Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przedkliniczna ocena elektrofizjologii serca za pomocą optycznego mapowania dwunapięciowego i wapniowego ludzkich organotypowych wycinków serca

10.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60781

⸱

16 czerwca 2020

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, The George Washington University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje procedurę cięcia i hodowli ludzkich wycinków serca do przedklinicznych testów leków oraz szczegółowo opisuje użycie mapowania optycznego do jednoczesnego rejestrowania napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych sygnałów wapnia z tych wycinków.

Streszczenie

Preparaty do badań nad ludzkim sercem zostały ostatnio opracowane jako platforma do badań fizjologii człowieka i testowania terapii, aby wypełnić lukę między badaniami na zwierzętach a badaniami klinicznymi. Do zbadania działania leków wykorzystano liczne modele zwierzęce i komórkowe, jednak reakcje te często różnią się u ludzi. Plastry ludzkiego serca mają przewagę w testach narkotykowych, ponieważ pochodzą bezpośrednio z żywotnych ludzkich serc. Oprócz zachowanych struktur wielokomórkowych, sprzężenia komórka-komórka i środowiska macierzy zewnątrzkomórkowej, wycinki ludzkiej tkanki serca mogą być używane do bezpośredniego testowania wpływu niezliczonych leków na fizjologię serca dorosłego człowieka. To, co odróżnia ten model od innych preparatów na serce, takich jak całe serca czy kliny, to fakt, że plastry można poddawać długotrwałej hodowli. W związku z tym plastry serca pozwalają na badanie zarówno ostrych, jak i przewlekłych skutków leków. Co więcej, możliwość zebrania od kilkuset do tysiąca wycinków z jednego serca sprawia, że jest to model o wysokiej przepustowości do testowania kilku leków w różnych stężeniach i kombinacjach z innymi lekami w tym samym czasie. Plastry można przygotować z dowolnego obszaru serca. W tym protokole opisujemy przygotowanie plastrów lewej komory poprzez wyizolowanie kostek tkankowych z wolnej ściany lewej komory i podzielenie ich na plasterki za pomocą precyzyjnego mikrotomu wibracyjnego. Plastry te można następnie poddać ostrym eksperymentom w celu zmierzenia wyjściowej funkcji elektrofizjologicznej serca lub wyhodować do badań nad lekami przewlekłymi. Protokół ten opisuje również podwójne mapowanie optyczne wycinków serca w celu jednoczesnego rejestrowania potencjałów transbłonowych i wewnątrzkomórkowej dynamiki wapnia w celu określenia skutków badanych leków.

Wprowadzenie

Modele zwierzęce były cennym narzędziem używanym do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw ludzkiej fizjologii i patofizjologii, a także platformą do wstępnego testowania terapii różnych chorób1. Na podstawie tych badań na zwierzętach poczyniono wielkie postępy w dziedzinie badań biomedycznych2. Istnieją jednak znaczące różnice międzygatunkowe między fizjologią ludzi i zwierząt, w tym myszy, szczurów, świnek morskich, królików, owiec, świń i psów3,4. W rezultacie, istnieje wiele terapii lekowych, genowych i komórkowych, które okazały się obiecujące na etapie testów na zwierzętach, ale nie osiągnęły wyników w badaniach klinicznych5. Aby wypełnić tę lukę, opracowano izolowane miocyty serca i ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) jako modele do testowania reakcji ludzkiej fizjologii na różne leki i choroby6. Kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych są szeroko stosowane w systemach typu organ-on-a-chip jako substytut serca6,7,8. Jednak przydatność kardiomiocytów pochodzących z iPSC (iPSC-CM) jest utrudniona przez ich stosunkowo niedojrzały fenotyp i brak reprezentacji subpopulacji kardiomiocytów; Dojrzały mięsień sercowy to złożona struktura składająca się z kilku współistniejących typów komórek, takich jak fibroblasty, neurony, makrofagi i komórki śródbłonka. Z drugiej strony, izolowane ludzkie kardiomiocyty są elektrycznie dojrzałe, a różne subpopulacje kardiomiocytów można uzyskać, zmieniając parametry hodowli9. Mimo to miocyty te na ogół wykazują zmienioną morfologię potencjału czynnościowego z powodu braku sprzężenia komórka-komórka, szybkiego odróżnicowania i występowania zachowań proarytmicznych in vitro10,11. Niektóre z tych ograniczeń zostały rozwiązane za pomocą modeli hodowli komórkowych 3D iPSC-CM i miocytów serca. Modele te, które obejmują sferoidy, hodowle 3D w kapsułkach z rusztowaniami hydrożelowymi, zmodyfikowane tkanki serca (EHT) i systemy serca na chipie, wykorzystują wiele populacji komórek serca, takich jak kardiomiocyty, fibroblasty i komórki śródbłonka. Albo same się organizują, albo montują wzdłuż rusztowania, tworząc struktury 3D, a niektóre nawet odtwarzają złożoną anizotropową naturę mięśnia sercowego. Doniesiono, że modele te mają komórki o dojrzałych fenotypach, właściwościach kurczliwych i profilach molekularnych podobnych do tkanki serca. System Heart-on-a-Chip pozwala również na badanie skutków ogólnoustrojowych w testach leków i modelach chorób. Jednak modele komórkowe oparte na in vitro nie mają natywnej macierzy zewnątrzkomórkowej i dlatego nie mogą dokładnie naśladować elektrofizjologii na poziomie narządów. Z kolei ludzkie plastry serca mają nienaruszoną macierz zewnątrzkomórkową i natywne kontakty międzykomórkowe, co czyni je przydatnymi do dokładniejszego badania arytmogennych właściwości ludzkiego mięśnia sercowego.

Badacze opracowali organiczne wycinki ludzkiego serca jako fizjologiczną platformę przedkliniczną do testowania leków ostrych i przewlekłych oraz do badania elektrofizjologii serca i progresji chorób serca12,13,14,15,16,17,18,19. W porównaniu z kardiomiocytami pochodzącymi z iPSC, wycinki ludzkiego serca wierniej odwzorowują elektrofizjologię serca dorosłego człowieka z dojrzałym fenotypem kardiomiocytów. W porównaniu z izolowanymi ludzkimi kardiomiocytami, wycinki serca wykazują czas trwania fizjologicznego potencjału czynnościowego ze względu na dobrze zachowane sprzężenie komórka-komórka i nieodłączne istnienie ich rodzimych środowisk wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych.

Ten protokół opisuje proces generowania wycinków ludzkiego serca z całych serc dawców, przeprowadzając ostre (tj. wielogodzinne) i przewlekłe (tj. dniowe) badania w celu sprawdzenia parametrów elektrofizjologii serca za pomocą mapowania optycznego. Chociaż protokół ten opisuje tylko użycie tkanki lewej komory (LV), został z powodzeniem zastosowany do innych regionów serca, a także innych gatunków, takich jak myszy, szczury, świnki morskie i świnie14,20,21,22. Nasze laboratorium wykorzystuje całe ludzkie serca dawców, które zostały odrzucone do przeszczepu w ciągu ostatnich 5 lat, ale możliwe jest przeprowadzenie tych samych procedur na dowolnych próbkach serca dawcy pobranych w inny sposób (np. implantacje urządzenia wspomagającego lewą komorę [LVAD], biopsje, miektomia), o ile tkanki te mają możliwość podzielenia na kostki. Mapowanie optyczne jest wykorzystywane do analizy w tym badaniu ze względu na jego zdolność do jednoczesnego mapowania potencjałów czynnościowych i stanów przejściowych wapnia z wysoką rozdzielczością przestrzenną (100 x 100 pikseli) i czasową (>1000 klatek/s). Można również stosować metody alternatywne, takie jak matryce wieloelektrodowe (MEA) lub mikroelektrody, ale techniki te są ograniczone przez ich stosunkowo niską rozdzielczość przestrzenną. Ponadto MEA zostały zaprojektowane do stosowania z hodowlami komórkowymi, a ostre mikroelektrody są łatwiejsze w obsłudze w przypadku całych serc lub dużych klinów tkankowych.

Celem artykułu jest umożliwienie większej liczbie badaczy wykorzystania tkanek ludzkiego serca do badań elektrofizjologii serca. Należy zauważyć, że technologia opisana w tym artykule jest stosunkowo prosta i korzystna dla badań krótkoterminowych (rzędu kilku godzin do dni). Bardziej fizjologiczna kultura biomimetyczna do badań długoterminowych (rzędu tygodni) została omówiona i opisana w wielu innych badaniach12,18,23. Stymulacja elektryczna, obciążenie mechaniczne i rozciąganie tkanek są korzystnymi mechanizmami kondycjonującymi, które mogą pomóc ograniczyć początek przebudowy tkanek in vitro12,18,23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane metody zostały wykonane zgodnie ze wszystkimi instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi. Badania zostały zatwierdzone przez Institution Review Board (IRB) na Uniwersytecie George'a Washingtona.

UWAGA: Ludzkie serca dawców zostały pozyskane od Regionalnej Wspólnoty Transplantacyjnej w Waszyngtonie jako niezidentyfikowane wyrzucone tkanki za zgodą IRB Uniwersytetu George'a Washingtona. Eksplantowane serca są kardiofilegicznie zatrzymywane przez przepłukanie serca roztworem lodowatej kardioplegii (krew została w tym procesie usunięta z serca) i przenoszone do laboratorium w standardowych warunkach przeszczepu narządów.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Dla każdego serca przygotuj 4 l roztworu kardioplegicznego (110 mM NaCl, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 1,2 mM CaCl2; pH = 7,4). Przechowywać 3 l w temperaturze 4 °C, a pozostały 1 l w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: To rozwiązanie można przygotować nawet z kilkudniowym wyprzedzeniem.
  2. Świeżo przygotować po 1 l roztworu do krojenia Tyrode'a (140 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 10 mM glukozy, 10 mM HEPES, 10 mM monoksymu 2,3-butanodionu [BDM]; pH = 7,4) i roztworu regeneracyjnego Tyrode'a (140 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 10 mM glukozy, 10 mM HEPES, 10 mM BDM; pH = 7,4).
    UWAGA: Zarówno roztwór do krojenia, jak i roztwór do odzysku powinny być przygotowane w dniu eksperymentu i mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotować roztwory podstawowe barwników fluorescencyjnych. Odtworzyć wrażliwy na napięcie barwnik RH237 w stężeniu 1,25 mg/ml w dimetylosulfotlenku (DMSO) i przechowywać go w 30 μl podwielokrotności w temperaturze 4 °C. Rozpuść wskaźnik wapnia Rhod-2AM w stężeniu 1 mg/ml w DMSO. Przechowywać w 30 μl porcji w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Di-4-ANEPPS (roztwór podstawowy o stężeniu 1,25 mg/ml w DMSO) może być stosowany w eksperymentach do obrazowania pojedynczej kamery samego potencjału transbłonowego.
    1. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy poddać sonikację barwników za pomocą ultrasonografu przez co najmniej 10 minut i rozcieńczyć każdą porcję barwników fluorescencyjnych w 1 ml roztworu odzysku. Dodać Pluronic F-127 (Tabela Materiałów) do Rhod-2AM w stosunku 1:1 przed rozcieńczeniem w roztworze regeneracyjnym.
  4. Przygotować roztwór podstawowy blebbistatyny rozprzęgającej wzbudzenie-skurcz w stężeniu 2 mg/ml roztworu w DMSO. Przechowywać w porcjach w temperaturze -20 °C. Podczas eksperymentów mapowania optycznego rozcieńczyć podstawowy roztwór bróbbitatyny do stężenia roboczego 5−10 μM w roztworze regeneracyjnym Tyrode.
  5. Przygotuj świeżą pożywkę hodowlaną, uzupełniając pożywkę 199 2% penicyliną-streptomycyną, 1x płynnym suplementem pożywki insulina-transferyna-selen (ITS) i 10 mM BDM. Przefiltrować pożywkę za pomocą sterylnego filtra 0,2 μm.
    UWAGA: W przypadku badań nad zaburzeniami farmakologicznymi leki można dodawać bezpośrednio do pożywki hodowlanej. Pożywka hodowlana może być przechowywana w temperaturze 37 °C.
  6. Przygotuj 4% żel agarozowy do montażu w tkankach, rozpuszczając agarozę o niskiej temperaturze topnienia w wodzie destylowanej i podgrzewając mieszaninę w kuchence mikrofalowej aż do całkowitego rozpuszczenia. Agarozę utwardzić na szalce Petriego o grubości 5 mm i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Konfiguracja sprzętu

  1. Konfiguracja mikrotomu wibracyjnego
    1. Kalibruj wibrujący mikrotom przed każdym eksperymentem.
      1. Za pomocą precyzyjnego mikrotomu wibracyjnego (tabela materiałów) załaduj ceramiczne ostrze tnące do uchwytu i zamocuj urządzenie kalibrujące dostarczone z wibrującym mikrotomem. Wybierz z menu opcję regulacji ostrza i wybierz ceramikę jako typ ostrza.
      2. Wybierz opcję wibracji, sprawdź wartość osi Z. Jeśli ta wartość wynosi <1 μm, wyjdź z menu kalibracji. Jeśli nie, dokładnie wyreguluj kalibracyjną przymocowaną do górnej części głowicy wibracyjnej i wybierz opcję wibracji. Powtórz tyle razy, ile potrzeba, aby ustawić oś Z na <1 μm.
    2. Ustaw ustawienia wibratomu na grubość cięcia 400 μm, prędkość posuwu 0,02 mm/s dla tkanki przedsionkowej i prędkość posuwu 0,04 mm/s dla tkanki komorowej, poziomą amplitudę drgań 2 mm i częstotliwość wibracji 80 Hz.
      UWAGA: Chociaż zalecana grubość 400 μm w celu skompensowania uszkodzeń komórek na powierzchniach cięcia plastra można również przygotować cieńsze plastry. Biorąc pod uwagę, że limit dyfuzji tlenu wynosi około 150 μm, często stosuje się plastry około 300 μm14,17,18,24.
    3. Napełnić kąpiel wibrującego mikrotomu roztworem do krojenia w temperaturze 4 °C i utrzymać temperaturę, otaczając zewnętrzną część kąpieli lodem, uzupełniając w razie potrzeby przez cały czas trwania protokołu krojenia. Stale natleniaj roztwór do krojenia w kąpieli, bulgocząc 100% tlenem podczas krojenia.
    4. Ustaw drugie naczynie z tyloma sitkami o siatce nylonowej 100 μm i podkładkami z siatki, ile potrzeba (jedno sitko na plasterek). Napełnij to naczynie roztworem regeneracyjnym i natlen je przez bulgotanie 100% tlenu w temperaturze pokojowej (RT).
      UWAGA: Ten roztwór jest utrzymywany w temperaturze pokojowej podczas eksperymentu.
  2. Konfiguracja mapowania optycznego
    UWAGA: Bardziej szczegółowy opis systemu mapowania optycznego znajduje się w poprzednich publikacjach16,25,26.
    1. Przymocuj kąpiel tkankową z warstwą żelu polidimetylosiloksanu (PDMS) na dole (aby przypiąć plastry) do systemu perfuzyjnego. Wprowadzić do cyrkulacji 1 l roztworu odzysku w temperaturze 37 °C i natlenić 100% tlenem przez system perfuzyjny z szybkością przepływu wystarczająco szybką, aby utrzymać temperaturę i usunąć nagromadzenie perfuzatu w kąpieli.
    2. Dostosuj ostrość i wyrównanie dwóch kamer CMOS (Tabela materiałów) za pomocą celu.
      UWAGA: Więcej szczegółów na temat wyrównania można znaleźć w poprzednich badaniach26.
    3. Użyj zielonego źródła światła LED o długości fali 520 ± 5 nm, aby jednocześnie wzbudzić barwniki wrażliwe na napięcie i wskaźnik wapnia.
      UWAGA: Źródło światła wzbudzenia jest przymocowane do kostki filtra wzbudzenia systemu mapowania optycznego i odbija się od zwierciadła dichroicznego 550 nm w celu oświetlenia epicentrycznego. Emitowane światło jest zbierane przez soczewkę 1x i dzielone przez drugie zwierciadło dichroiczne o długości fali 630 nm na składowe napięciowe i wapniowe, zanim zostanie przefiltrowane przez filtry odpowiednio 690 ± 50 nm i 590 ± 33 nm i zarejestrowane przez dwie kamery.

3. Protokół krojenia

  1. Gdy będziesz gotowy do sekcji tkanek i eksperymentów, przygotuj kąpiel z lodowatej kardioplegii, mieszając zamrożoną i płynną kardioplegię. Utrzymuj serce zanurzone w kąpieli kardioplegijnej do momentu pobrania tkanek do krojenia (Rysunek 1A).
  2. Przyklej gotowy żel agarozowy do tylnej części metalowych uchwytów na chusteczki wibratomu.
  3. Zidentyfikuj wolną ścianę lewej komory i wytnij 1 cm3 kostki tkanki w zimnym roztworze kardioplegicznym. Następnie szybko zamontuj bloki tkanek na metalowych uchwytach tkanek powierzchniami wsierdzia skierowanymi do góry i przymocuj je do żelu agarozowego za pomocą miejscowego kleju do skóry (Rysunek 1B).
    UWAGA: Wybrany obszar tkanki powinien znajdować się z dala od dużych naczyń krwionośnych, aby uniknąć w plasterkach. Płaszczyzna przekroju jest w przybliżeniu równoległa do orientacji włókien w warstwie wsierdzia (Rysunek 1E), a płaszczyzna przekroju może znajdować się pod niewielkim kątem ze względu na anizotropię rotacyjną w głębszej warstwie ściany lewej wysokości. Aby zwiększyć przepustowość, na tym samym uchwycie można zamontować do dwóch bloków tkanek obok siebie.
  4. Przenieś metalowe uchwyty do kąpieli wibratomicznej wypełnionej lodowato natlenionym roztworem do krojenia. Upewnij się, że kostki tkanek są całkowicie zanurzone.
  5. Przesuń ostrze na przednią krawędź tkanki i włącz wibratom, aby rozpocząć krojenie z ustawionymi parametrami. Wyrzuć kilka pierwszych plasterków, aż ostrze sięgnie poza beleczki do gładkiej tkanki wsierdzia.
  6. Po pokrojeniu każdego plasterka ostrożnie przenieś plasterek do natlenionej (100%O2) kąpieli roztworu regeneracyjnego Tyrode w temperaturze pokojowej. Delikatnie umieść każdy plasterek w oddzielnych sitkach do komórek z nylonowej siatki o grubości 100 μm i przykryj podkładkami z siatką, aby zapobiec zwijaniu się plasterków tkanki (Rysunek 1C). Plastry należy przechowywać w roztworze regeneracyjnym przez co najmniej 20 minut
    UWAGA: Plastry można przechowywać w kąpieli w tych warunkach do 3-4 godzin bez szkodliwych skutków elektrofizjologicznych.

4. Hodowla plastrów w warunkach statycznych

UWAGA: Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia, sterylizuj kleszcze za pomocą sterylizatora perełkowego przed każdym krokiem transferu.

  1. Gdy będzie gotowy do hodowli, ostrożnie przenieś każdą warstwę do indywidualnych dołków 6-dołkowej płytki wypełnionej sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Delikatnie kołysz płytką studzienki, aby wypłukać plastry roztworu regeneracyjnego.
    UWAGA: Od tego momentu plastry powinny być wystawiane wyłącznie w kapturze do hodowli z przepływem laminarnym BSL2, a do obchodzenia się z tkanką należy używać sterylnych kleszczy.
  2. Przenieś plastry do studzienek świeżego PBS, aby dokładnie wypłukać i wysterylizować plastry do hodowli. Wykonaj ten krok mycia 3 razy, aby zapewnić całkowite usunięcie roztworu regeneracyjnego z plastrów.
  3. Przenieś plastry do indywidualnych dołków na 6-dołkowej płytce wypełnionej 3 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki hodowlanej (z lekami lub bez, Rysunek 1D). Umieścić płytki na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 20 obr./min w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z zawartością 30%O2 i 5% CO2 . Odsysać i wymieniać pożywkę co 48 godzin.

5. Charakterystyka funkcjonalna―mapowanie optyczne

  1. W przypadku badań mapowania optycznego bezpośrednio po krojeniu lub po hodowli, ostrożnie przenieś badany plaster do kąpieli tkankowej systemu perfuzyjnego w temperaturze 37 °C ze 100%O2 w roztworze regeneracyjnym Tyrode'a i przymocuj cztery rogi do warstwy żelu PDMS, stosując minimalne rozciągliwość (tj. tylko tyle, aby plasterek nie poruszał się łatwo w warunkach przepływu). Pozostaw plastry w tej kąpieli z krążącym roztworem regeneracyjnym na około 10 minut.
  2. Dodać 0,3−0,5 ml rozcieńczonej bróbstatyny do zbiornika zawierającego roztwór odzysku. Pozostaw plasterek do inkubacji z blibstatyną przez około 10 minut.
  3. Rozpuść 30 μl podstawowego barwnika wrażliwego na napięcie, RH237, w 1 ml roztworu odzysku w temperaturze 37 °C. Wyłącz pompy i powoli załaduj 0,2-0,3 ml roztworu barwnika roboczego na powierzchnię plastra przez okres 30 s. Pozostaw plasterek do inkubacji w barwniku przy wyłączonych pompach przez okres do 90 s, Następnie ponownie włącz pompy, aby nadmiar barwnika został wypłukany.
    UWAGA: Należy uważać, aby równomiernie rozprowadzić barwnik na całym plastrze. Dodatkowo, bardzo powolne nakładanie barwnika ma kluczowe znaczenie, aby zapobiec odpływaniu barwnika z plastra.
  4. Powtórz krok 5.3, aby rozpuścić podstawowy wskaźnik wapnia Rhod-2AM i załaduj go na plasterek.
  5. Ustaw ostrość aparatów na wycinku, dostosowując odległość wycinka od obiektywu.
  6. Umieść bipolarną platynowo-irydową elektrodę stymulacyjną tak, aby jej końcówka stykała się ze środkiem plastra i zastosuj bodźce stymulacyjne o rosnącej amplitudzie, aby określić minimalny próg stymulacji wymagany do wywołania reakcji elektrycznej. Tempo wycinka z częstotliwością 1 Hz z czasem trwania impulsu wynoszącym 2 ms przy 1,5-krotności amplitudy ustalonego progu stymulacji. Umieść szkiełko nakrywkowe na plasterku chusteczki.
  7. Oświetl plasterek za pomocą źródła światła wzbudzającego LED o długości fali 520 ± 5 nm. Rejestruj emitowane sygnały napięciowe i wapniowe za pomocą dwóch kamer CMOS z prędkością 1,000 klatek/s.
  8. Sprawdź, czy nagranie jest dobrej jakości sygnału i czy występują w nim artefakty stłumionego ruchu (Rysunek 1F). Dodawaj więcej bróbstatyny do zbiornika w krokach co 0,1 ml, aż ruch przestanie powodować artefakty w sygnałach optycznych. W razie potrzeby dodaj więcej barwnika, aby poprawić jakość sygnału.
    UWAGA: Dobra jakość sygnału odnosi się do jakościowo ocenianej dużej amplitudy sygnału i niskiego szumu tła w nagrywanych sygnałach optycznych.

6. Przetwarzanie danych za pomocą RHYTHM1.2

UWAGA: RHYTHM1.2 to interfejs użytkownika oparty na MATLAB, który służy do wyświetlania, warunkowania i analizowania danych mapowania optycznego uzyskanych przez systemy mapowania optycznego z jedną lub dwiema kamerami (Rysunek 3). Jest on używany w połączeniu z systemem obrazowania.

  1. Wczytywanie plików danych
    1. Załaduj pliki danych do RHYTHM1.2, wybierając dowolne z czterech okien wyświetlania na ekranie i używając przycisków Wybierz katalog i Załaduj.
    2. Program poprosi użytkownika o wybranie danych z kamery 1 lub kamery 2 dla nagrań z podwójnym napięciem i wapniem. Wybierz Kamera 1 dla voltage sygnał.
    3. Powtórz ten proces, aby załadować sygnał wapniowy (Kamera 2) do jednego z sąsiednich okien wyświetlacza.
    4. Zaznacz pole wyboru Podwójne łączenie danych między dwoma zaznaczonymi oknami wyświetlania, aby połączyć te dwa okna wyświetlania, ponieważ oba zestawy danych są rejestrowane z tego samego regionu na plasterku.
      UWAGA: Alternatywnie, jeśli zachowane jest to samo pole widzenia, funkcja ta może być użyta do połączenia dwóch obrazów, które zostały uzyskane w różnych punktach czasowych, aby zobaczyć reakcję czasową w elektrofizjologii badanego leku. Dwukrotne kliknięcie dowolnego okna wyświetlania pozwala na maksymalizację tego jednego okna, aby umożliwić łatwą analizę.
  2. Kondycjonowanie sygnału
    1. Wybierz pozycję Analiza danych | Parametry warunku do kondycjonowania danych mapowania optycznego napięcia i wapnia przed dalszą analizą.
    2. Użyj funkcji "Usuń tło", aby usunąć piksele, które nie zawierają żadnego sygnału, w oparciu o próg natężenia fluorescencji (próg tła [BG]) i stopień grupowania pikseli (próg wzbudzenia [EX]).
    3. Wykonaj uśrednianie przestrzenne danych mapowania optycznego za pomocą funkcji "Bin" w celu poprawy jakości sygnału.
    4. Filtruj dane mapowania optycznego za pomocą filtra pasmowo-przepustowego z funkcją "Filtr".
    5. Użyj funkcji "Dryft", aby usunąć dryft linii bazowej w sygnale mapowania optycznego.
    6. Korzystając z funkcji "Normalizuj", znormalizuj dane mapowania optycznego z każdego piksela, aby uzyskać maksymalną amplitudę 1.
    7. Użyj funkcji "Sygnał odwrotny", aby odwrócić ślady wapnia do dalszej analizy.
    8. Kliknij przycisk Wyświetl falę, aby wybrać kondycjonowany ślad z dowolnego miejsca w oknie wyświetlania i wykreślić go w oknie Waveform. Dostosuj parametry kondycjonowania sygnału, aby uzyskać optymalny potencjał czynnościowy i ślady przejściowe wapnia.
  3. Obliczanie prędkości przewodzenia (CV)
    UWAGA: Czas aktywacji jest definiowany jako czas maksymalnej pochodnej sygnału optycznego (dF/dtmax).
    1. Wybierz pozycję Analiza danych | Mapa aktywacji i wprowadź czas rozpoczęcia i czas zakończenia, aby objąć pojedynczy potencjał działania w śladzie. Naciśnij Oblicz i wybierz obszar zainteresowania (ROI), aby wyświetlić mapę aktywacji wybranego regionu (Rysunek 1G).
    2. Wybierz pozycję Analiza danych | Mapa CV i podobnie wybierz czas rozpoczęcia i czas zakończenia. Wprowadź wartości rozdzielczości międzypikselowej na podstawie setup.
      UWAGA: W przypadku systemów powiększenia 1x rozdzielczość międzypikselowa wynosi 0,1 mm w kierunku X i Y.
    3. Naciśnij przycisk Generuj vec. Mapa, aby wybrać zwrot z inwestycji i wyświetlić wektory CV w tym regionie. Średnia, mediana, odchylenie standardowe i liczba wektorów uwzględnionych w analizie, a także średni kąt rozchodzenia się wektorów CV w wybranym regionie są obliczane i wyświetlane w sekcji Statystyka.
    4. Kliknij przycisk Rysuj linię, aby narysować linię wzdłuż podanego kierunku rozchodzenia się. Wszystkie wektory CV w tym kierunku zostaną wybrane. Kliknij przycisk Oblicz CV, aby użyć tylko tych wybranych wektorów CV do obliczenia statystyk, które będą wyświetlane w sekcji Statystyki.
  4. Obliczanie czasu trwania potencjału czynnościowego (APD) i czasu trwania przejściowego wapnia (CaTD)
    UWAGA: APD jest kolejnym podstawowym parametrem elektrofizjologii serca. Mapy APD można generować, określając różnicę czasu między aktywacją a określonym procentem repolaryzacji każdego optycznego potencjału czynnościowego. Heterogeniczność APD lub wydłużenie i skrócenie APD można wykorzystać do przewidywania podatności na arytmię.
    1. Aby obliczyć APD w RHYTHM1.2, wybierz Analiza danych | Mapa APD/CaT.
    2. Wybierz czas rozpoczęcia i czas zakończenia, aby objąć jeden pełny potencjał czynnościowy. Ustaw minimalną i maksymalną wartość APD/CaTD, aby usunąć wszystkie wartości odstające (na przykład odpowiednio 0 i 1 000 ms). Wprowadź procentową repolaryzację, która określi APD, na przykład 0,8 dla APD80/CaTD80 lub 0,5 dla APD50/CaTD50.
    3. Kliknij przycisk Regional APD Calc, aby wybrać ROI i wygenerować mapę APD. Średnia, mediana, odchylenie standardowe i liczba pikseli uwzględnionych w analizie zostaną wyświetlone w sekcji Statystyki.
  5. Czas narastania
    UWAGA: Czas narastania to kolejny parametr elektrofizjologiczny, który można zmierzyć na podstawie sygnałów optycznych napięcia i śladów przejściowych wapnia. Zapewnia oszacowanie, ile czasu zajmuje depolaryzującym kanałom jonowym wyzwolenie potencjału czynnościowego lub ile czasu zajmuje uwolnienie wapnia do cytoplazmy z retikulum sarkoplazmatycznego. Czas narastania optycznego nie jest idealnym substytutem czasów narastania mierzonych za pomocą mikroelektrod i może nie być tak wrażliwy na zmiany depolaryzacji, ponieważ optyczne potencjały czynnościowe są średnią potencjału transbłonowego wielu komórek. Rozdzielczość przestrzenna i czasowa systemu może również wpływać na wartości czasu narastania optycznego. Jednak nadal może być używany do przewidywania dużych zmian w depolaryzacji27.
    1. Aby określić czas narastania, wybierz Analiza danych | Czas narastania.
    2. Wybierz Czas rozpoczęcia i Czas zakończenia, aby wybrać skok w górę jednego pojedynczego potencjału czynnościowego lub stanu przejściowego wapnia. Wprowadź wartości Start% i End% (zwykle 10–90% jest zalecane dla sygnałów niezaszumionych), co pozwala użytkownikowi wybrać tylko części sygnału bez uwzględniania szumu w przypadku sygnałów hałaśliwych.
    3. Kliknij przycisk Oblicz, aby wybrać zwrot z inwestycji i określić średnią, medianę, odchylenie standardowe i liczbę pikseli uwzględnionych w analizie czasu narastania.
  6. Rozkład wapnia
    UWAGA: W przypadku śladowych ilości wapnia można określić stałą czasową rozpadu stanu przejściowego wapnia. Pozwala to na analizę zmian w usuwaniu jonów wapnia z cytoplazmy z powrotem do SR.
    1. Wybierz pozycję Analiza danych | Rozpad wapnia i wprowadź czas rozpoczęcia i czas zakończenia, aby objąć całą część rozpadu pojedynczego sygnału przejściowego wapnia.
    2. Kliknij przycisk Oblicz Tau, aby wybrać zwrot z inwestycji i określić średnią, medianę, odchylenie standardowe i liczbę pikseli uwzględnionych w analizie stałej czasowej rozpadu wapnia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ludzkie skrawki organotypowe pobrano z lewej komory serca ludzkiego dawcy zgodnie z protokołem opisanym powyżej i zilustrowanym na Rysunku 1. Do jednoczesnego mapowania optycznego napięcia i wapnia, około 1 h po zakończeniu protokołu skrawkowania, wykorzystano dwukamerowy system mapowania optycznego w konfiguracji obrazowania pionowego, przedstawiony na Rysunku 2. Dane analizowano za pomocą oprogramowania RHYTHM1.2 (Rysunek 3), otwa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy metody krok po kroku uzyskiwania żywotnych wycinków serca z zatrzymanych sercowo serc ludzkich oraz funkcjonalnego charakteryzowania wycinków za pomocą podwójnego mapowania optycznego potencjału transbłonowego i wewnątrzkomórkowego wapnia. Dzięki zachowanemu środowisku zewnątrzkomórkowemu i natywnemu sprzężeniu komórka-komórka, ludzkie wycinki serca mogą być wykorzystywane jako dokładny model ludzkiego serca do fundamentalnych odkryć naukowych oraz do testowania skuteczności i kardiotoksycznoś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Finansowanie przez NIH (granty R21 EB023106, R44 HL139248 i R01 HL126802), przez fundację Leducq (projekt RHYTHM) oraz stypendium podoktorskie American Heart Association (19POST34370122) są wdzięczne

za uznanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 ml BDThomas Scientific309597
2,3-butanodion monoksymusSigma-AldrichB0753
6-dołkowe płytki hodowlaneCorning3516
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoThermoFisher Scientific1377
BlebbistatinCayman13186
Pułapka bąbelkowaRadnoti
Chlorek wapniaSigma-AldrichC1016
Filtry siatkowe Corning CellFisher Scientific07-201-432
Di-4-ANEPPSRoztwór podstawowy biotuw stężeniu 1,25 mg/ml w DMSO
DMSO Sigma-AldrichD2650
Kleszcze #3c DumontNarzędzia do nauki11231-20
Emisyjne zwierciadło dichroiczneChromaT630LPXR-UF1
Filtr emisyjny (RH237)Filtr emisyjny ChromaET690/50m
(Rhod2AM)ChromaET590/33m
Wzbudzenie zwierciadło dichroiczneChromaT550LPXR-UF1
ChromaET500/40x
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 mlFisher Scientific14-959-49A
GlukozaSigma-AldrichG8270
Wymiennik ciepłaRadnoti158821
Inkubator HEPESSigma-AldrichH3375
ThermoFisher Scientific50145502
Insulina Transferyna Selen (ITS)Sigma-AldrichI3146
Źródło światła wzbudzenia LEDPrizmatixUHP-Mic-LED-520
Sześciowodny chlorek magnezuSigma-AldrichM9272
Medium 199ThermoFisher Scientific11150059
Kamera CMOS Micam Ultima L typ ScimediaN/A
Minutien PinsFine Science Tools26002-10
Pennicylina-StreptomycynaSigma-AldrichP4333
Pompa perystaltycznaCole ParmerEW-07522-20
Platynowy drut stymulacyjnyAlfa Aesar43275
Pluronic F127ThermoFisher ScientificP6867niejonowy, surfaktantowy poliol
Chlorek potasuSigma-AldrichP3911
Dane Powerlab akwizycja i stymulatorAD InstrumentsPowerlab 4/26
RH237Biotium61018
Rhod2AMThermoFisher ScientificR1245MP
Rhod-2AMInvitrogen, Carlsbad, CA
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS6014
Chlorek soduSigma-AldrichS9625
Sterylizator, sucha kulkaSigma-AldrichZ378550
Kamienny dyfuzor tlenuDrewno wodneB00O0NUVM0
TissueSeal - Histoacryl Miejscowy klej do skórygobiomedAESCULAP
UltraPure Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaThermo Fisher Scientific16520100
Ultradźwiękowy sonografBranson 1800
WibratomeCampden Instrumenty7000 smz
130149 precyzyjnej

Bibliografia

  1. Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).
  2. Choudhary, A., Ibdah, J. A. Animal models in today's translational medicine world. Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).
  3. Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
  4. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  5. Green, A. R. Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).
  6. Shinnawi, R., Gepstein, L. iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331(2014).
  7. Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip. Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).
  8. Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
  9. Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
  10. Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1. Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).
  11. Zhang, Y., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PloS One. 5 (9), 12559(2010).
  12. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168(2019).
  13. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, 117(2019).
  14. Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
  15. Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).
  16. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798(2016).
  17. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).
  18. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
  19. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
  20. Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts - A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).
  21. Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
  22. Bussek, A., et al. Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).
  23. Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).
  24. Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. Supply of nutrients to cells in engineered tissues. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).
  25. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275(2011).
  26. Brianna, C., et al. Open-Source Multiparametric Optocardiography. Scientific Reports. 9, 721(2019).
  27. George, S. A., et al. Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).
  28. Kawara, T., et al. Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis. Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).
  29. Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109(2018).
  30. Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies. Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).
  31. Lou, Q., et al. Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure. Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

ludzkie plastry sercaobrazowanie wapniowe sterowane napięciemprzygotowanie plastrów tkankiocena elektrofizjologicznamodel testowania lekówanaliza prędkości przewodzeniaczas trwania potencjału czynnościowegoobrazowanie przejściowych zmian stężenia wapniatkanka lewej komory
Przedkliniczna ocena elektrofizjologii serca za pomocą optycznego mapowania dwunapięciowego i wapniowego ludzkich organotypowych wycinków serca
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.