Laserowe uszkodzenie mózgu w korze ruchowej szczurów

Podsumowanie

Przedstawiony tutaj protokół pokazuje technikę tworzenia modelu uszkodzenia mózgu u gryzoni. Opisana tutaj metoda wykorzystuje promieniowanie laserowe i celuje w korę ruchową.

Streszczenie

Powszechna technika wywoływania udaru mózgu w eksperymentalnych modelach gryzoni polega na przejściowym (często oznaczanym jako MCAO-t) lub stałym (określanym jako MCAO-p) zamknięciu środkowej tętnicy mózgowej (MCA) za pomocą cewnika. Ta ogólnie przyjęta technika ma jednak pewne ograniczenia, ograniczając tym samym jej szerokie zastosowanie. Indukcja udaru tą metodą często charakteryzuje się dużą zmiennością lokalizacji i wielkości obszaru niedokrwiennego, okresowym występowaniem krwotoków i wysoką śmiertelnością. Ponadto pomyślne zakończenie którejkolwiek z procedur przejściowych lub stałych wymaga specjalistycznej wiedzy i często trwa około 30 minut. W niniejszym protokole przedstawiono technikę naświetlania laserowego, która może służyć jako alternatywna metoda wywoływania i badania uszkodzeń mózgu w modelach gryzoni.

W porównaniu do szczurów w grupie kontrolnej i MCAO, uszkodzenie mózgu przez indukcję laserową wykazało zmniejszoną zmienność temperatury ciała, objętości zawału, obrzęku mózgu, krwotoku śródczaszkowego i śmiertelności. Co więcej, użycie urazu wywołanego laserem spowodowało uszkodzenie tkanek mózgowych tylko w korze ruchowej, w przeciwieństwie do eksperymentów MCAO, w których obserwuje się zniszczenie zarówno kory ruchowej, jak i tkanek prążkowia.

Wyniki tego badania sugerują, że naświetlanie laserowe może służyć jako alternatywna i skuteczna technika wywoływania uszkodzeń mózgu w korze ruchowej. Metoda skraca również czas zakończenia procedury i nie wymaga doświadczonych opiekunów.

Wprowadzenie

Na całym świecie, udar mózgu jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów i trzecią główną przyczyną niepełnosprawności¹. Udar mózgu prowadzi również do poważnej niepełnosprawności, często wymagającej dodatkowej opieki ze strony personelu medycznego i krewnych. W związku z tym istnieje potrzeba zrozumienia powikłań związanych z zaburzeniem i zwiększenia potencjału uzyskania bardziej pozytywnych wyników.

Wykorzystanie modeli zwierzęcych to pierwszy krok do zrozumienia chorób. Aby zapewnić najlepsze wyniki badań, typowy model obejmowałby prostą technikę, przystępność cenową, wysoką odtwarzalność i minimalną zmienność. Determinanty w modelach udaru niedokrwiennego obejmują objętość obrzęku mózgu, wielkość zawału, stopień załamania bariery krew-mózg (BBB) oraz upośledzenie funkcjonalne ogólnie oceniane za pomocą oceny ciężkości neurologicznej².

Najczęściej stosowana technika indukcji udaru mózgu w modelach gryzoni zasłania tętnicę środkową mózgu (MCA) przejściowo lub na stałe³. Technika ta tworzy model udaru podobny do tych u ludzi: ma półcień otaczający obszar udaruchania, jest wysoce powtarzalny i reguluje czas trwania niedokrwienia i reperfuzję⁴. Niemniej jednak metoda MCAO wiąże się z pewnymi komplikacjami. Technika ta jest podatna na krwotok śródczaszkowy i uszkodzenie siatkówki ipsilateralnej z dysfunkcją kory wzrokowej i częstą hipertermią, które często prowadzą do dodatkowych wyników^5,6^,7. Inne ograniczenia obejmują duże wahania w indukowanym udarze (wynikające z prawdopodobnego rozszerzenia niedokrwienia na niezamierzone obszary, takie jak obszar tętnicy szyjnej zewnętrznej), niewystarczająca niedrożność MCA i przedwczesna reperfuzja. Ponadto szczury różnych szczepów i rozmiarów wykazują różne objętości zawału⁸. Oprócz wszystkich wymienionych wad, model MCAO nie może indukować małych izolowanych udarów w głębokich obszarach mózgu, ponieważ jest ograniczony technicznie pod względem wymagań dotyczących minimalnej wielkości naczynia do cewnikowania. To sprawia, że potrzeba alternatywnego modelu jest jeszcze bardziej krytyczna. Inna metoda, fotozakrzepica, stanowi możliwą alternatywę dla procedur MCAO, ale nie poprawia wydajności⁹. Ta technika ma na celu pociągnięcie światłem i oferuje pewne ulepszenia w stosunku do poprzednich modeli. Jednak fotozakrzepica wymaga inwazyjnej kraniotomii, która wiąże się z wtórnymi obrazami⁹.

W świetle zarysowanych niedociągnięć, przedstawiony tutaj protokół dostarcza skuteczną alternatywną technikę laserową do wywoływania uszkodzeń mózgu u gryzoni. Mechanizm działania techniki laserowej opiera się na efektach fototermicznych lasera wywieranych na żywe tkanki, co prowadzi do absorpcji wiązek światła przez tkanki ciała i ich zamiany na ciepło. Zaletami stosowania techniki laserowej są jej bezpieczeństwo i łatwość manipulacji. Zdolność lasera do wytwarzania ciepła w celu zatrzymania krwawienia sprawia, że jest on bardzo ważny w medycynie, a jego zdolność do wzmacniania różnych wiązek w danym punkcie spotkania zapewnia, że lasery unikają niszczenia zdrowych tkanek, które stoją na drodze do punktu docelowego¹⁰. Wiązka laserowa używana w tym protokole może przechodzić przez medium o niskiej zawartości cieczy, takie jak kość, nie emitując swojej energii i/lub nie powodując żadnych zniszczeń. Gdy dotrze do środowiska o wysokiej zawartości płynu, takiego jak tkanki mózgowe, zużywa swoją energię na zniszczenie tkanek docelowych. Technika ta może zatem wywołać uszkodzenie mózgu tylko w odpowiednim obszarze mózgu.

Technika przedstawiona tutaj wykazała ogromną zdolność do regulowania poziomu napromieniowania, powodując wybrane warianty uszkodzenia mózgu, które były zamierzone od samego początku. W przeciwieństwie do oryginalnego MCAO, który wpływa zarówno na korę, jak i prążkowie, technika laserowa była w stanie regulować wpływ uszkodzenia mózgu, wywołując uraz tylko na zamierzonej korze ruchowej. W niniejszym artykule przedstawiono protokół uszkodzenia mózgu wywołanego laserem oraz podsumowanie reprezentatywnych wyników procedury wykonywanej na korze mózgowej szczurów.

Protokół

Poniższą procedurę przeprowadzono zgodnie z wytycznymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt doświadczalnych Wspólnoty Europejskiej. Eksperymenty zostały również zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Ben-Guriona w Negev.

1. Wybór i przygotowanie zwierząt

1. Do tej procedury należy wybrać 65 samców szczurów Sprague-Dawley o masie od 300 do 350 g, bez widocznych patologii. Mniejsza masa ciała stwarza trudności techniczne podczas przeprowadzania procedury MCAO.
2. Umieścić po 3 szczury w jednej klatce i pozostawić je do aklimatyzacji na co najmniej 3 dni.

2. Procedura MCAO

1. Wybierz 25 szczurów do zabiegu MCAO, uwzględniając 10—20% śmiertelności związanej z procedurą¹¹.
2. Wykonaj MCAO przy użyciu standardowej techniki, opisanej wcześniej szczegółowo¹².

3. Procedura eksperymentalna wywoływania laserowego urazu mózgu

1. Przypisz 20 szczurów do grupy oznaczonej jako grupa laserowa i 20 szczurów do drugiej, grupy kontrolnej (operowanej pozornie).
2. poddaj szczury z grupy laserowej naświetlaniu laserowemu z dawką 50J X 10 punktów w następujący sposób:
   1. Zanurz szczura w znieczuleniu przy użyciu mieszaniny 2% izofluranu w tlenie, dopuszczając do oddychania spontanicznego. Sprawdź wystarczającą głębokość znieczulenia, uciśnięcie ogona pęsetą, aby zweryfikować brak odruchu cofania.
   2. Utrzymuj temperaturę głęboką ciała szczura na poziomie 37 ˚C przez cały czas trwania procedury eksperymentalnej, korzystając z podgrzewej maty regulowanej temperaturą rektalną.
   3. Usuń lokalnie sierść za pomocą golarki i zdezynfekuj obszar 70% alkoholem oraz 0,5% glukonianem chlorheksydyny. Powtórz etap dezynfekcji jeszcze dwa razy.
      UWAGA: Wielkość cięcia chirurgicznego powinna wynosić około 3 cm. Usuń sierść w promieniu co najmniej 2 cm wokół obszaru cięcia.
   4. Umieść szczura na stereotaktycznym uchwycie do głowy w pozycji brzusznej i wykonaj cięcie o długości 3 cm, aby odsunąć skórę głowy bocznie i odsłonić obszar między Bregma a Lambda.
   5. Utrzymuj znieczulenie za pomocą maski nosowej.
   6. Użyj lasera neodymowo-YAG-owego (Nd-YAG) (szczytowa długość fali 1064 nm), aby podać 50J X 10 punktów z czasem trwania impulsu 1 s w odsłoniętym obszarze czaszki nad prawą półkulą.
   7. Upewnij się, że emitująca laser część urządzenia znajduje się w odległości 2 mm od odsłoniętego obszaru, aby wytworzyć wiązkę lasera. Parametry 50J X 10 punktów zostały wybrane po dokładnej ocenie różnych kombinacji energii i powierzchni. Kombinacja ta jest skuteczna i nie powoduje destrukcji kości czaszki po podaniu trwającym krócej niż sekundę¹⁰.
      UWAGA: 2 mm to odległość między końcówką wiązki laserowej (przez którą przechodzi kabel optyczny) a kością czaszki. W przypadku użycia soczewki skupiającej, odległość należy obliczyć, uwzględniając kąt nachylenia soczewki, aby skupić wiązkę w pożądanym obszarze uszkodzenia. Zachowaj odpowiednie środki bezpieczeństwa podczas korzystania z urządzenia laserowego, w tym przejdź właściwe przeszkolenie i stosuj ochronę oczu.
   8. Zdejmij szczura z urządzenia i zamknij skórę głowy za pomocą chirurgicznych szwów jedwabnych 3-0.
   9. Przerwij znieczulenie i przenieś szczura do klatki w celu rekonwalescencji. Bezpośrednio po operacji podaj miejscowo 0,1 mL 0,25% bupiwakainy, aby zmniejszyć ból pooperacyjny.
      UWAGA: Cała procedura powinna trwać mniej niż 5 min, jeśli jest wykonywana prawidłowo.
3. Obserwuj szczura pod kątem wszelkich oznak stresu podczas wybudzania z znieczulenia. Przed całkowitym wybudzeniem podaj domięśniowo 0,01mg/kg buprenorfiny w celu analgezji pooperacyjnej i kontynuuj podawanie powtarzalnych dawek co 12 h przez co najmniej 48 h.
4. Poddaj szczury z grupy kontrolnej tym samym warunkom, z pominięciem naświetlania laserem.

4. Skala nasilenia deficytów neurologicznych (NSS)

1. Oceń stopień nasilenia deficytów neurologicznych 24 h po laserowym uszkodzeniu mózgu, stosując 43-punktową skalę oceny¹³. Przebadaj zwierzęta pod kątem deficytów neurologicznych, zaburzeń behawioralnych, wykonania zadania na belce równoważnej oraz odruchów, przypisując wyższe wartości za poważniejsze dysfunkcje, zgodnie z wcześniejszymi opisami¹³.

5. Manipulacje po urazie

1. Po ocenie skali NSS uśmierć szczury poprzez podanie mieszaniny 20% tlenu i 80% CO2 (drogą wziewną), a następnie przeprowadź perfuzję transkardialną z użyciem heparynowanego roztworu soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS, 0,9% NaCl).
   UWAGA: Należy upewnić się, że CO₂ podawany jest z określoną wcześniej prędkością, zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC). Krok ten można również przeprowadzić w znieczuleniu izofluranem w stężeniu 5%.
2. Pobrać mózgi i przygotować do dalszych badań zgodnie z opisem w poprzednim protokole¹¹. 
3. Należy ocenić występowanie krwawienia podpajęczynówkowego (SAH) poprzez badanie wzrokowe całego mózgu po jego wyjęciu z czaszki. W razie potrzeby do tego celu można użyć mikroskopu lub szkieł powiększających.

6. Ocena urazu mózgu

1. Oznaczanie objętości zawału mózgu i obrzęku mózgu za pomocą barwienia TTC
   UWAGA: Barwienie chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolium (TTC) jest wygodną procedurą wykrywania zawałów mózgu¹¹.
   1. Podziel pobrane mózgi na 6 przekrojów czołowych o grubości 2 mm każdy.
   2. Inkubuj zestaw przekrojów z każdego mózgu przez 30 min w temperaturze 37 °C w 0,05% TTC.
   3. Po barwieniu zeskanuj przekroje za pomocą skanera optycznego z rozdzielczością 1600 X 1600 dpi.
   4. Niezafarbowane obszary utrwalonych przekrojów mózgu definiuje się jako obszary zawałowe¹².
   5. Używając oprogramowania do przetwarzania obrazów (np. darmowego programu Image J), zmierz niezafarbowany obszar zawału w półkulach ipsilateralnej i kontralateralnej dla każdego z 6 przekrojów czołowych.
   6. Oblicz objętość zawału jako procent całkowitej objętości mózgu:
      
   7. Oblicz obrzęk mózgu metodą Kaplana:
      
2. Oznaczanie stopnia uszkodzenia bariery krew-mózg (BBB)
   UWAGA: Stopień uszkodzenia BBB oceniaj 24 h po laserowym uszkodzeniu mózgu w następujący sposób:
   1. Podaj szczurom dożylnie, poprzez kaniulowaną żyłę ogonową, 2% Evans Blue zmieszany z 4 mL/kg roztworem soli fizjologicznej i pozwól roztworowi krążyć przez 1 h.
   2. Uśmierć szczury poprzez wystawienie ich na działanie 20% tlenu i 80% CO₂ (drogą wziewną) 24 h po ostatnim NSS, zgodnie z wcześniejszym opisem¹³.
   3. Pobierz barwnik zlokalizowany wewnątrz naczyniowo w następujący sposób:
      1. Otwórz klatki piersiowe szczurów za pomocą pęset i nożyczek chirurgicznych.
      2. Przeprowadź perfuzję zwierząt schłodzoną 0,9% solą fizjologiczną przez lewą komorę przy ciśnieniu 110 mmHg, aż do uzyskania bezbarwnego płynu perfuzyjnego z prawego przedsionka.
   4. Pobierz mózgi i pokrój je w kierunku rostrokaudalnym na plastry o grubości 2 mm.
   5. Oddziel lewe plastry mózgu od części prawych, aby oddzielnie ocenić półkule uszkodzone i nieuszkodzone.
   6. Zważ, zhomogenizuj za pomocą moździerza i tłuczka, a następnie inkubuj tkanki mózgu w 50% kwasie trójchlorooctowym przez 24 h.
   7. Wirowuj zhomogenizowane plastry mózgu przy 10 000 × g przez 20 min.
   8. Wymieszaj 1 mL supernatantu z wirowanego mózgu z 1,5 mL 96% etanolu w stosunku 1:3 i oceń uszkodzenie bariery krew-mózg za pomocą detektora fluorescencji przy długości fali wzbudzenia 620 nm (szerokość pasma 10 nm) i długości fali emisji 680 nm (szerokość pasma 10 nm).
      UWAGA: Obie grupy szczurów są poddawane temu samemu protokołowi oznaczania rozpadu BBB.

Wyniki

W żadnej z grup, kontrolnej ani eksperymentalnej, nie odnotowano zgonów ani krwotoków podpajęczynówkowych (Tabela 1). W grupie MCAO wskaźnik śmiertelności oraz częstość występowania krwotoku podpajęczynówkowego wyniosły 20%.

Zmiany względnej temperatury ciała u szczurów z obu grup były również podobne, pomimo różnic w zmienności obu grup (Tabela 1).

Odnotowano istotnie gorszy wynik NSS zarówno w modelu laserowym (16 ± 1,1), jak i w ...

Dyskusja

Można założyć, że technika laserowa jest minimalnie inwazyjna, biorąc pod uwagę, że w grupie laserów nie wystąpiły żadne zgony ani SAH. Główną przyczyną zgonu i SAH jest uszkodzenie naczyń krwionośnych, które prowadzi do podniesienia ciśnienia śródczaszkowego (ICP), jak pokazano w oryginalnych technikach MCAO¹⁰. Brak zgonu i SAH w grupie laserów jest prawdopodobnie spowodowany specyficznym działaniem laserów: nie mają one bezpośredniego wpływu na naczynia krwionośne i mogą indukować krzepnięcie w ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu	SIGMA - ALDRICH	298-96-4
50% kwas trichlorooctowy	SIGMA - ALDRICH	76-03-9
Mózg i Matryce tkankowe	SIGMA - ALDRICH	15013
Kaniula Venflon 22 G	KD-FIX	1.83604E+11
Wirówka Sigma 2-16P	SIGMA - ALDRICH	Sigma 2-16P
Kompaktowe wagi analityczne	SIGMA - ALDRICH	HR-AZ/HR-A
Cyfrowa waga	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
Nożyczki	preparacyjneSIGMA - Pipeta ALDRICH	Z265969
Eppendorf	SIGMA - ALDRICH	Z683884
Eppendorf Rurka	SIGMA - ALDRICH	EP0030119460
Etanol 96 %	ROMICAL		Łatwopalna ciecz
Evans Blue 2%	SIGMA - ALDRICH	314-13-6
Detektor fluorescencji	Tecan, Mä nnedorf Szwajcaria	model Czytnik wielomodowy
Grzałka z termometrem	Heatpad-1	Model: Mankiet infuzyjny HEATPAD-1/2
	ABN	IC-500
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
Wielozadaniowy	TEVA MEDICAL	998702
Olympus BX 40	Olympus
Skaner optyczny	Canon	Cano Scan 4200F
szalki Petriego	SIGMA - ALDRICH	P5606
Ostrza skalpela 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (granat itrowo-aluminiowy domieszkowany neodymem)	Laser Industries Ltd
Stereotaktyczny uchwyt głowicy	KOPF	900LS
Sterylna strzykawka 2 ml	Braun	4606027V
Igła strzykawkowa 27 G	Braun	305620

ważąca Infinite 200 PRO mikroskop