Artykuł metodologiczny

Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji

DOI:

10.3791/60829

⸱

27 kwietnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Targeted Drug Delivery and Personalized Medicine Technologies, Department of Chemical Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2The Norman Seiden Multidisciplinary Program for Nanoscience and Nanotechnology, Technion - Israel Institute of Technology, 3The Interdisciplinary Program for Biotechnology, Technion - Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę, materiały, sprzęt i kroki do oddolnego przygotowania RNA i komórek syntetycznych produkujących białka. Wewnętrzna komora wodna komórek syntetycznych zawierała lizat bakteryjny S30 zamknięty w dwuwarstwie lipidowej (tj. stabilnych liposomach), przy użyciu metody przenoszenia emulsji woda w oleju.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podejście do montażu oddolnego do budowy syntetycznych komórek jest skutecznym narzędziem do izolowania i badania procesów komórkowych w środowisku naśladującym komórki. Co więcej, opracowanie bezkomórkowych systemów ekspresji wykazało zdolność do odtwarzania procesów produkcji, transkrypcji i translacji białek (DNA→RNA→białko) w kontrolowany sposób, wykorzystując biologię syntetyczną. Tutaj opisujemy protokół przygotowania bezkomórkowego systemu ekspresji, w tym produkcji silnego lizatu bakteryjnego i kapsułkowania tego lizatu w bogatych w cholesterol gigantycznych pęcherzykach unilamelarnych na bazie lipidów (GUV) (tj. stabilnych liposomów), w celu utworzenia komórek syntetycznych. W protokole opisano metody przygotowania składników komórek syntetycznych, w tym produkcję aktywnych lizatów bakteryjnych, a następnie szczegółowe przygotowanie komórek syntetycznych krok po kroku w oparciu o metodę transferu emulsji woda w oleju. Ułatwiają one produkcję milionów syntetycznych komórek w prosty i niedrogi sposób, przy zachowaniu dużej wszechstronności w produkcji różnych rodzajów białek. Uzyskane syntetyczne komórki mogą być wykorzystane do badania produkcji i aktywności białek/RNA w izolowanym środowisku, w ukierunkowanej ewolucji, a także jako platforma kontrolowanego dostarczania leków do produkcji białek terapeutycznych na żądanie wewnątrz organizmu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Syntetyczne komórki to sztuczne cząsteczki podobne do komórek, naśladujące jedną lub wiele funkcji żywej komórki, takich jak zdolność do podziału, tworzenia interakcji błonowych i syntezy białek na podstawie kodu genetycznego1,2,3. Komórki syntetyczne, które otaczają systemy bezkomórkowej syntezy białek (CFPS), mają wysoką modułowość ze względu na ich zdolność do wytwarzania różnych białek i sekwencji RNA po zmianach w matrycy DNA. Stanowiąc atrakcyjną alternatywę dla obecnych podejść do produkcji białek, systemy CFPS opierają się na lizacie komórkowym, oczyszczonych składnikach lub składnikach syntetycznych i obejmują wszystkie mechanizmy transkrypcji i translacji wymagane do syntezy białek, takie jak rybosomy, polimeraza RNA, aminokwasy i źródła energii (np. 3-fosfoglicerynian i trifosforan adeniny)4,5,6,7,8,9. Enkapsulacja systemu CFPS wewnątrz pęcherzyków lipidowych umożliwia prostą i wydajną produkcję białek bez zależności od żywej komórki10. Co więcej, platforma ta umożliwia syntezę peptydów, które mogą ulegać degradacji w naturalnych komórkach, produkcję białek, które są toksyczne dla żywych komórek, oraz modyfikację białek za pomocą nienaturalnych aminokwasów11,12. Komórki syntetyczne zostały wykorzystane jako model do celów badawczych badających minimalne składniki komórkowe wymagane do umożliwienia życia komórkowego z perspektywy ewolucyjnej1,13. Syntetyczne komórki były również wykorzystywane do budowy i implementacji obwodu genetycznego oraz jako modele ukierunkowanej ewolucji14,15,16. Inne badania koncentrowały się na zdolności komórek syntetycznych do naśladowania aktywności biologicznej komórek naturalnych, mając na celu zastąpienie uszkodzonych komórek naturalnych, takich jak komórki beta u pacjentów z cukrzycą17. Co więcej, zdolność tych CFPS hermetyzujących syntetyczne komórki do produkcji różnorodnych białek terapeutycznych ilustruje ich potencjał do wykorzystania w zastosowaniach klinicznych18.

Tutaj opisujemy oddolny protokół laboratoryjny (Rysunek 1) do produkcji RNA i syntetycznych komórek produkujących białka w oparciu o system CFPS zamknięty w pęcherzyku lipidowym. Pokazuje to potencjalne zastosowanie syntetycznych platform komórkowych jako nowatorskich systemów dostarczania leków do produkcji terapeutycznego leku białkowego na miejscu in vivo19. Wcześniejsze badania dotyczyły optymalizacji reakcji CFPS i procesów przygotowania lizatu komórkowego4,8,20. Ponadto do przygotowania liposomów wielkości komórki zastosowano kilka technik, takich jak metody stabilizacji kropel na bazie mikroprzepływów i polimerów21,22,23, które różnią się również składem lipidowym liposomów24,25,26. W przedstawionym protokole komórki syntetyczne są wytwarzane metodą transferu emulsji woda w oleju, a proces enkapsulacji odbywa się w niskich temperaturach (<4 °C)5,10,24,27,28. Stwierdzono, że te łagodne warunki sprzyjają zachowaniu biofunkcjonalnej integralności maszynerii molekularnej, a mianowicie rybosomów i białek27,29,30. Skład lipidowy cząstek składa się zarówno z cholesterolu, jak i 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (POPC). Pierwszy z nich znajduje się we wszystkich błonach komórkowych ssaków i jest niezbędny do zmniejszenia stabilności, sztywności i przepuszczalności błony, a drugi naśladuje skład fosfolipidów ssaków11,13. Molekularna maszyneria transkrypcji i translacji komórkowej jest ekstrahowana ze szczepu BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), który jest przekształcany za pomocą plazmidu pAR1219 z nadekspresją polimerazy T7 RNA w celu zwiększenia siły działania CFPS i syntezy białek. System ten został wykorzystany do produkcji białek diagnostycznych i terapeutycznych o masie cząsteczkowej do 66 kDa in vitro i in vivo19,31. Poniższy protokół zapewnia prostą i skuteczną metodę produkcji syntetycznego systemu komórkowego, który może odpowiedzieć na szeroki zakres podstawowych pytań związanych z syntezą białek w przyrodzie, a także może być wykorzystany do zastosowań związanych z dostarczaniem leków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ilustracja pełnego protokołu produkcji ogniw syntetycznych jest przedstawiona w Rysunek 1. W zależności od potrzeb użytkownika, części protokołu dotyczące ekspresji białek (sekcja 3.2) i tworzenia komórek syntetycznych (sekcja 4) mogą być również przeprowadzane niezależnie (z pewnymi adaptacjami).

1. Przygotowanie lizatu S30-T7

  1. Na płytce z agarem LB uzupełnionym ampicyliną o stężeniu 50 μg / ml ampicyliny w celu uzyskania pojedynczych kolonii przekształciła się w polimerazę RNA T7 wyrażającą plazmid pAR1219 na płytce LB-agar uzupełnionej ampicyliną o stężeniu 50 μg / ml w celu uzyskania pojedynczych kolonii.
  2. Przygotować roztwór startowy: Inokulować pojedynczą kolonię w 5 ml pożywki LB uzupełnionej 50 μg/ml ampicyliny w 100 ml kolbie Erlenmeyera i hodować przez noc przy użyciu wytrząsarki w inkubatorze podłogowym przy 250 obr./min i temperaturze 37 °C. Przygotować duplikaty.
  3. Zaszczepić każdy 5 ml startera oddzielnie w 500 ml pożywki gruźliczej uzupełnionej 50 μg/ml ampicyliny w 2-litrowej kolbie Erlenmeyera z przegrodami i hodować ją za pomocą wytrząsarki do inkubatora podłogowego z prędkością 250 obr./min i temperaturze 37 °C, aż osiągnie OD600 0,8-1. Okresowo monitorować za pomocą spektrofotometru.
  4. Dodaj 2-3 ml 100 mM zapasu IPTG (aby osiągnąć 0,4 - 0,6 mM) w celu indukcji ekspresji polimerazy T7 RNA i kontynuuj hodowlę, aż osiągnie OD600≈4.
  5. Przenieść roztwór z każdej kolby Erlenmeyera do dwóch wysterylizowanych probówek wirówkowych o pojemności 250 ml.
  6. Odwirować każdy z nich przy 7 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    UWAGA: Na tym etapie osad bakteryjny można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka dni przed przejściem do kolejnych kroków.
  7. Ponownie zawiesić każdą osadkę w 250 ml zimnego (4 °C) buforu lizatu S30 i odwirować przy 7 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Bufor lizatu S30 służy do utrzymania stabilności białka po przeprowadzeniu lizy komórek przy użyciu homogenizatora w kroku 1.9. Począwszy od tego kroku naprzód, wszystkie kroki aż do wersji 1.12 powinny być wykonywane kolejno i szybko.
    UWAGA: Przed przejściem do następnego kroku należy wstępnie schłodzić końcówki i 1,5-mililitrowe fiolki, które będą potrzebne do przechowywania lizatu
  8. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wszystkie granulki razem w 15 ml zimnego buforu lizatu S30. Przefiltrować zawiesinę za pomocą gaziku.
    UWAGA: 15 ml roztworu odpowiada minimalnej objętości homogenizatora. Należy zauważyć, że ważne jest również stężenie bakterii.
  9. Homogenizować pod ciśnieniem roboczym 15 000 psi, przy ciśnieniu powietrza 4 bary (dwa przejścia) w celu rozbicia komórek. Unikaj rozcieńczania roztworu, aby uzyskać bardziej skoncentrowany i aktywny lizat.
  10. Dodać 100 μl 0,1 M DTT (UWAGA) na 10 ml homogenizowanej zawiesiny.
  11. Odwirować zawiesinę o sile 24 700 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  12. Wykonaj szybko następujący krok, aby zachować aktywność lizatu: podzielić supernatant jeden po drugim na 200 μl podwielokrotności we wstępnie schłodzonych fiolkach o pojemności 1,5 ml i natychmiast zamrozić je ciekłym azotem. Przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania.
    UWAGA: Naziemna telewizja cyfrowa jest klasyfikowana jako drażniąca i szkodliwa i dlatego należy obchodzić się z nią ostrożnie.

2. Przygotowanie lipidów w roztworze oleju

  1. Rozpuścić POPC i cholesterol w chloroformie (UWAGA) oddzielnie, każdy do końcowego stężenia 100 mg/ml. Wirować każdą fiolkę osobno.
    1. Połącz składniki w szklanej fiolce o pojemności 2 ml: dodaj 50 μl POPC w chloroformie, 50 μl cholesterolu w chloroformie i 500 μl oleju mineralnego. Na 100 μl komórek syntetycznych potrzebne są 2 fiolki lipidów w oleju.
    2. Wirować, a następnie ogrzewać przez około 1 godzinę w temperaturze 80 °C w okapie chemicznym w celu odparowania chloroformu. Upewnij się, że nastąpiło całkowite odparowanie, postępując zgodnie z określonym czasem/warunkami i monitorując objętość roztworu.
      UWAGA: Powstały roztwór lipidowy w oleju można przechowywać w temperaturze pokojowej do dwóch tygodni. W celu poprawy wyników zaleca się stosowanie świeżego preparatu przed każdym eksperymentem. Proporcje lipidów i cholesterolu można zmieniać w zależności od pożądanego składu błony. Wysokie stężenie cholesterolu może prowadzić do tworzenia się agregatów w końcowym syntetycznym roztworze komórkowym.
      UWAGA: Chloroform jest klasyfikowany jako drażniący i szkodliwy i dlatego należy go traktować ostrożnie i w miejscach z ekstrakcją oparów.

3. Przygotowanie roztworów zewnętrznych, pre-wewnętrznych i żywieniowych

  1. Przygotowanie roztworów podstawowych
    1. Przygotować roztwory podstawowe wymienione w Tabeli 2 przy użyciu wody ultraczystej (UPW).
      UWAGA: Roztwory podstawowe należy przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia. Odczynnik 7 ma tendencję do tworzenia agregatów. Podgrzanie do 37 °C zmniejszy agregację. Niewielka agregacja nie wpłynie znacząco na reakcję. Roztwór odczynnika 8 jest mleczny i mętny.
  2. Rozwiązanie zewnętrzne
    1. Rozpuścić glukozę wH2Owolnym od DNaz/RNaz do końcowego stężenia 200 mM.
    2. Na 100 μl roztworu wewnętrznego przygotować 1,6 ml roztworu zewnętrznego.
  3. Rozwiązanie wstępne
    1. Dodać odczynniki 1-14 zgodnie z ilościami i stężeniem wymienionymi w tabeli 2. Na przykład, aby uzyskać końcową syntetyczną objętość komórek 100 μl, przygotuj 100 μl roztworu wewnętrznego.
      UWAGA: Upłu upłu należy dodać, aby uzupełnić ostateczną wymaganą objętość. Na tym etapie mieszaninę można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka godzin.
  4. Rozwiązanie do karmienia
    1. Dodać wszystkie odczynniki zgodnie z ilościami i stężeniami podanymi w tabeli 3.
      UWAGA: Użyj stosunku 1:1 roztworu do karmienia: roztwór wewnętrzny. Aby uzyskać końcową syntetyczną objętość komórek wynoszącą 100 μl, przygotuj 100 μl roztworu do karmienia. Zaleca się przygotowanie niewielkiej nadmiaru roztworu zewnętrznego, wewnętrznego i paszowego.

4. Przygotowanie komórek syntetycznych

UWAGA: Następujące objętości są dostosowane do przygotowania 100 μL syntetycznych komórek.

  1. Syntetyczne komórki produkujące białko
    1. W probówce o pojemności 15 ml umieść 12 ml roztworu zewnętrznego i powoli dodaj na wierzch warstwę 500 μl lipidów w roztworze oleju. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
    2. Aby sfinalizować przygotowanie roztworu wewnętrznego: wymieszać składniki roztworu wewnętrznego na kruszonym lodzie do końcowej objętości 100 μl, rozmrażając i dodając lizat S30-T7 (odczynnik 15) i plazmid DNA (odczynnik 16) do przechowywanej mieszaniny.
    3. Do drugiej szklanej fiolki o pojemności 2 ml z 500 μl lipidów w roztworze oleju dodać 100 μl roztworu wewnętrznego. Energicznie pipetuj w górę i w dół przez 1 minutę i wiruj przez kolejną minutę na poziomie piątym.
      1. Inkubować przez 10 minut na kruszonym lodzie i powoli dodawać otrzymaną emulsję na wierzch fazy olejowej w probówce o pojemności 15 ml (z 4.1.1).
    4. Wirować przez 10 minut przy 100 x g i 4 °C, a następnie wirować przez 10 minut przy 400 x g i 4 °C. Pod koniec wirowania należy zaobserwować osad na dnie probówki.
      UWAGA: Preferowane jest tutaj użycie wahadłowego wirnika wirówki kubełkowej w celu uzyskania lepszego pokrycia drugiej warstwy lipidów podczas przechodzenia kropelek wody w oleju przez interfazę. W przypadku, gdy nie ma obserwowalnego osadu, prędkość wirowania można zwiększyć do 1000 x g. W przeciwnym razie zapoznaj się z sekcją Dyskusja odnoszącą się do ciężaru właściwego roztworu zewnętrznego.
    5. Wyciągnij osad.
      1. Usuń nadmiar warstwy oleju.
      2. Użyj przyciętej końcówki pipety wypełnionej około 400 μl roztworu zewnętrznego, aby usunąć osad. Uwolnić zewnętrzny roztwór podczas przechodzenia przez fazę olejową, aby zebrać tylko osad w fazie wodnej.
        1. Wytrzyj końcówkę po wyjęciu granulki, aby uniknąć przenoszenia resztek oleju i przenieś granulkę do czystej probówki o pojemności 1,5 ml.
    6. Wirować przez 10 minut w temperaturze 1 000 x g i temperaturze 4 °C, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl roztworu zasilającego (stosunek 1:1 roztworu wewnętrznego do karmienia).
      UWAGA: Również w tym przypadku można zastosować wirnik wirówki o stałym kącie nachylenia.
    7. W celu ekspresji białka inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C bez wstrząsania.
      UWAGA: Optymalny czas inkubacji różni się w zależności od różnych białek.
    8. Ocenić ilość wyprodukowanego białka za pomocą odpowiedniej metody zgodnie z docelowymi właściwościami białka.
  2. Zalecane grupy kontrolne
    1. Potwierdzenie roztworu wewnętrznego i aktywności lizatu
      1. Przygotuj kompletny roztwór wewnętrzny (z DNA i lizatem S30-T7).
      2. Natychmiast inkubować powyższą reakcję za pomocą wytrząsarki z inkubatorem podłogowym o prędkości 250 obr./min lub termomieszalnika przy 1200 obr./min, w stałej temperaturze 37 °C przez 2 godz.
        UWAGA: Dostosuj czas inkubacji, aby odpowiadał czasowi inkubacji komórek syntetycznych.
    2. Ogniwa syntetyczne
      1. Ujemna grupa kontrolna: Przygotować protokół przedstawiony w ppkt 4.1 z roztworem wewnętrznym bez DNA.
      2. Kontrola pozytywna: Przygotować protokół przedstawiony w ppkt 4.1 z roztworem wewnętrznym zawierającym plazmid T7 kodujący gen reporterowy.
        UWAGA: Dodaj pozytywną grupę kontrolną składającą się z genu reporterowego, takiego jak sfGFP, wraz z grupami testowymi, aby zapewnić etap skuteczności enkapsulacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół przygotowania syntetycznych komórek poprzez zamknięcie systemu S30-T7 CFPS opartego na BL21 E. coli wewnątrz pęcherzyków lipidowych. Schematyczny opis procesu przygotowania, który zawiera obraz każdego etapu, znajduje się w Rysunek 2. Powodzenie procesu przygotowania komórek syntetycznych zależy od odpowiedniego przebiegu każdego etapu i zależy od różnych parametrów. Protokół powinien być dostosowany do produkcji określonego białka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten wprowadza prostą i niedrogą metodę produkcji dużych ilości syntetycznych komórek produkujących białka. Wydajność aktywnych komórek zależy od starannego i dokładnego wykonania protokołu z naciskiem na kilka krytycznych etapów. W sekcji przygotowania lizatu tej metody konieczne jest osiągnięcie odpowiedniej gęstości bakterii przed lizą komórek, aby uzyskać wystarczającą ilość białek w lizacie bakteryjnym. Po drugie, proces lizy należy przeprowadzić w temperaturze 4 °C, a lizat szybko zamrozić ciekłym azotem w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez ERC-STG-2015-680242.

Autorzy dziękują również za wsparcie Technion Integrated Cancer Center (TICC); Russell Berrie Nanotechnology Institute; Lorry I. Lokey Interdisciplinary Center for Life Sciences & Engineering; izraelskiego Ministerstwa Gospodarki za grant Kamin (52752); izraelskiego Ministerstwa Nauki, Technologii i Przestrzeni Kosmicznej - Office of the Chief Scientist (3-11878); Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); Izraelskie Stowarzyszenie Walki z Rakiem (2015-0116); Niemiecko-Izraelskiej Fundacji Badań Naukowych i Rozwoju za grant GIF Young (I-2328-1139.10/2012); Program Unii Europejskiej FP-7 IRG na rzecz stypendium na integrację zawodową (908049); grant Centrum Badań nad Fosfolipidami; Rosenblatt Foundation na rzecz badań nad rakiem, stypendium Mallat Family Foundation; oraz Fundacja Rodziny Ungerów. A. Schroeder dziękuje za stypendia Alon i Taub. O. Adir uznaje stypendia Shermana i Gutwirtha. G. Chen uznaje Stypendium Shermana. N. Krinsky dziękuje Baronessie Ariane de Rothschild Women Doctoral Program z Fundacji Rothschildów w Cezarei.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
A. Odczynniki wymagane do etapu 1 (przygotowanie lizatu S30-T7)
E.coli BL21 (DE3) NEBC2527E.coli BL21 (DE3).
pAR1219SigmaT2076Wektor TargeTron do transformacji.
Roztwór podstawowy 50 mg/ml ampicylinySigmaA9518przechowywany w temperaturze -20 °C.
10 g/L BaktootryptonBD Bioscience 211705Do przygotowania płytki agarowej Luria Bertani (LB) (1,5%).
10 g/L Chlorek sodu (NaCl)Bio-Lab19030591
5 g/L Ekstrakt z drożdży bakto-drożdżowychBD Bioscience 212750
15 g/L Agar agarowy oczyszczonyMerck1.01614.5007
50 &mikro; g/ml AmpicillinSigmaA9518
10 g/L Bakto-tryptonBD Bioscience 211705Do przygotowania pożywki Luria Bertani (LB) (20 ml).
10 g/L Chlorek sodu (NaCl)Bio-Lab19030591
5 g/L Ekstrakt z drożdży bakto-drożdżowychBD Bioscience 212750
50 & mikro; g/ml AmpicillinSigmaA9518
12 g/L Bakto-tryptonBD Bioscience 211705Do przygotowania pożywki Terrific Bulth (TB) (1 L).
24 g/L Ekstrakt z drożdży bakto-drożdżowychBD Bioscience 212750
4% (v/v) Glicerol bezwodnyBio-Lab7120501
2,32 g/L K2HPO4Spektrum chemiczneP1383
12,54 g/L KH2PO4Spektrum chemiczneP1380
  50 &mikro; g/ml AmpicillinSigmaA9518
Roztwór podstawowy 100 mM &β-D-1-tiogalaktopiranozydu izopropylu (IPTG) INALCOINA-1758-1400Filtrowane za pomocą 0,2 i mikro; m hydrofilowy filtr strzykawkowy PVDF.
Roztwór podstawowy 0,1 M ditiotreitolu (DTT) TCID1071Filtrowane przy użyciu 0,2 i mikro; m hydrofilowy filtr strzykawkowy PVDF.
10 mM octan trisu przy pH = 7,4Légétă T1503S30 bufor lizatu (1,5 l)
14 mM octan magnezuMerck1.05819.0250
60 mM octan potasuCarlo Erba470147
1 mM DTTTCID1071
0,5 mL/L 2-merkaptoetanolSigmaM6250
Sprzęt wymagany do kroku 1
100 ml sterylizowane kolby ErlenmeyeraThermo Scientific50-154-28462 kolby
2 L sterylizowane kolby Erlenmeyera z przegrodamiKIMAX-KIMBLE256302 kolby
Wytrząsarka podłogowaMRCTOU-120-2Wytrząsarka laboratoryjna 450x450mm, 400 obr./min, 70 stopni;
C WirówkaThermo Scientific75004270(75003340) - Rotor o stałym kącie nachylenia Fiberlite F10-6 x 100 LEX.
Powinien umożliwiać co najmniej 13 000 x g.        * Wstępnie schłodzony do 4 stopni C.
Homogenizator wysokociśnieniowyAVESTINEmulsiFlex-C3Wstępnie schłodzony do 4 stopni C.
-80oC zamrażarkaSO-LOWU85-18
Sterylizowane plastikowe probówki 1,5 mlEppendorf30120086Najlepiej wstępnie schłodzone do -20 °C.
SpektrofotometrTECANIN-MNANOInfinite M200 pro
96-dołkowa przezroczysta płytkaThermo Scientific167008
Sterylizowany cylinder z podziałkąCorning
Sterylizowane probówki wirówkoweEppendorf30120086Najlepiej wstępnie schłodzone do -20 °C.
Sterylizowane końcówki do pipetCorningNajlepiej wstępnie schłodzone do -20 stopni C.
Wiadro na kruszony lódBel-ArtM18848-4001
Mały zbiornik ciekłego azotuNALGENE4150-4000
B. Odczynniki wymagane w kroku 3 (lipidy w przygotowaniu roztworu oleju):
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-fosfocholina (POPC)Lipoid556400Cholesterol
w proszku SigmaC8667Chloroform w proszku
Bio-Lab3082301
Olej mineralnySigmaM5904Lekki olej
Sprzęt wymagany do kroku 2
Vortex mixerPrzemysł naukowySI-0256
Blok grzewczyTECHNEFDB03ADWstępnie podgrzany do 80 stopni C.
Powinien umożliwiać kontrolowaną temperaturę. 
2 ml szklane fiolki z zakręcaną szyjkąCSI Innowacje analityczneVT009M-1232Aby uzyskać większą skalę, użyj sokołów o pojemności 50 ml i odparuj chloroform za pomocą wyparki obrotowej.
Zakrętka 9mmCSI Analytical InnovationsC395R-09LC
strong>C. Odczynniki wymagane do kroku 3 (mieszaniny reakcyjne wewnętrzne i zasilające):
HEPESSpectrumH10891 M HEPES-KOH (pH = 8) - bufor pH
Wodorotlenek potasu (KOH)Frutarom55290
1 M Octan magnezuMerck1.05819.0250Kofaktor i stabilizor ładunku ujemnego.
1 M octan potasuCarlo Erba470147Stabilizor ładunku ujemnego.
5,2 M octan amonuMerck1.01116.1000Stabilizuje ładunek ujemny.
50% (w/v) Glikol polietylenowy 6000 (PEG)Merck8.07491.1000Zwiększa stężenie makrocząsteczek.
0,5 M 3-fosfoglicerynian (3-PGA)SigmaP8877Wtórne źródło energii.
50 mM Mieszanina aminokwasów ISigmaLAA21-1KTDodatek aminokwasów.
Zawiera: 50 mM każdego z następujących 17  naturalnych aminokwasów - alaniny, argininy, asparaginy, kwasu asparaginowego, cysteiny, glutaminy, kwasu glutaminowego, glicyny, histydyny, izoleucyny, leucyny, lizyny, metioniny, proliny, seryny, treoniny i waliny.
50 mM Mieszanina aminokwasów IISigmaLAA21-1KTDodatek aminokwasowy.
Zawiera: 50 mM każdego z następujących 3 naturalnych aminokwasów - tryptofanu, fenyloalaniny i tyrozyny.
100 mM trifosforan adeniny (ATP)SigmaA3377Nukleotydy i źródło energii.
50 mM trifosforan guanidyny (GTP)SigmaG8877Nukleotydy i źródło energii.
100 mM trifosforan urydyny (UTP)ACROS ORGANICS226310010Dodatek nukleotydów.
100 mM Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)INALCOINA-1758-1400Indukcja ekspresji genów.
2 M SacharozaJ.T. Baker1933078Generowanie gradientu gęstości.
2 M GlucoseSigma16301Generowanie gradientu gęstości.
H2O Ultraczysta woda (UPW)Bio-Lab2321777500DNaza i
Lizat S30-T7__Przygotowany w kroku 1.                                                                                                                                              Źródło transkrypcji & komponenty tłumaczeniowe.
Przechowywać pod kątem -80 stopni; c, rozmrozić na rozbitym lodzie tuż przed użyciem.
Zapas plazmidu DNA do wyboru__Zawiera sekwencję żądanego białka.
Pod promotorem T7
D. Sprzęt wymagany do kroku 4 (przygotowanie komórek syntetycznych)
Wytrząsarka podłogowa lub ThermomixerMRCTOU-120-2Wytrząsarka laboratoryjna 450x450mm, 400 obr./min, 70 & C
PHMT Grant Bio PSC18Wirówka do termomieszalnika
Thermo Scientific75004270(75003629) - TX-400 4 x 400 ml Wahadłowy wirnik kubełkowy.
Nadaje się do probówek o pojemności 15 ml.
Najlepiej wiadra wahadłowe.
Powinny umożliwiać co najmniej 1000 x g.
Wstępnie schłodzone do 4 & stopni C.
Wirówka stołowaThermo Scientific75002420(75003424) - rotor 24 x 1,5/2,0 ml z ClickSeal.
Nadaje się do fiolek Eppendorf.
Wstępnie schłodzony do 4 stopni C.
Mieszalnik wirowyPrzemysł naukowySI-0256
Wiadro na kruszony lódBel-ArtM18848-4001
2 ml szklane fiolki z zakręcaną szyjkąCSI Innowacje analityczneVT009M-1232
Sterylne plastikowe probówki 15 mlThermo Scientific339651
Sterylizowane plastikowe probówki 1,5 mlEppendorf30120086
Sterylizowane końcówki do pipetCorningSterylizowane w autoklawie.
Gürgen < wolny od RNazy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
  2. Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
  3. Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
  4. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
  5. Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
  6. Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
  7. Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
  8. Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
  9. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
  10. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  11. He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
  12. Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
  13. Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
  14. Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
  15. Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
  16. Arnold, F. H. Design by directed evolution. Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).
  17. Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
  18. Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
  19. Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163(2018).
  20. Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
  21. Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
  22. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447(2016).
  23. Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
  24. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578(2014).
  25. Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
  26. Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
  27. Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
  28. Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
  29. Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. Biosynthesis of proteins inside liposomes. , Humana Press. 127-145 (2010).
  30. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  31. Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137(2016).
  32. Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79(2006).
  33. Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
  34. Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
  35. Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278(2016).
  36. Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167(2017).
  37. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bezkom rkowe ekstrakty bia koweprodukcja bia ekenkapsulacja w liposomachmetoda transferu emulsyjnegoprzygotowanie lizatu bakteryjnegoanaliza cytometrycznadetekcja metod Western blotmikroskopia fluorescencyjnaliposomy bogate w cholesterol

Powiązane artykuły