$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie opisane tutaj metody, które wykorzystują zwierzęta doświadczalne, zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Michigan.
UWAGA: Neurosfery glejaka generowane z GEMM lub stabilnych linii mogą być używane do inscenizacji guza wewnątrzczaszkowego u myszy10 i przetwarzane do sekwencjonowania LMD i RNA. Komórki te konstytutywnie wyrażają lucyferazy świetlika i białka GFP, które będą dalej wykorzystywane do analizy wzrostu i lokalizacji guza.
1. Generowanie modelu glejaka myszy wewnątrzczaszkowej z neurosfer pochodzących z genetycznie modyfikowanych modeli glejaka
- Aby wygenerować pierwotną hodowlę komórek neurosfery z genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy (GEMM), użyj protokołu opisanego wcześniej10,11.
- Przygotuj pożywkę do hodowli neurosfery zgodnie z opisem: 500 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle F-12 firmy Dulbecco (DMEM/F12) uzupełnionego 10 ml 50x B-27 i 5 ml 100x suplementów do hodowli neuronów N-2, 5 ml 100x antybiotykowo-przeciwgrzybiczego i 1 ml Normocin. Przed posiewem neurosfer dodać 20 ng/ml ludzkiego rekombinowanego EGF i FGF do pożywki hodowlanej.
- Hodowla neurosfer glejaka w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2-3 dni przed wszczepieniem guza wewnątrzczaszkowego.
- W dniu zabiegu należy pobrać neurosfery glejaka i obracać je w temperaturze 550 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć sklarowany osad, nie naruszając osadu komórkowego.
- Aby dysocjować neurosfery, ponownie zawieś osad komórkowy w 1 ml roztworu do odrywania komórek i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2-4 minuty. Po okresie inkubacji należy pipetować neurosfery w górę i w dół za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
- Dezaktywować roztwór do odrywania komórek, rozcieńczając zawiesinę neurosfery 10 ml nieuzupełnionej pożywki DMEM/F12. Wiruj neurosfery w temperaturze 550 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant.
- Zawiesić osad komórkowy w 100 μl pożywki DMEM/F12 bez dodatków. Zawiesinę komórek należy rozcieńczyć w stosunku 1:50, a następnie dodać 50 μl błękitu trypanowego, aby policzyć komórki zdolne do życia. Użyj następującego wzoru, aby określić stężenie komórek:
komórki/ml = [((∑komórki zliczone na kwadrat) / # policzonych kwadratów) x 50 x 10 000 komórek/ml]
- Po określeniu liczby komórek, aby osiągnąć docelowe stężenie 30 000 komórek/μl w objętości 100 μl, należy obrócić neurosfery w dół i ponownie zawiesić je w odpowiedniej objętości DMEM/F12 niezawierającej suplementów.
- Umieść neurosfery we wstępnie oznaczonej probówce o pojemności 0,6 ml na lodzie.
- Przygotuj roztwory robocze znieczulenia, środka przeciwbólowego i odwrócenia znieczulenia przed implantacją: W przypadku znieczulenia ketaminą/deksmedetomidyną dodaj 0,6 ml 100 mg/ml chlorowodorku ketaminy i 0,8 ml 0,5 mg/ml chlorowodorku deksmedetomidyny do sterylnej 8,6 ml fiolki zawierającej 0,9% NaCl. W przypadku leku przeciwbólowego buprenorfiny należy dodać 1 ml 0,3 mg/ml buprenorfiny do 9 ml fiolki zawierającej 0,9% NaCl. W celu odwrócenia znieczulenia atipamezolem należy dodać 1 ml 5 mg/ml atipamezolu do 9 ml fiolki zawierającej 0,9% NaCl.
- Użyj 6-8-tygodniowych samic myszy C57BL/6J do wszczepienia guza wewnątrzczaszkowego.
- W pomieszczeniu zatwierdzonym do operacji przeżycia gryzoni ustaw sterylne materiały do wszczepienia guza wewnątrzczaszkowego. Wykonuj operacje na stereotaktycznej ramie gryzonia wyposażonej w sterylizowaną strzykawkę Hamiltona o pojemności 10 μl z wyjmowaną igłą 33G. Użyj sterylizatora perełkowego do sterylizacji narzędzi między operacjami.
- Znieczulenie myszy pojedynczym wstrzyknięciem dootrzewnowym (i.p.) roztworu znieczulającego przygotowanego w kroku 1.11 (ketamina: 75,0 mg/kg i deksmedetomidyna: 0,5 mg/kg). Około 250 μl objętości roztworu znieczulającego zostanie dostarczone myszy o wadze 20 g. Przed kontynuowaniem upewnij się, że mysz nie reaguje na odruch pedałowania.
- Gdy mysz znajdzie się w stanie głębokiego znieczulenia, nałóż sterylny smar okulistyczny z wazeliny na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Ogol futro na czaszce myszy. Nałóż 10% roztwór powidonowo-jodowy do stosowania miejscowego na ogolony obszar w celu dezynfekcji.
- Zabezpiecz czaszkę myszy w ramce stereotaktycznej. Najpierw ostrożnie otwórz usta kleszczami i delikatnie pociągnij język i przesuń go na jedną stronę ust, aby zapobiec zadławieniu. Trzymaj usta otwarte za pomocą kleszczy i umieść górne siekacze w dziurce od klucza w listwie zębowej na ramie stereotaktycznej.
- Trzymając głowę myszy za uszy, przyłóż nauszniki do kości zaoczodołowych i zabezpiecz je. Upewnij się, że czaszka myszy znajduje się na poziomie blatu chirurgicznego. Ostrożnie zabezpiecz nauszniki, nie wywierając nacisku na czaszkę. Następnie ostrożnie zabezpiecz nos barka.
- Używając ostrza skalpela w rozmiarze 15, wykonaj nacięcie wzdłuż głowy myszy, odsłaniając czaszkę. Wycofaj skórę w miejscu nacięcia za pomocą retraktorów Colibri. Użyj sterylnego aplikatora, aby usunąć całą tkankę okołoczaszkową.
- Zidentyfikuj bregma i opuść igłę strzykawki Hamiltona bezpośrednio nad nią. Za pomocą ramki umieść igłę 1 mm przed bregmą i 1,5 mm z boku. Za pomocą igły 26G zaznacz to miejsce, nacinając czaszkę.
- Użyj wiertarki akumulatorowej wyposażonej w wiertło 0,45 mm, aby wykonać otwór na zadziory w miejscu docelowym. Wiercić, aż dojdziesz do leżącej pod spodem opony twardej. Ostrożnie wyjmij pozostałą kość z otworu na zadziory za pomocą igły 26G.
- Za pomocą pipety dokładnie homogenizować komórki i pobrać 7 μl zawiesiny neurosfery do strzykawki. Aby upewnić się, że strzykawka działa prawidłowo, należy nasycić 1 μl zawiesiny na wacik nasączony 70% alkoholem.
- Opuść igłę na powierzchnię opony twardej. Opuścić strzykawkę o 3,5 mm brzusznie i wycofać 0,5 mm. Spowoduje to stworzenie 0,5 mm przestrzeni w mózgu, w której neurosfery będą się odkładać po wstrzyknięciu.
- Pozostaw igłę na miejscu na 2 minuty w celu wyrównania ciśnienia. Powoli i płynnie dostarczaj 1 μl komórek w ciągu 1 minuty. Pozwól komórkom ustabilizować się na 6 minut. Powoli i płynnie wyjmować strzykawkę z mózgu w ciągu 2 minut.
- Za pomocą sterylnego roztworu soli fizjologicznej trzykrotnie umyj powierzchnię czaszki. Dozuj nadmiar komórek ze strzykawki na wacik nasączony 70% alkoholem i przetrzyj igłę innym wacikiem nasączonym 70% alkoholem. Przepłukać strzykawkę jałowym PBS, aby uniknąć zatkania igły.
- Wyjmij zwijacze i ostrożnie wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej. Zamknij nacięcie za pomocą nylonowych szwów 3-0, kleszczy i wkrętaka do igieł.
- Podawać atipamezol (1,0 mg/kg), około 100 μl na 20 g myszy. Buprenorfinę (0,1 mg/kg podskórnie) podawać podskórnie, około 70 μl na 20 g myszy. Umieść myszy pooperacyjne w czystej klatce regeneracyjnej i monitoruj je, aż będą czujne i aktywne.
2. Perfuzja zwierzęca i zachowanie mózgu
- Aby monitorować postęp guza, należy określić bioluminescencję in vivo za pomocą systemu obrazowania in vivo, dopóki zwierzęta nie wykażą oznak obciążenia nowotworem. Poddaj myszy eutanazji, gdy osiągną sygnał między 106 a 107 fotonów / s.
- Znieczulenie myszy wykazujących oznaki obciążenia guzem za pomocą dootrzewnowego (i.p.) wstrzyknięcia roztworu ketaminy (75,0 mg / kg) i deksmedetomidyny (0,5 mg / kg). Dostarcz około 250 μl myszy o wadze 20 g. Następnie upewnij się, że mysz nie reaguje na odruch pedałowania.
- Za pomocą kleszczy przytrzymaj skórę nad jamą otrzewnej, a za pomocą dużej pary nożyczek preparacyjnych wykonaj nacięcie w kształcie litery "Y", penetrując ścianę otrzewnej, przebij przeponę, a następnie przetnij klatkę piersiową.
- Włóż kaniulę 20G do lewej komory serca myszy. Następnie odetnij prawy przedsionek serca, aby umożliwić wykrwawienie.
- Pozwól, aby natleniony roztwór Tyrode'a (0,8% NaCl, 0,0264% CaCl2, 0,005% NaH2PO4, 0,1% glukozy, 0,1% NaHCO3, 0,02% KCl) przepływał przez układ krążenia myszy, aż wątroba i płuca całkowicie oczyszczą się w wyniku usunięcia krwi (~ 5 min).
- Kontynuuj perfuzję zwierzęcia z 30% roztworem sacharozy rozpuszczonym w roztworze Tyrode'a przez dodatkowe 15 minut. Aby ocenić powodzenie perfuzji, upewnij się, że szyja, ogon i nogi są sztywne po 30% krążeniu sacharozy.
- Za pomocą małych nożyczek preparacyjnych odetnij skórę głowy w linii środkowej. Zaczynając od kości potylicznej i kierując się do przodu w kierunku pyska. To odsłoni czaszkę.
- Używając pary rongeurów, przebij się przez czaszkę, zaczynając od kości potylicznej i kontynuuj do przodu, aby całkowicie odsłonić powierzchnie mózgu. Następnie odwróć głowę do góry i wypreparuj nerwy u podstawy mózgu, aby uwolnić je z czaszki.
- Przygotuj 30% roztwór sacharozy z wodą wolną od RNaz i przefiltruj go przez nylonowy filtr siatkowy o grubości 40 μm, aby zmniejszyć degradację RNA.
- Aby zmaksymalizować infiltrację roztworu sacharozy, należy umieścić wypreparowane mózgi w 30% roztworze sacharozy i przechowywać je w temperaturze 4 °C przez noc. Przed dalszym przetwarzaniem upewnij się, że mózg dotrze do dna probówek zawierających roztwór sacharozy.
3. Kriokonserwacja mózgów, w których znajdują się guzy glejaka
- Przed krioprezerwacją mózgów przygotuj słoik wypełniony zimnym izopentanem/2-metylobutanem i umieść słoik w pojemniku wypełnionym ciekłym azotem. Poczekaj, aż rozpuszczalnik ostygnie.
- Wyjmij mózg z 30% roztworu sacharozy i osusz go na bibule filtracyjnej.
- Oznacz kriomold trwałym markerem. Ostrożnie dodaj około 5 ml OCT (związku o optymalnej temperaturze cięcia) do środka kriomoldu, unikając pęcherzyków powietrza.
- Umieść mózg w kriomold zawierającym OCT w pożądanej orientacji. Napełnij formę OCT, aż mózg zostanie całkowicie zanurzony. Używając czystych kleszczy, szybko umieść kriomold z OCT i mózg w zimnym izopentanie/2-metylobutanie.
- Gdy OCT zastygnie (~30-40 s), wyjmij kriom z mózgiem i umieść go w suchym lodzie. Nie pozostawiaj formy zawierającej mózg w 2-metylobutanie dłużej niż 2 minuty, ponieważ może to spowodować pęknięcia w stałym OCT. Owiń kriomold wraz z mózgiem w folię aluminiową i przechowuj w temperaturze -80 °C.
4. Cięcie zamrożonych tkanek guza mózgu
- Oznaczyć szkiełka z 2 μm polietylenu naftalanowego (PEN) informacjami o próbce. Skrawki tkanek zostaną umieszczone bezpośrednio na tych szkiełkach po przecięciu.
- Ustawić temperaturę w komorze kriostatu w zakresie od -20 do -24 °C. Przed podziałem na sekcje umieścić blok próbki w komorze kriostatu i pozostawić do wyrównania do temperatury w komorze przez 30-60 minut.
- Wyczyść komorę kriostatu i uchwyt noża 100% etanolem i spryskaj szczotki, które mają być używane, roztworem czyszczącym RNazy. Pracując w komorze kriostatu, usuń formę i przymocuj blok OCT zawierający mózg do dysku próbki kriostatu za pomocą OCT. Umieść blok w uchwycie dysku i wyrównaj blok z ostrzem noża.
- Zamontuj jednorazowe ostrze w uchwycie do sekcji.
- Przekrój mózg na grubość 10 μm. Upewnij się, że w chusteczce nie ma smug ani zadrapań. Za pomocą pędzla ostrożnie spłaszcz i rozwiń chusteczkę na powierzchni cięcia.
- Ostrożnie zamontuj tkankę zawierającą sekcje mózgu na szkiełkach PEN wolnych od RNaz. Odwróć dodatnio naładowane szkiełka szkiełkowe palcami w kierunku tkanki i płynnie dociśnij szkiełko szklane w dół w kierunku sekcji tkanki.
UWAGA: Temperatura dłoni pomoże chusteczce przyczepić się do szkła.
- Po zamontowaniu skrawków mózgu na szkiełkach, należy przechowywać szkiełka w pudełku wewnątrz komory kriostatu, a następnie przechowywać je w temperaturze -80 °C. Nigdy nie przechowuj szkiełek w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Fałdowanie tkanki i rozdarcie są powszechne. Aby uzyskać dokładną analizę a posteriori, ważne jest, aby zminimalizować te artefakty.
5. Utrwalanie i barwienie kriokonserwowanych skrawków tkanki mózgowej
- Aby zachować integralność RNA, wyczyść wszystkie używane instrumenty roztworem czyszczącym RNaza. Postępuj zgodnie z protokołem utrwalania i barwienia wewnątrz dygestoria.
- Przygotować opisane roztwory utrwalające w czystych, wolnych od RNaz probówkach o pojemności 50 ml. Wszystkie roztwory należy przygotować wodą wolną od RNaz w dniu barwienia.
- Tego samego dnia zostanie wykonana mikrodysekcja laserowa, w której przygotowane zostaną roztwory 100%, 95%, 70% i 50% etanolu. Roztwory należy przechowywać w szczelnie zamkniętych tubkach w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 4% fioletu krezylowego i 0,5% eozyny Y w 75% roztworze etanolu. Energicznie wirować roztwór przez 1 minutę i przefiltrować je przez filtr nylonowy 0,45 μm, aby wyeliminować ślady nierozpuszczonego proszku.
- Umieść szkiełka tkankowe w pojemniku z 95% etanolem na 30 sekund. Przenieś szkiełka do rurki zawierającej 75% etanolu; pozostaw tam szkiełka na 30 sekund.
- Przenieś szkiełka do 50% etanolu i pozostaw je tam na 25 sekund. W tym momencie KTZ zostanie rozwiązany. Przenieść szkiełko do 4% roztworu fioletu krezylowego na 20 s, a następnie przenieść do 0,5% roztworu eozyny Y na 5 s.
- Wyjmij szkiełko z roztworu barwnika i osusz szkiełko bibułą filtracyjną. Następnie umieść szkiełka w 50% etanolu na 25 s. Przenieś szkiełka do 75% etanolu na 25 s. Przenieś szkiełka do 95% etanolu na 30 s. Przenieś szkiełka do 100% etanolu na 60 s.
- Przepłukać szkiełko ksylenem. Przełóż je do pojemnika z ksylenem i odczekaj 3 minuty.
- Przygotuj podłoże montażowe (np. gumę Pinpoint) w wodzie wolnej od RNaz. Aby zamontować sekcje mózgu myszy, rozcieńczyć podłoże mocujące w wodzie wolnej od RNaz w stosunku 1:10.
- Suszyć szkiełka na powierzchni wolnej od RNaz w temperaturze pokojowej przez 10 sekund. Zanim ksylen wyschnie, przystąp do montażu szkiełek z sekcjami tkanki.
- Delikatnie rozprowadź roztwór montażowy na wierzchu tkanki na szkiełku za pomocą sterylnego i wolnego od RNaz cienkiego pędzla. Odczekaj 10-20 s, a następnie natychmiast przenieś szkiełka tkankowe na platformę mikrodysekcji mikroskopu.
UWAGA: Stosunek podłoża montażowego do wody wolnej od RNaz użytej do montażu różni się w zależności od tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Stosunek podłoża montażowego do wody zachowuje morfologię tkanki glejaka do mikrodysekcji laserowej bez wpływu na integralność RNA.
6. Mikrodysekcja laserowa
UWAGA: Mikroskop mikrodyparacyjny do laserowego mikrodysekcji musi być używany do laserowego mikropreparowania określonych obszarów zainteresowania w tkance nowotworowej. Aby zminimalizować czas mikrodysekcji laserowej tkanek, należy przygotować mikroskop LMD przed utrwaleniem i barwieniem.
- Aby uruchomić system, najpierw włącz listwę zasilającą, a następnie włącz laser. Następnie włącz kontroler mikroskopu i komputer. Uruchom oprogramowanie LMD.
- W obszarze Sterowanie mikroskopem wybierz powiększenie 10x. W obszarze Sterowanie laserem ustaw parametry lasera do rozwarstwiania tkanek. Ustaw częstotliwość lasera na 120 Hz, aby uzyskać najlepsze wyniki cięcia. Zawsze ustawiaj prąd lasera na 100%.
- Aby uzyskać dokładną mikrodysekcję laserową, ustaw prędkość na 10, a ustawienie przysłony na 2.0-10.0 μm. Ustaw moc na 53. Ustawienie mocy lasera może spowodować wytrawianie szkła.
- Załaduj kolektor tkanek, który przechwyci tkankę po rozbiorzeniu. Kliknij drugi przycisk rozładowywania. Wyjmij pusty kolektor i umieść w nim wolne od DNaz/RNaz 0,5 ml płaskie probówki czołowe PCR zawierające 30 μl buforu do lizy. Umieść kolektor z powrotem w urządzeniu i kliknij przycisk Kontynuuj w oprogramowaniu, aby kontynuować.
- Załaduj przetworzoną (utrwaloną i barwioną) próbkę do mikroskopu. Najpierw kliknij rozładuj w oprogramowaniu LMD. Następnie zamontuj próbkę na uchwycie szkiełka i umieść uchwyt szkiełka na stoliku. Kliknij Kontynuuj w oprogramowaniu, aby kontynuować.
- W obszarze Okna Wytnij kształty wybierz pozycję Rysuj + Wytnij. Użyj elementów sterujących mikroskopu, aby znaleźć obszar zainteresowania. Narysuj obszar zainteresowania (ROI) i wybierz docelową rurkę kolektora. Możliwe jest narysowanie wielu ROI, aby jednocześnie przeanalizować różne obszary z jednego slajdu.
- Kliknij przycisk Start Cut, aby przejść do mikrosekcji tkanek. Po podziale obszarów zainteresowania wyjmij rurki kolektora z uchwytu i umieść probówki na suchym lodzie. Pobrane próbki tkanki RNA należy przenieść do temperatury -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.
7. Izolacja RNA mikrowypreparowanej tkanki glejaka
- Do ekstrakcji RNA z LMD należy użyć zestawu do izolacji RNA zoptymalizowanego pod kątem małych próbek i niskiej wydajności RNA (patrz Tabela materiałów). Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Wszystkie etapy izolacji należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej (25 °C). Aby utrzymać jakość RNA, pracuj szybko. Przygotuj wszystkie roztwory zgodnie ze wskazaniami producenta.
- Dostosować objętość próbki do 350 μl za pomocą buforu do lizy z 1% β-merkaptoetanolem. Wirować próbkę przez 40 sekund w celu zmniejszenia lepkości próbki i zwiększenia wydajności kolumny wirowej elucji RNA.
- Przenieść całą próbkę do kolumny wirowej eliminatora gDNA umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Odwirować probówkę przez 30 s przy 8 000 x g. Zachowaj przepływ i upewnij się, że po odwirowaniu w kolumnie nie pozostał żaden płyn.
- Dodać 350 μl 70% etanolu do przepływowego roztworu i dobrze wymieszać, pipetując w górę iw dół. Przenieść próbkę do kolumny wirowej elucji RNA umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Delikatnie zamknij pokrywę i wiruj przez 15 s przy 8 000 x g. Odrzuć przepływ, oszczędzając kolumnę.
- Dodać 700 μl buforu płuczącego RNA 1 (20% etanolu, 900 mM GITC, 10 mM Tris-HCl pH 7,5) do kolumny wirowej elucji RNA. Delikatnie zamknij pokrywę i wiruj przez 15 s przy 8,000 x g, aby umyć membranę kolumny wirowej. Odrzuć przepływ.
- Po odwirowaniu ostrożnie wyjąć kolumnę wirową elucji RNA z probówki zbiorczej, tak aby kolumna nie stykała się z przepływem.
- Dodać 500 μl drugiego buforu płuczącego RNA (etanol 80%, NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,5) do kolumny wirowej. Zamknij pokrywę kolumny i wiruj 8 000 x g przez 20 sekund, aby umyć membranę kolumny. Usunąć przepływ.
- Aby przepłukać kolumnę elucyjną RNA, dodać 500 μl 80% etanolu, zamknąć pokrywę kolumny i odwirować przy 8000 x g przez 2 min. Wyrzucić probówki z roztworem elucyjnym.
- Użyj nowej probówki zbiorczej, otwórz pokrywę kolumny wirowej i odwiruj przy 8000 x g przez 5 minut, aby wysuszyć kolumnę. Wyrzucić probówkę elucyjną.
- Umieść kolumnę wirową elucji RNA w nowej probówce zbiorczej o pojemności 1,5 ml. Dodać 12 μl wody wolnej od RNaz podgrzanej w temperaturze 37 °C bezpośrednio do środka membrany kolumny wirowej. Odczekaj 4 minuty i wiruj przez 1 minutę z pełną prędkością, aby wymyć RNA.
8. Kontrola jakości RNA, przygotowanie biblioteki i analiza RNA-Seq
- Po ekstrakcji i oczyszczeniu RNA należy amplifikować RNA i utworzyć bibliotekę cDNA za pomocą specjalnego zestawu odpowiedniego do izolacji RNA w stężeniach pikomolowych zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Wyczyść stację roboczą, aby uniknąć zanieczyszczenia innymi produktami PCR i degradacji próbek przez nukleazy.
- Jeśli RNA ma wartość RIN większą niż 4, co oznacza, że RNA jest dobrej jakości lub tylko częściowo zdegradowany, przejdź do etapu fragmentacji. Przygotuj wszystkie przedmioty na lodzie.
- Utworzyć mieszankę wzorcową, jak wskazano (Tabela 1). Utworzyć mieszaninę reakcyjną w pozbawionej nukleaz cienkościennej probówce do PCR o pojemności 0,2 ml. Inkubować probówki w temperaturze 94 °C w termocyklerze z gorącą pokrywą. Czas inkubacji fragmentacji zależy od jakości RNA. RIN ≥ 7: 4 min, RIN 5-6: 3 min, RIN 4-5: 2 min.
- Po inkubacji umieścić probówki na stojaku do chłodziarki PCR, który został wcześniej schłodzony w temperaturze -20 °C i pozostawić na 2 minuty.
- Dla każdej probówki próbki RNA przygotować główną mieszaninę reakcji syntezy pierwszej nici (tabela 2). Inkubować probówki w termocyklerze z gorącą pokrywą w warunkach opisanych w tabeli 3. Produkty cDNA można zamrażać w temperaturze -20 °C przez dwa tygodnie przed przejściem do następnego etapu.
- Utworzyć główną mieszankę PCR, jak wskazano w Tabeli 4. Umieścić probówki w termocyklerze z gorącą pokrywą i uruchomić reakcję PCR zgodnie z ustawieniami wskazanymi w Tabeli 5.
- Pozwól, aby kulki, które zostaną użyte do oczyszczenia DNA, ogrzały się do temperatury pokojowej. Po podgrzaniu dodać 40 μl kulek do każdej próbki. Wiruj probówki, aby wymieszać i krótko odwirować, aby zebrać płyn na dnie probówki. Pozwól probówkom inkubować w temperaturze pokojowej przez 8 minut, aby DNA mogło związać się z kulkami.
- Umieść probówki na urządzeniu do separacji magnetycznej i pozostaw na około 5 minut lub do momentu, gdy roztwór stanie się całkowicie klarowny. Trzymając probówki na urządzeniu rozdzielającym, użyj pipety, aby ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając kulek.
- Trzymając probówki na urządzeniu rozdzielającym, dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do kulek, aby umyć je bez naruszania kulek. Odczekaj 30 sekund przed usunięciem 80% etanolu. Powtórz ten krok.
- Na krótko odkręć rurki i umieść je z powrotem na urządzeniu rozdzielającym. Usuń resztki 80% etanolu bez naruszania kulek.
- Pozostaw probówki do wyschnięcia na powietrzu z otwartymi nakrętkami przez 5 minut. Nie pozwól mu siedzieć dłużej, ponieważ koraliki wyschną.
- Trzymając probówki na urządzeniu separującym, dodaj 52 μl wody wolnej od nukleaz, aby przykryć kulki. Wyjmij probówki z urządzenia rozdzielającego i pipetuj w górę iw dół, aż wszystkie kulki zostaną ponownie zawieszone. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Umieść probówki z powrotem na urządzeniu rozdzielającym, aż roztwór stanie się klarowny, około 1 minuty. Przenieś 50 μl powstałego supernatantu do studzienek 8-dołkowego paska. Do każdej próbki dodać 40 μl nowych kulek. Dokładnie wymieszaj, aby wymieszać. Pozwól kulkom związać się z DNA poprzez inkubację w temperaturze pokojowej przez 8 minut.
- Podczas tego okresu inkubacji należy rozpocząć rozmrażanie składników, które mają być użyte do dowolnego rRNA obecnego w próbkach. Po rozmrożeniu połóż je na lodzie. Podgrzej również termocykler do temperatury 72 °C.
- Umieścić próbki na urządzeniu do separacji magnetycznej, aż roztwór się klarowny (około 5 minut). Podaniec 1,5 μl sond na próbkę do schłodzonej probówki PCR. Umieść rurkę w nagrzanym termocyklerze w ustawieniach 72 °C na 2 min i 4 °C.
- Trzymając probówki z próbkami w urządzeniu do separacji magnetycznej, usunąć supernatant za pomocą pipety, nie naruszając kulek. Następnie dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do kulek, aby umyć je bez naruszania kulek. Odczekaj 30 s przed usunięciem 80% etanolu. Powtórz ten krok.
- Na krótko odkręć rurki i umieść je z powrotem na urządzeniu rozdzielającym. Usuń resztki 80% etanolu bez naruszania kulek. Pozostaw probówki do wyschnięcia na powietrzu z otwartymi nakrętkami przez 2 minuty. Nie pozwól siedzieć dłużej, ponieważ koraliki wyschną.
- Przygotować mieszankę wzorcową dla wszystkich próbek, łącząc następujące składniki w przedstawionej kolejności (tabela 6).
- Wymieszać mieszankę wzorcową przez wirowanie i dodać 22 μl mieszanki do wysuszonych kulek każdej próbki i dokładnie wymieszać w celu ponownego zawieszenia. Pozwól mu inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
- Odkręć probówki i umieść je na urządzeniu do separacji magnetycznej na 1 minutę lub do momentu, gdy próbki staną się przezroczyste. Przenieść 20 μl supernatantu, nie naruszając kulek do nowych probówek PCR. Umieść probówki we wstępnie nagrzanym termocyklerze zgodnie z ustawieniami w Tabeli 7.
- Przygotować główną mieszankę PCR, aby uzyskać wystarczającą ilość reakcji dla każdej próbki. Dodać następujące składniki do mieszanki wzorcowej we wskazanej tabeli 8. Dodać 80 μl głównej mieszanki PCR do każdej z probówek z próbką z kroku 8.20 i umieścić w termocyklerze z następującymi ustawieniami (tabela 9).
- Pozwól, aby koraliki, które zostaną użyte do oczyszczenia DNA, ogrzały się do temperatury pokojowej. Po podgrzaniu dodaj 100 μl kulek do każdej próbki. Pozwól probówkom inkubować w temperaturze pokojowej przez 8 minut, aby DNA mogło związać się z kulkami.
- Umieść probówki na urządzeniu do separacji magnetycznej i pozostaw na około 5 minut lub do momentu, gdy roztwór stanie się całkowicie klarowny.
- Trzymając probówki na urządzeniu rozdzielającym, użyj pipety, aby ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając kulek.
- Trzymając probówki na urządzeniu rozdzielającym, dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do kulek, aby umyć je bez naruszania kulek. Odczekaj 30 sekund przed usunięciem 80% etanolu. Powtórz ten krok.
- Krótko odkręć rurki i umieść probówki z powrotem na urządzeniu rozdzielającym. Usuń resztki 80% etanolu bez naruszania kulek.
- Pozostaw probówki do wyschnięcia na powietrzu z otwartymi nakrętkami przez 5 minut. Nie pozwól siedzieć dłużej, ponieważ koraliki przeschną. Odpipetować 20 μL Tris Buffer do wysuszonego osadu. Wyjmij probówkę z urządzenia rozdzielającego i dokładnie wymieszaj pipetą, aby ponownie zawiesić kulki. Pozwól mu inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
- Umieść probówki na urządzeniu rozdzielającym na 2 minuty lub do momentu, gdy roztwór stanie się klarowny. Pobrać supernatant i przenieść go do nowych probówek. Następnie przechowywać zebrany roztwór w temperaturze -20 °C.
- Sprawdź końcowe biblioteki potrzebne do kontroli jakości i ilości. Zgrupuj próbki, zgrupowane i sekwencjonowane, zgodnie z odczytami 50 nt z sparowanym końcem, zgodnie z zalecanymi przez producenta protokołami.