Protokół przedstawia zoptymalizowane parametry przygotowania termoczułych liposomów za pomocą urządzenia mikrofluidycznego do mikromiksera w jodełkę. Umożliwia to również kokapsułkowanie doksorubicyny i zieleni indocyjaninowej do liposomów oraz fototermiczne uwalnianie doksorubicyny w celu kontrolowanego/wyzwalanego uwalniania leku.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikroprzepływowa produkcja liposomów wrażliwych na temperaturę zawierających lizolipidy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Prezentowany protokół umożliwia wysokoprzepustowe ciągłe przygotowanie liposomów wrażliwych na niską temperaturę (LTSL), które są zdolne do ładowania leków chemoterapeutycznych, takich jak doksorubicyna (DOX). Aby to osiągnąć, mieszaninę lipidów etanolowych i roztwór siarczanu amonu wstrzykuje się do naprzemiennego mikromiksera w jodełkę (SHM). Roztwory są szybko mieszane przez SHM, zapewniając jednorodne środowisko rozpuszczalnika do samoorganizacji liposomów. Zebrane liposomy są najpierw wyżarzane, a następnie dializowane w celu usunięcia resztek etanolu. Gradient pH siarczanu amonu ustala się poprzez wymianę buforową roztworu zewnętrznego przy użyciu chromatografii wykluczania wielkości. DOX jest następnie zdalnie ładowany do liposomów z wysoką skutecznością enkapsulacji (> 80%). Otrzymane liposomy są jednorodne pod względem wielkości o średniej średnicy Z wynoszącej 100 nm. Są one zdolne do wyzwalanego temperaturą impulsowego uwalniania zamkniętego DOX w obecności łagodnej hipertermii (42 °C). Zieleń indocyjaninowa (ICG) może być również współładowana do liposomów w celu uwolnienia DOX w bliskiej podczerwieni za pomocą lasera. Podejście mikroprzepływowe zapewnia wysokowydajne, powtarzalne i skalowalne przygotowanie LTSL.
Wprowadzenie
LTSL formulacja jest klinicznie istotnym produktem liposomalnym, który został opracowany w celu dostarczania leku chemioterapeutycznego doksorubicyny (DOX) i umożliwia skuteczne uwalnianie leku w klinicznie osiągalnej łagodnej hipertermii (T ≈ 41 °C)1. Preparat LTSL składa się z 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DPPC), lizolipidu 1-stearoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfatydylocholiny (MSPC; M oznacza "mono") i pegylowany lipid 1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[methoxy(glikol polietylenowy)-2000] (DSPE-PEG2000). Po osiągnięciu temperatury przemiany fazowej (Tm ≈ 41 °C) l....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Konfiguracja sprzętu
- Zmontuj pompy strzykawkowe i SHM w następujący sposób.
- Połącz port „To Computer” wtórnej pompy strzykawkowej (Pompa 02, dla roztworu wodnego) z portem „To Network” głównej pompy strzykawkowej (Pompa 01, dla etanolowego roztworu lipidów) za pomocą kabla sieciowego pompa-pompa (Rysunek 1, żółty).
- Połącz port „To Computer” pompy głównej z portem „RS232 Serial” komputera za pomocą kabla sieciowego PC-pompa (Rysunek 1, niebieski).
- Podłącz przewody do każdego z wlotów i wylotów SHM, używając nakrętki i tulei. Prz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przygotowanie LTSL za pomocą mikrofluidyki wymaga zastosowania składu lipidowego DPPC/MSPC/DSPE-PEG20 (stosunek molowy 80/10/10; LTSL10). Rysunek 7A (po lewej) przedstawia wygląd świeżo przygotowanego LTSL10 z etapu 2.9, który ma postać przejrzystego i niewiskozycznego płynu. Formuła LTSL10 została opracowana na podstawie konwencjonalnej formuły LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG20, stosunek molowy 86/10/4), ponieważ LTSL4 tworzy.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony protokół opisuje przygotowanie liposomów wrażliwych na niską temperaturę (LTSL) przy użyciu naprzemiennego mikromiksera w jodełkę (SHM). Preparat LTSL10 umożliwia wywołane temperaturą impulsowe uwalnianie doksorubicyny w ciągu 5 minut przy klinicznie osiągalnej temperaturze hipertermicznej 42 °C. Zieleń indocyjaninowa (ICG) może być również współładowana do ogrzewania fototermicznego wyzwalanego uwalnianiem DOX. Metoda opiera się na: (i) samoorganizacji fosfolipidów w liposomach w homogenizowanym środowisku.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship) oraz Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) (EP/M008657/1) za dofinansowanie.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DPPC) | Lipoid | PC 16:0/16:0 (DPPC) | |
| 1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (DSPE-PEG2000)Lipoid | PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE) | ||
| 1-stearoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina (MSPC) | Avanti Polar Lipid | 855775P-500MG | Dystrybucja przez Sigma-Adrich; znany również jako Lyso 16:0 PC (nie mylić z 14:0/18:0 PC, który jest również określany jako MSPC) |
| Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)Adaptery | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| , żeńskie Luer Lock do 1/4"-28UNF | IDEX Health & Nauka | P-624 | Wymaga 2 jednostek. Do adapterów wlotowych |
| , montaż złączy, 1/4"-28UNF | IDEX Health & Nauka | P-630 | Wymaga 2 jednostek. (Jedna jednostka zawierała 2 nakrętki i 2 tuleje) |
| Siarczan amonu ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | 31119-1KG-M | |
| Fiolka Bijou | VWR | 216-0980 | 7 mL, przezroczysta, polistyrenowa fiolka |
| Filtr odśrodkowy | Sigma-Aldrich | UFC801008 | 10 kDa MWCO, Wirówka z filtrem odśrodkowym Amicon Ultra-4 |
| ThermoFisher Scientific | Heraeus Megafuge 8R | z wirnikiem | |
| o stałym kącie nachylenia HIGHConic IIICuvette | Fisher Scientific | 11602609 | Jednorazowa kuweta polistyrenowa, mała objętość, do pomiaru DLS |
| Zestaw do dializy - Pur-A-Lyzer Maxi | Sigma-Aldrich | PURX12015-1KT | 12-14 kDa |
| MWCO Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34943-1L-M | |
| DLS Instrument | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS90 | |
| Chlorowodorek doksorubicyny (DOX) | Apollo Scientific | BID0120 | |
| Instrument DSC TA | Instruments | TA Q200 DSC | |
| DSC Tzero Hermetyczne pokrywki | TA Instruments | 901684.901 | Do pomiaru DSC |
| DSC Tzero Pans | TA Instruments | 901683.901 | Do pomiaru DSC |
| Zestaw prasowy do próbek DSC Tzero | TA Instruments | 901600.901 | Do pomiaru |
| Etanol | VWR | 20821.330 | Absolutny, ≥ 99,8% |
| FC-808 System laserowy sprzężony z włóknem | CNI Optoelectronics Tech | FC-808-8W-181315 | Kolimator światłowodowy FOC-01-B w zestawie. |
| Okucie, 1/4"-28UNF do 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-200 | Do gniazdka |
| Światłowodowa sonda temperatury | Osensa | PRB-G40 | |
| Szklany naprzemienny mikromikser w jodełkę (SHM) | Darwin Microfluidics | Mikser w jodełkę - taśma | |
| Omega | DHT052020LD | Może być zastąpiony innym podgrzewaczem strzykawkowym, takim jak "HTC" lub "seria SRT" w celu wolniejszego nagrzewania. Ręczne okablowanie do 3-pinowej wtyczki wymagane dla modeli 240 V | |
| Indocyanine Green | Adooq | A10473-100 | Dystrybuowane przez Bioquote Limited (Wielka Brytania) |
| Strzykawka Luer-lock, 5 ml | VWR | 613-2043 | Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-częściowe strzykawki, OD 12,45 mm |
| Czytnik mikropłytek | BMG Labtech | FLUOstar Omega | Zainstalowany z filtrami 485 nm (exictation) i 590 nm (emisja) |
| Microplate, 96-dołkowy,, Płaskodenny | ThermoFisher Scientific | 611F96BK | Do pomiaru fluorescencji w czytniku mikropłytek |
| Mikropłytka, 96-dołkowa, Przezroczysty, płaskodenny | Grenier | 655101 | Do pomiaru absorbancji czytnik mikropłytek |
| Nakrętka, 1/4"-28UNF do 1/16" OD | IDEX Zdrowie & Science | P-245 | Do gniazdka |
| sieciowy z komputera do pompy dla Aladdin, 7ft | World Precision Instruments | NE-PC7 | Opcjonalnie: Pompy strzykawkowe mogą być obsługiwane ręcznie |
| Oprogramowanie sterujące pompą - Licencja na oprogramowanie SyringePumpPro dla 2 | World Precision Instruments | SYRINGE-PUMP-PRO-02 | Opcjonalnie: Pompy strzykawkowe mogą być obsługiwane ręcznie |
| sieciowy między pompami do Aladdin, 7 stóp | World Precision Instruments | NE-NET7 | Opcjonalnie: Pompy strzykawkowe mogą być obsługiwane ręcznie |
| Kolumna chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) | GE Life Science | 17085101 | Żywica Sephadex G-25 w kolumnach odsalających PD-10 |
| Chlorek sodu (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-M | |
| Wodorotlenek sodu (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Pompy strzykawkowe i (DUAL-PUMP-NE-1000) | World Precision Instruments | ALADDIN2-220/AL1000-220 | |
| Termostat Regulator temperatury | Inkbird | ITC-308 | Może być zastąpiony innym zestawem grzałki strzykawki / termostatem |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Rurka, ETFE (1/16" OD) | IDEX Health & Science | 1516 | |
| Konwerter USB na RS-232 | Precision Instruments | CBL-USB-232 | Opcjonalnie: Do komputera bez portu RS-232 |
| Water Bath | Grant Instruments Ltd. | JB Nova 12 |
Bibliografia
- Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin. Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).
- Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
Mikrofluidyczna produkcja liposomówliposomy zawierające lysolipidyzdalne ładowanie doksorubicynywspółładowanie zieleni indocyjaninowejmikro-mieszalnik o strukturze zygzakowatej (staggered herringbone)chromatografia wykluczania molekularnegogradient siarczanu amonudynamiczne rozpraszanie światłauwalnianie wyzwalane laserem bliskiej podczerwieni
