Tutaj prezentujemy metodę oczyszczania fibroblastów i komórek Schwanna z nerwów czuciowych i ruchowych in vitro.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Oczyszczanie fibroblastów i komórek Schwanna z nerwów czuciowych i ruchowych in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Głównymi komórkami obwodowego układu nerwowego są komórki Schwanna (SC) i fibroblasty. Obie te komórki wyraźnie wyrażają fenotypy czuciowe i motoryczne zaangażowane w różne wzorce ekspresji genów czynników neurotroficznych i innych procesów biologicznych, wpływając na regenerację nerwów. W niniejszym badaniu opracowano protokół mający na celu szybsze uzyskanie wysoce oczyszczonych sensorycznych i motorycznych SC i fibroblastów szczurów. Korzeń brzuszny (nerw ruchowy) i korzeń grzbietowy (nerw czuciowy) nowonarodzonych szczurów (7-dniowych) zostały rozdzielone, a komórki hodowano przez 4-5 dni, a następnie izolowano fibroblasty czuciowe i ruchowe oraz SC poprzez sekwencyjne połączenie metod trawienia różnicowego i różnicowego przylegania. Wyniki analiz immunocytochemicznych i cytometrii przepływowej wykazały, że czystość czuciowych i motorycznych SC i fibroblastów wynosiła >90%. Protokół ten może być wykorzystany do szybszego uzyskania dużej liczby fibroblastów czuciowych i ruchowych / SC, przyczyniając się do badania regeneracji nerwów czuciowych i ruchowych.
Wprowadzenie
W obwodowym układzie nerwowym włókna nerwowe składają się głównie z aksonów, komórek Schwanna (SC) i fibroblastów, a także zawierają niewielką liczbę makrofagów, mikronaczyniowych komórek śródbłonka i komórek odpornościowych1. SC owijają aksony w stosunku 1:1 i są otoczone warstwą tkanki łącznej zwaną endoneurium. Aksony są następnie wiązane razem, tworząc grupy zwane pęczkami, a każdy pęczek jest owinięty warstwą tkanki łącznej znaną jako krocze. Wreszcie całe włókno nerwowe jest owinięte warstwą tkanki łącznej, która jest określana jako epineurium. W endoneurium cała populacja komórek składa się w 48% z SC, a znaczna część pozostałych komórek obejmuje fibroblasty2. Ponadto fibroblasty są ważnymi składnikami wszystkich przedziałów nerwowych, w tym epineurium, perineurium i endoneurium3. Wiele badań wykazało, że SC i fibroblasty odgrywają kluczową rolę w procesie regeneracji po urazach nerwów obwodowych4,5,6. Po przecięciu nerwu obwodowego, fibroblasty okołonerwowe regulują sortowanie komórek za pomocą szlaku sygnałowego efryny-B / EphB2 między SC a fibroblastami, dalej kierując odrostem aksonów przez rany5. Fifibroblasty nerwów obwodowych wydzielają białko tenascyny-C i zwiększają migrację SC podczas regeneracji nerwów przez szlak sygnałowy β1-integryny7. Jednak SC i fibroblasty użyte w powyższych badaniach pochodziły z nerwu kulszowego, który obejmuje zarówno nerwy czuciowe, jak i ruchowe.
W obwodowym układzie nerwowym, nerwy czuciowe (doprowadzające) przewodzą sygnały czuciowe z receptorów do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), podczas gdy nerwy ruchowe (nerwy odprowadzające) przewodzą sygnały z OUN do mięśni. Wcześniejsze badania wykazały, że SC wyrażają odrębne fenotypy motoryczne i czuciowe oraz wydzielają czynniki neurotroficzne, które wspierają regenerację nerwów obwodowych8,9. Według ostatnich badań, fibroblasty wyrażają również różne fenotypy motoryczne i czuciowe oraz wpływają na migrację SCs10. Tak więc badanie różnic między fibroblastami nerwów ruchowych i czuciowych / SC pozwala nam badać skomplikowane mechanizmy molekularne leżące u podstaw regeneracji specyficznej dla nerwów obwodowych.
Obecnie istnieje wiele sposobów na oczyszczanie SC i fibroblastów, w tym stosowanie środków antymitotycznych, cytoliza za pośrednictwem przeciwciał11,12, sekwencyjna immunopanina13 i podłoże lamininy14. Jednak wszystkie powyższe metody usuwają fibroblasty i zachowują tylko SC. Wysoce oczyszczone SC i fibroblasty można uzyskać za pomocą technologii sortowania metodą cytometrii przepływowej15, ale jest to technika czasochłonna i kosztowna. W związku z tym w niniejszym badaniu opracowano prostą metodę trawienia różnicowego i różnicowego przylegania do oczyszczania i izolowania fibroblastów nerwów czuciowych i ruchowych oraz SC w celu szybszego uzyskania dużej liczby fibroblastów i SC.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi Instytucjonalnej Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Nantong. Wszystkie procedury, w tym zwierzęta badane, zostały etycznie zatwierdzone przez Komitet Administracyjny ds. Zwierząt Doświadczalnych w prowincji Jiangsu w Chinach.
1. Izolacja i hodowla fibroblastów nerwów ruchowych i czuciowych oraz SC
- Użyj siedmiodniowych szczurów Sprague-Dawley (SD) (n=4) dostarczonych przez Centrum Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Nantong w Chinach. Umieść szczury w zbiorniku zawierającym 5% izofluranu na 2-3 minuty, pozwól zwierzętom oddychać powoli i nie mieć samodzielnej aktywności, a następnie zdezynfekuj je przy użyciu 75% etanolu przed dekapitacją.
- Za pomocą nożyczek przeciąć tylną skórę na około 3 cm i usunąć kręgosłup. Ostrożnie otwórz kanał kręgowy, aby odsłonić rdzeń kręgowy.
- Utrzymuj rdzeń kręgowy na szalce Petriego o średnicy 60 mm z 2-3 ml lodowatego roztworu soli D-Hanksa (HBSS).
- Na podstawie budowy anatomicznej wyciąć korzeń brzuszny (nerw ruchowy), a następnie korzeń grzbietowy (nerw czuciowy) pod mikroskopem preparacyjnym. Następnie umieść je w lodowatym zrównoważonym roztworze soli D-Hanksa (HBSS).
- Po usunięciu HBSS pokrój nerwy na 3-5 mm kawałki nożyczkami i trawij 1 ml 0,25% (w/v) trypsyny w temperaturze 37 °C przez 18-20 minut. Następnie uzupełnij 3-4 ml DMEM zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), aby zatrzymać trawienie.
- Delikatnie pipetować mieszaninę w górę i w dół około 10 razy i wirować przy 800 x g przez 5 minut. Następnie wyrzuć supernatant i zawiesij osad w 2-3 ml DMEM uzupełnionego 10% FBS.
- Przefiltrować zawiesinę komórkową za pomocą filtra o siatce 400, a następnie zaszczepić komórki na 60-milimetrowej szalce Petriego i wyhodować w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 . Po 4-5 dniach hodowli wyizoluj fibroblasty pasażowe 0 (p0) i SC po osiągnięciu 90% konfluencji.
- Izolacja i hodowla SC (Rysunek 1)
- Umyj komórki raz za pomocą 1x PBS. Dodać 1 ml 0,25% (w/v) trypsyny (37 °C) na 60 mm szalkę Petriego, aby trawić komórki przez 8-10 s w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 3 ml DMEM uzupełnione 10% FBS, aby zatrzymać trawienie.
- Delikatnie przedmuchaj mieszaninę, aby odłączyć SC za pomocą pipety. Następnie zebrać i odwirować SC przy 800 x g przez 5 minut.
- Odrzucić supernatant i zawiesić osad w 3 ml DMEM z 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, 2 μM forskoliny i 10 ng/ml HRG, a następnie zaszczepić komórki na niepowlekanej szalce Petriego o średnicy 60 mm. Po hodowli w temperaturze 37 °C przez 30-45 minut, fibroblasty (kilka fibroblastów jest trawionych za pomocą SC) przyczepiają się do dna naczynia.
- Przenieść supernatant (łącznie z SC) do innego naczynia pokrytego poli-L-lizyną (PLL) i wyhodować go w temperaturze 37 °C przez 2 dni.
- Izolacja i hodowla fibroblastów (Rysunek 1)
- Po usunięciu SC (jak pokazano w kroku 1.8), umyj pozostałe fibroblasty w naczyniach 1x PBS, a następnie dodaj 1 ml 0,25% (w/v) trypsyny, aby trawić fibroblasty przez 2 minuty w temperaturze 37 °C.
- Dodaj DMEM uzupełniony 10% FBS, aby zakończyć trawienie. Przedmuchaj fibroblasty za pomocą pipety, a następnie zbierz je i odwiruj w sile 800 x g przez 5 minut.
- Odrzucić supernatant, zawiesić osad w 2 ml DMEM zawierającego 10% FBS, a następnie zaszczepić komórki na niepowlekanej szalce Petriego o średnicy 60 mm. Fibroblasty po hodowli przez 30-45 minut w temperaturze 37 °C przyczepiają się do dna naczynia. Odrzucić supernatant (łącznie z kilkoma numerami SC). Następnie dodaj 3 ml DMEM uzupełnionego 10% FBS do naczynia z fibroblastami i hoduj w temperaturze 37 °C przez 2 dni.
- Przejdź przez komórki p1, aż osiągną 90% konfluencji. Następnie należy je oczyścić przez trawienie różnicowe i ponowne różnicowe przyleganie, jak opisano w sekcjach 1.8 i 1.9.
- Trawić fibroblasty p2 i SC po hodowli przez 2 dni, a następnie zebrać komórki, policzyć i zaszczepić w 1 x 105 liczbach / dołku na szkiełkach pokrytych PLL do immunocytochemii (ICC).
2. ICC do identyfikacji czystości komórek
- Hodować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i przeprowadzić barwienie ICC po zróżnicowanym trawieniu i zróżnicowanym przyleganiu fibroblastów motorycznych i czuciowych oraz SC.
- Umyj fibroblasty motoryczne i czuciowe oraz SC 1x PBS i utrwal je w 200 μl/studzienkę 4% paraformaldehydu (pH 7,4) przez 18 minut w temperaturze pokojowej.
- Zablokować próbkę SC buforem blokującym (0,1% Triton X-100 w 0,01 M PBS zawierającym 5% surowicy koziej) i zablokować fibroblasty próbki buforem blokującym (0,01 M PBS zawierającym 5% surowicy koziej) na 45 minut w temperaturze 37 °C po trzykrotnym przemyciu ich PBS.
- Usunąć bufor blokujący i inkubować z następującymi pierwszorzędowymi przeciwciałami: mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-CD90 (swoistym markerem fibroblastów) (1:1000) dla fibroblastów i mysim przeciwciałem anty-S100 (swoistym markerem dla SC) (1:400) dla SC w temperaturze 4 °C przez noc.
- Odrzuć przeciwciała pierwszorzędowe, trzykrotnie przemyj PBS i inkubuj z następującymi przeciwciałami drugorzędowymi: Alexa Fluor 594 kozia anty-mysia IgG (1:400) dla fibroblastów i 488-sprzężona kozia anty-mysia IgG (1:400) dla SC w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny.
- Próbki należy przemyć trzykrotnie PBS i wybarwić jądra barwnikiem Hoechst 33342 o stężeniu 5 μg/ml przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć próbkę trzykrotnie 1x PBS i zamontować je za pomocą medium mocującego (20 μl/szkiełko) na szkiełku podstawowym.
- Wykonaj zdjęcia komórek za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego w trzech losowych polach dla każdej studzienki. Oceń całkowitą liczbę jąder i komórek CD90-dodatnich, komórek S100-dodatnich, a następnie oblicz odpowiednio procent komórek CD90-dodatnich i komórek S100-dodatnich. Wykonaj barwienie w trzech egzemplarzach.
3. Analiza cytometrii przepływowej (FCA) do identyfikacji czystości komórek
- Oceń czystość fibroblastów motorycznych i czuciowych oraz SC zgodnie z wcześniejszym opisem FCA16. Krótko mówiąc, trawić fibroblasty motoryczne i czuciowe p2 oraz SC za pomocą 0,25% (w/v) trypsyny, ponownie zawiesić granulki komórkowe i inkubować je w pożywce utrwalającej w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
- Inkubować komórki z pożywką permeabilizacyjną i sondować za pomocą mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-CD90 (0,1 μg / 106 komórek, 200 μl) dla fibroblastów i mysiego przeciwciała anty-S100 (1:400, 200 μl) dla SC odpowiednio przez 30 minut.
- Inkubuj komórki z 488-sprzężoną kozą anty-mysią IgG przez 30 minut. Użyj kalibru FACS do wykonania cytometrii przepływowej i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania Cell Quest.
- Inkubuj komórki tylko z 488-sprzężonymi kozami anty-mysimi IgG (grupa fibroblastów) i mysią IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - kontrola izotypu (grupa SC), która służy jako kontrola ujemna.
4. Analiza statystyczna
- Przedstaw wszystkie dane jako średnie ± SEM. Oceń różnice statystyczne w danych za pomocą niesparowanego testu t przy użyciu GraphPad Prism 6.0. Ustaw istotność statystyczną na p<0,05. Wykonaj wszystkie testy w trzech egzemplarzach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Obserwacja pod mikroskopem świetlnym
Komórki Schwanna (SCs) oraz fibroblasty to dwie główne populacje komórek uzyskiwane w pierwotnej hodowli komórkowej z tkanek nerwowych. Po 1 h od inokulacji większość komórek przytwierdziła do dna szalki, a ich morfologia zmieniła się z okrągłej na owalną. Po 24 h hodowli SCs wykazywały morfologię bipolarną lub tripolarną, a ich długość wynosiła od 100 do 200 µm. Po 48 h nastąpiła agregacja i proliferacja komórek, w wyniku której w...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Dwie główne populacje komórek nerwów obwodowych obejmowały SC i fibroblasty. Głównie hodowane fibroblasty i SC mogą dokładnie pomóc w modelowaniu fizjologii fibroblastów i SC podczas rozwoju i regeneracji nerwów obwodowych. Badanie wykazało, że komórki nerwowe płucza kulszowa szczura P7 zawierały około 85% S100-dodatnich SC, 13% fibroblastów OX7-dodatnich i tylko 1,5% makrofagów OX42-dodatnich13. Chociaż liczba fibroblastów jest mniejsza niż w przypadku SC, początkowe tempo proliferacji fibroblast...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (Grant nr 2017YFA0104703), Narodową Fundację Naturalną Chin (Grant nr 31500927).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Rozcieńczenie: 1:400 |
| CoraLite488-sprzężony Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Rozcieńczenie: 1:400 |
| Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Oprogramowanie Cell Quest | Becton Dickinson Biosciences | ||
| Zrównoważony roztwór soli D-Hanka | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Mikroskop preparacyjny | Olympus | SZ2-ILST | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Podłoże montażowe | Abcam | ab104135 | |
| Pożywka utrwalająca / Pożywka przepuszczalna | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Cytometria przepływowa | Becton Dickinson Biosciences | FACS Mysz Calibur | |
| IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Kontrola izotypu | Abcam | ab106163 | Rozcieńczenie: 1:400 |
| Mysie przeciwciało monoklonalne anty-CD90 | Abcam | ab225 | Rozcieńczenie: 1:1000 dla ICC, 0,1 i mikro; g dla komórek 106 dla |
| przeciwciała anty-S100 myszy | Flow Cyt Abcam | ab212816 | Rozcieńczenie: 1:400 |
| Polilizyna (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Rekombinowane ludzkie białko domeny NRG1-beta 1 / HRG1-beta 1 EGF R | & D Systems | 396-HB-050 | |
| 0,25% (w/v) trypsyna | Gibco | 25200-072 |
Bibliografia
- Stierli, S., et al. The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population. Development (The Company of Biologists). , (2018).
- Schubert, T., Friede, R. L. The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).
- Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior. European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).
- Lavdas, A. A., et al. Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143 (1), 145-155 (2010).
- Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration. Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).
- Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).
- Hoke, A., et al. Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration. Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).
- Brushart, T. M., et al. Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro. Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).
- He, Q., et al. Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts. Frontiers in Neuroscience. 12, 1016(2018).
- Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Palomo Irigoyen, M., et al. Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells. Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).
- Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation. Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).
- Pannunzio, M. E., et al. A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).
- Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting. Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).
- He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells. Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).
- Weiss, T., et al. Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype. Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
