Method Article

Kowalencyjne przyłączanie pojedynczych cząsteczek do spektroskopii sił opartej na AFM

DOI:

10.3791/60934

⸱

March 16th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physical Chemistry, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, 2Chair in Polymer Chemistry, Saarland University, 3Cluster of Excellence livMatS at FIT - Freiburg Center for Interactive Materials and Bioinspired Technologies, University of Freiburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kowalencyjne dołączanie cząsteczek sondy do końcówek wsporników mikroskopii sił atomowych (AFM) jest niezbędną techniką do badania ich właściwości fizycznych. Dzięki temu możemy określić siłę rozciągania, siłę desorpcji i długość polimerów za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM o wysokiej odtwarzalności.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek oparta na mikroskopii sił atomowych (AFM) jest idealnym narzędziem do badania oddziaływań między pojedynczym polimerem a powierzchniami. W prawdziwym eksperymencie z pojedynczą cząsteczką niezbędne jest kowalencyjne przyłączenie cząsteczki sondy, ponieważ tylko wtedy można uzyskać setki śladów rozciągnięcia siły z jedną i tą samą pojedynczą cząsteczką. Wiele śladów jest z kolei koniecznych, aby udowodnić, że badana jest tylko pojedyncza cząsteczka. Ponadto pasywacja ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania niepożądanym interakcjom między pojedynczą cząsteczką sondy a końcówką wspornika AFM, a także między końcówką wspornika AFM a powierzchnią znajdującą się pod spodem. Przedstawiony tutaj protokół funkcjonalizacji jest niezawodny i można go łatwo zastosować do różnych polimerów. Charakterystyczne zdarzenia pojedynczej cząsteczki (tj. rozciągnięcia i płaskowyże) są wykrywane w śladach siły-rozciągnięcia. Na podstawie tych zdarzeń można uzyskać parametry fizyczne, takie jak siła rozciągania, siła desorpcji i długość desorpcji. Jest to szczególnie ważne dla precyzyjnego badania układów reagujących na bodźce na poziomie pojedynczej cząsteczki. Jako przykładowe systemy poli(glikol etylenowy) (PEG), poli(N-izopropyloakrylamid) (PNiPAM) i polistyren (PS) są rozciągane i desorbowane z SiOx (dla PEG i PNiPAM) oraz z hydrofobowych samoorganizujących się powierzchni jednowarstwowych (dla PS) w środowisku wodnym.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od czasu wynalezienia w latach 80. XX wieku1, mikroskop sił atomowych (AFM) stał się jedną z najważniejszych technik obrazowania w naukach przyrodniczych, oferując sub-nanometrową rozdzielczość przestrzenną, rozdzielczość siły sub-Piconewton i możliwość pomiaru w różnych warunkach rozpuszczalnikowych i temperaturowych2,3,4,5,6,7.

Oprócz obrazowania8,9, AFM służy do wykonywania spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki (SMFS), dając wgląd w interakcje adhezyjne między pojedynczym polimerem a powierzchniami, właściwości fizyczne pojedynczych polimerów i mechanizmy rozwijania białek7,10,11,12,13,14,15,16. W zwykłym eksperymencie SMFS funkcjonalizowana końcówka wspornika styka się z powierzchnią, tak że polimer na końcówce wspornika AFM dociera do tej powierzchni. Poprzez cofnięcie końcówki wspornika AFM od powierzchni, zmiana ugięcia wspornika AFM jest przekształcana w siłę prowadzącą do krzywej siła-wydłużenie4. Parametry fizyczne, takie jak siła rozciągania, siła desorpcji i długość desorpcji, mogą być określane jako zależne od różnych parametrów, takich jak prędkość ciągnięcia, czas przebywania na powierzchni, głębokość wgłębienia w powierzchnię, temperatura, rozpuszczalnik17,18 i różne powierzchnie, takie jak podłoża stałe, folie polimerowe lub dwuwarstwy lipidowe19,20,21,22. Co więcej, polimer może być badany w różnych kierunkach przestrzennych, badając w ten sposób właściwości cierne polimeru23,24,25,26.

Kowalencyjne połączenie badanego polimeru z końcówką wspornika AFM jest niezbędne dla takich badań. W ten sposób wysoka wydajność pojedynczych cząsteczek z jednym i tym samym polimerem związanym z końcówką wspornikową AFM zapobiega wszelkim odchyleniom wyników wynikającym z kalibracji stałej sprężystości wspornika AFM27,28, różne punkty mocowania29 lub różnych polimerów (o różnych długościach konturów), takich jak w przypadku eksperymentów z nanopołowami30, 31,32. Można również w znacznym stopniu zapobiec interakcjom z innymi polimerami, a także efektom uśredniania18,28. Do kowalencyjnego mocowania polimeru do końcówki wspornika AFM można zastosować różne rodzaje modyfikacji chemicznych, z których wiele podsumowano w książce Hermanson33. Reakcje łączenia na bazie amin i tioli, a także chemia kliknięć to najczęściej stosowane metody w funkcjonalizacji końcówek kantylowych AFM34,35,36,37,38,39,40,41,42. Becke i wsp.40 pokazują, jak używać chemii 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC)/NHS do przyłączenia białka do końcówki wspornika AFM. Jednak wspomniane grupy funkcyjne mają tendencję do sieciowania, co prowadzi do utraty funkcjonalności43,44. Ponadto karbodiymidy wykazują tendencję do szybkiej hydrolizy w roztworze43. Grupy maleimidowe i tiolowe są na ogół bardziej stabilne i nie wykazują reakcji sieciowania. Prezentowany protokół jest optymalizacją wcześniej opublikowanych protokołów podanych w references35,39.

Tutaj prezentowany jest niezawodny protokół funkcjonalizacji, który można łatwo dostosować do dużej liczby różnych polimerów, niezależnie od właściwości takich jak długość konturu czy hydrofobowość. Jako przykład wybrano trzy różne polimery: hydrofilowy glikol polietylenowy (PEG) i poli(N-izopropyloakrylamid) (PNiPAM) oraz polistyren hydrofobowy o wysokiej masie molowej (PS). Aby zapewnić zdolność wiązania kowalencyjnego z odpowiednią cząsteczką łącznika, trzy polimery wybrano tak, aby zawierały telecheliczne ugrupowanie tiolowe jako funkcjonalną grupę końcową. Sama cząsteczka łącznika jest zazwyczaj krótkim polimerem PEG z dwoma miejscami aktywnymi, grupą silanową na jednym końcu i grupą maleimidową na drugim końcu. Pierwsza z nich umożliwia kowalencyjne przymocowanie do końcówki wspornika AFM, a druga reakcję wiązania z grupą tiolową funkcjonalizowanego polimeru o wysokiej masie molowej. Ponadto nieaktywne cząsteczki łącznikowe PEG służą jako warstwa pasywacyjna, aby zapobiec niepożądanym interakcjom między polimerem sondy a końcówką wspornika AFM, a także między końcówką wspornika AFM a powierzchnią pod spodem.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Zobacz Rysunek 1 dla przeglądu schematu.

1. Konfiguracja odczynnika

UWAGA: Polimery użyte do tego protokołu to: glikol maleimidowo-polietylenowy-trietoksysilan (silan-PEG-mal, 5 kDa), glikol tiolowo-polietylenowy-tiol (HS-PEG-SH, 35 kDa), poli(N-izopropyloakrylamid) zakończony tiolem (PNiPAM-SH, 637 kDa) i polistyren zakończony tiolem (PS-SH, 1,3 mDa).

  1. Przygotować dobrze zdefiniowany PNiPAM-SH o wysokiej masie molowej poprzez polimeryzację rodnikową z przeniesieniem atomu, a następnie konwersję i redukcję funkcjonalnej grupy końcowej w celu wprowadzenia ugrupowania tiolowego, jak opisano w literaturze18. Zobacz Rysunek 1, aby zapoznać się ze szczegółowymi strukturami.
  2. Do przechowywania chemikaliów należy przygotować mniejsze porcje w systemie suchego komory rękawicowej z atmosferą azotu, aby uniknąć narażenia na działanie tlenu atmosferycznego i wilgoci. PEG i PNiPAM są higroskopijne45,46 a funkcjonalne grupy końcowe PEG, PNiPAM i PS są znane z tego, że łatwo się utleniają, gdy są przechowywane w temperaturze otoczenia33,47,48. Wszystkie chemikalia muszą być przechowywane w temperaturze -20 °C.
  3. Stosować rozpuszczalniki o czystości analitycznej lub wyższej. Co więcej, używaj ultraczystej wody do płukania chipów wspornikowych AFM i szkła, ponieważ eksperymenty z pojedynczymi cząsteczkami są bardzo wrażliwe na wszelkie zanieczyszczenia.

2. Konfiguracja sprzętu

UWAGA: Użyj pęsety i zlewek wykonanych ze stali nierdzewnej lub szkła. Użyj odwróconej pęsety, aby zapewnić pewny chwyt (np. model R3 SA o niskiej stałej sprężystości).

  1. Przygotuj roztwór RCA (ultraczysta woda, nadtlenek wodoru i amoniak (5:1:1)) do czyszczenia szkła i pęsety.
  2. Umieść naczynia w zlewce i napełnij ją RCA, aż szkło lub pęseta zostaną całkowicie pokryte.
  3. Podgrzewać zlewkę z kroku 2.2 przez 1 godzinę w temperaturze 80 °C.
  4. Następnie przepłukać naczynia ultraczystą wodą, aż nie będzie już można stwierdzić ostrego zapachu (co najmniej trzy razy).
  5. Wysuszyć szkło i pęsetę w piekarniku (120 °C).

3. Funkcjonalność końcówki

UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane w dygestorium, aby uniknąć wdychania oparów organicznych. Dodatkowo wymagane są rękawice, fartuch laboratoryjny i ochrona oczu. Na każdym kroku używaj rękawic nitrylowych lub lateksowych, aby uniknąć zanieczyszczenia. Podczas używania toluenu należy nosić rękawice odporne na rozpuszczalniki. Wszystkie kroki, o ile nie określono inaczej, są wykonywane w RT. Na każdym etapie należy używać świeżego sprzętu i rękawic, aby uniknąć ewentualnego zanieczyszczenia krzyżowego.

  1. Przeprowadzić aktywację powierzchniową poprzez zastosowanie plazmy tlenowej do chipa wspornikowego AFM MLCT-Bio-DC.
    UWAGA: Efektywność obróbki plazmowej dla dalszych etapów funkcjonalizacji skaluje się wraz z zawartością tlenu w komorze plazmowej.
    1. Użyj świeżo oczyszczonej pęsety, aby umieścić wióry wspornikowe AFM w komorze plazmowej (40 kHz, 600 W).
    2. Użyj specjalnie zmodyfikowanego programu aktywacji: ewakuacja (0,1 mbar) – zalanie tlenem do ciśnienia: 0,2 mbar (4 min) – proces plazmowy (moc: 40%, czas trwania: 2 min, ciśnienie procesowe: 0,2 mbar).
    3. Przewietrzyć komorę i natychmiast przejść do kroku 3.2.2, aby zapobiec adsorpcji zanieczyszczeń z powietrza na wiórach wspornikowych AFM.
  2. Silanizacja i PEGylacja
    UWAGA: Czas jest krytycznym parametrem między krokami. W czasie oczekiwania przygotuj roztwory tak świeże, jak to możliwe. Grupy maleimidowe ulegają hydrolizie w środowisku wodnym, a tiole łatwo utleniają się do dwusiarczków w roztworze33,47 utrudniając reakcje funkcjonalizacji końcówki AFM.
    1. Przygotować roztwór silanu-PEG-mal w toluenie (1,25 mg/ml) w odpornych na rozpuszczalniki probówkach z tworzywa sztucznego lub szkła i wlać 6 ml roztworu na płaskie szalki Petriego po 3 ml każda.
      UWAGA: Jeśli w eksperymencie SMFS zaobserwowano wiązanie wielu polimerów sondy, mieszanie silanu-PEG-mal z niefunkcjonalnym silanem-PEG może zmniejszyć liczbę punktów kotwiczenia. Do regulacji warstwy pasywacyjnej można użyć PEG o różnych masach (tj. długościach konturów)27.
    2. Inkubować wióry wspornikowe AFM natychmiast po kroku 3.1.3 w roztworze silan-PEG-mal (do 10 wiórów na szalkę Petriego) przez 3 godziny w temperaturze 60 °C35.
    3. Wyjmij szalki Petriego z piekarnika i pozwól roztworowi ostygnąć przez co najmniej 10 minut.
    4. Dokładnie opłucz każdy chip wspornikowy AFM. Zmniejszyć wpływ sił kapilarnych na wspornik AFM podczas przechodzenia przez granicę faz powietrze-rozpuszczalnik, na przykład poprzez lekkie przechylenie tych wiórów podczas zanurzania w roztworze.
      1. W przypadku polimerów PEG i PS spłukać trzykrotnie toluenem.
      2. W przypadku polimeru PNiPAM przepłukać raz toluenem i dwa razy etanolem.
    5. Wybierz co najmniej dwa wióry wspornikowe AFM jako kontrolne wióry wspornikowe AFM, pomijając krok 3.3 i przepłucz je w następujący sposób, aby zwiększyć polarność rozpuszczalnika:
      1. W przypadku polimerów PEG i PS spłukać dwukrotnie etanolem i raz ultraczystą wodą.
      2. W przypadku polimeru PNiPAM spłukać dwukrotnie ultraczystą wodą.
        UWAGA: Chipy wspornikowe Control AFM przeszły wszystkie etapy funkcjonalizacji z wyjątkiem mocowania polimerowego (krok 3.3). Służą one do udowodnienia czystości procesu funkcjonalizacji, systemu wspornikowych uchwytów wiórów AFM, powierzchni i rozpuszczalników użytych w eksperymencie SMFS.
  3. Nasadka polimerowa kowalencyjna
    UWAGA: Mimo, że oczekuje się, że końcówka wspornika AFM będzie całkowicie pokryta grupami maleimidowymi, istnieje tylko kilka miejsc wiązania dla polimeru pojedynczej sondy, ponieważ maleimid ulega hydrolizie w wodzie, co prowadzi do nieaktywnych PEGs47. Te nieaktywne PEG-i działają jak warstwa pasywacyjna, jak opisano powyżej.
    1. Inkubować wióry wspornikowe AFM bezpośrednio po kroku 3.2.5 w jednym z następujących roztworów polimerowych na 3 ml szalek Petriego. Jeśli dany polimer nie zostanie prawidłowo rozpuszczony, należy użyć łaźni wodnej o temperaturze 40 °C i dobrze wymieszać roztwór.
      UWAGA: Ponieważ stosowanie polimerów zakończonych tiolem może prowadzić do powstawania wiązań dwusiarczkowych utrudniających reakcję z grupami maleimidowymi silanu-PEG-mal, zaleca się stosowanie środka redukującego, w szczególności jeśli krok 3.3 jest stosowany w wodnych dla polimerów rozpuszczalnych w wodzie33.
      1. W przypadku polimerów PEG i PS należy stosować stężenie 1,25 mg/ml w toluenie przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C.
      2. W przypadku polimerów PNiPAM należy stosować stężenie 1,25 mg/ml w etanolu przez 3 godziny w temperaturze RT.
        UWAGA: Jeśli w eksperymencie SMFS zaobserwowano wiązanie wielu polimerów sondy, stężenie polimeru powinno zostać zmniejszone.
    2. Ostrożnie wypłucz każdy chip wspornikowy AFM.
      1. W przypadku polimerów PEG i PS po 10 minutach schładzania spłukać dwukrotnie toluenem, dwukrotnie etanolem i raz wodą ultraczystą.
      2. W przypadku polimerów PNiPAM należy spłukać dwukrotnie etanolem i dwukrotnie wodą ultraczystą.
    3. Przechowuj każdy chip wspornikowy AFM oddzielnie na małej (1 ml) szalce Petriego wypełnionej ultraczystą wodą o temperaturze 4 °C do czasu użycia w eksperymencie.

4. Przygotowanie powierzchni

  1. Wafel z tlenku krzemu
    UWAGA: Ta powierzchnia została użyta do SMFS z PEG i PNiPAM.
    1. Pokrój wafel z tlenku krzemu na małe kawałki za pomocą noża diamentowego.
    2. Umieść kawałki tlenku krzemu oddzielnie w probówkach do mikrowirówek i napełnij te probówki etanolem.
    3. Sonikować kawałki tlenku krzemu przez 10 minut.
    4. Dwukrotnie opłucz kawałki tlenku krzemu etanolem i ostrożnie wysusz je pod strumieniem azotu. Kawałki tlenku krzemu należy natychmiast zużyć.
  2. Samoorganizująca się monowarstwa hydrofobowego alkanu tiolu na złocie (SAM)
    UWAGA: Ta powierzchnia była używana do SMFS z PS. Zobacz literature39,49, aby uzyskać więcej informacji na temat SAM.
    1. Użyj płytki krzemowej pokrytej złotem (A [100], tytan 5 nm, złoto 100 nm), aby wykonać kroki 4.1.1 – 4.1.4.
    2. Inkubować kawałki powierzchni w roztworze 1-dodekantiolu (2 mM) przez 18 godzin.
    3. Świeżo przygotowane SAM-y opłucz dwukrotnie w etanolu.
    4. Suszyć SAM z przepływem azotu do bezpośredniego użycia lub przechowywać je w etanolu do 4 dni do późniejszego wykorzystania.

5. Akwizycja danych

UWAGA: Wszystkie pokazane tutaj pomiary zostały wykonane w ultraczystej wodzie za pomocą Cypher ES AFM przy użyciu ogrzewania i chłodzenia próbki do zmiany temperatury. Ogólnie rzecz biorąc, można stosować wszystkie AFM zapewniające możliwość pomiaru w cieczach.

  1. Włóż funkcjonalny chip wspornikowy AFM do AFM.
  2. Przyklej przygotowaną powierzchnię do uchwytu na próbkę, który jest odpowiedni do pomiaru w cieczach (np. Związek replikujący o wysokiej rozdzielczości 101RF lub klej utwardzany promieniami UV).
    UWAGA: Te środki wiążące są wysoce obojętne i odporne na dużą liczbę rozpuszczalników polarnych. Przed użyciem należy sprawdzić odporność kleju na rozpuszczalniki niepolarne (np. toluen lub heksan) lub wysokie temperatury.
  3. Zanurz chip wspornikowy AFM i próbkę sondy w cieczy, tutaj: ultraczysta woda.
    UWAGA: Kropla rozpuszczalnika (około 100 μl) może osadzać się na wspornikowym uchwycie wiórów AFM. Pokrycie wióra wspornika AFM rozpuszczalnikiem zmniejsza siły kapilarne, które w przeciwnym razie działałyby na wspornik AFM podczas zbliżania się do powierzchni próbki przechodzącej przez granicę faz powietrze-rozpuszczalnik
    4. .
  4. W razie potrzeby wyreguluj temperaturę i pozwól systemowi się zrównoważyć.
    UWAGA: Zmiany temperatury mogą powodować ugięcie wspornika AFM z powodu efektu bimetalicznego dla wsporników AFM z powłoką odblaskową, taką jak aluminium lub złoto. Równowagę należy przeprowadzać z dala od powierzchni (kilka μm) do momentu, gdy nie obserwuje się dalszej zmiany sygnału ugięcia (do 15 minut dla MLCT-Bio-DC).
  5. Zmieniaj temperaturę losowo, aby wykluczyć jakiekolwiek efekty starzenia się funkcjonalizacji. Upewnij się, że zastosowane temperatury nie prowadzą do nieodwracalnego wygięcia wspornika AFM.
    UWAGA: Jakikolwiek wpływ temperatury na właściwości rozpuszczalnika (taki jak parowanie lub zmiany lepkości) może utrudnić eksperymenty. W prezentowanych przykładach temperatura zmieniała się w zakresie do 40 K w krokach co 10 K, przyjmując wodę jako rozpuszczalnik (np. od 278 K do 318 K).
  6. Zbliż się do powierzchni, aby określić InvOLS (odwrotną czułość dźwigni optycznej), wykonując krzywe siły-wydłużenia na twardej powierzchni (takiej jak tlenek krzemu). W tym celu należy wziąć sygnał odchylenia fotodetektora (w V) w funkcji odległości piezoelektrycznej i określić nachylenie części reprezentującej wcięcie końcówki wspornika AFM w powierzchnię znajdującą się pod spodem (reżim odpychający) za pomocą funkcji liniowej. Aby zmniejszyć liczbę błędów, należy wziąć średnią z co najmniej pięciu wartości, aby uzyskać ostateczną wartość InvOLS. Więcej informacji można znaleźć w literaturze4,39.
    UWAGA: InvOLS można niezawodnie określić tylko na twardych powierzchniach. W przypadku eksperymentów na miękkich powierzchniach lub interfejsach upewnij się, że umieścisz twardą powierzchnię blisko miękkich powierzchni. Następnie kalibrację InvOLS można przeprowadzić przed lub po eksperymentach z miękkimi powierzchniami bez konieczności demontażu zestawu AFM.
  7. W celu wyznaczenia stałej sprężystości należy przesunąć wspornik AFM na wysokość, na której nie ma ani atrakcyjnych, ani odpychających interakcji między końcówką wspornika AFM a powierzchnią (kilka μm). Następnie nagraj widmo szumu termicznego, w którym wykreślana jest gęstość widmowa mocy (PSD) w funkcji częstotliwości. Następujące kroki są zwykle wykonywane przez zautomatyzowane funkcje wbudowane w komercyjne oprogramowanie AFM: po pierwsze, uzyskane widmo szumu termicznego jest analizowane poprzez dopasowanie funkcji do PSD, np. prostego oscylatora harmonicznych (SHO). Dopasowanie jest wykonane do minimum między pierwszym a drugim rezonansem. Po drugie, określa się powierzchnię pod zamontowaną częścią wykresu PSD w funkcji częstotliwości, reprezentującą średnie kwadratowe przemieszczenie wspornika AFM w kierunku pionowym. Na koniec twierdzenie o ekwipartycji służy do uzyskania stałej siły wspornika AFM28,50.
    UWAGA: Należy zastosować odpowiedni zakres częstotliwości obejmujący pierwszy pik rezonansowy wspornika AFM. Aby uzyskać zadowalający stosunek sygnału do szumu, należy zgromadzić co najmniej 10 plików PSD o najwyższej możliwej rozdzielczości częstotliwości.
  8. Rozpocznij eksperyment. Zapisuj mapy sił, biorąc krzywe rozciągnięcia siły w sposób przypominający siatkę (np. 10 x 10 punktów dla obszaru 20 x 20 μm2), aby uniknąć lokalnych skutków powierzchniowych (np. zanieczyszczeń, przemieszczeń) i uśrednić różne powierzchnie.
    UWAGA: Typowe parametry to prędkość ciągnięcia 1 μm/s i częstotliwość próbkowania 5 kHz, aby zapewnić wystarczającą rozdzielczość. Częstotliwość pobierania próbek powinna być dostosowana, gdy prędkość ciągnięcia jest zmienna. Odległość cofania powinna być dostosowana do długości konturu lub desorpcji mierzonego polimeru (ok. dwukrotność oczekiwanej długości).
  9. Używaj i zmieniaj czas przebywania w kierunku powierzchni, aby pojedynczy polimer mógł przylegać do powierzchni (zwykle 0 – 5 s).
  10. Powtórz oznaczanie InvOLS i stałej sprężystości na końcu doświadczenia, aby sprawdzić konsystencję i stabilność systemu.
    UWAGA: Aby uzyskać silną przyczepność między polimerem a powierzchnią, kalibrację można wykonać po faktycznym eksperymencie, aby zachować funkcjonalizację.

6. Ocena danych

UWAGA: Do oceny danych, do wykonania następujących kroków użyto specjalnie napisanego oprogramowania opartego na Igor Pro.

  1. Przelicz surowy sygnał ugięcia (w woltach) na wartości siły (w niutonach), mnożąc przez zarejestrowany InvOLS i wyznaczoną stałą sprężystości.
  2. Odejmij ugięcie wspornika AFM (po pomnożeniu surowego sygnału ugięcia za pomocą InvOLS) od odległości pokonywanej przez elementy piezoelektryczne w kierunku pionowym, aby uzyskać rzeczywiste wydłużenie (odległość końcówka-powierzchnia)4.
  3. Skorygować krzywe siła-wydłużenie uzyskane dla dryftu, dopasowując funkcję liniową do linii bazowej po ostatnim zdarzeniu i odejmując ją od krzywej siła-wydłużenie. Dopasowana część powinna stanowić wystarczające przedłużenie od powierzchni, gdzie nie obserwuje się ani przyciągających, ani odpychających oddziaływań między końcówką wspornika AFM a powierzchnią znajdującą się pod spodem. Następnie linia bazowa jest ustawiana na oś zerową.
    UWAGA: W przypadku pomiarów na powierzchniach silnie odbijających światło, takich jak złoto, mogą pojawić się zakłócenia. Wynikają one z częściowego odbicia wiązki laserowej od powierzchni i od tyłu wspornika AFM. Tak więc uzyskane krzywe rozciągnięcia siły mogą pokazywać artefakt sygnału siły sinusoidalnej wzdłuż wydłużenia pionowego. Jest to artefakt, który utrudnia końcowe wartości siły. Aby nadal uwzględniać te krzywe siła-rozciągnięcie, możliwa jest korekta (Rysunek 2).
  4. Jeśli zakłócenia pojawiają się na krzywych rozciągnięcia siły, wybierz reprezentatywną krzywą siła-wydłużenie (krzywa retrakcji) nie pokazującą żadnych innych zdarzeń poza ewentualnie szczytem niespecyficznej adhezji i tym samym artefaktem sinusoidalnym (tj. amplitudą i fazą) (Rysunek 2A).
    UWAGA: Wygładź reprezentatywną krzywą siła-wydłużenie, aby uzyskać wzór zakłóceń o niskiej częstotliwości.
  5. Wybierz krzywą siła-wydłużenie, która ma zostać skorygowana (Rysunek 2B).
  6. Nałóż obie krzywe rozciągnięcia siły z kroków 6.4. i 6.5., aby upewnić się, że obie pokazują ten sam artefakt sinusoidalny (tj. amplitudę i fazę) (Rysunek 2C).
  7. Odejmij (wygładzoną) reprezentatywną krzywą siła-wydłużenie od krzywej siła-wydłużenie, która ma zostać skorygowana, prowadząc do prostej, a nie sinusoidalnej linii bazowej (Rysunek 2D).
    UWAGA: Należy zwrócić uwagę, aby niespecyficzny pik adhezji krzywej reprezentatywnej różnił się od wszelkich zdarzeń pojedynczych cząsteczek pojawiających się w krzywych, które mają być korygowane. W rzeczywistości wybór krzywej reprezentatywnej jest kluczowy dla prawidłowej korekty.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższe przykłady pokazują wyniki rozciągania i desorpcji pojedynczych cząsteczek polimerów PEG, PNiPAM i PS. Wszystkie końcówki wspornikowe AFM zostały sfunkcjonalizowane zgodnie z protokołem podanym powyżej. PEG i PNiPAM mierzono na SiOx ze zmianami temperatury. Szczegółowe omówienie wynikowych krzywych rozciągania zależnych od temperatury dla PEG i PNiPAM można znaleźć w Kolberg et al.18 Innym motywem wydłużenia siły jest plateau stałej siły (np. podczas desorpcji PS z samoorganizujących się monowarstw tioli alkanowych zakończonych metylem na złocie (SAM) w wodzie4,27,39,51).

Przykład 1: Rozciąganie PEG i PNiPAM w wodzie
Zależne od temperatury rozciąganie w wodzie mierzono przy użyciu pojedynczych polimerów PNiPAM i PEG kowalencyjnie związanych z końcówką wspornika AFM na jednym końcu i fizsorbowanych na powierzchni SiOx na drugim końcu. Po eksperymentach kalibracyjnych i czystej kontroli (mniej niż 2% krzywych rozciągnięcia siły pokazuje zdarzenia pojedynczej cząsteczki), zarejestrowano co najmniej dwie mapy sił dla każdego wspornika AFM. Eksperyment zależny od temperatury przeprowadzono poprzez zarejestrowanie co najmniej jednej mapy sił w każdej temperaturze. Gdy pojawiło się tylko kilka zdarzeń rozciągających, odpowiedni wspornik AFM był odrzucany i pobierany był następny wspornik AFM chipa (zwykle w kolejności C, B, D i E MLCT-Bio-DC). W przypadku przykładowych danych PEG pojedyncze zdarzenie rozciągania zaobserwowano w 95 z 500 zmierzonych krzywych siła-wydłużenie (19%). W przypadku PNiPAM 252 z 600 krzywych siła-rozciągnięcie wykazało wzorzec rozciągania (42%). W celu lepszego porównania krzywych siła-wydłużenie, wygenerowano pojedynczą krzywą wzorcową dla każdej temperatury. W tym celu wybrano tylko te krzywe, których zdarzenie rozciągania do co najmniej 500 pN, gdzie fluktuacje konformacyjne i wpływ rozpuszczalnika są pomijalne52. Ostateczna liczba wziętych pod uwagę odcinków to 3 przy 278 K, 7 przy 298 K i 4 przy 318 K dla PEG oraz 4 przy 278 K, 3 przy 298 K i 3 przy 318 K dla PNiPAM18.

Procedura generowania krzywych głównych jest podana w Rysunek 3. Wybrane krzywe siła-rozciągnięcie (Rysunek 3A) są przeskalowane do długości L0 (rozciągnięcie przy sile 500 pN), patrz Rysunek 3B. Szczyt adhezji wykazuje dużą zmienność niespecyficznej przyczepności między powierzchnią a końcówką wspornika AFM, ale nie wpływa na rozciąganie polimeru. Po scaleniu przeskalowanych krzywych siła-wydłużenie, są one uśredniane przez dwunominalne wygładzenie, jak pokazano w Rysunek 3C. W tym celu filtr Gaussa łączy dane ze znormalizowanymi współczynnikami wyprowadzonymi z trójkąta Pascala na poziomie równym parametrowi wygładzania 2053. Na koniec uzyskuje się krzywą wzorcową dla każdej temperatury, jak podano w Rysunek 3D. Powiększenie pokazuje zakres, w którym wpływ temperatury na zachowanie siły rozciągnięcia jest najbardziej wyraźny.

Porównanie zachowania temperatury PEG (A) i PNiPAM (B) można znaleźć w Rysunek 4. W przypadku PEG zaobserwowano spadek siły rozciągania wraz ze wzrostem temperatury. Przy wzroście temperatury z 278 do 318 K zaobserwowano wzrost o około 5% przeskalowanego wydłużenia przy 100 pN. W przypadku PNiPAM można zaobserwować odwrotne przesunięcie zależne od temperatury. Zaobserwowano spadek o około 1% przeskalowanego wydłużenia przy 100 pN, gdy temperatura wzrosła z 278 do 328 K. Dodatkowo, rozciągającą energię swobodną można było uzyskać z krzywych głównych siła-wyprost, określając obszar pod krzywą dla dowolnej wartości siły. Można to wykorzystać do wyodrębnienia energetycznych i entropicznych wkładów rozciągającej się energii swobodnej za pomocą symulacji dynamiki molekularnej (MD) 18.

Przykład 2: Desorpcja PS z powierzchni SAM w wodzie
Desorpcja PS z powierzchni SAM w wodzie może być wykorzystana do określenia siły i długości desorpcji, a tym samym do ilościowego określenia oddziaływania hydrofobowego. Po kalibracji zarejestrowano co najmniej dwie mapy sił w dwóch różnych miejscach powierzchni. Gdy mocowanie polimeru zakończyło się sukcesem, krzywe siła-wydłużenie wykazywały plateau stałej siły, jako cechę charakterystyczną, patrz Rysunek 5A i Rysunek 5C. Desorpcję podobną do plateau obserwuje się, gdy dynamika badanych wiązań jest znacznie większa niż szybkość ciągnięcia końcówki wspornika AFM (quasi-równowaga). Siły desorpcji krzywych rozciągnięcia sił podobnych do plateau bezpośrednio dostarczają energii swobodnej adhezji poprzez całkowanie śladu siły-rozciągnięcia54. Zostały one wykorzystane do określenia oddziaływań elektrostatycznych, dyspersyjnych i hydrofobowych, a także właściwości tarcia pojedynczych polimerów na powierzchniach w środowisku ciekłym2,4,23,51,54,55.

Każdy plateau stałej siły został wyposażony w krzywą sigmoidalną w celu określenia siły desorpcji i długości desorpcji, które następnie zostały wykreślone w histogramach. Histogramy zostały wyposażone w metodę Gaussa, aby wyodrębnić maksymalną wartość i odchylenie standardowe. Dla lepszego przeglądu, wartości siły desorpcji i długości zostały wyświetlone razem na wykresie punktowym, jak podano w Rysunek 5B i Rysunek 5D.

Dla polistyrenu na SAM w wodzie, wyznaczone siły desorpcji odpowiadają poprzednio uzyskanym wartościom19,23. Ponieważ długość desorpcji koreluje z długością konturu polimeru51, rozkład długości desorpcji może być wykorzystany jako dowód kowalencyjnego wiązania danego polimeru z końcówką wspornika AFM za pośrednictwem jego funkcjonalnej grupy końcowej. W ten sposób długość desorpcji służy jako odcisk palca.

Dla więcej niż jednego polimeru przymocowanego do końcówki wspornika AFM, kaskady płaskowyżów (dyskretne kroki) można zaobserwować na krzywych rozciągnięcia siły56. Każdy plateau reprezentuje desorpcję polimeru w innym rozciągnięciu. Eksperyment opisany w Rysunek 5C i Rysunek 5D pokazał typowy przypadek dwóch polimerów przymocowanych do końcówki wspornika AFM w tym samym czasie. Dopasowując końcowe pęknięcie, można było znaleźć rozkład bimodalny dla długości desorpcji, podczas gdy siła desorpcji wykazała wąski rozkład. W tym przypadku mniejszą długość desorpcji można znaleźć w 90% krzywych rozciągnięcia siły, albo jako pojedynczy plateau, albo jako dodatkowy plateau na dłuższym płaskowyżu, jak podano w Rysunek 5C. Większą długość desorpcji stwierdzono w 37% uzyskanych krzywych siła-rozciąg. W ten sposób rozkład długości desorpcji można wykorzystać do określenia liczby różnych polimerów przymocowanych do końcówki wspornika AFM. Ogólnie rzecz biorąc, wąski rozkład wartości długości desorpcji jest dobrą wskazówką, że jeden i ten sam pojedynczy polimer został zbadany w uzyskanych krzywych siła-rozciągnięcie. Jednocześnie można zastosować superpozycję odpowiednich sił rozciągnięcia, aby zdecydować, czy zmierzono jeden i ten sam pojedynczy polimer.

Po udowodnieniu kowalencyjnego wiązania pojedynczego polimeru PS, można przeprowadzić dalsze eksperymenty z tym polimerem PS w zależności od podłoża (zarówno powierzchni stałej, jak i folii polimerowych), warunków rozpuszczalnika, temperatury, prędkości ciągnięcia lub czasu przebywania.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczny przegląd procesu funkcjonalizacji końcówki. Obejmuje chemiczną modyfikację końcówki wspornika AFM po (1) aktywacji plazmowej, (2) silanizacji/PEGylacji i (3) przymocowaniu polimeru. Dodatkowo przedstawiono szczegółową strukturę chemiczną zastosowanych polimerów, a mianowicie PEG, PNiPAM i PS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Eliminacja zakłóceń w krzywych siła-wydłużenie. (A) Znajdź krzywą rozciągnięcia siły pokazującą artefakt sygnału siły sinusoidalnej wzdłuż rozciągnięcia, ale bez zdarzenia rozciągania pojedynczej cząsteczki. (B) Wybierz krzywą rozciągnięcia siły z pojedynczym zdarzeniem cząsteczkowym, które ma być skorygowane z artefaktu sinusoidalnego. (C) Nałóż krzywe, aby kontrolować, czy sinusoidalne artefakty krzywych naprawdę się zgadzają. (D) Odejmując krzywą siła-wydłużenie (A) od (B), otrzymuje się krzywą siła-wydłużenie z prostą linią podstawową. Chociaż pik adhezji nie może być wykorzystany do dalszej analizy, krzywa rozciągnięcia siły jest teraz korygowana dla artefaktu, co prowadzi do znacznie dokładniejszych wartości siły w obszarze zdarzenia pojedynczej cząsteczki (tutaj: > 0,2 μm rozciągłości). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wyznaczanie krzywych wzorcowych na podstawie krzywych siła-wydłużenie PEG w temperaturze 298 K. (A) Dane doświadczalne w temperaturze 298 K, przy użyciu 7 krzywych siły i wydłużenia. Po przeskalowaniu do długości L0 przy sile 500 pN (B), krzywe siła-wydłużenie można połączyć i uśrednić przez wygładzanie dwunominalne, uzyskując krzywą wzorcową (C). Przeskalowane krzywe są wyświetlane jako kropki, podczas gdy krzywa wzorcowa jest pokazana jako linia ciągła. Na koniec można porównać uzyskane krzywe wzorcowe dla różnych temperatur (D). Powiększenie wskazuje zakres, w którym wpływ temperatury na zachowanie siły rozciągającej jest najbardziej wyraźny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Porównanie zależnych od temperatury krzywych wzorcowych PNiPAM i PEG. Dla PEG obserwuje się wzrost wydłużenia przeskalowanego przy 100 pN (średni zakres siły) przy wzroście temperatury (A), podczas gdy dla PNiPAM ujawnia się odwrotne przesunięcie zależne od temperatury (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Analiza krzywych siła-wydłużenie PS na SAM w wodzie. (A) Przykładowa krzywa siła-rozciąg (niebieska) z esowatym dopasowaniem plateau (fioletowa). Dodatkowo strzałki oznaczają wyznaczoną siłę (kolor czerwony) i długość (kolor zielony) płaskowyżu. Wartości siły desorpcji i długości desorpcji uzyskane przez pasowania sigmoidalne są wyświetlane na wykresie punktowym, a wynikowe histogramy są dopasowywane za pomocą gaussowskiego. (B) Wyznaczone średnie wartości siły desorpcji i długości desorpcji wynoszą (112 ± 6) pN i (659 ± 7) nm, przy czym 93% krzywych siła-wydłużenie wykazuje takie pojedyncze zdarzenia plateau. (C) Przykładowa krzywa siła-wydłużenie (niebieska) dla dwóch polimerów przymocowanych do końcówki wspornika AFM w tym samym czasie. W tym przypadku siła desorpcji wykazuje rozkład jednomodalny ze średnią wartością siły (117 ± 5) pN, podczas gdy rozkład bimodalny można znaleźć dla długości desorpcji, co prowadzi do średnich wartości długości (656 ± 9) nm i (1050 ± 16) nm. (D) 90% badanych krzywych rozciągnięcia siły wykazuje tylko pojedyncze zdarzenia plateau. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SMFS oparty na AFM jest jednym z głównych narzędzi do badania oddziaływań pojedynczych cząsteczek w fizyce polimerów. Aby przeprowadzić prawdziwy eksperyment z pojedynczą cząsteczką, niezbędne jest kowalencyjne przymocowanie polimeru sondy do końcówki wspornika AFM.

Wiele wcześniejszych prac opiera się na eksperymentach z nanopołowami, w szczególności dla PNiPAM, gdzie polimery są adsorbowane na powierzchni, a następnie rozciągane poprzez losowe wybieranie ich z podłoża za pomocą końcówki wspornikowej AFM30,31. Może to zmienić wyniki i prowadzić do błędnej interpretacji zachowania pojedynczej cząsteczki. W tym przypadku efekty kooperacyjne mogą zdominować wyniki, ponieważ nie można wykluczyć interakcji z sąsiednimi polimerami. Ma to duży wpływ na wyniki, szczególnie w przypadku polimerów, które wykazują znacznie inne zachowanie w masie w porównaniu z pojedynczymi izolowanymi cząsteczkami57,58.

Przedstawiony tutaj protokół funkcjonalizacji jest niezawodny i może być łatwo zastosowany do różnych polimerów, niezależnie od ich długości konturu, hydrofobowości lub sterycznej przeszkody monomerów. Dodatkowo zapewniona jest pasywacja, aby zapobiec niepożądanym interakcjom między polimerem pojedynczej sondy a końcówką wspornika AFM, a także między końcówką wspornika AFM a powierzchnią pod spodem. Ponadto przedstawiono ocenę krzywych siła-wydłużenie pokazujących zdarzenia rozciągania. Zaproponowano tam procedurę wyznaczania krzywych siły głównej-wydłużenia. Daje to lepszy sposób na ujawnienie, np. wpływu związanego z temperaturą na zachowanie siły rozciągniętej. Ponadto zapewniono analizę zdarzeń desorpcji pojedynczych cząsteczek o stałym płaskowyżu siły. Podano również prosty sposób korygowania artefaktów sygnału siły sinusoidalnej w krzywych rozciągnięcia siły, które w przeciwnym razie mogłyby pogorszyć wyniki eksperymentu.

W porównaniu ze Stetterem i wsp.39, przedstawiona tutaj procedura funkcjonalizacji została zredukowana do trzech kroków zamiast czterech, a niezawodność procedury uległa poprawie. Główną korzyścią płynącą z przeprowadzenia pegylacji i silanizacji w jednym kroku jest lepiej kontrolowana reakcja i zwiększenie wydajności. Ponadto trzeba przygotować mniej roztworów i wymagana jest mniejsza liczba etapów płukania. Zmniejsza to wysiłek i czas potrzebny na przygotowanie oraz zwiększa powtarzalność. Co więcej, przesuwanie wsporników AFM jest zawsze krytyczną częścią procesu funkcjonalizacji. Przeniesienie z jednego rozwiązania na drugie zawsze wiąże się z ryzykiem silnego wpływu na jakość funkcjonalizacji z powodu transferów przez interfejs powietrze-woda lub utraty wsporników AFM przez niewłaściwe użycie pęsety.

Aby udowodnić prawidłowe kowalencyjne połączenie pojedynczego polimeru z końcówką wspornikową AFM, muszą być spełnione różne warunki. Po pierwsze, wsporniki sterujące AFM mają niebagatelne znaczenie i powinny być przygotowane na każdą funkcjonalizację. Proces funkcjonalizacji i płynna komórka do przeprowadzania eksperymentów są uważane za czyste tylko wtedy, gdy niewielka liczba krzywych siła-rozciągnięcie wykazuje rozciągnięcia lub plateau w eksperymencie kontrolnym (w przedstawionych przykładach mniej niż 2%).

Wyraźny wzór rozciągania bez dalszych spadków lub maksimów jest niezbędny do prawidłowego rozciągania pojedynczej cząsteczki. Dodatkowo należy przeanalizować zależność siły zrywającej od szybkości obciążenia siłą przy zerwaniu lub całkowitej odpowiedzi sprężystej krzywej rozciągania w celu wykluczenia jednoczesnej desorpcji wielu polimerów59,60. W przypadku PEG i PNiPAM odpowiednio 19% i 42% krzywych siła-rozciągnięcie wykonanych w różnych miejscach powierzchni wykazywało taki wzór rozciągania. Aby uzyskać zdarzenia rozciągające, fizysorpcja polimeru do odpowiedniej powierzchni leżącej pod spodem musi być silna. W przeciwnym razie obserwuje się zdarzenie desorpcji podobne do plateau. Jest to jeszcze bardziej decydujące dla wykrywania zdarzeń rozciągania przy dużych siłach (do 500 pN lub więcej). Ponieważ ta silna fizysorpcja nie jest spełniona dla każdej krzywej rozciągnięcia siły, wydajność takich zdarzeń jest mniejsza niż w przypadku czystych zdarzeń desorpcji podobnych do plateau. Alternatywnie można zastosować silnie przylegające grupy, takie jak katechole lub chemisorpcja między polimerem a leżącą pod spodem powierzchnią. Wymaga to jednak wprowadzenia kolejnych grup funkcyjnych lub miejsc sprzęgania w polimerze61,62.

W rzeczywistości masa (tj. długość konturu) polimeru stanowi cenny odcisk palca. Chociaż masy nie można bezpośrednio przełożyć na zmierzoną długość konturu z następujących powodów, rozkład długości jest bardzo cenny dla zdefiniowania zdarzeń pojedynczych cząsteczek. W przypadku polimeru PNiPAM o niskiej polidyspersyjności (Ɖ = 1,28) stwierdzono istotne różnice w wartościach wydłużenia dla uzyskanych zdarzeń rozciągania (a tym samym w długości polimeru) w eksperymentach. Jedną z przyczyn takiego stanu rzeczy może być określenie długości polimeru i jego rozkładu. W chromatografii wykluczającej według wielkości (SEC) określa się względną masę docelowego polimeru w porównaniu z wzorcami, takimi jak PS lub poli(metakrylan metylu) (PMMA)63. Oczekuje się, że przypuszczalna masa względna będzie odbiegać od bezwzględnej masy cząsteczkowej, ponieważ promień hydrodynamiczny docelowego polimeru i wzorca może się znacznie różnić. Dodatkowo warstwa silanu może być oligomeryzowana przez fałszywą wodę w toluenie podczas procesu funkcjonalizacji. Przymocowanie takich oligomerów do końcówki wspornika AFM prowadzi do uzyskania bardziej elastycznej warstwy z mniejszą liczbą punktów kotwiczenia64. Ponadto punkt przyczepienia polimeru do warstwy krzemu niekoniecznie musi znajdować się na wierzchołku, co prowadzi do przesunięcia wykrytych wartości długości29. Podczas gdy model polimerowy, taki jak łańcuch ślimakowy (WLC) lub model łańcucha swobodnie łączonego (FJC), nie może prawidłowo odtworzyć odpowiedniego zachowania siły-wydłużenia dla PEG lub PNiPAM w całym zakresie rozciągnięcia 18,29,41,65,66, taki model polimerowy może być cenny dla innych układów polimerowych i białkowych 10,15,67,68.

Kowalencyjne przyłączenie pojedynczego polimeru PS (o długości konturu większej niż 1 μm) uważa się za udane tylko wtedy, gdy znaczna liczba krzywych siła-rozciągnięcie wykazuje wystarczająco długi plateau stałej siły (rysunek 5). Plateau wynikający z desorpcji pojedynczego polimeru jest definiowany przez pojedynczy gwałtowny spadek stałej siły do linii podstawowej przy pewnym rozciągnięciu, jak pokazano na rysunku 5A. Jeśli więcej polimerów jest przymocowanych do końcówki wspornika AFM, obserwuje się kaskadę płaskowyżów56 (Rysunek 5C). Długość plateau (długość desorpcji), skorelowana z długością konturu polimeru51, musi być znacznie dłuższa niż jakikolwiek pik adhezji ze względu na niespecyficzne przyleganie końcówki wspornika AFM do powierzchni leżącej pod spodem (tutaj około 200 nm). Cechy pojawiające się wyłącznie na pojedynczej krzywej siła-wydłużenie nie powinny być interpretowane. W prezentowanych eksperymentach co najmniej 80 ze 100 krzywych wykazało plateau dłuższe niż 200 nm na co najmniej dwóch mapach sił w dwóch różnych miejscach na powierzchni. Ponadto rozkład długości desorpcji, przy użyciu wykresów punktowych, takich jak pokazano na rysunku 5B i 5D, ujawnia, czy i ile polimerów jest związanych z końcówką wspornika AFM. W przypadku PS wąski rozkład siły desorpcji i długości zaczerpnięty z płaskowyżów krzywych siła-wydłużenie posłużył jako dowód udanego przyłączenia kowalencyjnego. To ostatecznie udowodniło sukces protokołu funkcjonalizacji. Dlatego gorąco rekomendujemy aby takie rozkłady siły i długości prezentować w publikacjach.

Ocena krzywych siła-wydłużenie przy użyciu wbudowanych algorytmów, które zawierają wiele wstępnie ustawionych parametrów, powinna być wykonywana ostrożnie. Powodem jest na przykład to, że stała częstotliwość próbkowania nie jest odpowiednia dla każdej zastosowanej prędkości ciągnięcia lub że automatyczne wygładzanie krzywych siła-wydłużenie może uśrednić ważne szczegóły. Zazwyczaj właściwe zrozumienie danej procedury oceny może zapobiec błędom w procedurze oceny, które z kolei mogą silnie wpłynąć na końcowe wyniki eksperymentu SMFS opartego na AFM.

Podsumowując, przedstawiamy protokół funkcjonalizacji, który jest niezawodny i można go łatwo zastosować do różnych polimerów. Ponadto przedstawiono właściwą ocenę krzywych rozciągnięcia siły pojedynczej cząsteczki, co pozwala na wyznaczenie parametrów fizycznych, takich jak siła rozciągania, siła desorpcji i długość desorpcji. Przedstawione protokoły i procedury są cenne dla badania systemów reagujących na bodźce na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.N.B. i T.H. potwierdzają finansowanie przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) w ramach Niemieckiej Strategii Doskonałości – EXC-2193/1 – 390951807, gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder – EXC-2193/1 – 390951807, oraz przyznają HU 997/1-13 (projekt # 420798410). M.G. potwierdza częściowe wsparcie w ramach projektu LOEWE iNAPO poprzez Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego, Badań Naukowych i Sztuki Kraju Związkowego Hesja. Dziękujemy dr Wolfgangowi Bronnerowi i dr Agne Zukauskaite z Instytutu Fraunhofera ds. Stosowanej Fizyki Ciała Stałego IAF za przekazanie wysokiej jakości płytek krzemowych pokrytych złotem.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-dodekanetiol (≥ 98%)Sigma-Aldrich, USA417364-500MLUżywany do roztworu
amoniaku SAM (30%)Roth, NiemcyCP17.2Używany do czyszczenia
Cypher ESAsylum Research, firmy Oxford Instruments, USA-AFM
Etanol (≥ 99,9%)Roth, NiemcyPO76.1Wafel
krzemowy pokryty złotemFraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Niemcy-używany do SAM
Resolution Replicating CompoundMicroset Products Ltd, Wielka Brytania101RFŚrodek wiążący
Roztwór nadtlenku wodoruSigma-Aldrich, USAH1009Używany do czyszczenia
Igor ProWavemetrics, USA-Środowiskooprogramowania
Tetra-30-LF-PCDiener Electronic, Niemcy-Komoraplazmowa
Maleimid-glikol polietylenowy-trietoksysilanCreative PEG works, USAPHB-1923Polimer łącznikowy
MLCT-Bio-DCBruker, USAMLCT-Bio-DCAFM
wafel Prime CZ-Si, typ n (fosfor) TTV < 10 µ mMicroChemicals, NiemcyWSA40600250 P1314SNN1Wafel krzemowy
Purelab Chorus 1, 18.2 MΩ cmElga LabWater, Niemcy10034-540Źródło wody ultraczystej
R3 SAVomm GmbH, Niemcy5803Pęseta
Poli(N-izopropyloakrylaamid) zakończony tiolem)Gallei Group, Uniwersytet Kraju Saary,Niemcy-Polimer
sondy PNiPAMPolistyren zakończony tiolemŹródło polimeru, KanadaP40722-SSHPolimer sondy PS
Tiol-glikol polietylenowy-tiolCreative PEGWorks, USAPSB-615Polimer sondy PEG
Toluen (99,99%)Fisher ChemicalsT324-500Rozpuszczalnik
High ślepa

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56 (9), 930-933 (1986).
  2. Hugel, T., Seitz, M. The Study of Molecular Interactions by AFM Force Spectroscopy. Macromolecular Rapid Communications. 22 (13), 989-1016 (2001).
  3. Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1(2005).
  4. Balzer, B. N., Hugel, T. Single-Molecule Detection and Manipulation. Reference Module in Materials Science and Materials Engineering. Hashmi, S. , Elsevier. Amsterdam. (2016).
  5. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  6. Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. -A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
  7. Alsteens, D., et al. Nanomechanical mapping of first binding steps of a virus to animal cells. Nature Nanotechnology. 12 (2), 177-183 (2017).
  8. Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468, 72-76 (2010).
  9. Shibata, M., et al. Real-space and real-time dynamics of CRISPR-Cas9 visualized by high-speed atomic force microscopy. Nature Communications. 8 (1), 1-9 (2017).
  10. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  11. Oesterhelt, F., Oesterhelt, D., Pfeiffer, M., Engel, A., Gaub, H. E., Müller, D. J. Unfolding pathways of individual bacteriorhodopsins. Science. 288 (5463), New York, N.Y. 143-146 (2000).
  12. Hugel, T., Holland, N. B., Cattani, A., Moroder, L., Seitz, M., Gaub, H. E. Single-molecule optomechanical cycle. Science. 296 (5570), New York, N.Y. 1103-1106 (2002).
  13. Yu, H., Siewny, M. G. W., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), New York, N.Y. 945-950 (2017).
  14. Erlich, K. R., Sedlak, S. M., Jobst, M. A., Milles, L. F., Gaub, H. E. DNA-free directed assembly in single-molecule cut-and-paste. Nanoscale. 11 (2), 407-411 (2019).
  15. Rico, F., Russek, A., González, L., Grubmüller, H., Scheuring, S. Heterogeneous and rate-dependent streptavidin-biotin unbinding revealed by high-speed force spectroscopy and atomistic simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6594-6601 (2019).
  16. Löf, A., et al. Multiplexed protein force spectroscopy reveals equilibrium protein folding dynamics and the low-force response of von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (38), 18798-18807 (2019).
  17. Kienle, S., Liese, S., Schwierz, N., Netz, R. R., Hugel, T. The effect of temperature on single-polypeptide adsorption. Chemphyschem : a European journal of chemical physics and physical chemistry. 13 (4), 982-989 (2012).
  18. Kolberg, A., et al. Opposing Temperature Dependence of the Stretching Response of Single PEG and PNiPAM Polymers. Journal of the American Chemical Society. 141 (29), 11603-11613 (2019).
  19. Balzer, B. N., et al. Cohesion Mechanisms of Polystyrene-Based Thin Polymer Films. Macromolecules. 46 (18), 7406-7414 (2013).
  20. Balzer, B. N., et al. Adhesion property profiles of supported thin polymer films. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (13), 6300-6306 (2013).
  21. Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
  22. Schwierz, N., Krysiak, S., Hugel, T., Zacharias, M. Mechanism of Reversible Peptide-Bilayer Attachment: Combined Simulation and Experimental Single-Molecule Study. Langmuir. 32 (3), 810-821 (2016).
  23. Balzer, B. N., et al. Nanoscale Friction Mechanisms at Solid-Liquid Interfaces. Angewandte Chemie International Edition. 52 (25), 6541-6544 (2013).
  24. Balzer, B. N., Kienle, S., Gallei, M., von Klitzing, R., Rehahn, M., Hugel, T. Stick-Slip Mechanisms at the Nanoscale. Soft Materials. 12, 106-114 (2014).
  25. Kühner, F., Erdmann, M., Sonnenberg, L., Serr, A., Morfill, J., Gaub, H. E. Friction of single polymers at surfaces. Langmuir. 22 (26), 11180-11186 (2006).
  26. Grebíková, L., Gojzewski, H., Kieviet, B. D., Klein Gunnewiek, M., Vancso, G. J. Pulling angle-dependent force microscopy. The Review of Scientific Instruments. 88 (3), 33705(2017).
  27. Geisler, M., et al. Hydrophobic and Hofmeister effects on the adhesion of spider silk proteins onto solid substrates: an AFM-based single-molecule study. Langmuir. 24 (4), 1350-1355 (2008).
  28. Pirzer, T., Hugel, T. Atomic force microscopy spring constant determination in viscous liquids. Review of Scientific Instruments. 80 (3), 35110(2009).
  29. Liese, S., et al. Hydration Effects Turn a Highly Stretched Polymer from an Entropic into an Energetic Spring. ACS Nano. 11 (1), 702-712 (2017).
  30. Cui, S., Pang, X., Zhang, S., Yu, Y., Ma, H., Zhang, X. Unexpected Temperature-Dependent Single Chain Mechanics of Poly(N-isopropyl-acrylamide) in Water. Langmuir. 28 (11), 5151-5157 (2012).
  31. Liang, X., Nakajima, K. Nanofishing of a Single Polymer Chain: Temperature-Induced Coil-Globule Transition of Poly(N -isopropylacrylamide) Chain in Water. Macromolecular Chemistry and Physics. 219 (3), 1700394(2018).
  32. Zhang, W., Zou, S., Wang, C., Zhang, X. Single Polymer Chain Elongation of Poly(N -isopropylacrylamide) and Poly(acrylamide) by Atomic Force Microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (44), 10258-10264 (2000).
  33. Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques - 3rd Edition. , Academic Press. San Diego. (2013).
  34. Leitner, M., et al. Single-molecule AFM characterization of individual chemically tagged DNA tetrahedra. ACS Nano. 5 (9), 7048-7054 (2011).
  35. Walder, R., et al. Rapid Characterization of a Mechanically Labile α-Helical Protein Enabled by Efficient Site-Specific Bioconjugation. Journal of the American Chemical Society. 139 (29), 9867-9875 (2017).
  36. Tang, J., et al. High-affinity tags fused to s-layer proteins probed by atomic force microscopy. Langmuir. 24 (4), 1324-1329 (2008).
  37. Wildling, L., et al. Linking of sensor molecules with amino groups to amino-functionalized AFM tips. Bioconjugate Chemistry. 22 (6), 1239-1248 (2011).
  38. Maity, S., Viazovkina, E., Gall, A., Lyubchenko, Y. A. A Metal-free Click Chemistry Approach for the Assembly and Probing of Biomolecules. Journal of Nature and Science. 2 (4), 187(2016).
  39. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456(2015).
  40. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167(2018).
  41. Ott, W., et al. Elastin-like Polypeptide Linkers for Single-Molecule Force Spectroscopy. ACS Nano. 11 (6), 6346-6354 (2017).
  42. Newton, R., et al. Combining confocal and atomic force microscopy to quantify single-virus binding to mammalian cell surfaces. Nature Protocols. 12 (11), 2275-2292 (2017).
  43. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical Biochemistry. 156 (1), 220-222 (1986).
  44. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
  45. Baird, J. A., Olayo-Valles, R., Rinaldi, C., Taylor, L. S. Effect of Molecular Weight, Temperature, and Additives on the Moisture Sorption Properties of Polyethylene Glycol. Journal of Pharmaceutical Sciences. 99 (1), 154-168 (2010).
  46. Halperin, A., Kröger, M., Winnik, F. M. Poly(N-isopropylacrylamide) Phase Diagrams: Fifty Years of Research. Angewandte Chemie International Edition. 54 (51), 15342-15367 (2015).
  47. Barradas, R. G., Fletcher, S., Porter, J. D. The hydrolysis of maleimide in alkaline solution. Canadian Journal of Chemistry. 54 (9), 1400-1404 (1976).
  48. Kharasch, N., Tarbell, D. S. Chapter 10 - The Mechanism of Oxidation of Thiols to Disulfides. Organic Sulfur Compounds. , 97-102 (1961).
  49. Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1992).
  50. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868-1873 (1998).
  51. Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
  52. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H. E., Netz, R. R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 48301(2005).
  53. Marchand, P., Marmet, L. Binomial smoothing filter: A way to avoid some pitfalls of least-squares polynomial smoothing. Review of Scientific Instruments. 54 (8), 1034-1041 (1983).
  54. Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2842-2847 (2008).
  55. Friedsam, C., Gaub, H. E., Netz, R. R. Adsorption energies of single charged polymers. EPL (Europhysics Letters). 72 (5), 844-850 (2005).
  56. Scherer, A., Zhou, C., Michaelis, J., Brauchle, C., Zumbusch, A. Intermolecular Interactions of Polymer Molecules Determined by Single-Molecule Force Spectroscopy. Macromolecules. 38 (23), 9821-9825 (2005).
  57. Abbott, L. J., Tucker, A. K., Stevens, M. J. Single Chain Structure of a Poly(N-isopropylacrylamide) Surfactant in Water. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (9), 3837-3845 (2015).
  58. Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. Journal of Controlled Release. 11 (1), 255-265 (1990).
  59. Sulchek, T., Friddle, R. W., Noy, A. Strength of multiple parallel biological bonds. Biophysical journal. 90 (12), 4686-4691 (2006).
  60. Sulchek, T. A., et al. Dynamic force spectroscopy of parallel individual Mucin1-antibody bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16638-16643 (2005).
  61. Krysiak, S., Wei, Q., Rischka, K., Hartwig, A., Haag, R., Hugel, T. Adsorption mechanism and valency of catechol-functionalized hyperbranched polyglycerols. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 11, 828-836 (2015).
  62. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating receptor-ligand systems of the cellulosome with AFM-based single-molecule force spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950(2013).
  63. Trathnigg, B. Determination of MWD and chemical composition of polymers by chromatographic techniques. Progress in Polymer Science. 20 (4), 615-650 (1995).
  64. Blass, J., Albrecht, M., Wenz, G., Zang, Y. N., Bennewitz, R. Single-molecule force spectroscopy of fast reversible bonds. Physical Chemistry Chemical Physics. 19 (7), 5239-5245 (2017).
  65. Oesterhelt, F., Rief, M., Gaub, H. E. Single molecule force spectroscopy by AFM indicates helical structure of poly(ethylene-glycol) in water. New Journal of Physics. 1, 1-11 (1999).
  66. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348(2014).
  67. Lyu, X., Song, Y., Feng, W., Zhang, W. Direct Observation of Single-Molecule Stick-Slip Motion in Polyamide Single Crystals. ACS Macro Letters. 7 (6), 762-766 (2018).
  68. Hugel, T., et al. Elasticity of Single Polyelectrolyte Chains and Their Desorption from Solid Supports Studied by AFM Based Single Molecule Force Spectroscopy. Macromolecules. 34 (4), 1039-1047 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule Force SpectroscopyCovalent Attachment ProtocolAFM Cantilever FunctionalizationPolymer Surface InteractionForce Extension TracesPlasma Surface ActivationSilane PEG Mal FunctionalizationThermal Noise Spectrum AnalysisInverse Optical Lever SensitivityDesorption Force Measurement

Related Articles