulturami komórkowymi. Protokół ten można zastosować do lizatów białkowych otrzymywanych z tkanek lub granulek kultur komórkowych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty opisane w protokole są zgodne z wytycznymi Komitetu Badań nad Zwierzętami Instytutu Bucka.

1. Ekstrakcja białka z homogenizowanej tkanki i trawienie za pomocą proteazy

  1. Świeżo przygotować bufor do lizy do końcowego stężenia 8 M mocznika, 50 mM wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB), 1 μM trichostatyny A (TSA), 20 mM nikotynamidu, 75 mM chlorku sodu (NaCl), 1x koktajl inhibitorów proteazy/fosfatazy () z wodą o czystości HPLC.
  2. Dodaj jeden sterylny stalowy koralik do probówki o pojemności 2 ml kompatybilnej z homogenizatorem do młynków perełkowych, a następnie umieść kawałek tkanki (wielkości ziarnka grochu) w probówce. Dodać bufor do lizy (500 μl) i krótko odwirować, aby upewnić się, że bufor zakrywa kawałek tkanki (w razie potrzeby dodać więcej buforu do lizy). Umieść probówki na wstępnie schłodzonych zestawach adapterów, upewniając się, że probówki są wyważone między dwoma adapterami homogenizatora.
  3. Homogenizować próbki 2x w temperaturze 25 Hz przez 3 minuty każda, w temperaturze 4 °C. Jeśli tkanka nie jest w pełni homogenizowana, należy krótko obrócić probówki i przenieść homogenizowany lizat do świeżo oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml. Następnie dodać dodatkowy bufor do lizy do pozostałego fragmentu tkanki i powtórzyć homogenizację 2x przy 25 Hz przez 3 minuty każde. Zazwyczaj wystarczają dwie rundy homogenizacji do rozbicia tkanki.
  4. Usuń metalowy koralik za pomocą pęsety. Pomiędzy każdą próbką przepłucz pęsetę wodą klasy HPLC, metanolem klasy HPLC i ponownie wodą klasy HPLC.
  5. Połączyć homogenizowane lizaty, jeśli zastosowano dwie rundy homogenizacji i sonikować próbki za pomocą ultradźwięków przez 10 cykli w czasie 30 s włączenia/30 s wyłączenia i 4 °C przy dużej mocy.
  6. Odwirować homogenizowane lizaty przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu oczyszczenia lizatu. Przenieść supernatant (oczyszczony lizat) do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, unikając warstwy tłuszczu, która może znajdować się na wierzchu supernatantu i wszelkich zanieczyszczeń na dnie probówki.
  7. Wykonać test kwasu bicinchoninowego (BCA) w celu zmierzenia stężenia białka w oczyszczonym lizacie z odpowiednim rozcieńczeniem (na przykład 1:20 i/lub 1:200). Zgodnie z wynikami BCA, podwielokrotność 1 mg białka z każdej próbki.
  8. Redukować białka w 4,5 mM ditiotreitolu (DTT) w temperaturze 37 °C przez 30 minut z mieszaniem przy 1 400 obr./min. Następnie alkilatować białka w 10 mM jodoacetamidu (IAA) z inkubacją w ciemności (umieścić w szufladzie lub szafce) w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 min.
    UWAGA: Można stosować alternatywne odczynniki, takie jak N-etylomaleimid (NEM) zamiast IAA.
  9. Dodać 50 mM TEAB do próbek, aby rozcieńczyć stężenie mocznika poniżej 2 M. Umieścić 1 μl próbki na bibułce pH, aby upewnić się, że pH rozcieńczonej próbki mieści się w przedziale 7,0-8,5. Dodać trypsynę do każdej próbki w stosunku 1:50 (trypsyna do białka, wag/wag) i trawić białko przez mieszanie w temperaturze 37 °C przez noc (około 14-16 godzin).
  10. Ugasić trawienia 10% kwasem mrówkowym, aby następnego dnia osiągnąć 1% kwasu mrówkowego. Wiruj i krótko wiruj. Umieścić 1 μl próbki na paskach pH, aby upewnić się, że trawienie ma pH = 2-3. Odwirować próbki o masie 1 800 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia dowolnego materiału nierozpuszczalnego.

2. Odsalanie niewzbogaconych peptydów proteolitycznych poprzez ekstrakcję do fazy stałej na dużą skalę

  1. Zaopatrz się w wkłady zawierające żywicę C18, która może związać do 10 mg białka. Zamontuj te wkłady w aparacie próżniowym, aby użyć ssania próżniowego, które może przeciągnąć ciecz przez wkład podczas każdego z poniższych kroków. Oznaczyć jeden wkład dla każdej próbki peptydu.
  2. Dodaj 800 μl 80% acetonitrylu (ACN) w 0,2% kwasie mrówkowym do wkładów z 19,8% wodą i użyj odsysania próżniowego, aby przeciągnąć płyn. Powtórz ten krok 1x, unikając całkowitego wyschnięcia wkładów.
  3. Wyrównaj wkłady, dodając 800 μl 0,2% kwasu mrówkowego do wody z odsysaniem próżniowym, aby przeciągnąć całą objętość przez filtr. Powtórz to 2x. Załaduj peptydy na wkłady za pomocą odsysania próżniowego. Przemyć peptydy 2x 800 μL 0,2% kwasu mrówkowego w wodzie pod odsysaniem próżniowym.
  4. Umieść 1,5 ml probówek wirówkowych pod każdym wkładem, aby zebrać peptydy eluujące w ostatnim etapie. Pod odsysaniem próżniowym wymyj peptydy z wkładów, najpierw z 800 μl 80% ACN w 0,2% kwasie mrówkowym i 19,8% wodzie, a następnie z 400 μl tego samego roztworu. Całkowicie wysuszyć odsolone próbki peptydów w koncentratorze próżniowym (2-3 h).

3. Jednoczesne wzbogacanie peptydów K-acetylowanych i K-sukcynylowanych w koraliki powinowactwa immunologicznego

  1. Ponownie zawiesić wysuszone peptydy w 1,4 ml zimnego buforu oczyszczającego 1x immunopowinowactwo (IAP). Wirować do wymieszania i zapewnić pH ~7. Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Może pojawić się mała granulka.
  2. Odłóż peptydy na lód podczas przygotowywania kulek przeciwciał. Do probówki z K-acetylem i probówki z zawiesiną z kulkami przeciwciała K-sukcynylowego (objętość: 100 μl zawiesiny na probówkę) dodać 1 ml zimnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i wymieszać pipetując. Przenieść cały roztwór do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i wirować w miniaturowej wirówce przez 30 s w temperaturze pokojowej.
  3. Zassać PBS, uważając, aby nie zassać żadnych koralików. Powtórzyć mycie 3x, przemywając ponownie 1 ml zimnego 1x PBS, wirując przez 30 s w temperaturze pokojowej i odsysając PBS.
  4. Ponownie zawiesić kulki w około 440 μl PBS. Jedna czwarta liczby kulek w każdej probówce PTM (100 μl, dostarczana przez producenta) jest używana do wzbogacania w jednym garnku (około 62,5 μg każdego unieruchomionego przeciwciała zarówno dla kulek przeciwciała K-acetylowego, jak i K-sukcynylowego). Odpipetuj koraliki kilka razy, aby dobrze wymieszać. Usuń 100 μl kulek przeciwciała acetylolizyny i przenieś do jednej probówki z 200 μl wstępnie przyciętymi końcówkami, upewniając się, że mieszanka główna pozostaje niezmiennie dobrze wymieszana.
  5. Zrób to samo z kulkami przeciwciała sukcynylo-lizyny, usuwając 100 μl kulek przeciwciała sukcynylo-lizyny do probówki, aby dotrzeć do równych części przeciwciała acetylolizyny i przeciwciała sukcynylo-lizyny w każdej probówce. Wirować przez 30 s w miniaturowej wirówce i odsysać pożywkę za pomocą końcówki do ładowania żelu (kulki zmienią kolor na biały).
    UWAGA: Każda tubka powinna mieć podobny granulat koralików na dole.
  6. Odpipetować zawieszony peptyd bezpośrednio na umyte kulki. Uważaj, aby nie dopuścić do powstania granulek (dodaj szybko, aby uniknąć wysuszenia koralików). Inkubować peptydy z kulkami w temperaturze 4 °C przez noc z mieszaniem.

4. Elucja peptydów związanych z kulkami przeciwciał

  1. Wirować próbki peptydów w temperaturze 2 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant zawierający niezwiązane peptydy i zachować do przyszłych doświadczeń, jeśli będzie to pożądane. Dodaj 1 ml zimnego buforu 1x IAP do kulek, aby umyć i wymieszać, odwracając 5x. Wirować w temperaturze 2 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C. Odessać roztwór IAP i powtórzyć etap prania IAP 1x, w sumie dwa prania.
  2. Dodaj 1 ml zimnej wody HPLC do kulek i wymieszaj, odwracając 5x. Wirować z prędkością 2 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C. Odessać wodę. Powtórz etap mycia wodą dwa razy, w sumie trzy prania. Wirować dodatkowo w temperaturze 2 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C, aby zebrać pozostałą wodę na dnie tuby. Odessać nadmiar wody, która mogła się zebrać, za pomocą końcówek ładujących żel z płaską końcówką. Uważaj, aby nie zasysać koralików.
  3. Dodaj 55 μl 0,15% kwasu trifluorooctowego w wodzie do kulek. Inkubuj kulki przez 10 minut w temperaturze pokojowej, od czasu do czasu stukając w spód probówki, aby wymieszać. Wiruj kulki w temperaturze pokojowej przez 30 sekund w miniaturowej wirówce. Usuń eluowane peptydy i odłóż na bok za pomocą płaskiej końcówki żelowej.
  4. Dodaj 45 μl 0,15% kwasu trifluorooctowego w wodzie do kulek. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, od czasu do czasu stukając w dno probówki, aby wymieszać. Wiruj kulki w temperaturze pokojowej przez 30 sekund w miniaturowej wirówce. Usunąć drugą elucję za pomocą końcówki z płaską końcówką do nakładania żelu i połączyć z pierwszą elucją.
  5. Wiruj połączone eluowane peptydy w temperaturze 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby osadzać wszelkie kulki, które się przenoszą. Przenieść roztwór próbki peptydów do nowej probówki o pojemności 500 μl.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

5. Odsalanie wzbogaconych peptydów

UWAGA: pH próbek powinno być mniejsze niż 4 dla optymalnego wiązania z końcówką zawierającą żywicę C18. Użyj końcówki do pipety o pojemności 10 μl zawierającej 0,6 μl żywicy C18 i pipety o pojemności 10 μl, aby kontrolować końcówkę.

  1. Wstępnie zwilż końcówkę C18, pipetując 10 μl acetonitrylu do końcówki. Dozuj acetonitryl do odpadów. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.
  2. Zrównoważyć końcówkę, przemłukując 3x 10 μl 0,2% kwasu mrówkowego w wodzie. Dozować roztwór do odpadów po każdym wyrównaniu.
  3. Załaduj peptydy z próbki na końcówkę, ciągle pipetując i dozując wzbogaconą próbkę peptydu za pomocą końcówki. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół co najmniej 20 razy i dozować pozostały roztwór z końcówki.
  4. Umyj końcówkę zawierającą związany peptyd 10 μl 0,2% kwasu mrówkowego w wodzie. Dozować roztwór do odpadów. Powtórz ten krok 9 razy.
  5. Wyeluj peptydy do nowej probówki, używając 10 μl buforu elucyjnego zawierającego 0,2% kwasu mrówkowego, 50% acetonitrylu i 49,8% wody. Kilkakrotnie odpipetować i dozować 10 μl roztworu do nowej probówki 15x. Powtórzyć ten etap z dodatkowymi 10 μl buforu elucyjnego, kilkakrotnie pipetując do tej samej probówki, co poprzednia elucja.
  6. Peptydy należy całkowicie wysuszyć w koncentratorze próżniowym (około 20 min). Ponownie zawiesić wysuszone peptydy w odpowiedniej objętości 0,2% kwasu mrówkowego w wodzie.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

6. Akwizycja danych za pomocą DDA i DIA

UWAGA: Analizuj próbki metodami DDA i DIA LC-MS/MS, które można dostosować w zależności od dostępnego instrumentu spektrometrii mas. W tym przypadku próbki analizowano przy użyciu systemu nano-LC 2D HPLC sprzężonego ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

  1. Użyj systemu HPLC w połączeniu z systemem HPLC opartym na chipie, bezpośrednio połączonym ze spektrometrem mas (można również użyć wielu konfiguracji i systemów LC-MS).
  2. Analiza próbek przy użyciu HPLC-ESI-MS/MS z odwróconymi fazami
    1. Po wstrzyknięciu przenieść mieszaniny peptydów na chip kolumny C18 i odsolić peptydy, przemłukując ruchomą fazą A w tempie 2 μl/min przez 10 minut. Następnie przenieś peptydy do kolumny analitycznej i eluuj z szybkością przepływu 300 nL/min z gradientem 2-3 godzinnym przy użyciu ruchomych faz A i B. W szczególności należy zastosować gradient liniowy od 5% fazy ruchomej B do 35% fazy ruchomej B przez 80 minut.
    2. Następnie zwiększ ruchomą fazę B do 80% w ciągu 5 minut, a następnie przytrzymaj 80% B przez 8 minut, a następnie wróć do 5% B na 25-minutową ponowną równowagę.
  3. Zbuduj metodę instrumentu MS dla DDA i zdefiniuj następujące eksperymenty skanowania instrumentu
    1. Eksperyment 1: Skan jonów prekursorowych MS1 z m/z 400-1,500 (czas akumulacji 250 ms). Ustaw próg intensywności, aby wyzwolić skanowanie MS/MS w poszukiwaniu stanów jonów ładunku od 2-5 do 200 zliczeń. Ustaw dynamiczne wyłączanie jonów prekursorowych na 60 s.
    2. Eksperyment 2: Skanowanie jonów produktu MS/MS z zakresem skanowania MS2 od m/z 100-1,500 (czas akumulacji 100 ms na każde skanowanie jonów 30 produktów na cykl). Ustaw rozrzut energii zderzenia na CES = 5, a następnie wybierz "tryb skanowania jonów produktu o wysokiej czułości".
      UWAGA: Metoda DDA uzyska widma MS/MS dla 30 najliczniejszych jonów prekursorowych po każdym skanowaniu MS1 na cykl, a całkowity czas cyklu wyniesie ~3,3 s. Akwizycje DDA zostaną wykorzystane do budowy bibliotek spektralnych, jak opisano w sekcji 7.
  4. Tworzenie metody instrumentu MS dla DIA i definiowanie następujących eksperymentów skanowania instrumentów.
    1. Eksperyment 1: wykonać skan jonów prekursorowych MS1 z m/z 400-1,250 (czas akumulacji 250 ms).
    2. Eksperyment 2: wykonaj skany jonów produktu MS/MS dla 64 zmiennych segmentów SWATH z zakresem skanowania MS2 od m/z 100-1,500 (czas akumulacji 45 ms na każdy skan jonów 64 produktów na cykl). Ustaw rozrzut energii zderzenia na CES = 10, a następnie wybierz "tryb skanowania jonów produktu o wysokiej czułości".
    3. Użyj strategii akwizycji DIA/SWATH o zmiennym oknie 64, zgodnie z opisem Schillinga i wsp.22, aby uzyskać kwantyfikację bez znaczników z całkowitym czasem cyklu ~3,2 s. Krótko mówiąc, w tej akwizycji, zamiast kwadrupola Q1 przesyłającego wąski zakres masy do komórki zderzeniowej, szersze okno o zmiennej szerokości okna (5 -90 m/z) jest przekazywane w krokach przyrostowych w pełnym zakresie mas (m/z 400 -1,250 przy 64 pokosach segmenty, każdy z czasem akumulacji 45 ms, co daje czas cyklu 3,2 s, który obejmuje jeden skan MS1 z czasem akumulacji 250 ms).
      UWAGA: Zmienna szerokość okna jest dostosowywana zgodnie ze złożonością typowego prądu jonowego MS1 obserwowanego w pewnym zakresie m/z za pomocą algorytmu kalkulatora zmiennego okna22 (węższe okna są wybierane w "zajętych" zakresach m/z, szerokie okna w zakresach m/z z niewielką ilością eluujących jonów prekursorowych). Na innych platformach instrumentów MS mogą być wdrażane inne strategie okien DIA.

7. Analiza danych

UWAGA: Niektóre ustawienia analizy danych powinny zostać zmienione i dostosowane do konkretnego eksperymentu. Na przykład wybrana baza danych białek (plik FASTA) zależy od gatunku, z którego przygotowano próbkę (w tym przypadku Mus musculus). Poniżej opisano analizę danych dla próbek mysich wzbogaconych o peptydy acetylowane i sukcynylowane.

  1. Skorzystaj z wyszukiwarki baz danych MS, aby przeanalizować akwizycje DDA. Utwórz metodę wyszukiwarki bazy danych w następujący sposób:
    1. Dla parametrów opisu próbki: wybierz "Identyfikacja" w sekcji Typ próbki, wybierz "Kwas jodooctowy" w sekcji "Alkilowanie cysteiny", wybierz "Trypsyna" w sekcji "Trawienie" (zakładając rozszczepienie C-końcowe na lizynie i argininie), wybierz "TripleTOF 6600" w sekcji Instrument, w sekcji Czynniki specjalne, sprawdź nacisk na acetylację i wzbogacenie sukcynylacji, a następnie wybierz Mus musculus w obszarze Gatunek.
    2. W polu Określone parametry przetwarzania: wybierz "Modyfikacje biologiczne" w obszarze ID Focus, wybierz "SwissProt" w obszarze Baza danych, zaznacz "Dokładny identyfikator" w obszarze Wysiłek wyszukiwania, wybierz "0,05 (10%)" w obszarze "Wykryty próg białka" i zaznacz "Uruchom analizę współczynnika fałszywych odkryć"" w sekcji "Jakość wyników". Zapisz metodę wyszukiwarki i prześlij surowe pliki spektrometrii mas do przetworzenia przez wyszukiwarkę bazy danych przy użyciu wygenerowanej metody.
      UWAGA: W procesie iteracyjnym wszystkie skany MS i MS/MS są automatycznie ponownie kalibrowane przez wyszukiwarkę na podstawie początkowych adnotacji i wyników.
  2. Kliknij "Eksportuj podsumowanie peptydów" po zakończeniu wyszukiwania i przefiltruj wszystkie wyniki identyfikacji peptydów według "progu ufności" 99 w oprogramowaniu arkusza kalkulacyjnego (np. Excel; wskaźnik fałszywych wykryć [FDR] wynoszący 1%).
  3. W pliku arkusza kalkulacyjnego "Peptide Summary" przefiltruj wszystkie peptydy, które zawierają adnotację PTM "acetylacja" i "sukcynylacja" w kolumnie modyfikacji, aby wygenerować raport z wynikami przedstawiający wyłącznie acylowane peptydy i odpowiadające im białka.
  4. Aby zbudować biblioteki spektralne MS/MS do dalszego przetwarzania surowego pliku DIA i dalszej względnej kwantyfikacji, otwórz oprogramowanie do analizy ilościowej DIA. Wybierz zakładkę "Biblioteka", a następnie (na dole strony) kliknij "Generuj bibliotekę spektralną" z "Wyszukiwarki baz danych" i otwórz raport FDR wyszukiwarki baz danych (plik *FDR.xlsx), który został automatycznie wygenerowany w ramach procesu przeszukiwania bazy danych plików surowych DDA. Następnie kliknij "dalej" i wybierz "Schemat ustawień biblioteki" i "dalej". Wybierz "Uniprot_mouse_proteome" jako bazę danych, a następnie kliknij "dalej" i "goa_mouse" jako plik adnotacji genów (ontologii). Na koniec kliknij "zakończ", a biblioteka spektralna zostanie wygenerowana.
    UWAGA: Informacje o acetylowanych i sukcynylowanych peptydach z plików surowych danych DDA, skany jonów prekursorowych z MS1 i skany jonów fragmentacyjnych z MS2 zostaną uwzględnione w bibliotekach spektralnych (obejmuje to czas retencji, wzór fragmentacji MS/MS itp.).
  5. Użyj oprogramowania do ilościowej analizy proteomicznej DIA, aby przeprowadzić względną kwantyfikację poziomów acetylacji i sukcynylacji oraz utworzyć arkusze kalkulacyjne potencjalnych peptydów zawierających PTM, które można wykorzystać do dalszej analizy danych.
    1. Aby przeanalizować i określić ilościowo peptydy zawierające PTM, otwórz oprogramowanie do analizy ilościowej DIA, użyj schematu analizy szablonu. Schemat szablonu jest dostępny w oprogramowaniu po wybraniu opcji "Perspektywa ustawień" | "Analiza DIA" | "BGS PTM" (znaczące lub nieliczne, w zależności od eksperymentu).
      UWAGA: Zamiast korzystać z szablonu analizy BGS PTM w oprogramowaniu do analizy ilościowej DIA, wszystkie ustawienia specyficzne dla PTM można również skonfigurować ręcznie, postępując zgodnie z poniższymi instrukcjami: 1) w sekcji "identyfikacja" wybierz "Lokalizacja PTM" (granica prawdopodobieństwa = 0,75); 2) W polu "Kwantyfikacja" wybierz "Grupowanie mniejszych peptydów" | "zmodyfikowana sekwencja"; oraz 3) w sekcji "Analiza końcowa" wybierz "Grupowanie liczebności różnicowej" | "grupa mniejsza" (ustawienia kwantyfikacji). Te ustawienia aktywują funkcję lokalizacji PTM, dzięki czemu zmodyfikowane peptydy są wymieniane jako indywidualne wpisy, a analiza różnicowa jest wykonywana na poziomie peptydów.
    2. Aby rozpocząć analizę ilościową, wybierz zakładkę "Rurociąg", a następnie kliknij "Skonfiguruj analizę DIA z pliku", otwórz interesujące Cię pliki MS DIA w celu względnej oceny ilościowej. Wybierz "Przypisz bibliotekę spektralną" i wybierz bibliotekę, która została zbudowana powyżej, kliknij "załaduj" | "Następny". Wybierz schemat analizy "BGS PTMS" i kliknij "dalej". Wybierz odpowiedni plik bazy danych FASTA "Uniprot_mouse_proteome" | "Następny". Zdefiniuj konfigurację warunków, która przypisuje różne warunki do próbek, a następnie kliknij "dalej". Wybierz "goa_mouse" jako plik adnotacji genów (ontologii) i kliknij "dalej". Przejrzyj przegląd analizy (podsumowanie konfiguracji eksperymentu) i wybierz "katalog wyjściowy" | "Koniec". Na koniec kliknij "Uruchom potok", aby przeprowadzić analizę ilościową bez etykiet.
      UWAGA: Moduły statystyczne w oprogramowaniu do analizy ilościowej DIA automatycznie przeprowadzają analizę FDR, generują mapy cieplne i wykresy wulkanów porównujące różne warunki, generują listy zidentyfikowanych i ilościowo oznaczonych peptydów i białek oraz dostarczają wartości Q wraz ze względnymi zmianami fałdowania porównującymi różne warunki.
  6. Alternatywnie należy użyć oprogramowania do usuwania zakłóceń zbiorów danych DIA do przetwarzania danych i przeprowadzania analizy statystycznej po wyeksportowaniu wyekstrahowanych obszarów pików dla miejsc acetylacji i sukcynylacji.

8. Wizualizacja danych zmodyfikowanych peptydów i ocena lokalizacji miejsca PTM

  1. Aby otworzyć wygenerowaną analizę ilościową DIA, wybierz zakładkę "Analiza", a następnie "załaduj eksperyment oprogramowania do analizy ilościowej" (z zapisanego eksperymentu, otwierając *. Plik SNE). Przejdź do *. SNE z wynikami i wybierz "otwórz".
  2. W lewym panelu kliknij strzałkę po lewej stronie trzeciego pliku *.wiff z surowymi danymi od góry, aby rozwinąć i zwizualizować wszystkie 64 segmenty SWATH. Kliknij strzałkę po lewej stronie segmentu [428.7-437.3], aby rozwinąć określony segment i wyświetlić zmodyfikowane peptydy zidentyfikowane dla tego zakresu mas. Kliknij na potrójnie naładowany peptyd KQYGEAFEK[Acetyl]R.
    UWAGA: Domyślnie prawy górny panel zazwyczaj wyświetla MS2 XIC, a dolny panel wyświetla MS1 Isotope Envelope XIC
    1. W górnym panelu wybierz "Wykres lokalizacji PTM". W dolnym panelu wybierz "Wykres lokalizacji PTM".
    2. Na wykresie lokalizacji PTM wybierz górną sekwencję peptydową "KQYGEAFEK[Acetyl]R" z całkowitym wynikiem lokalizacji PTM wynoszącym 18,32. Kliknij strzałkę po lewej stronie, aby rozwinąć widok i zwizualizować jony potwierdzające i obalające. Kliknij strzałkę obok "Jony potwierdzające", a następnie wybierz jon "y3 [+42]", aby podświetlić ten konkretny jon, co potwierdza, że miejsce acetylacji znajduje się na K2 sekwencji peptydowej.
    3. Na wykresie lokalizacji PTM wybierz drugą sekwencję peptydową "K[Acetyl]QYGEAFEKR" z całkowitym (bardzo niskim) wynikiem lokalizacji PTM wynoszącym 1. Kliknij strzałkę po lewej stronie, aby rozwinąć widok i zwizualizować jony potwierdzające i obalające. Kliknij strzałkę obok "Jony potwierdzające", a następnie strzałkę obok "Jony obalające", a następnie wybierz jony fragmentacyjne, aby zobrazować i ocenić wyekstrahowany chromatogram jonowy i widma MS/MS (Rysunek 5).
      UWAGA: Przypisana ocena lokalizacji PTM i oględziny wskazują, że prawidłowym izomerem PTM jest KQYGEAFEK[Acetyl]R, podczas gdy nie ma żadnych lub istnieją minimalne dowody na inny możliwy izomer PTM K[Acetyl]QYGEAFEKR.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazuje ogólny schemat przepływu pracy, w tym pobieranie tkanki z wątroby myszy, użycie 1 mg białka do trawienia lizatu białkowego za pomocą trypsyny, inkubację peptydów z kulkami sprzężonymi z przeciwciałami, pobieranie próbek na MS, a na końcu przeprowadzenie analizy danych metodą DIA/SWATH przy użyciu różnych pakietów oprogramowania do proteomiki ilościowej (akademickiej i komercyjnej).

Rysunek 2A pokazuje, jak przebieg pracy oraz wymagane ilości próbki i białka w porównaniu z alternatywnymi metodami stosowanymi obecnie do badań nad wzbogacaniem wielu PTM. Metodę jednodoniczkową można przeprowadzić w o połowę krótszym czasie i przy o połowę mniejszej liczbie próbek niż te alternatywne metody. W porównaniu z metodą wzbogacania dwoma pojedynczymi PTM, protokół jednodoniczkowy wymaga również o połowę mniejszej ilości białka.

Wykazano, że ten protokół jest realną i opłacalną alternatywą. Rysunek 2B pokazuje, że mediana współczynnika zmienności (CV) dla zmodyfikowanych obszarów peptydowych była niższa w metodzie jednogarnkowej niż w wzbogaceniach pojedynczych PTM i szeregowych PTM. Rysunek 2C,D pokazuje, że porównując metody wzbogacania PTM w jednym i pojedynczym PTM, nie zaobserwowano żadnych godnych uwagi różnic między korelacjami kwantyfikacji na poziomie miejsca dla tych dwóch modyfikacji. Dotyczyło to również korelacji na poziomie peptydu i fragmentu. Ta sama obserwacja dotyczyła wszystkich trzech korelacji, gdy porównano wzbogacenia jednogarnkowe i szeregowe PTM. Wszystkie podstawowe surowe dane MS i przetworzone arkusze wyników Excela powiązane z ostatnim raportem Basisty et al.14 są dostępne i można je pobrać z MassIVE (MSV00081906) i ProteomeXchange (PXD008640).

Ogólnie, podczas gdy strategie wzbogacania przeciwciał mogą wykazywać pewne ograniczenia, takie jak potencjalna okluzja epitopów lub ograniczona swoistość, przeciwciała użyte w tym badaniu są mieszaninami niezależnie generowanych klonów, a zatem zapewniają szerszy zakres specyficzności.

Wyniki eksperymentów dokumentują możliwość wykrycia i oceny przesłuchów PTM. Rysunek 3 wyświetla dane z udanego wzbogacenia i ilustruje przykład peptydu zawierającego wiele różnych modyfikacji acylowych, wizualizując przesłuchy PTM. Rysunek 3A pokazuje peptyd, który jest acetylowany na jednej reszcie lizyny i sukcynylowany na drugiej, a Rysunek 3B pokazuje ten sam peptyd sukcynylowany na obu lizynach. Pokazuje to, że ta sama reszta lizyny może być modyfikowana za pomocą obu grup acylacyjnych i istnieje możliwość wystąpienia przesłuchów w tym miejscu. Rysunek 4 pokazuje liczbę reszt lizyny, które zostały zidentyfikowane zgodnie z opisem w sekcjach 7.1-7.3 w celu przeprowadzenia obu modyfikacji, wskazując również na możliwe przesłuchy PTM.

Jak pokazuje Rysunek 5 pokazuje, przetwarzanie zestawów danych DIA PTM za pomocą ilościowego oprogramowania proteomicznego pozwala nam określić, które konkretne reszty lizyny są modyfikowane. Jest to koncepcja znana jako lokalizacja lokalizacji, która jest niezbędnym krokiem dla każdej analizy w celu określenia możliwego przesłuchu PTM. Rysunek 5 pokazuje dwie potencjalne izoformy wraz z jonami potwierdzającymi i obalającymi dla każdej z nich, które mogą być wizualizowane i oceniane zgodnie z opisem w sekcjach 8.1-8.3 (konkretnie kroki 8.3.2 i 8.3.3). Na podstawie tych informacji byliśmy w stanie z całą pewnością zidentyfikować, która z dwóch izoform była obecna w oryginalnej próbce. Widmo MS/MS potwierdzonej izoformy KQYGEAFEKacR wyraźnie pokazuje, że jony y (y2-y 5) zawierające acetylowaną resztę lizyny, które przesunęły się o 42 m/z (masa przyrostowa grupy acetylowej), potwierdziły specyficzną resztę lizyny w zmodyfikowanym peptydzie.

figure-results-1
Rysunek 1: Typowy przepływ pracy dla jednoetapowego wzbogacania PTM. Tkanki (w tym przypadku wątroby) są zbierane od myszy SIRT5 KO i myszy typu dzikiego (WT), a białka są poddawane lizie, trawieniu trypsyny do peptydów i odsalaniu. Peptydy są następnie wzbogacane o powinowactwo immunologiczne za pomocą kombinacji kulek przeciwciał sukcynylowych i acetylowych. Równoległe przepływy pracy MS mierzą zarówno 1) małe podwielokrotności zmian ekspresji białka całego lizatu (w celu normalizacji białek), jak i 2) wzbogacone peptydy zawierające acyl w celu identyfikacji miejsca acylacji (DDA-MS) i lokalizacji miejsca, a następnie kwantyfikacji (DIA-MS). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Porównanie przepływu pracy w jednym puli z metodami alternatywnymi. (A) Porównanie czasu, kosztów i materiałów wymaganych do jednogarnkowego przepływu pracy, seryjnego wzbogacania PTM i dwóch pojedynczych wzbogaceń PTM. (B) Porównanie CV między przepływem pracy w jednym garnku, wzbogacaniem PTM w mono acetylolizynę i wzbogacaniem PTM w postaci pojedynczej sukcynylolizyny. Analiza korelacji Spearmana porównująca obszary pików peptydu acylowego uzyskane z przepływu pracy w jednym garnku oraz wzbogacenia pojedynczym PTM: odpowiednie wykresy wyników obszaru piku log2 dla miejsc acetylacji (C) i (D) miejsc sukcynylacji. Nachylenia regresji i współczynniki korelacji są wskazane w poszczególnych panelach14. Dla każdego z warunków przetworzono dwie niezależne repliki biologiczne. Ten rysunek został zmodyfikowany z Basisty et al.14. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Przesłuch między modyfikacjami acetylacji i sukcynylacji reszt lizyny. Widma MS / MS peptydów tryptycznych z mitochondrialnej tiolazy 3-ketoacylo-CoA, które wykazują tę samą sekwencję aminokwasów, ale zostały zmodyfikowane przy dwóch resztach lizyny z różnymi PTM. (A) MS / MS peptydu AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKacK i (B) MS / MS peptydu AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKsuccK. Ten rysunek został zmodyfikowany z Basisty et al.14. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Nakładanie się i przesłuchy między acetylowanymi i sukcynylowanymi resztami lizyny – specyficzne przykłady w kompleksach białkowych. (A) Diagram Venna przedstawiający nakładanie się 2 235 miejsc acetylacji i 2 173 sukcynylacji. Spośród nich 943 miejsca były zarówno acetylowane, jak i sukcynylowane. Przeanalizowano wątrobę myszy z nokautem SIRT5 (de-sukcynylazy) i zidentyfikowano wiele miejsc sukcynylacji. W rzeczywistości były one bardziej obfite niż zwykle obserwowane w wątrobie myszy (zmodyfikowane peptydy filtrowano przy wartości Q <0,05). (B) Kompleksy białkowe pokazujące procent ich podjednostek zawierających zarówno miejsca acetylowane, jak i sukcynylowane (pogrubiona czerwona linia reprezentuje znaczenie określone dokładnym testem Fishera). (C) Schemat kompleksu syntazy ATP: podjednostki białkowe w kolorze czerwonym przedstawiają podjednostki, które zawierają zarówno miejsca acetylowane, jak i sukcynylowane. Ten rysunek został zmodyfikowany z Basisty et al.14. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Oprogramowanie do proteomiki ilościowej rozszyfrowuje lokalizację miejsc peptydowych PTM. Na podstawie fragmentacji peptydu MS/MS możliwe jest dostarczenie informacji o specyficznej resztie lizyny, którą modyfikuje grupa acetylowa. Pokazuje to zdolność oprogramowania do dostarczania cennych informacji na temat lokalizacji PTM. (A) Dwie możliwości modyfikacji pozostałości lizyny i lokalizacji miejsca PTM: KQYGEAFEKacR (po lewej) i KacQYGEAFEKR (po prawej). "Potwierdzające" i "obalające" jony fragmentacyjne są pokazane dla każdej z izoform potencjalnej lokalizacji miejsca peptydu. Na podstawie tych informacji przypisuje się wyniki potwierdzające i obalające wyniki, potwierdzające obecność izoformy KQYGEAFEKacR w próbce. (B) Widmo MS/MS odpowiadające potwierdzonej izoformie KQYGEAFEKacR wskazujące, że wszystkie jony y, w tym acetylowana reszta lizyny (y2 i wyższe) mają masę przyrostową +42 m/z, co odpowiada modyfikacji acetylu. Obserwowane jony b nie zawierają modyfikacji. (C) Wyekstrahowany chromatogram jonowy (XIC) z obfitymi obszarami pików wynikającymi z jonów y2 iy 3, z których oba tworzą miejsce acetylacji w potwierdzonej izoformie KQYGEAFEKacR. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje nowatorską technikę jednoczesnego wielokrotnego wzbogacania PTM w celu skuteczniejszego zrozumienia przesłuchów PTM. Alternatywne metody osiągnięcia tego celu są zwykle zbyt czasochłonne i kosztowne, a do ich powodzenia potrzebne są duże ilości białka11,13. Protokół ten przedstawia przepływ pracy wzbogacania wielu PTM, który obejmuje inkubację w kulkach sprzężonych z przeciwciałami dla dwóch PTM jednocześnie w celu poprawy ogólnej wydajności eksperymentu. Metoda ta obejmuje również wykorzystanie DDA do generowania biblioteki spektralnej i akwizycji DIA MS w celu wykrycia i ilościowego określenia peptydów obecnych ze zmniejszoną interferencją jonów fragmentacyjnych22,23. Oprogramowanie, takie jak wyszukiwarki baz danych MS, jest wykorzystywane do analizy i ilościowego określania danych pochodzących z akwizycji DDA, podczas gdy oprogramowanie Quantitative ProteomicsSoftware 24 i specjalne oprogramowanie do analizy ilościowej DIA25 są niezbędne do interpretacji złożonych widm wytwarzanych przez akwizycje DIA.

W ramach tego protokołu istnieje kilka krytycznych kroków, których należy uważnie przestrzegać. Ponieważ głównym celem protokołu jest wzbogacenie wielu PTM jednocześnie, etap wzbogacania powinowactwa przeciwciał (sekcja 2) ma kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Podczas wykonywania prania na koralikach należy upewnić się, że żaden z koralików nie został przypadkowo zassany. Konieczne jest również upewnienie się, że stężenie mocznika zostało rozcieńczone do 1 M przed trawieniem trypsyną (krok 1.8). Chociaż 8 M mocznik jest wymagany wcześniej w protokole do rozpuszczania białek, stężenia mocznika powyżej 1 M będą hamować aktywność enzymatyczną trypsyny. Ponadto ważne jest, aby konsekwentnie sprawdzać pH próbki przez cały czas trwania protokołu. Jest to szczególnie ważne przed trawieniem. Jeśli pH próbki i roztworu trypsyny nie zostaną odpowiednio zneutralizowane przed inkubacją, może to spowodować nieefektywne trawienie, w którym wiele miejsc rozszczepienia może zostać pominiętych, co skutkuje mniejszą liczbą identyfikacji peptydów.

Kilka modyfikacji protokołu może być pomocnych przy przygotowywaniu próbek. W przypadku lizatu białkowego uzyskanego z 1 mg materiału wyjściowego, jedną czwartą kulek przeciwciał znajdujących się w każdej probówce skanującej PTM można zastosować jako opłacalną alternatywę. Aby uzyskać lepsze wyniki, można użyć większej ilości materiału wyjściowego, o ile ilość użytych kulek przeciwciał zostanie proporcjonalnie zwiększona. Inną modyfikacją, która może usprawnić przepływ pracy, jest trawienie próbek z inną proteazą oprócz trypsyny. Ta modyfikacja spowodowałaby większą zmienność rozszczepionych peptydów, zapewniając zwiększone pokrycie reszt białkowych. Chociaż nie jest to konieczne, zaleca się, aby trypsyna była jednym z enzymów stosowanych do analizy PTM ze względu na jej wysoką specyficzność łupliwości26.

Ograniczeniem tego protokołu jest to, że badane PTM muszą mieć podobny skład chemiczny, aby mogły być jednocześnie wzbogacane14. Procedury dla różnych kulek sprzężonych z przeciwciałami muszą być podobne, przy użyciu podobnych rozpuszczalników i roztworów, w tym podobnych warunków elucji, i najlepiej od tego samego dostawcy. Z tego powodu opisana tutaj metoda konsekwentnie wykorzystuje acetylację i sukcynylację jako przykład, z których obie wykorzystują kulki sprzężone z przeciwciałami (Cell Signaling Technology, Inc). Chociaż metoda ta może być teoretycznie zastosowana do dowolnej liczby PTM, potrzebne byłyby dodatkowe badania, aby ocenić dokładne ograniczenie protokołu w tym zakresie. Ponadto, ponieważ jest to metoda wzbogacania oparta na przeciwciałach, metoda ta może zapewnić jedynie względną kwantyfikację miejsc PTM.

W porównaniu z istniejącymi metodami wzbogacania wielu PTM, ten przepływ pracy jest bardziej wykonalną i opłacalną alternatywą. W tym eksperymencie zaobserwowano, że skuteczność tej metody bardzo dobrze wypada w porównaniu z metodami alternatywnymi, takimi jak wzbogacanie indywidualne lub seryjne. Rysunek 2B pokazuje, że mediana CV dla zmodyfikowanych obszarów pików peptydowych była w rzeczywistości zmniejszona w metodzie jednogarnkowej w porównaniu ze wzbogaceniami pojedynczym PTM i szeregowymi wzbogaceniami PTM13. Następnie przeanalizowaliśmy wyniki eksperymentalne, oceniając kwantyfikacje na poziomie miejsca dla acetylacji lub sukcynylacji. Ponadto analiza korelacji Spearmana (rysunek 2C,D) wykazała, że jednoetapowe wzbogacanie PTM działało podobnie do przepływów pracy wzbogacania jednoetapowego. Dotyczyło to również korelacji na poziomie peptydów i fragmentów. Ta sama obserwacja dotyczyła wszystkich trzech korelacji, gdy porównano wzbogacenie jednogarnkowe z szeregowym PTM.

Protokół ten pozwala naukowcom na uzyskanie fascynujących biologicznych spostrzeżeń na temat przesłuchów PTM w szybki i opłacalny sposób. Komponent DIA przepływu pracy pozwala naukowcom lepiej zrozumieć PTM, ponieważ dostarcza informacji o lokalizacji lokalizacji i pokonuje wyzwania, takie jak niskie obłożenie PTM. Jony prekursorowe są zwykle wykluczane za pomocą DDA, co jest szczególnie ważne podczas badania PTM, ponieważ zajętość miejsca jest często niska do punktu, w którym peptydy te nie są wybierane do SM/MS, ale nadal zawierają kluczowe informacje. Można przeprowadzić dalsze eksperymenty w celu oceny górnej granicy liczby PTM, które można jednocześnie wzbogacić przy użyciu tej metody. Przyszłe usprawnienie tego przepływu pracy może obejmować opracowanie bardziej zaawansowanych platform oprogramowania w celu dalszej automatyzacji analizy lokalizacji lokalizacji i zajętości lokalizacji PTM.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy za wsparcie ze strony NIH shared instrumentation grant dla systemu TripleTOF w Buck Institute (1S10 OD016281). Prace te były również wspierane przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (R01 AI108255 do B.S.) oraz Narodowy Instytut Cukrzycy i Chorób Trawiennych i Nerek (R24 DK085610 do Erica Verdina; R01 DK090242 do Erica Goetzmana). X.X. był wspierany przez grant z National Institutes of Health (grant NIH T32GM8806, dla Judith Campisi i Lisy Ellerby), N.B. był wspierany przez stypendium podoktorskie z Glenn Foundation for Medical Research.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 M Bufor biowęglanu trietyloamonu (TEAB)Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USAT7408
Acetonitryl, Burdick i Jackson LC-MS klasyBurdick and Jackson, Muskegon, MI, USA36XL66
Bioruptor sonikatorDiagenode, Denville, NJ, USAB01020001
Układ przedkolumnowy C18 (200 &mikro; m x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A)SCIEX, Framingham, MA, USA5015841
C18-CL (75 µ m x 15 cm ChromXP, 3 i mikro; m, 300 & Aring ;)SCIEX, Framingham, MA, Stany Zjednoczone804-00001
Dithiothreitol (DTT)Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Stany ZjednoczoneD9779-5G
Eppendorf Thermomixer CompactEppendorf AG, Hamburg, NiemcyT1317-1EA
Probówka Eppendorf (2.0 ml Safelock)Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy22363352
Kwas mrówkowySigma Aldrich, St. Louis, MO, Stany ZjednoczoneF0507-500ML
Indeksowany standard peptydu normalizującego czas retencji (iRT)Biognosys AG, Schlieren, Zurych, SzwajcariaKi-3002-2
Jodoacetamid (IAA)Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USAI1149-25G
mapDialinksoftware do usuwania zakłóceń z zestawów danych DIA
Metanol, Burdick i Jackson LC-MS klasyBurdick and Jackson, Muskegon, MI, Stany ZjednoczoneBJLC230-4
Dystrybutor wody ultraczystej PURELAB flex 1VWR International, Radnor, PA, USA89204-088
mProphet w Skylinewłączony do Skylinezintegrowane algorytmy statystyczne do ocen FDR
Wkłady Oasis HLB SPEWaters Corp., Milford, MA, USAWAT094225wkłady do odsalania lizatów białkowych, do 50 mg materiału
Roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanamiLife Technologies10010023
Test Pierce BCAThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA23225
ProteinPilot 5.0 - 'Wyszukiwarka baz danych MS'SCIEX, Framingham, MA, USApobieranie oprogramowania SCIEXMS Wyszukiwarka baz danych
PTMScan Motyw sukcynylo-lizynowy [Succ-K] Zestaw #13764Sygnalizacja komórkowa Technologia13764kulki przeciwciał do wzbogacania powinowactwa
PTMScan Motyw acetylo-lizyny [Ac-K] Zestaw #13416Technologia sygnalizacji komórkowej13416kulki przeciwciał do wzbogacania powinowactwa
Liofilizowana trypsyna klasy sekwencjonowaniaLife Technologies23225
Skyline - "Ilościowe oprogramowanie proteomiczne"Laboratorium MacCoss (akademickie)oprogramowanieopen sourceOprogramowanie do proteomiki ilościowej (akademickie)
Spectronaut - 'Oprogramowanie do analizy ilościowejDIA'Biognosys AG, Schlieren, Zurych, SzwajcariaDIA SW-3001/ lokalizacja na miejscu PTM
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Koncentrator SpeedvacThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USASPD131DDA-115przyrząd do koncentracji cieczy próbek
TissueLyser IIQiagen, Hilden, Niemcy85300przyrząd do efektywnej lizy tkanek
Kwas trifluorooctowy (TFA)Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USAT6508-1L
TripleTOF 6600: ortoganol kwadrupolowy spektrometr masowy czasu przelotu (QqTOF)SCIEX, Framingham, MA, USANa wycenęspektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości
System Ultra Plus nano-LC 2D HPLCSCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USAModel #845chromatograficzny system
separacji MocznikThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAPI29700
Water, Burdick and Jackson LC-MSBurdick and Jackson, Muskegon, MI, USA600-30-76
Końcówki do pipet ZipTip C18, P10Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRLZTC18S096Końcówki C-18 obciążone żywicą do odsalania mieszanin peptydowych
web Oprogramowanie do analizy ilościowej

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Christensen, D. G., et al. Post-translational Protein Acetylation: An Elegant Mechanism for Bacteria to Dynamically Regulate Metabolic Functions. Frontiers in Microbiology. 10, 1604(2019).
  2. Deribe, Y. L., Pawson, T., Dikic, I. Post-translational modifications in signal integration. Nature Structural Molecular Biology. 17 (6), 666-672 (2010).
  3. Sadoul, K., Boyault, C., Pabion, M., Khochbin, S. Regulation of protein turnover by acetyltransferases and deacetylases. Biochimie. 90 (2), 306-312 (2008).
  4. Swaney, D. L., et al. Global analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk in protein degradation. Nature Methods. 10 (7), 676-682 (2013).
  5. Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 596-601 (2000).
  6. Grunstein, M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature. 389 (6649), 349-352 (1997).
  7. Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms. Genes and Development. 12 (5), 599-606 (1998).
  8. Mocciaro, A., Rape, M. Emerging regulatory mechanisms in ubiquitin-dependent cell cycle control. Journal of Cell Sciences. 125 (Pt 2), 255-263 (2012).
  9. Lopez-Otin, C., Hunter, T. The regulatory crosstalk between kinases and proteases in cancer. Nature Reviews in Cancer. 10 (4), 278-292 (2010).
  10. Du, Z., et al. DNMT1 stability is regulated by proteins coordinating deubiquitination and acetylation-driven ubiquitination. Science Signalling. 3 (146), (2010).
  11. McManus, F. P., Lamoliatte, F., Thibault, P. Identification of cross talk between SUMOylation and ubiquitylation using a sequential peptide immunopurification approach. Nature Protocols. 12 (11), 2342-2358 (2017).
  12. Venne, A. S., Kollipara, L., Zahedi, R. P. The next level of complexity: crosstalk of posttranslational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 513-524 (2014).
  13. Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of post-translational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2013).
  14. Basisty, N., Meyer, J. G., Wei, L., Gibson, B. W., Schilling, B. Simultaneous Quantification of the Acetylome and Succinylome by 'One-Pot' Affinity Enrichment. Proteomics. 18 (17), e1800123(2018).
  15. Wang, G., et al. Regulation of UCP1 and Mitochondrial Metabolism in Brown Adipose Tissue by Reversible Succinylation. Molecular Cell. 74 (4), 844-857 (2019).
  16. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
  17. Rardin, M. J., et al. Label-free quantitative proteomics of the lysine acetylome in mitochondria identifies substrates of SIRT3 in metabolic pathways. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 110 (16), 6601-6606 (2013).
  18. Rardin, M. J., et al. SIRT5 regulates the mitochondrial lysine succinylome and metabolic networks. Cell Metabolism. 18 (6), 920-933 (2013).
  19. Carrico, C., Meyer, J. G., He, W., Gibson, B. W., Verdin, E. The Mitochondrial Acylome Emerges: Proteomics, Regulation by Sirtuins, and Metabolic and Disease Implications. Cell Metabolism. 27 (3), 497-512 (2018).
  20. Sadhukhan, S., et al. Metabolomics-assisted proteomics identifies succinylation and SIRT5 as important regulators of cardiac function. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 113 (16), 4320-4325 (2016).
  21. Collins, B. C., et al. Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry. Nature Communications. 8 (1), 291(2017).
  22. Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. Generation of High-Quality SWATH((R)) Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF((R)) Mass Spectrometers. Methods in Molecular Biology. 1550, 223-233 (2017).
  23. Meyer, J. G., Schilling, B. Clinical applications of quantitative proteomics using targeted and untargeted data-independent acquisition techniques. Expert Reviews in Proteomics. 14 (5), 419-429 (2017).
  24. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  25. Sticker, A., Martens, L., Clement, L. Mass spectrometrists should search for all peptides, but assess only the ones they care about. Nature Methods. 14 (7), 643-644 (2017).
  26. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular Cell Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Post Translational ModificationsSimultaneous EnrichmentAcetylation SuccinylationData Independent AcquisitionMass SpectrometryAntibody BeadsPeptide ElutionSite LocalizationPTM CrosstalkMouse Liver Lysate

Related Articles