Mikroprzepływowa produkcja liposomów wrażliwych na temperaturę zawierających lizolipidy

Summary

Protokół przedstawia zoptymalizowane parametry przygotowania termoczułych liposomów za pomocą urządzenia mikrofluidycznego do mikromiksera w jodełkę. Umożliwia to również kokapsułkowanie doksorubicyny i zieleni indocyjaninowej do liposomów oraz fototermiczne uwalnianie doksorubicyny w celu kontrolowanego/wyzwalanego uwalniania leku.

Abstract

Prezentowany protokół umożliwia wysokoprzepustowe ciągłe przygotowanie liposomów wrażliwych na niską temperaturę (LTSL), które są zdolne do ładowania leków chemoterapeutycznych, takich jak doksorubicyna (DOX). Aby to osiągnąć, mieszaninę lipidów etanolowych i roztwór siarczanu amonu wstrzykuje się do naprzemiennego mikromiksera w jodełkę (SHM). Roztwory są szybko mieszane przez SHM, zapewniając jednorodne środowisko rozpuszczalnika do samoorganizacji liposomów. Zebrane liposomy są najpierw wyżarzane, a następnie dializowane w celu usunięcia resztek etanolu. Gradient pH siarczanu amonu ustala się poprzez wymianę buforową roztworu zewnętrznego przy użyciu chromatografii wykluczania wielkości. DOX jest następnie zdalnie ładowany do liposomów z wysoką skutecznością enkapsulacji (> 80%). Otrzymane liposomy są jednorodne pod względem wielkości o średniej średnicy Z wynoszącej 100 nm. Są one zdolne do wyzwalanego temperaturą impulsowego uwalniania zamkniętego DOX w obecności łagodnej hipertermii (42 °C). Zieleń indocyjaninowa (ICG) może być również współładowana do liposomów w celu uwolnienia DOX w bliskiej podczerwieni za pomocą lasera. Podejście mikroprzepływowe zapewnia wysokowydajne, powtarzalne i skalowalne przygotowanie LTSL.

Introduction

LTSL formulacja jest klinicznie istotnym produktem liposomalnym, który został opracowany w celu dostarczania leku chemioterapeutycznego doksorubicyny (DOX) i umożliwia skuteczne uwalnianie leku w klinicznie osiągalnej łagodnej hipertermii (T ≈ 41 °C)¹. Preparat LTSL składa się z 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DPPC), lizolipidu 1-stearoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfatydylocholiny (MSPC; M oznacza "mono") i pegylowany lipid 1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[methoxy(glikol polietylenowy)-2000] (DSPE-PEG₂₀₀₀). Po osiągnięciu temperatury przemiany fazowej (T_m ≈ 41 °C) lizolipid i DSPE-PEG₂₀₀₀ razem ułatwiają tworzenie się porów błonowych, co skutkuje gwałtownym uwalnianiem leku². Przygotowanie LTSL wykorzystuje przede wszystkim podejście masowe odgórne, a mianowicie uwodnienie i wytłaczanie filmu lipidowego. Wyzwaniem pozostaje powtarzalne przygotowanie dużych partii o identycznych właściwościach i w ilościach wystarczających do zastosowań klinicznych³.

Mikrofluidyka to nowa technika przygotowywania liposomów, oferująca możliwość dostosowania wielkości nanocząstek, powtarzalność i skalowalność³. Po zoptymalizowaniu parametrów produkcyjnych, przepustowość może być skalowana w górę przez zrównoleglenie, z właściwościami identycznymi z tymi przygotowanymi na skali laboratoryjnej^3,4,5. Główną przewagą mikrofluidyki nad konwencjonalnymi technikami masowymi jest zdolność do obsługi małych objętości cieczy z wysoką sterowalnością w czasie i przestrzeni poprzez miniaturyzację, co pozwala na szybszą optymalizację, przy jednoczesnym działaniu w sposób ciągły i zautomatyzowany⁶. Produkcja liposomów za pomocą urządzeń mikroprzepływowych jest osiągana dzięki podejściu nanoprecypitacji od dołu do góry, które jest bardziej efektywne czasowo i energetycznie, ponieważ procesy homogenizacji, takie jak ekstruzja i sonikacja, są niepotrzebne⁷. Zazwyczaj organiczny roztwór (np. etanol) lipidów (i ładunku hydrofobowego) miesza się z mieszalnym roztworem nierozrozpuszczalnikowym (np. wodą i ładunkiem hydrofilowym). Gdy rozpuszczalnik organiczny miesza się z rozpuszczalnikiem niebędącym rozpuszczalnikiem, rozpuszczalność lipidów ulega zmniejszeniu. Stężenie lipidów ostatecznie osiąga stężenie krytyczne, przy którym uruchamiany jest proces wytrącania⁷. Nanoprecywaty lipidów w końcu powiększają się i zamykają w liposom. Głównymi czynnikami decydującymi o wielkości i jednorodności liposomów są stosunek między rozpuszczalnikiem niebędącym rozpuszczalnikiem a rozpuszczalnikiem (tj. stosunek natężenia przepływu między cieczą wodną a organiczną; FRR) oraz jednorodność środowiska rozpuszczalnika podczas samoorganizacji lipidów w liposomy⁸.

Efektywne mieszanie płynów w mikrofluidyce jest zatem niezbędne do przygotowania jednorodnych liposomów, a różne konstrukcje mieszalników zostały wykorzystane w różnych zastosowaniach⁹. Mikromieszalnik w jodełkę (SHM) reprezentuje jedną z nowych generacji mieszalników pasywnych, która umożliwia wysoką przepustowość (w zakresie ml/min) przy niskim współczynniku rozcieńczenia. Jest to lepsze rozwiązanie niż tradycyjne mikroprzepływowe hydrodynamiczne urządzenia do mieszania^8,10. SHM ma wzorzyste rowki w jodełkę, które szybko mieszają płyny poprzez chaotyczną adwekcję^9,11. Krótka skala czasu mieszania SHM (< 5 ms, mniej niż typowa skala czasu agregacji wynosząca 10–100 ms) umożliwia samoorganizację lipidów w jednorodnym środowisku rozpuszczalnika, wytwarzając nanocząstki o jednolitym rozkładzie wielkości^3,12.

Przygotowanie LTSL z mikrofluidyką nie jest jednak tak proste w porównaniu z konwencjonalnymi preparatami liposomalnymi ze względu na brak cholesterolu⁸, bez którego dwuwarstwy lipidowe są podatne na interdigitację wywołaną etanolem^13,14,15. Do tej pory wpływ resztkowego etanolu podczas mikroprzepływowej produkcji liposomów nie był dobrze poznany. Większość zgłoszonych preparatów jest z natury odporna na interdigitation (zawierające cholesterol lub nienasycone lipidy)¹⁶, które w przeciwieństwie do LTSL są zarówno nasycone, jak i wolne od cholesterolu.

Protokół przedstawiony tutaj wykorzystuje SHM do przygotowania LTSL do dostarczania leków o uwalnianym uwalnianiu w temperaturze. W prezentowanej metodzie zapewniliśmy, że przygotowane mikroprzepływowo LTSL są nanowymiarowe (100 nm) i jednorodne (dyspersyjność < 0,2) dzięki dynamicznemu rozpraszaniu światła (DLS). Ponadto okapowaliśmy DOX przy użyciu metody transbłonowego gradientu siarczanu amonu (znanej również jako ładowanie zdalne)¹⁷ jako walidację integralności dwuwarstwy lipidowej LTSL. Zdalne ładowanie DOX wymaga, aby liposom utrzymywał gradient pH w celu osiągnięcia wysokiej wydajności enkapsulacji (EE), co jest mało prawdopodobne bez nienaruszonej dwuwarstwy lipidowej. W tej przedstawionej metodzie, odróżniającej się od typowych protokołów przygotowania liposomów mikroprzepływowych, przed usunięciem etanolu wymagany jest etap wyżarzania, aby umożliwić zdalne ładowanie; tj. w celu przywrócenia integralności dwuwarstwy lipidowej.

Jak wspomniano wcześniej, hydrofilowe i hydrofobowe ładunki mogą być również wprowadzone do początkowych rozwiązań do jednoczesnej enkapsulacji ładunków podczas tworzenia LTSL. Jako dowód słuszności koncepcji, zieleń indocyjaninowa (ICG), zatwierdzony przez FDA barwnik fluorescencyjny w bliskiej podczerwieni, który jest również obiecującym środkiem fototermicznym, jest wprowadzany do początkowej mieszaniny lipidów i z powodzeniem wprowadzany do LTSL. Laser o długości fali 808 nm służy do naświetlania LTSL obciążonych DOX/ICG i skutecznego indukowania impulsowego uwalniania DOX wywołanego ogrzewaniem fototermicznym w ciągu 5 minut.

Wszystkie instrumenty i materiały są dostępne na rynku, gotowe do użycia i bez potrzeby dostosowywania. Ponieważ wszystkie parametry formułowania LTSL zostały zoptymalizowane, zgodnie z tym protokołem, naukowcy bez wcześniejszej wiedzy z zakresu mikrofluidyki mogli również przygotować LTSL, który służy jako podstawa termoczułego systemu dostarczania leków.

Protocol

1. Konfiguracja sprzętu

1. Zmontować pompy strzykawkowe i SHM w następujący sposób.
   1. Podłącz port "Do komputera" dodatkowej pompy strzykawkowej (pompa 02, dla roztworu wodnego) do portu "Do sieci" głównej pompy strzykawkowej (pompa 01, dla roztworu lipidów etanolowych) za pomocą sieciowego pompa-pompa (Rysunek 1, żółty).
   2. Podłącz port "Do komputera" pompy głównej do portu "RS232 Serial" komputera za pomocą sieciowego PC to Pump (Rysunek 1, niebieski).
   3. Podłącz rurkę do każdego z wlotów i wylotów SHM za pomocą nakrętki i tulejki. Przekształć końcówkę rurki dla obu wlotów na żeńską Luer za pomocą innej nakrętki i tulejki oraz zespołu złącza. Dłuższe rurki wlotów umożliwiają łatwiejsze mocowanie do strzykawek (Rysunek 2).
2. Skonfiguruj oprogramowanie sterujące pompą.
   1. Przypisz adres głównej pompy strzykawkowej i dodatkowej pompy strzykawkowej odpowiednio do "Ad:01" i "Ad:02" za pomocą przycisku "Ustawienia" pompy strzykawkowej. Wystarczy to zrobić po raz pierwszy.
   2. Otwórz oprogramowanie sterujące pompą na komputerze. Dwie pompy strzykawkowe powinny zostać wykryte automatycznie, po czym powinien nastąpić sygnał dźwiękowy. W przeciwnym razie kliknij Pompy i Wyszukaj pompy, aby zaktualizować połączenie. (Rysunek 3).
   3. Przypisz średnicę do 12,45 (mm), wybierając "HSW Norm-Ject 5 cc (Dia=12,45)".
   4. Przypisz szybkość do 0,25 ml/min dla pompy 01 (roztwór etanolu lipidowego) i 0,75 ml/min dla pompy 02 (roztwór wodny). Natężenia przepływu odpowiadają całkowitemu natężeniu przepływu (TFR) wynoszącemu 1 ml/min i stosunkowi natężenia przepływu wody do etanolu (FRR) wynoszącemu 3.
   5. Przypisz objętość do dowolnych wartości powyżej 5 ml.
      UWAGA: Docelowa objętość infuzji jest większa niż objętość załadowanego płynu, biorąc pod uwagę pustą objętość rurki.
   6. Wybierz tryb INF (infuzja) dla obu pomp.
   7. Naciśnij Ustaw, aby potwierdzić ustawienia.

2. Przygotuj LTSL

1. Przygotować mieszaninę lipidów LTSL10 lub LTSL10-ICG (patrz Tabela 1).
2. Pobrać 1 ml mieszaniny lipidów i co najmniej 3 ml roztworu (NH₄)₂SO₄ za pomocą dwóch strzykawek Luer lock o pojemności 5 ml.
3. Zamontuj dwie strzykawki na pompach strzykawkowych w pozycji pionowej, wsuwając kołnierz cylindra strzykawki do uchwytu strzykawki pompy, a kołnierz tłoka strzykawki do bloku popychacza pompy (Rysunek 4).
4. Owiń koniec taśmy grzewczej do strzykawki roztworem wodnym. Owiń drugi koniec taśmy grzewczej i sondy temperatury termostatu wokół strzykawki z roztworem lipidów. Pomocne jest przećwiczenie tego kroku z pustymi strzykawkami na miejscu, aby ułatwić proces składania (Rysunek 5A).
5. Połączyć obie strzykawki z żeńskimi adapterami Luer w odpowiednich wlotach SHM. Upewnij się, że strzykawki zawierające mieszaninę lipidów i roztwory (NH₄)_2SO4 są połączone odpowiednio wlotem etanolu i wlotem wody. Wyreguluj pozycję tłoka, aby usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawek (Rysunek 5B).
   UWAGA: Upewnij się, że strzykawki są nadal bezpiecznie umieszczone na uchwycie strzykawki pomp.
6. Podgrzać strzykawki do temperatury powyżej 51 °C za pomocą taśmy grzewczej, podczas 10-sekundowej sesji podgrzewania. Pozwolić, aby termostat zaktualizował temperaturę strzykawek. Powtórz ten krok w następujących krokach, aby utrzymać temperaturę podczas infuzji.
   UWAGA: Wyłącz taśmę grzewczą po 10 sekundach, aby zapobiec przekroczeniu temperatury i pozwól termostatowi zaktualizować rzeczywistą temperaturę. Z taśmą grzewczą należy również obchodzić się ostrożnie, ponieważ jej temperatura bardzo szybko rośnie. Ciągłe ogrzewanie może spowodować uszkodzenie sprzętu i strzykawek ze względu na opóźnienie czasowe termostatu w aktualizacji zmierzonej temperatury.
7. Gdy temperatura przekroczy 51 °C, uruchom pompy strzykawkowe, naciskając przycisk Uruchom wszystko w oprogramowaniu sterującym pompą (Rysunek 3).
8. Upewnij się, że przepływ płynu jest wolny od pęcherzyków powietrza i wszelkich wycieków. Początkową objętość (około 0,5 ml) płynu z wylotu należy wyrzucić jako odpad.
   UWAGA: Ta początkowa objętość odpadów nie jest określona i zależy od wewnętrznej objętości zestawu, która jest objętością, jaką płyn przepływa ze strzykawek przez rurkę i SHM do wylotu.
9. Resztę płynu w postaci próbek liposomów należy zebrać do probówki do mikrowirówki lub fiolki z biżuterią.
10. Wstrzymać/przerwać infuzję, gdy płyn w którejkolwiek ze strzykawek jest prawie pusty.
    UWAGA: Pompy należy zatrzymać ręcznie, ponieważ mogą one nie wykrywać dokładnie pozycji, gdy strzykawki są puste.
11. Zebrane roztwory liposomów umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C do wyżarzania przez 1,5 godziny
    UWAGA: Ten krok jest niezbędny, aby umożliwić ładowanie leku do liposomów.
12. Przenieść roztwory do probówek dializacyjnych. Dializować roztwory w stosunku do 1 l 240 mM (NH₄)₂SO₄ w temperaturze 37 °C przez co najmniej 4 godziny w celu uzyskania oczyszczonych liposomów.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Liposomy na tym etapie mają 5 mM fosfolipidu. Oczyszczone liposomy można przechowywać w temperaturze 4 °C.
13. Aby wyczyścić SHM do wielokrotnego użytku, należy kolejno przepłukać SHM wodą dejonizowaną, etanolem i osuszyć gazowym azotem.

3. Zdalne ładowanie DOX do LTSL za pomocą transbłonowego gradientu pH

1. Zamiana zewnętrznego buforu LTSL na sól fizjologiczną buforowaną przez HEPES (HBS) przy użyciu chromatografii wykluczania wielkości (SEC) w celu ustalenia transbłonowego gradientu pH.
   1. Dodaj łącznie 25 ml HBS na górę kolumny SEC, aby przygotować kolumnę. Pozwolić, aby cały eluent wymył się przez kolumnę i usunąć eluat.
   2. Dodać 1 ml dializowanych liposomów, przygotowanych z kroku 2.12, do kolumny i usunąć elucję.
   3. Dodać 1,5 ml HBS do kolumny i usunąć elucję.
   4. Dodać 3 ml HBS do kolumny i zebrać 3 ml elucji.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Na tym etapie zbiera się liposomy i mają 1,67 mM fosfolipidu. Liposomy z wymianą buforową mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C.
2. Inkubuj LTSL z doksorubicyną (DOX) i oczyszczaj LTSL.
   1. Dodać roztwór DOX w stosunku molowym DOX do fosfolipidów w stosunku 1:20 do 1 ml roztworu liposomów z buforem wymiennym (1,67 mmol) znajdującego się w fiolce z biżuterią. Można to osiągnąć, dodając 48,4 μl 1 mg/ml roztworu DOX (83,4 μmol).
   2. Umieścić fiolkę bijou w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1,5 godziny, aby umożliwić załadowanie DOX do liposomów.
   3. Zmieszać 10 μl liposomów ze 170 μl HBS i 20 μl 1% (v/v) roztworu Triton X-100 w czarnej 96-dołkowej płytce. Powtórz dla trzech dołków. Studzienki te odpowiadają zawartości DOX "przed oczyszczeniem".
   4. W przypadku przygotowania LTSL10-ICG należy wymieszać 40 μl liposomów ze 160 μl DMSO na przezroczystej 96-dołkowej płytce. Powtórz dla trzech dołków. Studzienki te odpowiadają zawartości ICG "przed oczyszczeniem".
   5. Oczyść roztwór liposomu zgodnie z opisem w kroku 3.1.
      UWAGA: Aby ponownie wykorzystać kolumnę do przyszłego oczyszczania, oczyść kolumnę z wolnego DOX, dodając najpierw 1 ml rozcieńczonego 0,5 M roztworu NaOH przed wykonaniem kroku 3.1.1. Wolny DOX w kolorze czerwonym zmieni kolor na fioletowo-niebieski i szybko wymyje się przez kolumnę.
   6. Zmieszać 30 μl oczyszczonego roztworu liposomów ze 150 μl HBS i 20 μl 1% (v/v) roztworu Triton X-100 w czarnej 96-dołkowej płytce. Powtórz dla trzech dołków. Studzienki te odpowiadają zawartości DOX "po oczyszczeniu".
   7. W przypadku LTSL10-ICG wymieszać 40 μl oczyszczonego roztworu liposomów ze 160 μl DMSO w przezroczystej 96-dołkowej płytce. Powtórz dla trzech dołków. Studzienki te odpowiadają zawartości ICG "po oczyszczeniu".
   8. Zmierzyć intensywność fluorescencji DOX studzienek przed (etap 3.2.3) i po (etap 3.2.5) oczyszczeniu, używając czytnika mikropłytek (λ_ex = 485 nm, λ_em = 590 nm).
   9. Obliczyć skuteczność enkapsulacji DOX (DOX EE), biorąc pod uwagę stosunek intensywności fluorescencji przed i po oczyszczeniu.
      
   10. Zmierzyć absorbancję ICG studzienek przed i po oczyszczeniu, używając czytnika mikropłytek (600 do 1000 nm).
   11. Obliczyć skuteczność kapsułkowania ICG (ICG EE), przyjmując stosunek absorbancji przy 792 nm przed i po oczyszczeniu, biorąc pod uwagę współczynnik rozcieńczenia (3-krotnie) podczas oczyszczania.
       

4. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)

1. Dodać 50 μl roztworu liposomów (krok 2.12) do 450 μl wody dejonizowanej.
2. Umieść kuwetę w przyrządzie DLS i wykonaj pomiar zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Zanotować średnią średnicę Z-średnią i dyspersję z trzech pomiarów dla każdej próbki.

5. Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC)

1. Zagęścić 1 ml próbek liposomów (etap 2.12) za pomocą filtra odśrodkowego do 0,5 ml (końcowe stężenie lipidów 10 mM). Za pomocą wirnika o stałym kącie wirowania wirować z prędkością 7500 x g przez około 15 minut.
2. Przenieść 20 μl roztworu (NH₄)₂SO₄ i próbki liposomów do dwóch odpowiednich szalek DSC. Uszczelnij patelnie hermetycznymi pokrywkami DSC za pomocą zestawu do prasowania próbek DSC.
3. Zmierzyć próbkę w zakresie od 30 °C do 60 °C przy szybkości ogrzewania 1 °C/min za pomocą różnicowego kalorymetru skaningowego.
4. Analizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Przyjmijmy temperaturę przemiany fazowej (T_m) jako początek przemiany fazowej (pik topnienia), który jest mierzony przez punkt przecięcia x stycznej punktu maksymalnego nachylenia.

6. Uwalnianie doksorubicyny

1. Podgrzej HBS w wyznaczonej temperaturze (37 lub 42 °C) w łaźni wodnej. Przygotować lodowatą kąpiel wodną do schładzania próbek.
2. Dodać 100 μl oczyszczonych liposomów obciążonych DOX (krok 3.2.5) do 1,9 ml HBS w probówce do mikrowirówki. Umieść rurkę w łaźni wodnej o wyznaczonej temperaturze.
3. Natychmiast pobrać 200 μl próbek z probówki i szybko umieścić ją w lodowatej łaźni wodnej w celu stłumienia ewentualnego późniejszego uwolnienia leku. Próbka ta odpowiada początkowemu (t = 0) punktowi czasowemu.
4. Pobrać 200 μl próbek w kolejnych punktach czasowych (t = 5, 10, 15, 30, 60 min) i szybko umieścić je w lodowatej łaźni wodnej w celu stłumienia uwalniania leku.
5. Zmieszać 50 μl próbki z każdego punktu czasowego ze 150 μl HBS na czarnej 96-dołkowej płytce. Zmierz intensywność fluorescencji DOX za pomocą czytnika płytek.
6. Dodać 20 μl 1% (v/v) Triton X-100 do losowo wybranych studzienek przygotowanych w kroku 6.5. Zmierz intensywność fluorescencji DOX tych studzienek za pomocą czytnika płytek. Wartości te odpowiadają punktowi czasowemu pełnego zwolnienia (t = ∞; 100% zwolnienia).
7. Oblicz i wykreśl procent DOX uwolniony przez interpolację intensywności fluorescencji każdego punktu czasowego (I(t)), w porównaniu z początkowym (I(0)) i całkowicie uwolnionym (I(∞)), wartość.
   

7. Nagrzewanie lasera i wyzwolenie

1. Ustaw temperaturę łaźni wodnej na 37 °C i poczekaj, aż temperatura się ustabilizuje.
2. Dodaj 200 μl LTSL10-ICG załadowanego DOX ([ICG] = 10 μg/ml) do przezroczystej 96-dołkowej płytki, a następnie umieść ją w łaźni wodnej, utrzymuj dno zanurzone w wodzie.
3. Ustaw prąd systemu laserowego na 2.27 A. Umieść kolimator systemu laserowego na wysokości 5 cm pionowo nad powierzchnią płytki 96-dołkowej, co odpowiada strumieniowi energii 0.5 W/^cm2 [Rysunek 6].
   UWAGA: System laserowy powinien być eksploatowany zgodnie z odpowiednimi środkami bezpieczeństwa lasera.
4. Włącz laser i monitoruj temperaturę co minutę za pomocą światłowodowej sondy temperatury.
5. Po 5 i 10 minutach pobrać 10 μl napromieniowanych laserowo liposomów z przezroczystej 96-dołkowej płytki i wymieszać ze 190 μl HBS dla trzech dołków w czarnej 96-dołkowej płytce.
6. Wymieszaj 10 μl liposomów ze 170 μl HBS i 20 μl 1% (v/v) roztworu Triton X-100 dla trzech dołków w czarnej 96-dołkowej płytce. Studzienki te odpowiadają zawartości DOX "w 100% uwolnionej". Zmierz intensywność fluorescencji DOX i oblicz uwalnianie DOX zgodnie z opisem w kroku 6.7.

Results

Przygotowanie LTSL za pomocą mikrofluidyki wymaga składu lipidowego DPPC/MSPC/DSPE-PEG₂₀₀₀ (80/10/10, stosunek molowy; LTSL10). Rysunek 7A (po lewej) pokazuje wygląd przygotowanego LTSL10 z kroku 2.9, jako klarowną i nielepką ciecz. Preparat LTSL10 został opracowany na podstawie konwencjonalnego preparatu LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG₂₀₀₀, 86/10/4, stosunek molowy), ponieważ LTSL4 tworzy lepką próbkę o konsystencji żelu, na ...

Discussion

Przedstawiony protokół opisuje przygotowanie liposomów wrażliwych na niską temperaturę (LTSL) przy użyciu naprzemiennego mikromiksera w jodełkę (SHM). Preparat LTSL10 umożliwia wywołane temperaturą impulsowe uwalnianie doksorubicyny w ciągu 5 minut przy klinicznie osiągalnej temperaturze hipertermicznej 42 °C. Zieleń indocyjaninowa (ICG) może być również współładowana do ogrzewania fototermicznego wyzwalanego uwalnianiem DOX. Metoda opiera się na: (i) samoorganizacji fosfolipidów w liposomach w homogenizowanym środowisku...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DPPC)	Lipoid	PC 16:0/16:0 (DPPC)
1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (DSPE-PEG2000)Lipoid		PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE)
1-stearoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina (MSPC)	Avanti Polar Lipid	855775P-500MG	Dystrybucja przez Sigma-Adrich; znany również jako Lyso 16:0 PC (nie mylić z 14:0/18:0 PC, który jest również określany jako MSPC)
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)Adaptery	Sigma-Aldrich	H3375-100G
, żeńskie Luer Lock do 1/4"-28UNF	IDEX Health & Nauka	P-624	Wymaga 2 jednostek. Do adapterów wlotowych
, montaż złączy, 1/4"-28UNF	IDEX Health & Nauka	P-630	Wymaga 2 jednostek. (Jedna jednostka zawierała 2 nakrętki i 2 tuleje)
Siarczan amonu ((NH4)2SO4)	Sigma-Aldrich	31119-1KG-M
Fiolka Bijou	VWR	216-0980	7 mL, przezroczysta, polistyrenowa fiolka
Filtr odśrodkowy	Sigma-Aldrich	UFC801008	10 kDa MWCO, Wirówka z filtrem odśrodkowym Amicon Ultra-4
	ThermoFisher Scientific	Heraeus Megafuge 8R	z wirnikiem
o stałym kącie nachylenia HIGHConic IIICuvette	Fisher Scientific	11602609	Jednorazowa kuweta polistyrenowa, mała objętość, do pomiaru DLS
Zestaw do dializy - Pur-A-Lyzer Maxi	Sigma-Aldrich	PURX12015-1KT	12-14 kDa
MWCO Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	34943-1L-M
DLS Instrument	Malvern Panalytical	Zetasizer Nano ZS90
Chlorowodorek doksorubicyny (DOX)	Apollo Scientific	BID0120
Instrument DSC TA	Instruments	TA Q200 DSC
DSC Tzero Hermetyczne pokrywki	TA Instruments	901684.901	Do pomiaru DSC
DSC Tzero Pans	TA Instruments	901683.901	Do pomiaru DSC
Zestaw prasowy do próbek DSC Tzero	TA Instruments	901600.901	Do pomiaru
Etanol	VWR	20821.330	Absolutny, ≥ 99,8%
FC-808 System laserowy sprzężony z włóknem	CNI Optoelectronics Tech	FC-808-8W-181315	Kolimator światłowodowy FOC-01-B w zestawie.
Okucie, 1/4"-28UNF do 1/16" OD	IDEX Health & Science	P-200	Do gniazdka
Światłowodowa sonda temperatury	Osensa	PRB-G40
Szklany naprzemienny mikromikser w jodełkę (SHM)	Darwin Microfluidics	Mikser w jodełkę - taśma
	Omega	DHT052020LD	Może być zastąpiony innym podgrzewaczem strzykawkowym, takim jak "HTC" lub "seria SRT" w celu wolniejszego nagrzewania. Ręczne okablowanie do 3-pinowej wtyczki wymagane dla modeli 240 V
Indocyanine Green	Adooq	A10473-100	Dystrybuowane przez Bioquote Limited (Wielka Brytania)
Strzykawka Luer-lock, 5 ml	VWR	613-2043	Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-częściowe strzykawki, OD 12,45 mm
Czytnik mikropłytek	BMG Labtech	FLUOstar Omega	Zainstalowany z filtrami 485 nm (exictation) i 590 nm (emisja)
Microplate, 96-dołkowy,, Płaskodenny	ThermoFisher Scientific	611F96BK	Do pomiaru fluorescencji w czytniku mikropłytek
Mikropłytka, 96-dołkowa, Przezroczysty, płaskodenny	Grenier	655101	Do pomiaru absorbancji czytnik mikropłytek
Nakrętka, 1/4"-28UNF do 1/16" OD	IDEX Zdrowie & Science	P-245	Do gniazdka
sieciowy z komputera do pompy dla Aladdin, 7ft	World Precision Instruments	NE-PC7	Opcjonalnie: Pompy strzykawkowe mogą być obsługiwane ręcznie
Oprogramowanie sterujące pompą - Licencja na oprogramowanie SyringePumpPro dla 2	World Precision Instruments	SYRINGE-PUMP-PRO-02	Opcjonalnie: Pompy strzykawkowe mogą być obsługiwane ręcznie
sieciowy między pompami do Aladdin, 7 stóp	World Precision Instruments	NE-NET7	Opcjonalnie: Pompy strzykawkowe mogą być obsługiwane ręcznie
Kolumna chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC)	GE Life Science	17085101	Żywica Sephadex G-25 w kolumnach odsalających PD-10
Chlorek sodu (NaCl)	Sigma-Aldrich	31434-1KG-M
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881-500G
Pompy strzykawkowe i (DUAL-PUMP-NE-1000)	World Precision Instruments	ALADDIN2-220/AL1000-220
Termostat Regulator temperatury	Inkbird	ITC-308	Może być zastąpiony innym zestawem grzałki strzykawki / termostatem
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Rurka, ETFE (1/16" OD)	IDEX Health & Science	1516
Konwerter USB na RS-232	Precision Instruments	CBL-USB-232	Opcjonalnie: Do komputera bez portu RS-232
Water Bath	Grant Instruments Ltd.	JB Nova 12