Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mikroprzepływowa produkcja liposomów wrażliwych na temperaturę zawierających lizolipidy

9.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60907

⸱

3 marca 2020

 ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Queen's University Belfast

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół przedstawia zoptymalizowane parametry przygotowania termoczułych liposomów za pomocą urządzenia mikrofluidycznego do mikromiksera w jodełkę. Umożliwia to również kokapsułkowanie doksorubicyny i zieleni indocyjaninowej do liposomów oraz fototermiczne uwalnianie doksorubicyny w celu kontrolowanego/wyzwalanego uwalniania leku.

Streszczenie

Prezentowany protokół umożliwia wysokoprzepustowe ciągłe przygotowanie liposomów wrażliwych na niską temperaturę (LTSL), które są zdolne do ładowania leków chemoterapeutycznych, takich jak doksorubicyna (DOX). Aby to osiągnąć, mieszaninę lipidów etanolowych i roztwór siarczanu amonu wstrzykuje się do naprzemiennego mikromiksera w jodełkę (SHM). Roztwory są szybko mieszane przez SHM, zapewniając jednorodne środowisko rozpuszczalnika do samoorganizacji liposomów. Zebrane liposomy są najpierw wyżarzane, a następnie dializowane w celu usunięcia resztek etanolu. Gradient pH siarczanu amonu ustala się poprzez wymianę buforową roztworu zewnętrznego przy użyciu chromatografii wykluczania wielkości. DOX jest następnie zdalnie ładowany do liposomów z wysoką skutecznością enkapsulacji (> 80%). Otrzymane liposomy są jednorodne pod względem wielkości o średniej średnicy Z wynoszącej 100 nm. Są one zdolne do wyzwalanego temperaturą impulsowego uwalniania zamkniętego DOX w obecności łagodnej hipertermii (42 °C). Zieleń indocyjaninowa (ICG) może być również współładowana do liposomów w celu uwolnienia DOX w bliskiej podczerwieni za pomocą lasera. Podejście mikroprzepływowe zapewnia wysokowydajne, powtarzalne i skalowalne przygotowanie LTSL.

Wprowadzenie

LTSL formulacja jest klinicznie istotnym produktem liposomalnym, który został opracowany w celu dostarczania leku chemioterapeutycznego doksorubicyny (DOX) i umożliwia skuteczne uwalnianie leku w klinicznie osiągalnej łagodnej hipertermii (T ≈ 41 °C)1. Preparat LTSL składa się z 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DPPC), lizolipidu 1-stearoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfatydylocholiny (MSPC; M oznacza "mono") i pegylowany lipid 1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[methoxy(glikol polietylenowy)-2000] (DSPE-PEG2000). Po osiągnięciu temperatury przemiany fazowej (Tm ≈ 41 °C) lizolipid i DSPE-PEG2000 razem ułatwiają tworzenie się porów błonowych, co skutkuje gwałtownym uwalnianiem leku2. Przygotowanie LTSL wykorzystuje przede wszystkim podejście masowe odgórne, a mianowicie uwodnienie i wytłaczanie filmu lipidowego. Wyzwaniem pozostaje powtarzalne przygotowanie dużych partii o identycznych właściwościach i w ilościach wystarczających do zastosowań klinicznych3.

Mikrofluidyka to nowa technika przygotowywania liposomów, oferująca możliwość dostosowania wielkości nanocząstek, powtarzalność i skalowalność3. Po zoptymalizowaniu parametrów produkcyjnych, przepustowość może być skalowana w górę przez zrównoleglenie, z właściwościami identycznymi z tymi przygotowanymi na skali laboratoryjnej3,4,5. Główną przewagą mikrofluidyki nad konwencjonalnymi technikami masowymi jest zdolność do obsługi małych objętości cieczy z wysoką sterowalnością w czasie i przestrzeni poprzez miniaturyzację, co pozwala na szybszą optymalizację, przy jednoczesnym działaniu w sposób ciągły i zautomatyzowany6. Produkcja liposomów za pomocą urządzeń mikroprzepływowych jest osiągana dzięki podejściu nanoprecypitacji od dołu do góry, które jest bardziej efektywne czasowo i energetycznie, ponieważ procesy homogenizacji, takie jak ekstruzja i sonikacja, są niepotrzebne7. Zazwyczaj organiczny roztwór (np. etanol) lipidów (i ładunku hydrofobowego) miesza się z mieszalnym roztworem nierozrozpuszczalnikowym (np. wodą i ładunkiem hydrofilowym). Gdy rozpuszczalnik organiczny miesza się z rozpuszczalnikiem niebędącym rozpuszczalnikiem, rozpuszczalność lipidów ulega zmniejszeniu. Stężenie lipidów ostatecznie osiąga stężenie krytyczne, przy którym uruchamiany jest proces wytrącania7. Nanoprecywaty lipidów w końcu powiększają się i zamykają w liposom. Głównymi czynnikami decydującymi o wielkości i jednorodności liposomów są stosunek między rozpuszczalnikiem niebędącym rozpuszczalnikiem a rozpuszczalnikiem (tj. stosunek natężenia przepływu między cieczą wodną a organiczną; FRR) oraz jednorodność środowiska rozpuszczalnika podczas samoorganizacji lipidów w liposomy8.

Efektywne mieszanie płynów w mikrofluidyce jest zatem niezbędne do przygotowania jednorodnych liposomów, a różne konstrukcje mieszalników zostały wykorzystane w różnych zastosowaniach9. Mikromieszalnik w jodełkę (SHM) reprezentuje jedną z nowych generacji mieszalników pasywnych, która umożliwia wysoką przepustowość (w zakresie ml/min) przy niskim współczynniku rozcieńczenia. Jest to lepsze rozwiązanie niż tradycyjne mikroprzepływowe hydrodynamiczne urządzenia do mieszania8,10. SHM ma wzorzyste rowki w jodełkę, które szybko mieszają płyny poprzez chaotyczną adwekcję9,11. Krótka skala czasu mieszania SHM (< 5 ms, mniej niż typowa skala czasu agregacji wynosząca 10–100 ms) umożliwia samoorganizację lipidów w jednorodnym środowisku rozpuszczalnika, wytwarzając nanocząstki o jednolitym rozkładzie wielkości3,12.

Przygotowanie LTSL z mikrofluidyką nie jest jednak tak proste w porównaniu z konwencjonalnymi preparatami liposomalnymi ze względu na brak cholesterolu8, bez którego dwuwarstwy lipidowe są podatne na interdigitację wywołaną etanolem13,14,15. Do tej pory wpływ resztkowego etanolu podczas mikroprzepływowej produkcji liposomów nie był dobrze poznany. Większość zgłoszonych preparatów jest z natury odporna na interdigitation (zawierające cholesterol lub nienasycone lipidy)16, które w przeciwieństwie do LTSL są zarówno nasycone, jak i wolne od cholesterolu.

Protokół przedstawiony tutaj wykorzystuje SHM do przygotowania LTSL do dostarczania leków o uwalnianym uwalnianiu w temperaturze. W prezentowanej metodzie zapewniliśmy, że przygotowane mikroprzepływowo LTSL są nanowymiarowe (100 nm) i jednorodne (dyspersyjność < 0,2) dzięki dynamicznemu rozpraszaniu światła (DLS). Ponadto okapowaliśmy DOX przy użyciu metody transbłonowego gradientu siarczanu amonu (znanej również jako ładowanie zdalne)17 jako walidację integralności dwuwarstwy lipidowej LTSL. Zdalne ładowanie DOX wymaga, aby liposom utrzymywał gradient pH w celu osiągnięcia wysokiej wydajności enkapsulacji (EE), co jest mało prawdopodobne bez nienaruszonej dwuwarstwy lipidowej. W tej przedstawionej metodzie, odróżniającej się od typowych protokołów przygotowania liposomów mikroprzepływowych, przed usunięciem etanolu wymagany jest etap wyżarzania, aby umożliwić zdalne ładowanie; tj. w celu przywrócenia integralności dwuwarstwy lipidowej.

Jak wspomniano wcześniej, hydrofilowe i hydrofobowe ładunki mogą być również wprowadzone do początkowych rozwiązań do jednoczesnej enkapsulacji ładunków podczas tworzenia LTSL. Jako dowód słuszności koncepcji, zieleń indocyjaninowa (ICG), zatwierdzony przez FDA barwnik fluorescencyjny w bliskiej podczerwieni, który jest również obiecującym środkiem fototermicznym, jest wprowadzany do początkowej mieszaniny lipidów i z powodzeniem wprowadzany do LTSL. Laser o długości fali 808 nm służy do naświetlania LTSL obciążonych DOX/ICG i skutecznego indukowania impulsowego uwalniania DOX wywołanego ogrzewaniem fototermicznym w ciągu 5 minut.

Wszystkie instrumenty i materiały są dostępne na rynku, gotowe do użycia i bez potrzeby dostosowywania. Ponieważ wszystkie parametry formułowania LTSL zostały zoptymalizowane, zgodnie z tym protokołem, naukowcy bez wcześniejszej wiedzy z zakresu mikrofluidyki mogli również przygotować LTSL, który służy jako podstawa termoczułego systemu dostarczania leków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Konfiguracja sprzętu

  1. Zmontuj pompy strzykawkowe i SHM w następujący sposób.
    1. Połącz port „To Computer” wtórnej pompy strzykawkowej (Pompa 02, dla roztworu wodnego) z portem „To Network” głównej pompy strzykawkowej (Pompa 01, dla etanolowego roztworu lipidów) za pomocą kabla sieciowego pompa-pompa (Rysunek 1, żółty).
    2. Połącz port „To Computer” pompy głównej z portem „RS232 Serial” komputera za pomocą kabla sieciowego PC-pompa (Rysunek 1, niebieski).
    3. Podłącz przewody do każdego z wlotów i wylotów SHM, używając nakrętki i tulei. Przekształć końcówkę przewodów dla obu wlotów na gniazdo Luer za pomocą drugiej nakrętki i tulei oraz zgromadzenia łączącego. Dłuższe przewody wlotowe ułatwiają podłączenie do strzykawek (Rysunek 2).
  2. Skonfiguruj oprogramowanie do sterowania pompą.
    1. Przypisz adresy głównej pompy strzykawkowej i wtórnej pompy strzykawkowej odpowiednio na „Ad:01” i „Ad:02”, używając przycisku „Setup” pompy strzykawkowej. Należy to zrobić tylko przy pierwszym uruchomieniu.
    2. Otwórz oprogramowanie do sterowania pompą na komputerze. Obie pompy strzykawkowe powinny zostać wykryte automatycznie, co zostanie potwierdzone sygnałem dźwiękowym. W przeciwnym razie kliknij Pumps, a następnie Search for pumps, aby odświeżyć połączenie (Rysunek 3).
    3. Ustaw parametr Diameter na 12.45 (mm), wybierając opcję „HSW Norm-Ject 5 cc (Dia=12.45)”.
    4. Ustaw parametr Rate na 0.25 mL/min dla Pompy 01 (etanolowy roztwór lipidów) oraz 0.75 mL/min dla Pompy 02 (roztwór wodny). Prędkości przepływu odpowiadają całkowitemu przepływowi (TFR) wynoszącemu 1 mL/min oraz stosunkowi przepływów (FRR) fazy wodnej do etanolowej równemu 3.
    5. Ustaw parametr Volume na dowolną wartość powyżej 5 mL.
      UWAGA: Docelowa objętość infuzji jest ustawiona na wartość większą niż objętość załadowanego płynu, uwzględniając objętość martwą przewodów.
    6. Wybierz tryb INF (infuzja) dla obu pomp.
    7. Naciśnij Set, aby zatwierdzić ustawienia.

2. Przygotowanie LTSL

  1. Przygotować mieszaninę lipidową LTSL10 lub LTSL10-ICG (patrz Tabela 1).
  2. Pobrać 1 mL mieszaniny lipidowej i co najmniej 3 mL roztworu (NH4)2SO4 za pomocą dwóch strzykawek 5 mL z blokadą Luer lock.
  3. Zamontować obie strzykawki w pompach strzykawkowych w pozycji pionowej, przesuwając kołnierz tulei strzykawki do uchwytu strzykawki w pompie, a kołnierz tłoka do bloku pchacza pompy (Rysunek 4).
  4. Owinąć koniec taśmy grzewczej wokół strzykawki z roztworem wodnym. Owinąć drugi koniec taśmy grzewczej oraz sondę temperatury termostatu wokół strzykawki z roztworem lipidowym. W celu ułatwienia procesu montażu zaleca się przećwiczenie tego kroku na pustych strzykawkach (Rysunek 5A).
  5. Podłączyć obie strzykawki do żeńskich adapterów Luer odpowiednich wlotów mikromiksera SHM. Upewnić się, że strzykawka z mieszaniną lipidową jest podłączona do wlotu etanolowego, a strzykawka z roztworem (NH4)2SO4 do wlotu wodnego. Dostosować pozycję tłoka, aby usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawek (Rysunek 5B).
    UWAGA: Upewnić się, że strzykawki są nadal stabilnie osadzone w uchwytach pomp.
  6. Podgrzać strzykawki powyżej 51 °C za pomocą taśmy grzewczej w 10-sekundowej sesji grzania. Odczekać, aż termostat zaktualizuje temperaturę strzykawek. Powtarzać ten krok w dalszej części procedury, aby utrzymać temperaturę podczas infuzji.
    OSTRZEŻENIE: Wyłączyć taśmę grzewczą po 10 s, aby zapobiec przekroczeniu zadanej temperatury i umożliwić termostatowi aktualizację rzeczywistej temperatury. Z taśmą grzewczą należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ jej temperatura rośnie bardzo szybko. Ciągłe grzanie może uszkodzić sprzęt i strzykawki ze względu na opóźnienie termostatu w aktualizacji mierzonej temperatury.
  7. Gdy temperatura przekroczy 51 °C, uruchomić pompy strzykawkowe, klikając Run All w oprogramowaniu sterującym pompami (Rysunek 3).
  8. Upewnić się, że przepływ cieczy jest wolny od pęcherzyków powietrza i wycieków. Odrzucić początkową objętość (około 0,5 mL) cieczy wypływającej z wylotu jako odpad.
    UWAGA: Ta początkowa objętość odpadu nie jest stała i zależy od objętości wewnętrznej układu, czyli objętości, jaką musi przebyć ciecz od strzykawek przez rurki i SHM do wylotu.
  9. Pozostałą ciecz zebrać jako próbki liposomów do probówki do mikrowirówki lub fiolki typu bijou.
  10. Wstrzymać/zatrzymać infuzję, gdy ciecz w którejkolwiek ze strzykawek będzie prawie całkowicie zużyta.
    UWAGA: Pompy należy zatrzymać ręcznie, ponieważ mogą one nie wykryć precyzyjnie momentu opróżnienia strzykawek.
  11. Umieścić zebrane roztwory liposomów w kąpieli wodnej o temperaturze 60 °C w celu wyżarzania przez 1,5 h.
    UWAGA: Ten krok jest niezbędny do umożliwienia ładowania leku do liposomów.
  12. Przenieść roztwory do tub dializacyjnych. Dializować roztwory przeciwko 1 L 240 mM (NH4)2SO4 w temperaturze 37 °C przez co najmniej 4 h w celu uzyskania oczyszczonych liposomów.
    UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół. Na tym etapie stężenie fosfolipidów w liposomach wynosi 5 mM. Oczyszczone liposomy można przechowywać w temperaturze 4 °C.
  13. Aby oczyścić SHM do ponownego użycia, przepłukać SHM sekwencyjnie wodą dejonizowaną, etanolem, a następnie osuszyć azotem.

3. Zdalne ładowanie DOX do LTSL za pomocą transbłonowego gradientu pH

  1. Wymień bufor zewnętrzny LTSL na sól buforowaną HEPES (HBS), wykorzystując chromatografię wykluczania cząsteczkowego (SEC), aby ustanowić transmembraneowy gradient pH.
    1. W celu przygotowania kolumny dodaj łącznie 25 ml buforu HBS na górę kolumny SEC. Pozwól, aby cały eluent przepłynął przez kolumnę, a następnie zutylizuj eluat.
    2. Do kolumny należy dodać 1 ml dializowanych liposomów, przygotowanych w kroku 2.12, a następnie usunąć eluat.
    3. Dodać 1,5 ml buforu HBS do kolumny, a następnie usunąć eluat.
    4. Dodaj 3 ml HBS do kolumny i zbierz 3 ml eluatu.
      UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół. Liposomy są zbierane na tym etapie i mają stężenie fosfolipidów wynoszące 1,67 mM. Liposomy po wymianie buforu można przechowywać w 4 °C.
  2. Inkubować LTSL z doksorubicyną (DOX), a następnie oczyścić LTSL.
    1. Do 1 ml roztworu liposomów po wymianie buforu (1,67 mmol) znajdującego się w fiolce typu bijou dodać roztwór DOX, zachowując stosunek molowy DOX do fosfolipidów wynoszący 1:20. Można to osiągnąć poprzez dodanie 48.4 µL roztworu DOX o stężeniu 1 mg/ml (83.4 µmol).
    2. Umieść fiolkę bijou w 37 °C kąpiel wodna przez 1,5 h w celu umożliwienia załadunku DOX do liposomów.
    3. Wymieszać 10 µL liposomów z 170 µL z HBS i 20 µL roztworu 1% (v/v) Triton X-10 w czarnej płytce 96-dołkowej. Powtórzyć dla trzech dołków. Dołki te odpowiadają zawartości DOX „przed oczyszczaniem”.
    4. W przypadku przygotowania LTSL10-ICG, wymieszać 40 µL liposomów z 160 µL DMSO w przezroczystej płytce 96-dołkowej. Powtórz procedurę dla trzech dołków. Dołki te odpowiadają zawartości ICG „przed oczyszczaniem”.
    5. Oczyścić roztwór liposomów zgodnie z opisem w kroku 3.1.
      UWAGA: Aby móc ponownie wykorzystać kolumnę do przyszłych oczyszczeń, należy usunąć z niej wolną doksorubicynę (DOX), dodając 1 ml rozcieńczonego 0,5 M roztworu NaOH przed wykonaniem kroku 3.1.1. Wolna DOX o czerwonym kolorze zmieni barwę na fioletowo-niebieską i zostanie szybko wymyta z kolumny.
    6. Wymieszać 30 µL roztworu oczyszczonych liposomów z 150 µL z HBS i 20 µL roztworu 1% (v/v) Triton X-10 w czarnej płytce 96-dołkowej. Powtórzyć dla trzech dołków. Dołki te odpowiadają zawartości DOX „po oczyszczaniu”.
    7. W przypadku LTSL10-ICG wymieszać 40 µL roztworu oczyszczonych liposomów z 160 µL DMSO w przezroczystej płytce 96-dołkowej. Powtórz czynność dla trzech dołków. Dołki te odpowiadają zawartości ICG „po oczyszczeniu”.
    8. Zmierz intensywność fluorescencji DOX w dołkach przed (krok 3.2.3) i po (krok 3.2.5) oczyszczaniu, używając czytnika mikropłytek (λPrzykładowy tekst do tłumaczenia nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści źródłowej w języku angielskim, którą należy przetłumaczyć na język polski zgodnie z wytycznymi dla treści naukowych JoVE. = 485 nm, λem = 590 nm).
    9. Oblicz wydajność enkapsulacji DOX (DOX EE), wyznaczając stosunek intensywności fluorescencji przed i po oczyszczaniu.
      Wzór na wydajność enkapsulacji doksorubicyny, DOX EE% = FI po/przed oczyszczaniem × 10, równanie.
    10. Zmierz absorbancję ICG w dołkach przed i po oczyszczaniu, używając czytnika mikropłytek (60 do 10 nm).
    11. Oblicz wydajność enkapsulacji ICG (ICG EE), wyznaczając stosunek absorbancji przy 792 nm przed i po oczyszczaniu, uwzględniając czynnik rozcieńczenia (3-krotny) podczas procesu oczyszczania.
      Wzór na wydajność enkapsulacji ICG; równanie absorbancji; analiza oczyszczania.

4. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)

  1. Dodać 50 µL roztworu liposomów (krok 2.12) do 450 µL wody dejonizowanej.
  2. Umieścić kuwetę w urządzeniu DLS i przeprowadzić pomiar zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Zapisać średnią wartość średnicy Z-average oraz polidyspersyjność dla trzech pomiarów dla każdej próbki.

5. Różnicowa kalorymetria skanująca (DSC)

  1. Skoncentrować 1 mL próbek liposomów (krok 2.12) do 0,5 mL (końcowe stężenie lipidów 10 mM) za pomocą jednostki filtra wirówkowego. Używając rotora z kątem stałym, wirować z prędkością 750 x g przez około 15 min.
  2. Przenieść 20 µL roztworu (NH4)2SO4 oraz próbek liposomów do dwóch odpowiednich tygli DSC. Zamknąć tygle hermetycznymi pokrywkami DSC za pomocą zestawu prasy do próbek DSC.
  3. Zmierzyć próbkę w zakresie od 30 °C do 60 °C przy szybkości nagrzewania 1 °C/min za pomocą różnicowego kalorymetru skanującego.
  4. Przeanalizować dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Przyjąć temperaturę przejścia fazowego (Tm) jako początek przejścia fazowego (piku topnienia), wyznaczony przez punkt przecięcia z osią x stycznej do punktu o maksymalnym nachyleniu.

6. Uwalnianie doksorubicyny

  1. Podgrzej HBS do wyznaczonej temperatury (37 lub 42 °C) przy użyciu łaźni wodnej. Przygotować łaźnię z lodowatej wody do hartowania próbek.
  2. Dodaj 100 µL oczyszczonych liposomów obciążonych DOX (krok 3.2.5) do 1,9 ml buforu HBS w probówce do mikrocentryfugi. Umieść probówkę w kąpieli wodnej o wyznaczonej temperaturze.
  3. Natychmiast wycofać 200 µL próbek z probówki i szybko umieścić ją w kąpieli wodno-lodowej, aby zahamować dalsze uwalnianie leku. Próbka ta odpowiada początkowemu punktowi czasowemu (t = 0).
  4. Wycofać 200 µL próbek w kolejnych punktach czasowych (t = 5, 10, 15, 30, 60 min) i szybko umieścić ją w kąpieli z lodowatej wody, aby zatrzymać uwalnianie leku.
  5. Wymieszać 50 µL próbki z każdego punktu czasowego za pomocą 150 µL buforu HBS w czarnej płytce 96-dołkowej. Zmierzyć intensywność fluorescencji DOX przy użyciu czytnika płytek.
  6. Dodaj 20 µL 1% (v/v) Triton X-10 do wybranych losowo studzienek przygotowanych w kroku 6.5. Pomiar natężenia fluorescencji DOX w tych studzienkach należy przeprowadzić za pomocą czytnika płytek. Wartości te odpowiadają punktowi czasowemu pełnego uwalniania (t = ∞; 10% uwalniania).
  7. Oblicz i wykreśl procent uwolnionej doksorubicyny (DOX) poprzez interpolację intensywności fluorescencji dla każdego punktu czasowego (I(t)) w odniesieniu do wartości początkowej (I(0)) oraz wartości całkowitego uwolnienia (I(∞)).
    Wzór na uwalnianie doksorubicyny; równanie dla badań uwalniania leku, I(t), I(0), I(∞), procent.

7. Nagrzewanie laserowe i wyzwalane uwalnianie

  1. Ustaw temperaturę łaźni wodnej na 37 °C i odczekaj do jej stabilizacji.
  2. Dodaj 20 µL naładowanych DOX LTSL10-ICG ([ICG] = 10 µg/mL) do przezroczystej płytki 96-dołkowej, a następnie umieść ją w łaźni wodnej, dbając o to, aby dno było zanurzone w wodzie.
  3. Ustaw natężenie prądu systemu laserowego na 2,27 A. Umieść kolimator systemu laserowego 5 cm pionowo nad powierzchnią płytki 96-dołkowej, co odpowiada strumieniowi energii 0,5 W/cm2 [Rysunek 6].
    UWAGA: System laserowy należy obsługiwać zgodnie z odpowiednimi środkami bezpieczeństwa pracy z laserem.
  4. Włącz laser i monitoruj temperaturę w każdej minucie za pomocą światłowodowej sondy temperatury.
  5. W 5. i 10. minucie pobierz 10 µL naświetlanych laserem liposomów z przezroczystej płytki 96-dołkowej i wymieszaj z 190 µL HBS w trzech dołkach czarnej płytki 96-dołkowej.
  6. Wymieszaj 10 µL liposomów ze 170 µL HBS i 20 µL 1% (v/v) roztworu Triton X-10 w trzech dołkach czarnej płytki 96-dołkowej. Dołki te odpowiadają zawartości DOX „uwolnionej w 10%”. Zmierz intensywność fluorescencji DOX i oblicz stopień uwalniania DOX zgodnie z opisem w kroku 6.7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przygotowanie LTSL za pomocą mikrofluidyki wymaga zastosowania składu lipidowego DPPC/MSPC/DSPE-PEG20 (stosunek molowy 80/10/10; LTSL10). Rysunek 7A (po lewej) przedstawia wygląd świeżo przygotowanego LTSL10 z etapu 2.9, który ma postać przejrzystego i niewiskozycznego płynu. Formuła LTSL10 została opracowana na podstawie konwencjonalnej formuły LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG20, stosunek molowy 86/10/4), ponieważ LTSL4 tworzy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony protokół opisuje przygotowanie liposomów wrażliwych na niską temperaturę (LTSL) przy użyciu naprzemiennego mikromiksera w jodełkę (SHM). Preparat LTSL10 umożliwia wywołane temperaturą impulsowe uwalnianie doksorubicyny w ciągu 5 minut przy klinicznie osiągalnej temperaturze hipertermicznej 42 °C. Zieleń indocyjaninowa (ICG) może być również współładowana do ogrzewania fototermicznego wyzwalanego uwalnianiem DOX. Metoda opiera się na: (i) samoorganizacji fosfolipidów w liposomach w homogenizowanym środowisku...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship) oraz Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) (EP/M008657/1) za dofinansowanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DPPC)LipoidPC 16:0/16:0 (DPPC)
1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (DSPE-PEG2000)LipoidPE 18:0/18:0-PEG 2000
(MPEG 2000-DSPE)
1-stearoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina (MSPC)Avanti Polar Lipid855775P-500MGDystrybucja przez Sigma-Adrich; znany również jako Lyso 16:0 PC
(nie mylić z 14:0/18:0 PC, który jest również określany jako MSPC)
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)AdapterySigma-AldrichH3375-100G
, żeńskie Luer Lock do 1/4"-28UNFIDEX Health & NaukaP-624Wymaga 2 jednostek. Do adapterów wlotowych
, montaż złączy, 1/4"-28UNFIDEX Health & NaukaP-630Wymaga 2 jednostek. (Jedna jednostka zawierała 2 nakrętki i 2 tuleje)
Siarczan amonu ((NH4)2SO4)Sigma-Aldrich31119-1KG-M
Fiolka BijouVWR216-09807 mL, przezroczysta, polistyrenowa fiolka
Filtr odśrodkowySigma-AldrichUFC80100810 kDa MWCO, Wirówka z filtrem odśrodkowym Amicon Ultra-4
ThermoFisher ScientificHeraeus Megafuge 8Rz wirnikiem
o stałym kącie nachylenia HIGHConic IIICuvetteFisher Scientific11602609Jednorazowa kuweta polistyrenowa, mała objętość, do pomiaru DLS
Zestaw do dializy - Pur-A-Lyzer MaxiSigma-AldrichPURX12015-1KT12-14 kDa
MWCO Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-Aldrich34943-1L-M
DLS InstrumentMalvern PanalyticalZetasizer Nano ZS90
Chlorowodorek doksorubicyny (DOX)Apollo ScientificBID0120
Instrument DSC TAInstrumentsTA Q200 DSC
DSC Tzero Hermetyczne pokrywkiTA Instruments901684.901Do pomiaru DSC
DSC Tzero PansTA Instruments901683.901Do pomiaru DSC
Zestaw prasowy do próbek DSC TzeroTA Instruments901600.901Do pomiaru
EtanolVWR20821.330Absolutny, ≥ 99,8%
FC-808 System laserowy sprzężony z włóknemCNI Optoelectronics TechFC-808-8W-181315Kolimator światłowodowy FOC-01-B w zestawie.
Okucie, 1/4"-28UNF do 1/16" ODIDEX Health & ScienceP-200Do gniazdka
Światłowodowa sonda temperaturyOsensaPRB-G40
Szklany naprzemienny mikromikser w jodełkę (SHM)Darwin MicrofluidicsMikser w jodełkę - taśma
OmegaDHT052020LDMoże być zastąpiony innym podgrzewaczem strzykawkowym, takim jak "HTC" lub "seria SRT" w celu wolniejszego nagrzewania. Ręczne okablowanie do 3-pinowej wtyczki wymagane dla modeli 240 V
Indocyanine GreenAdooqA10473-100Dystrybuowane przez Bioquote Limited (Wielka Brytania)
Strzykawka Luer-lock, 5 mlVWR613-2043Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-częściowe strzykawki, OD 12,45 mm
Czytnik mikropłytekBMG LabtechFLUOstar OmegaZainstalowany z filtrami 485 nm (exictation) i 590 nm (emisja)
Microplate, 96-dołkowy,, PłaskodennyThermoFisher Scientific611F96BKDo pomiaru fluorescencji w czytniku mikropłytek
Mikropłytka, 96-dołkowa, Przezroczysty, płaskodennyGrenier655101Do pomiaru absorbancji czytnik mikropłytek
Nakrętka, 1/4"-28UNF do 1/16" ODIDEX Zdrowie & ScienceP-245Do gniazdka
sieciowy z komputera do pompy dla Aladdin, 7ftWorld Precision InstrumentsNE-PC7Opcjonalnie: Pompy strzykawkowe mogą być obsługiwane ręcznie
Oprogramowanie sterujące pompą - Licencja na oprogramowanie SyringePumpPro dla 2World Precision InstrumentsSYRINGE-PUMP-PRO-02Opcjonalnie: Pompy strzykawkowe mogą być obsługiwane ręcznie
sieciowy między pompami do Aladdin, 7 stópWorld Precision InstrumentsNE-NET7Opcjonalnie: Pompy strzykawkowe mogą być obsługiwane ręcznie
Kolumna chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC)GE Life Science17085101Żywica Sephadex G-25 w kolumnach odsalających PD-10
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-Aldrich31434-1KG-M
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma-AldrichS5881-500G
Pompy strzykawkowe i (DUAL-PUMP-NE-1000)World Precision InstrumentsALADDIN2-220/AL1000-220
Termostat Regulator temperaturyInkbirdITC-308Może być zastąpiony innym zestawem grzałki strzykawki / termostatem
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Rurka, ETFE (1/16" OD)IDEX Health & Science1516
Konwerter USB na RS-232Precision InstrumentsCBL-USB-232Opcjonalnie: Do komputera bez portu RS-232
Water BathGrant Instruments Ltd.JB Nova 12
: DSC grzewcza z wiórami szklanymi World

Bibliografia

  1. Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin. Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).
  2. Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).
  3. Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
  4. Chen, D., et al. Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).
  5. Forbes, N., et al. Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring. International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).
  6. Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).
  7. Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).
  8. Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content. International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).
  9. Suh, Y. K., Kang, S. A. Review on Mixing in Microfluidics. Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).
  10. Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
  11. Stroock, A. D. Chaotic Mixer for Microchannels. Science. 295 (5555), 647-651 (2002).
  12. Belliveau, N. M., et al. Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37(2012).
  13. Patra, M., et al. Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers. Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).
  14. Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine. Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).
  15. Lu, J., Hao, Y., Chen, J. Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary. Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).
  16. Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes. Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).
  17. Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).
  18. Sadeghi, N., et al. Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).
  19. Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).
  20. Komatsu, H., Okada, S. Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes. BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).
  21. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  22. Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation. Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).
  23. Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions. Pharmaceutical Research. , (2005).
  24. Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes. Pharmaceutics. 8 (3), 29(2016).
  25. Kim, S. -H., Kim, J. W., Kim, D. -H., Han, S. -H., Weitz, D. A. Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device. Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikrofluidyczna produkcja liposomówliposomy zawierające lysolipidyzdalne ładowanie doksorubicynywspółładowanie zieleni indocyjaninowejmikro-mieszalnik o strukturze zygzakowatej (staggered herringbone)chromatografia wykluczania molekularnegogradient siarczanu amonudynamiczne rozpraszanie światłauwalnianie wyzwalane laserem bliskiej podczerwieni
Mikroprzepływowa produkcja liposomów wrażliwych na temperaturę zawierających lizolipidy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.