Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie zamrożonych i rozmrożonych zarodków do wysokowydajnej produkcji genetycznie zmodyfikowanych myszy

DOI:

10.3791/60808

⸱

2 kwietnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Max Planck Florida Institute for Neuroscience, 2Life Science Research Center, University of Toyama, 3Department of Biochemical Engineering, Graduate School of Science and Engineering, Yamagata University, 4Graduate School of Innovative Life Science, University of Toyama, 5Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Cairo University, 6Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 7Division of Stem Cell Research and Drug Development, Center for Development of Advanced Medical Technology, Jichi Medical University, 8Synthetic Biology Division, Research Center for Advanced Science and Technology, University of Tokyo, 9Institute for Advanced Biosciences, Keio University, 10Graduate School of Media and Governance, Keio University, 11Department of Molecular Oncology, Graduate School of Medicine, Chiba University, 12Department of Biological Sciences, School of Science, University of Tokyo, 13College of Arts and Sciences, University of Tokyo

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę kriokonserwacji jednokomórkowych zarodków, a także protokół, który łączy użycie zamrożonych i rozmrożonych embrionów z elektroporacją w celu efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użycie myszy modyfikowanych genetycznie (GM) stało się kluczowe dla zrozumienia funkcji genów i rozszyfrowania mechanizmów leżących u podstaw chorób ludzkich. System CRISPR/Cas9 pozwala naukowcom modyfikować genom z niespotykaną dotąd wydajnością, wiernością i prostotą. Wykorzystując tę technologię, naukowcy poszukują szybkiego, wydajnego i łatwego protokołu do generowania myszy GMO. Tutaj przedstawiamy ulepszoną metodę kriokonserwacji zarodków jednokomórkowych, która prowadzi do wyższego tempa rozwoju zamrożonych i rozmrożonych zarodków. Łącząc go ze zoptymalizowanymi warunkami elektroporacji, protokół ten pozwala na generowanie myszy z nokautem i knock-inem o wysokiej wydajności i niskich szybkościach mozaiki w krótkim czasie. Ponadto pokazujemy krok po kroku wyjaśnienie naszego zoptymalizowanego protokołu, obejmującego przygotowanie odczynnika CRISPR, zapłodnienie in vitro, kriokonserwację i rozmrażanie zarodków jednokomórkowych, elektroporację odczynników CRISPR, hodowlę myszy i genotypowanie założycieli. Korzystając z tego protokołu, naukowcy powinni być w stanie przygotować myszy GMO z niezrównaną łatwością, szybkością i wydajnością.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)/białka związanego z CRISPR 9 (Cas9) jest przełomem naukowym, który zapewnia bezprecedensową ukierunkowaną modyfikację genomu1. System CRISPR/Cas9 składa się z białka Cas9 i przewodnika RNA (gRNA) z dwoma składnikami molekularnymi: specyficznym dla celu CRISPR RNA (crRNA) i transaktywującym CRISPR RNA (tracrRNA) 2 . gRNA kieruje białko Cas9 do określonego locus w genomie, 20 nukleotydów komplementarnych do crRNA i sąsiadujących z motywem sąsiadującym z protospacerem (PAM). Białko Cas9 wiąże się z sekwencją docelową i indukuje pęknięcia dwuniciowe (DSB), które są naprawiane przez podatne na błędy niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) lub naprawę ukierunkowaną na homologię o wysokiej wierności (HDR)3,4,5. NHEJ prowadzi do insercji i/lub delecji (indeli), a tym samym do utraty funkcji genu, gdy celem jest sekwencja kodująca. HDR prowadzi do precyzyjnej edycji genomu w obecności szablonu naprawy zawierającego sekwencje homologiczne3,4,5. NHEJ i HDR zostały wykorzystane do generowania myszy odpowiednio z nokautem i knock-inem.

Chociaż system CRISPR/Cas9 znacznie przyspieszył wytwarzanie myszy GMO z wyjątkową skutecznością i wiernością, naukowcy stosujący te metody często napotykają wyzwania techniczne. Po pierwsze, konwencjonalne protokoły wymagają mikroiniekcji w celu wprowadzenia narzędzi do edycji CRISPR do przedjądrza zapłodnionych jaj6,7. Ta technika jest czasochłonna i zwykle wymaga intensywnego treningu. W związku z tym kilka grup zastąpiło mikroiniekcję elektroporacją8,9,10,11,12,13. Jednak we wczesnych protokołach elektroporacji do elektroporacji używano świeżych zarodków. Spowodowało to kolejny problem, ponieważ przygotowanie świeżych zarodków przed każdym eksperymentem jest trudne14.

Ostatnio my i inni połączyliśmy użycie zamrożonych i rozmrożonych embrionów oraz elektroporacji do edycji genomu, co ułatwia generowanie myszy GMO15,16. Protokół ten umożliwia naukowcom nieposiadającym zaawansowanych umiejętności manipulacji zarodkami szybkie generowanie zwierzęcych modeli chorób ludzkich z wysoką wydajnością. Protokół znacznie zmniejsza również praktyczne wyzwania związane z generowaniem myszy GMO, takie jak heterogeniczność genetyczna w klasie founders16. Aby przezwyciężyć mozaicyzm, przeprowadzamy elektroporację odczynników CRISPR w ciągu 1 godziny po rozmrożeniu zarodka, aby upewnić się, że edycja następuje przed pierwszą replikacją genomu. Kolejnym ulepszeniem jest użycie białka Cas9 zamiast mRNA Cas9 w celu zmniejszenia niepożądanej mozaikowości17. Ponadto opracowaliśmy optymalną metodę kriokonserwacji zarodków jednokomórkowych, która zwiększa tempo rozwoju do stadium dwukomórkowego16: stosowanie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) radykalnie poprawia przeżywalność zamrożonych oocytów po zapłodnieniu, być może za pomocą tego samego mechanizmu, który sprawia, że rozmrożone niezapłodnione oocyty są bardziej odporne18.

Tutaj prezentujemy kompleksowy protokół generowania myszy GM przy użyciu zamrożonych i rozmrożonych embrionów, w tym zmodyfikowaną metodę kriokonserwacji jednokomórkowych zarodków C57BL/6J. Obejmuje 1) projektowanie gRNA, przygotowanie i montaż odczynnika CRISPR; 2) Zapłodnienie in vitro, kriokonserwacja i rozmrażanie zarodków jednokomórkowych; 3) Elektroporacja odczynników CRISPR do zamrożonych i rozmrożonych zarodków; 4) Transfer zarodka do jajowodu samic myszy w ciąży rzekomej; oraz 5) Genotypowanie i analiza sekwencji zwierząt założycielskich F0.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury związane z opieką nad zwierzętami i procedurami przeprowadzonymi w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami i przepisami Przewodnika po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych. Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi Uniwersytetu Toyama, Uniwersytetu Tokijskiego, Uniwersytetu Jichi i Instytutu Neuronauki Maxa Plancka na Florydzie. Informacje o wszystkich odczynnikach znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Projekt odczynników CRISPR

  1. Projektowanie crRNA
    1. Odwiedź stronę CRISPR direct19 (https://crispr.dbcls.jp/), aby zaprojektować specyficzne crRNA ze zmniejszonymi miejscami poza celem.
      UWAGA: Istnieje wiele innych przydatnych narzędzi do projektowania crRNA20 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/wereview/crisprtools/).
    2. Wstaw docelową sekwencję nukleotydową i wprowadź następujące zmiany:
      Wymagana sekwencja PAM = NGG
      Kontrola swoistości = Genom myszy (Mus musculus), GRCm38/mm10 (Dec, 2011)
      UWAGA: Na przykład, aby wygenerować myszy z nokautem tyrozynazy (Tyr), wybrano ekson 2 (sekwencja nukleotydowa z 9476–9692).
    3. Kliknij przycisk Projekt, a w przypadku bardzo szczegółowych działań zaznacz opcję Pokaż tylko bardzo konkretny element docelowy.
    4. Aby zmniejszyć potencjalne efekty niedocelowe, wybierz sekwencję docelową o najniższej wartości w kolumnach "12 mer+PAM" i "8 mer+PAM".
      UWAGA: W tych kolumnach ("1") oznacza, że sekwencja ma tylko jedno idealne dopasowanie do zamierzonego miejsca docelowego, a liczby większe niż jeden wskazują na obecność potencjalnych miejsc poza celem.
    5. Zamów otrzymane oligonukleotydy w firmach zajmujących się syntezą crRNA (tabela uzupełniająca 1).
      UWAGA: Dla genu Tyr eksonu 2 zastosowano następującą sekwencję docelową: GGACCACTATTACGTAATCC, z +TGG jako sekwencją PAM (Figura 2A).
  2. Jednoniciowy oligodeoksynukleotyd (ssODN) do eksperymentów edycyjnych za pośrednictwem HDR (tj. Knock-in myszy).
    1. Zaprojektuj długość ssODN tak, aby wynosiła około 80–180 pz, w tym 30–60 ramion homologii nukleotydów (nt) po obu stronach.
      UWAGA: ssODN o długości 75–85 nt, w tym ramię homologii 30–35 nt i komplementarne do gRNA, wykazało wysoką wydajność edycji knock-in21.
    2. Wstawić zamierzoną modyfikację i cichą mutację w sekwencji PAM lub, jeśli nie jest to możliwe, w sąsiedniej podstawie 5′ PAM, aby zablokować ponowne cięcie po edycji genomu.
      UWAGA: CrRNA i ssODN użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli Uzupełniającej 1.

2. Zapłodnienie in vitro, kriokonserwacja zarodków oraz zamrażanie i rozmrażanie

  1. Zapłodnienie in vitro
    1. Superowulacja C57BL/6J samice myszy (4 lub 8 tygodni) przez wstrzyknięcie IP gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG), a następnie wstrzyknięcie ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG) 7,5 IU po 48 godzinach
      UWAGA: Liczbę oocytów owulowanych można zwiększyć około 3-krotnie za pomocą ultra-super-overovulation22.
    2. Usuń najądrza ogona u dojrzałych płciowo samców myszy C57BL/6J (3–5 miesięcy).
      UWAGA: Możliwe jest pobieranie plemników bez poświęcania samców myszy.
    3. Pobrać skrzepy plemników za pomocą igły preparacyjnej i inkubować je w 200 μl kropli ludzkiego płynu jajowodowego (HTF) w inkubatorze CO2 przez 1,5 godziny w celu kapacytacji.
    4. Zebrać kompleksy wzgórko-oocytów (COC) z jajowodów 16–18 godzin po wstrzyknięciu hCG i inkubować je w świeżej kropli 200 μl pożywki HTF pokrytej ciekłą parafiną w inkubatorze CO2 (5% CO2, 37 °C) nie dłużej niż 2 godziny
      UWAGA: Lepiej jest złożyć myszy w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu, ponieważ eutanazja poprzez wdychanie CO2 wpływa na IVF i rozwój zarodka23.
    5. Dodać 1–5 μl zawiesiny plemników z granicy pożywki inkubacyjnej do 200 μl kropli pożywki HTF zawierającej COC i inkubować je w inkubatorze CO2 przez 3 godziny.
    6. Umyj oocyty pożywką optymalizacyjną z dodatkiem potasu (KSOM) 3x, aby usunąć pozostałe plemniki i wzgórki.
    7. Sprawdź tworzenie się przedjądrza i stopień zarodków jednokomórkowych za pomocą odwróconego mikroskopu.
  2. Kriokonserwacja zarodków jednokomórkowych
    1. Inkubować zarodki jednokomórkowe w kropli HTF o pojemności 200 μl zawierającej 20% FBS (nie pokrytej płynną parafiną) przez 10 minut w inkubatorzeCO2
      2. .
    2. Przenieś 20–100 zarodków do 50 μl roztworu 1 M dimetylosulfotlenku (DMSO)24.
    3. Przenieść 5 μl roztworu zawierającego 100 zarodków na dno krioprobówki i schłodzić przez 5 minut w temperaturze 0 °C za pomocą chłodziarki lub na lodzie.
    4. Powoli dodać 45 μl roztworu DAP213 (2 M sultlenku dimetylu, 1 M acetamid i 3 M glikol propylenowy) wzdłuż ścianki probówki, zakryć probówki i przechowywać przez 5 minut w chłodziarce lub na lodzie w temperaturze 0 °C.
      UWAGA: Nie dokręcaj nasadek zbyt mocno, aby można je było łatwo zdjąć podczas rozmrażania próbki.
    5. Szybko przechowuj probówki w ciekłym azocie.
  3. Rozmrażanie zarodków
    1. Otwórz pokrywę krioprobówki, wyrzuć pozostały ciekły azot i dodaj 900 μl 0,25 M roztworu sacharozy podgrzanego do 37 °C.
      UWAGA: 0,25 M roztwór sacharozy należy wcześniej podgrzać do temperatury 37 °C, ponieważ użycie zimnego roztworu zmniejsza żywotność zarodków po rozmrożeniu.
    2. Pipetować szybko przez 10x i przenieść zawartość krioprobówki do plastikowego naczynia.
      UWAGA: Pipetowanie należy wykonywać ostrożnie, aby nie powstawały pęcherzyki powietrza, które uszkadzały zarodki.
    3. Prawidłowo morfologicznie zapłodnione oocyty przemyć 2x w pożywce KSOM pokrytej płynem parafinowym i trzymać w inkubatorze CO2 do momentu elektroporacji.

3. Montaż i elektroporacja odczynników CRISPR

UWAGA: Do elektroporacji użyliśmy elektrody platynowej (wysokość: 0,5 mm, długość: 10 mm, szerokość: 3 mm, odstęp: 1 mm) oraz jednostopniowego elektroporatora, które zostały opisane wcześniej8 (Tabela materiałów). Można również zastosować elektroporator dwustopniowy (tabela materiałów).

  1. Przygotowanie i montaż odczynników CRISPR
    1. Zamów odczynniki CRISPR (tj. crRNA, tracrRNA i białko Cas9) i ssODN, jeśli wykonujesz eksperymenty edycyjne za pośrednictwem HDR (tabela materiałów i tabela uzupełniająca 1).
    2. Przygotuj roztwór do wyżarzania w następujący sposób.
      1. Przygotować 1 μg/μl crRNA i 1 μg/μl tracrRNA w roztworze minimalnej pożywki niezbędnej o zredukowanej surowicy (tabela materiałów) i dodać 6 μl każdego roztworu do 42 μl buforu wolnego od nukleaz.
      2. Inkubować mieszaninę w suchym podgrzewaczu w temperaturze 95 °C przez 3 minuty i schładzać w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
      3. Przygotować 1 μg/μL białka HiFi Cas9 rozcieńczonego w Opti-MEM I i dodać 6 μl do poprzedniej mieszaniny, aby uzyskać całkowitą objętość 60 μl.
      4. Wykonując eksperymenty z edycją za pośrednictwem HDR, dodaj 6 μl 1 μg/μL ssODN. Ponieważ końcowa objętość powinna wynosić 60 μl, użyj 36 μl wody wolnej od nukleaz w kroku 3.1.2.1.
        UWAGA: Końcowe stężenie crRNA, tracrRNA, białka Cas9 i ssODN wyniesie 100 ng / μL.
      5. Przenieść do 100 zarodków do 25 μl końcowej mieszaniny (kompleksu RNP) w szkiełku z jednym otworem i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
  2. Elektroporacja
    1. Wypełnij lukę elektrodową 6 μl nowej mieszaniny odczynników CRISPR i dodaj do mieszaniny 20–25 zarodków.
      UWAGA: Ważne jest, aby unikać kontaktu zarodków z elektrodą elektroporacyjną, która może uszkodzić zarodki podczas impulsów elektrycznych.
    2. Wykonaj elektroporację w następujących warunkach dla elektroporatora jednostopniowego:
      Napięcie: 25 V, Kierunek impulsu (Pd) +
      WŁ.: 3 ms, WYŁ.: 97 ms
      Powtórzenia: 5x
      UWAGA: Elektroporację należy wykonać nie później niż 1 godzinę po rozmrożeniu, aby upewnić się, że edycja genomu następuje przed pierwszą replikacją DNA, aby zapobiec mozaicyzmowi.
    3. W przypadku elektroporatora dwustopniowego należy ustawić warunki w następujący sposób:
      Impuls poringowy = 40V, Pd +
      ON = 1 lub 2,5 ms; Interwał impulsów = 50 ms
      Powtórzenia: 4x, Rozpad 10%

      Impuls przesyłowy = 5 lub 7V; Pd +/-.
      WŁ.: 50 ms; Interwał impulsów = 50 ms.
      Powtórzenia = 5x; Rozpad = 40%.
      UWAGA: Ważne jest, aby wyregulować głośność, aby utrzymać impedancję w określonym zakresie określonym przez producenta.
    4. Przemyć zarodki 3x zmodyfikowanym pożywką Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer 2 (M2), a następnie dwukrotnie przepłukać kroplą pożywki KSOM pokrytej płynem parafinowym.
    5. Umyte zarodki należy inkubować (w pożywce KSOM) w inkubatorze CO2 przez noc w celu dalszego przeszczepu.

4. Transfer zarodków

  1. Przygotuj samice myszy w ciąży rzekomej. Skojarzenie samic myszy ICR (3–6 miesięcy) z samcami myszy poddanych wazektomii 1 dzień przed transferem zarodków (ET).
    UWAGA: Myszy należy sprawdzić następnego ranka pod kątem korka kopulacyjnego. Myszy z zatyczką są uważane za pseudociężarne i mogą być używane do ET.
  2. Odsysać powietrze i KSOM (bez cieczy parafinowej) w naprzemiennych odstępach 2–3 mm do szklanej kapilary jako marker udanej implantacji.
  3. Wprowadzić 20-24 zarodki do 200 μl kropli KSOM (bez płynu parafinowego) i pobrać 10-12 zarodków do szklanej kapilary w celu implantacji w każdym jajowodzie.
  4. Znieczulenie samic myszy za pomocą izofluranu (inhalacja) lub wstrzyknięcia IP roztworu łączącego medetomidynę/midazolam/butorfanol (odpowiednio 0,3 mg/kg, 4,0 mg/kg i 5,0 mg/kg). Umieść znieczuloną mysz na jej brzusznej stronie na poduszce grzewczej. Chroń oczy znieczulonej myszy żelem nawilżającym.
  5. Ogol się wzdłuż dolnej części grzbietowej linii środkowej i zdezynfekuj obszar jodowidonem, a następnie 70% etanolem.
  6. Wykonaj długie nacięcie ~1 cm równolegle do grzbietowej linii środkowej.
  7. Wyjmij jajowód i umieść na sterylnej plastikowej zasłonie. Utrzymuj go w wilgoci za pomocą ciepłej sterylnej soli fizjologicznej.
  8. Umieść jajowód pod mikroskopem stereoskopowym.
  9. Zrób otwór w ścianie jajowodu między lejkiem a bańką kilka milimetrów przed bańką za pomocą nożyczek z mikrosprężynami.
  10. Włóż końcówkę szklanej kapilary zawierającej zarodki do otworu i delikatnie dmuchnij w ustnik uchwytu kapilary, aby wydalić zarodki, aż w bańce będzie widoczny pęcherzyk powietrza.
    UWAGA: Transfer od 10 do 12 zarodków na jajowód.
  11. Wyjmij szklaną kapilarnę ze ściany jajowodu i delikatnie wepchnij narząd rozrodczy z powrotem do jamy ciała.
  12. Powtórz poprzedni proces, aby wprowadzić zarodki do drugiego jajowodu.
  13. Po zakończeniu procedury ET należy zszyć otrzewną prostym szwem przerywanym (50, wchłanialnych, plecionych szwów syntetycznych), a następnie skórę prostym wzorem przerywanym lub zakopanym podskórnym przerywanym wzorem szwu (60 niewchłanialnych, monosyntetycznych szwów).
  14. Utrzymuj mysz w cieple na płycie grzewczej o temperaturze 37 °C, aż dojdzie do siebie po znieczuleniu.
  15. Monitoruj stan zdrowia zwierzęcia codziennie przez 7 dni po zabiegu.

5. Genotypowanie i analiza sekwencji

  1. Ekstrakcja genomowego DNA
    UWAGA: Użyliśmy zestawów do ekstrakcji DNA tkanek NucleoSpin, aby wyekstrahować genomowe DNA z tkanki ucha myszy zgodnie z zaleceniami producenta.
    1. Dodać 180 μl buforu T1 i 25 μl roztworu proteinazy K do próbki i mieszać przez wirowanie przez 10 s.
    2. Inkubować w temperaturze 56 °C przez 2 godziny lub do uzyskania całkowitej lizy. Wirować przez 10 s co 30 minut inkubacji.
    3. Dodać 200 μl buforu B3, energicznie wirować przez 30 s i inkubować w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
    4. Dodać 210 μl 100% etanolu do próbki i energicznie wirować.
    5. Dla każdej próbki umieść jedną kolumnę tkankową w probówce zbiorczej i nałóż próbkę do kolumny.
    6. Wirować przez 1 minutę przy 11 000 x g, odrzucić przepływ i umieścić kolumnę z powrotem w probówce zbiorczej.
    7. Dodać 500 μl buforu BW do przepłukania próbki (1. przemycie), odwirować przez 1 minutę przy 11 000 x g, odrzucić przepływ i umieścić kolumnę z powrotem w probówce zbiorczej.
    8. Dodać 600 μl buforu B5 do kolumny (2. płukanie), wirować przez 1 minutę przy 11 000 x g, odrzucić przepływ i umieścić kolumnę z powrotem w probówce zbiorczej.
    9. Odwirować kolumnę przez 1 minutę przy 11 000 x g, aby wysuszyć membranę krzemionkową i umieścić kolumnę tkankową NucleoSpin w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    10. Dodać 100 μl buforu BE, inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę, następnie odwirować przez 1 minutę przy 11 000 x g.
  2. Amplifikacja i oczyszczanie PCR
    1. Zaprojektuj startery za pomocą strony internetowej primer3 plus (https://primer3plus.com/) w celu amplifikacji sekwencji 400–500 pz otaczającej docelowe locus.
    2. Zaprojektuj nowy protokół PCR i przetestuj go empirycznie.
    3. Oczyść produkt PCR, aby usunąć niepożądane enzymy, nukleotydy, startery i składniki buforowe. Standardową metodę oczyszczania można zastosować w następujący sposób.
      1. Dodać 50 μl fenolu do 50 μl produktów PCR i wymieszać przez wirowanie.
      2. Wirować przez 1 minutę przy 11 000 x g i przenieść górną przezroczystą warstwę do nowej probówki.
      3. Dodaj 120 μl 99,5% etanolu i 20 μl 5 M octanu amonu i wiruj przez 30 s.
      4. Przechowywać w temperaturze pokojowej przez 10 minut i wirować przy 11 000 x g przez 10 minut.
      5. Odrzucić supernatant i przemyć osad DNA 1 ml 70% etanolu.
      6. Suszyć granulki w temperaturze suchej przez 10 minut i rozpuścić w 10 μl wody wolnej od RNazy.
        UWAGA: Zestawy do oczyszczania oparte na kolumnie PCR są ponownie opisane, ponieważ fenol jest toksyczny dla ludzi.
  3. Sekwencjonowanie Sangera
    1. Przeprowadzić analizę kwantyfikacyjną DNA (patrz tabela materiałów), aby określić ilościowo oczyszczony amplikon PCR.
    2. Wyślij produkt(y) PCR i starter(y) sekwencjonowania do dostawcy usług sekwencjonowania.
    3. Przeanalizuj sekwencję, korzystając z dostępnych stron internetowych.
      UWAGA: W tym badaniu do analizy sekwencji użyto CRISP-ID25 (http:/crispid.gbiomed.kuleuven.be/).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasza zmodyfikowana metoda kriokonserwacji jednokomórkowych zarodków, w tym inkubacja w HTF zawierającym 20% FBS przez 10 minut, a następnie kriokonserwacja w 1 M roztworze DMSO i DAP213, poprawiła tempo rozwoju zamrożonych zarodków do stadium dwukomórkowego (Rysunek 1, p = 0,009, test t-Studenta). Zamrożone i rozmrożone zarodki wykorzystano do produkcji myszy GMO, a warunki elektroporacji zoptymalizowano: pięć powtórzeń 25 V z impulsami 3 ms i odstępami 97 ms przy użyciu elektroporatora, jak opisano ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół pozwala na generowanie myszy GMO o wysokiej wydajności i niskich wskaźnikach mozaiki (Tabela 1). Umożliwia naukowcom bez zaawansowanych umiejętności manipulowania zarodkami łatwe tworzenie zmutowanych myszy, ponieważ wykorzystuje najnowsze i najbardziej przydatne osiągnięcia zarówno w inżynierii reprodukcyjnej, jak i technologiach edycji genomu: rybonukleoproteinę CRISPR/Cas9 (RNP) i elektroporację w zamrożonych zarodkach. Postępy te ułatwiły i przyspieszyły tworzenie myszy GMO. Jak opis...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie posiadają żadnych istotnych informacji finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pragniemy podziękować Hitomi Sawada i Elizabeth Garcia za opiekę nad zwierzętami. Praca ta była wspierana przez KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 i 16K01946) oraz Hokugin Research Grant (dla H.N.) oraz Jichi Medical University Young Investigator Award (dla H.U.). Fundacja Stypendialna Otsuka Toshimi wsparła medycynę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25 M SacharozaARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japonia)SACHAROZA
1 M DMSOARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japonia)1M DMSO
ButorphanolMeiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokio, Japonia)Vetorphale 5mg
Cas9 białko: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLSIntegrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)1081060
Myszy C57BL/6JJaponia SLC (Hamamatsu, Japonia)Nie
DAP213ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japonia)DAP213
FBSSigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)ES-009-C
hCGMOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokio, Japonia)HCG Mochida 3000
HTFARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japonia)HTF
Myszy ICRJaponia SLC (Hamamatsu, Japonia)Nie dotyczy
IsofluranePetterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO)07-893-1389
KSOMARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japonia)KSOM
LN2 TankChart Industries (Ball Ground, GA)XC 34/18
M2ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japonia)M2
MedetomidineNippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd. (Koriyama, Japonia)1124401A1060
MikroskopNikon Co. (Tokio, Japonia)SMZ745T
MidazolamSandoz K.K. (Tokio, Japonia)1124401A1060
Bufor wolny od nukleazIntegrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)1072570
Zestaw do ekstrakcji DNA nukleospinowegoTakara Bio Inc (Kusatsu, Japonia)740952 .5
Jednootworowe szkło ślizgoweMatsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japonia)S339929
Elektroporator jednostopniowyBEX Co., Ltd. (Tokio, Japonia)CUY21EDIT II
Ciecz parafinowaNACALAI TESQUE Inc. (Kioto, Japonia)SP 26137-85
Elektroda płytkowa platynowaBEX Co., Ltd. (Tokio, Japonia)LF501PT1-10, GE-101
PMSGASKA Animal Health Co., Ltd (Tokio, Japonia)SEROTROPIN 1000
Jodek PowidonuProfessional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY)C12400
Minimalna niezbędna pożywka w surowicy: OptiMEM ISigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)22600134
Dwustopniowy elektroporatorNepa Gene Co., Ltd. ( Ichikawa, Japonia)NEPA21
dotyczy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA - guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-822 (2012).
  3. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  4. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  5. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  6. Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355(2013).
  7. Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Developmental Biology. 393 (1), 3-9 (2014).
  8. Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
  9. Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
  10. Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382(2014).
  11. Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315(2015).
  12. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  13. Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
  14. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474(2018).
  15. Nakagawa, Y., et al. Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).
  16. Darwish, M., et al. Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain. Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).
  17. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  18. Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility. Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).
  19. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
  20. Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments. Bioengineering. 6 (3), 63(2019).
  21. Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 4811(2019).
  22. Takeo, T., Nakagata, N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).
  23. Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development. Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).
  24. Nakagata, N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).
  25. Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing. Scientific Reports. 6, 28973(2016).
  26. Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation. Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).
  27. Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases. Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).
  28. Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).
  29. Dumeau, C. E., et al. Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1. Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).
  30. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  31. Mizuno, N., et al. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  32. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  33. Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
  34. Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
  35. Smits, A. H., et al. Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts. Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

CRISPR Cas9elektroporacja zarodk wzarodki jednokom rkoweprotok kriokonserwacjizap odnienie in vitromyszy z knockoutemmyszy z knock inemredukcja mozaicyzmu

Powiązane artykuły