Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60996

⸱

10 kwietnia 2020

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky, 2Markey Cancer Center, University of Kentucky

W tym artykule

Podsumowanie

Modele ksenoprzeszczepów danio pręgowanego pozwalają na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków i obrazowanie fluorescencyjne ludzkich komórek nowotworowych w mikrośrodowisku in vivo. Opracowaliśmy przepływ pracy do zautomatyzowanych badań przesiewowych leków na dużą skalę na próbkach białaczki pobranych od pacjentów u danio pręgowanego przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia do obrazowania wyposażonego w mikroskop fluorescencyjny.

Streszczenie

Modele ksenoprzeszczepów pochodzące od pacjentów są kluczowe w określaniu, jak różne nowotwory reagują na leczenie farmakologiczne w systemie in vivo. Modele mysie są standardem w tej dziedzinie, ale danio pręgowany pojawił się jako alternatywny model z kilkoma zaletami, w tym możliwością wysokowydajnych i tanich badań przesiewowych leków. Danio pręgowany pozwala również na badania przesiewowe leków in vivo z dużą liczbą powtórzeń, które wcześniej można było uzyskać tylko za pomocą systemów in vitro. Możliwość szybkiego wykonywania badań przesiewowych leków na dużą skalę może otworzyć możliwość spersonalizowanej medycyny z szybkim przekazywaniem wyników z powrotem do kliniki. Modele ksenoprzeszczepów danio pręgowanego mogą być również wykorzystywane do szybkich badań przesiewowych w kierunku mutacji, które można by wykorzystać, w oparciu o odpowiedź guza na terapie celowane lub do identyfikacji nowych związków przeciwnowotworowych z dużych bibliotek. Obecnie głównym ograniczeniem w tej dziedzinie jest ilościowe określenie i automatyzacja procesu, tak aby badania przesiewowe leków mogły być wykonywane na większą skalę i były mniej pracochłonne. Opracowaliśmy przepływ pracy do ksenoprzeszczepu pierwotnych próbek pacjentów do larw danio pręgowanego i wykonywania badań przesiewowych leków na dużą skalę przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w jednostkę obrazowania i zautomatyzowaną jednostkę próbnika. Metoda ta pozwala na standaryzację i kwantyfikację wszczepionego obszaru guza i odpowiedzi na leczenie farmakologiczne u dużej liczby larw danio pręgowanego. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta jest korzystna w porównaniu z tradycyjnymi badaniami przesiewowymi leków w hodowli komórkowej, ponieważ pozwala na wzrost komórek nowotworowych w środowisku in vivo przez cały okres leczenia farmakologicznego i jest bardziej praktyczna i opłacalna niż myszy w przypadku badań przesiewowych leków in vivo na dużą skalę.

Wprowadzenie

Ksenografowanie pierwotnych nowotworów pacjenta lub ludzkich linii komórkowych raka do organizmów modelowych jest szeroko stosowaną techniką do badania progresji i zachowania guza in vivo, odpowiedzi guza na leczenie farmakologiczne oraz interakcji komórek rakowych z mikrośrodowiskiem, między innymi. Tradycyjnie, komórki są ksenoprzeszczepiane myszom z obniżoną odpornością i pozostaje to standardem w tej dziedzinie. Jednak ten system modelowy ma kilka ograniczeń, takich jak wysoki koszt, niska liczba powtórzeń, trudności w dokładnym określeniu obciążenia guzem in vivo oraz wydłużony czas potrzebny na wszczepienie guza i zakończenie testów na obecność narkotyków. W ostatnich latach danio pręgowany pojawił się jako alternatywny model ksenoprzeszczepu, a pierwszy przypadek został opisany w 2005 roku, z liniami komórek ludzkiego czerniaka znakowanymi zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) przeszczepionymi do zarodków w stadium blastuli1,2. Ostatnio larwy danio pręgowanego w ciągu 2 dni po zapłodnieniu (dpf) były wykorzystywane jako biorcy ksenoprzeszczepów, aby umożliwić kontrolę anatomicznej lokalizacji wstrzyknięcia i wykorzystać w wysokiej rozdzielczości obrazowanie in vivo interakcji guza z otaczającym mikrośrodowiskiem3,4.

Danio pręgowany oferuje wiele zalet jako model ksenoprzeszczepu. Po pierwsze, dorosłe danio pręgowany można trzymać w pomieszczeniach i szybko hodować w dużych ilościach przy stosunkowo niskich kosztach. Każda para godowa dorosłego danio pręgowanego może wyprodukować setki larw ryb tygodniowo. Ze względu na swoje niewielkie rozmiary, te larwy danio pręgowanego mogą być trzymane na 96-dołkowych płytkach w celu wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków. Larwy nie muszą być karmione w trakcie typowego eksperymentu z ksenoprzeszczepem, ponieważ ich woreczek żółtkowy dostarcza składników odżywczych, które podtrzymują je przez pierwszy tydzień życia. Co więcej, danio pręgowany nie ma w pełni funkcjonalnego układu odpornościowego do 7 dpf, co oznacza, że nie wymagają napromieniania ani schematów immunosupresyjnych przed wstrzyknięciem ksenoprzeszczepu. Wreszcie, optycznie przezroczyste linie danio pręgowanego pozwalają na obrazowanie interakcji między guzem a mikrośrodowiskiem w wysokiej rozdzielczości.

Być może najbardziej obiecującym zastosowaniem danio pręgowanego jako modelu ksenoprzeszczepu jest możliwość przeprowadzania wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków na próbkach ludzkiego raka w sposób, który nie jest możliwy przy użyciu żadnego innego organizmu modelowego. Larwy wchłaniają leki z wody przez skórę, co ułatwia podawanie leków5. Ponieważ zwierzęta są trzymane na 96-dołkowych płytkach, zwykle w 100-300 μl wody, badania przesiewowe wymagają mniejszych ilości leków w porównaniu z myszami. Obecnie istnieje kilka różnych metod standaryzacji i kwantyfikacji wpływu leków na obciążenie nowotworami u ludzi u danio pręgowanego, z których niektóre są bardziej praktyczne niż inne w celu zwiększenia skali testów pojedynczych leków do wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Na przykład niektóre grupy dysocjują ryby na zawiesiny pojedynczych komórek i określają ilościowo znakowane fluorescencyjnie lub barwione komórki nowotworowe poprzez obrazowanie pojedynczych kropelek zawiesiny i ilościowe określanie fluorescencji za pomocą półautomatycznego ImageJ macro4. Opracowano półautomatyczną metodę obrazowania całych larw, w której larwy ryb utrwalono na 96-dołkowych płytkach i zobrazowano za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego przed ponownym wyrównaniem obrazów kompozytowych i kwantyfikacją ognisk komórek nowotworowych6. Oba te testy są dość pracochłonnymi metodami oznaczania ilościowego, co sprawiło, że naprawdę wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków w modelach ksenoprzeszczepów danio pręgowanego stały się niepraktyczne.

Ten problem został rozwiązany przez opracowanie Vertebrate Automated Screening Technology (VAST) Bioimager and Large Particle (LP) Sampler, jednostki obrazowania wyposażonej w mikroskop fluorescencyjny oraz automatycznej jednostki próbnika (Rysunek 1 i Tabela Materiałów), która jest prawdziwie zautomatyzowaną metodą wysokoprzepustowego obrazowania larw danio pręgowanego7,8,9. Za pomocą tego urządzenia, ryby są znieczulane, automatycznie pobierane próbki z płytki 96-dołkowej, umieszczane w kapilarze i obracane do ustalonej orientacji w oparciu o ustalone preferencje użytkownika, obrazowane, a następnie umieszczane z powrotem w tym samym dołku nowej płytki 96-dołkowej w celu dalszych badań lub odrzucane. Połączenie tej technologii obrazowania z ksenoprzeszczepami danio pręgowanego może pozwolić na spersonalizowaną medycynę, która wykorzystuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków w dużych bibliotekach związków leczniczych przeciwko pojedynczym nowotworom pacjenta. Ksenoprzeszczepy danio pręgowanego stanowią również zakrojoną na szeroką skalę i tanią metodę badania zarówno toksyczności, jak i skuteczności nowych związków in vivo. Danio pręgowany może być stosowany jako wstępny etap badań przesiewowych przed przystąpieniem do mysich modeli ksenoprzeszczepów.

Opracowaliśmy usprawniony przepływ pracy dla ksenoprzeszczepu komórek białaczki pierwotnego pacjenta do danio pręgowanego i wykonywania wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków z automatycznym obrazowaniem i kwantyfikacją, które mogą być stosowane do innych pierwotnych komórek nowotworowych pacjenta lub linii komórek rakowych. W tym procesie pracy wykorzystano jednostkę obrazowania wyposażoną w mikroskop fluorescencyjny i automatyczny próbnik w celu ulepszenia obecnych metod standaryzacji i kwantyfikacji oraz stanowi zautomatyzowaną alternatywę dla poprzednich, bardziej pracochłonnych metod ilościowego określania masy guza in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kentucky (protokół 2015-2225). Próbki od pacjentów zostały pobrane w ramach Institutional Review Board Uniwersytetu Kentucky (protokół 44672). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzane zgodnie z tym protokołem muszą zostać zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania.

1. Rozmrażanie komórek ostrej białaczki limfoblastycznej u pacjenta

pierwotnego
  1. Rozmrozić pierwotne komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) pacjenta z zamrożonego materiału w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Natychmiast po rozmrożeniu komórek przenieś komórki w pożywce do zamrażania (90% FBS + 10% dimetylosulfotlenku [DMSO]) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z powolnym pipetowaniem, unikając pęcherzyków powietrza. Dodać 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki do rozmrażania o temperaturze 37 °C (25% płodowej surowicy bydlęcej [FBS] w zmodyfikowanej pożywce Dulbecco firmy Iscove [IMDM]) kroplami (około 2-3 s na ml) do komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
    UWAGA: PBMC pobrano z próbek krwi pacjenta w momencie diagnozy. Płaszcz kożuchowy oddzielono przez odwirowanie gęstości, a komórki przemyto 2x w RPMI 1640 + 10% FBS. Komórki policzono i zamrożono 107 komórek na kriowial w 1 ml pożywki do zamrażania i przechowywano w temperaturze -80 °C.
  2. Odwirować komórki przy 100 x g przez 10 minut i odessać pożywkę z osadu komórkowego. Powtórz dodawanie pożywki do rozmrażania, odwirowywanie i aspirację jeszcze jeden raz, aby usunąć wszelkie pozostałości DMSO.
  3. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i usunąć 10 μl w celu zliczenia na automatycznym liczniku komórek lub hemocytometrze. Dodać 10 μl błękitu trypanowego do 10 μl komórek usuniętych do zliczenia. Policz liczbę komórek na ml i zapisz, aby później obliczyć objętość do ponownego zawieszenia komórek do ksenoprzeszczepu (patrz krok 2.5).
    nuta: Zazwyczaj ksenoprzeszczepuje się 500 komórek na larwę danio pręgowanego. Na przykład 5 x 105 komórek jest potrzebnych do wstrzyknięcia 1,000 danio pręgowanego. Żywotność powinna wynosić >85% do wykorzystania do ksenoprzeszczepu. W tym eksperymencie żywotność komórek wynosiła 96% po rozmrożeniu, oceniana za pomocą barwienia błękitem trypanowym.

2. Fluorescencyjne znakowanie komórek za pomocą DiI

  1. Odwirować żądaną liczbę komórek w 5 ml PBS przy 200 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Zabarwić minimum 2 x 106 komórek w przypadku zbrylania się lub problemów z obciążeniem igły podczas wstrzykiwania.
  2. Sporządzić roztwór barwiący nadchloranu 1,1'-dioktadecylo-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny (DiI) (5 ml PBS zawierającego 4 μl na ml barwnika DiI, tabela materiałów) i ponownie zawiesić osad komórek w roztworze barwiącym.
    nuta: Gęstość komórek nie powinna przekraczać 2 x 106 komórek/ml po ponownym zawieszeniu w roztworze barwiącym.
  3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w temperaturze 37 °C w osłonie przed światłem przez 20 minut, delikatnie wirować, a następnie inkubować komórki na lodzie przez 15 minut, chroniąc je przed światłem.
  4. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Przemyć komórki 5 ml PBS, odwirować przy 200 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Powtórz mycie, odwirowanie i aspirację jeszcze jeden raz.
  5. Zawieś komórki w 1 μl PBS na 250 000 żywych komórek i przenieś do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Utrzymuj zawieszone komórki na lodzie w ciemności i natychmiast kontynuuj mikroiniekcje.
    nuta: Gwarantuje to, że 500 komórek pacjenta jest wstrzykiwanych do danio pręgowanego za pomocą każdej pompy iniekcyjnej o objętości 2 nL.

3. Mikroiniekcja larw danio pręgowanego

UWAGA: Mikroiniekcje powinny być zakończone w ciągu 1−3 godzin od barwienia, aby poprawić żywotność komórek.

  1. Przed barwieniem komórek i wstrzyknięciem przygotuj płytki agarozowe do wstrzykiwań, wlewając 25 ml 3% agarozy w 1x Tris/boran/EDTA (TBE) do szalki Petriego i pozwól jej zestalić się. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
  2. Również przed barwieniem komórek i wstrzyknięciem należy zdechorionować 2 dpf danio pręgowanego za pomocą kleszczy pod mikroskopem preparacyjnym. W celu ręcznej dechorionacji pociągnij kleszczemi z przeciwległych końców ochronnej kosmówki danio pręgowanego, aż kosmówka się rozerwie i danio pręgowany stanie się nieotoczony10.
    nuta: Dechorionację można również wykonać za pomocą leczenia enzymatycznego pronazą, jak opisano wcześniej10. Kacper (roy-/-; Do tych eksperymentów użyto danio pręgowanego z masy perłowej11. Do ksenoprzeszczepu można wykorzystać każdy szczep larwalny danio pręgowanego. Jeśli pigment zakłóca obrazowanie lub wizualizację, leczenie propylotiouracylem (PTU) może być zastosowane w celu zablokowania syntezy melaniny, jeśli optycznie czyste szczepy danio pręgowanego nie są dostępne12.
  3. Igły należy schłodzić w temperaturze 4 °C lub na lodzie, aby zapobiec zbrylaniu się komórek podczas mikroiniekcji. Załaduj 5 μl barwionych komórek do schłodzonej, nienitkowej igły ze szkła borokrzemianowego za pomocą końcówek do pipet do mikroładowarek.
    nuta: Metody ustawiania mikrowtryskiwaczy i igieł zostały wcześniej opublikowane13.
  4. Załadować igłę do ramienia mikrowtryskiwacza. Skosować końcówkę igły za pomocą sterylnej żyletki. Zmierz wielkość kropel w oleju mineralnym za pomocą mikrometru stopniowego, utrzymując objętość kropli na stałym poziomie 2 nL (~0,15 mm średnicy) przez cały czas.
  5. Użyj 350 μl 4 mg / ml tricaine-S do znieczulenia ~ 30 zdechorionowanych 2 dpf danio pręgowanego na szalce Petriego zawierającej 25 ml pożywki E3. Po ~1 min przenieś znieczulone larwy na płaską płytkę iniekcyjną (3% agarozy na szalce Petriego) i wstrzyknij larwy jedną pompą barwionych komórek w pożądane miejsce wstrzyknięcia (np. żółtko lub osierdzie; patrz Rysunek 2A,B).
    nuta: Miejsce wstrzyknięcia należy wybrać w oparciu o cel eksperymentu. Najczęstszym miejscem wstrzyknięcia jest żółtko. Aby komórki krążyły w krwiobiegu, jako miejsca wstrzyknięcia można wykorzystać osierdzie, przewód Cuviera, przestrzeń okołooczodołową lub przestrzeń zaoczodołową. Można również wykorzystać ortotopowe miejsca wstrzyknięć, takie jak mózg.
  6. Zmyć larwy z płytki iniekcyjnej na 10 cm2 szalkę Petriego (30 larw na płytkę) zawierającą pożywkę E314 bez błękitu metylenowego i inkubować w temperaturze 28 °C przez 1 godzinę okresu odbudowy. Kontynuować wstrzykiwanie, aż zostanie wstrzyknięta żądana liczba larw.
    nuta: Najlepiej wstrzyknąć 2-2,5-krotnie liczbę larw potrzebną do eksperymentów. Nastąpi pewne wymieranie larw z powodu stresu spowodowanego wstrzyknięciem i podwyższoną temperaturą inkubacji. Zazwyczaj, po ćwiczeniu z tą techniką, 800-1,500 larw danio pręgowanego może zostać wstrzykniętych przez jedną osobę w ciągu 1-3 godzin, kiedy należy wstrzyknąć barwione komórki.
  7. Przenieść płytki z wstrzykniętymi larwami do inkubatora o temperaturze 34 °C. Nie umieszczaj szalek Petriego larw bezpośrednio na metalowej półce w inkubatorze, aby zapobiec przegrzaniu wody E3. Na przykład umieść pustą szalkę Petriego między półką a szalką Petriego z larwami, aby działała jako bufor. Martwe larwy danio pręgowanego należy usunąć po 24 i 48 godzinach od wstrzyknięcia (hpi).

4. Ustawianie ekranu narkotykowego z ksenoprzeszczepowanym danio pręgowanym

  1. Przy 48 hpi przesiewaj larwy danio pręgowanego pod kątem fluorescencji/wszczepienia guza i zdrowia (Rysunek 2C,D). Usuń martwego lub zniekształconego danio pręgowanego i wybierz danio pręgowanego z podobnym szczepieniem (Rysunek 2C, D, 1−3 i 1'−3'). Usuń nieszczepionego danio pręgowanego (Rysunek 2C,D, 5 i 5').
    1. W przypadku ryb z wstrzykiwanym żółtkiem należy usunąć ryby, w których nie widać granic żółtka wokół wszczepionej masy komórkowej (Rysunek 2C, 4), ponieważ utrudnia to kwantyfikację. W przypadku ryb, u których wstrzyknięto osierdzie, należy usunąć ryby, w których wstrzyknięta masa komórkowa wdziera się do woreczka żółtkowego (Rysunek 2D, 4').
  2. Dodaj danio pręgowanego do 96-dołkowej płytki. Aby to zrobić, odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 200 μl, wystarczająco dużą, aby zmieścił się w niej danio pręgowany o napięciu 4 dpf. Odessać 150 μl pożywki E3 z jednym daniem pręgowanym z płytki za pomocą pipety P200 i dodać do pustego dołka płaskodennej płytki 96-dołkowej.
  3. Rozcieńczyć badany lek w wymaganej objętości pożywki E3 w 150 μl na studzienkę. Przygotuj lek w stężeniu 2-krotnym od pożądanego. Na przykład przygotuj 20 μM leku w E3, jeśli pożądane stężenie końcowe wynosi 10 μM, ponieważ połowa całkowitej objętości w każdym dołku składa się z roztworu leku. W przypadku grupy kontrolnej DMSO dodać DMSO w tej samej objętości co lek.
  4. Dodać 150 μl 2x rozcieńczonego roztworu leku do każdej studzienki zawierającej larwy danio pręgowanego w 150 μl E3, aby uzyskać końcową objętość 300 μl z 1x roztworem leku na studzienkę.
  5. Inkubować płytkę w temperaturze 34 °C. Codziennie sprawdzać, czy nie ma martwych danio pręgowanego. Po 2 dniach, jeśli jest to pożądane, odświeżyć lek, usuwając 200 μl płynu z każdej studzienki 96-dołkowej płytki i zastępując 200 μl 1x rozcieńczonego roztworu leku lub DMSO w pożywce E3.
    nuta: Najlepsze wyniki uzyskano po 3 dniach leczenia farmakologicznego w tym eksperymencie; Jednak długość leczenia farmakologicznego może wahać się od 2 do 4 dni i może wymagać optymalizacji w zależności od przeprowadzanego eksperymentu lub stosowanych leków.

5. Obrazowanie ksenoprzeszczepowanego danio pręgowanego za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, urządzenia do obrazowania wyposażonego w urządzenie do obrazowania i automatyczny próbnik

  1. Przygotować 1 l świeżej 4 mg/ml trikainy i 1,5 l pożywki E3. Napełnij butelkę z podłożem 1 z pożywką E3, a butelkę z podłożem 2 z trikainą.
  2. Usuń wszystkie niechciane kanały fluorescencyjne w oprogramowaniu do obrazowania i dodaj żądany kanał (DiI w tym eksperymencie). Sprawdź żądany kanał fluorescencyjny, ponieważ zdjęcie zostanie wykonane tylko dla kanałów ze znacznikiem wyboru. Wybierz także sposób robienia zdjęć (stosy z, automatyzacja, pętle szeregowe itp.).
    nuta: W tym eksperymencie ostrość została ręcznie ustawiona dla każdej sfotografowanej ryby, aby uzyskać jak największą liczbę obrazów z optymalną ostrością.
  3. Zobrazuj rybę kontrolną DMSO przed rybą leczoną lekiem, aby można było ustawić odpowiedni czas ekspozycji w oprogramowaniu do obrazowania. Po ustawieniu ekspozycji nie zmieniaj czasu ekspozycji na czas trwania eksperymentu.
    nuta: Ostrość można regulować ręcznie dla każdego danio pręgowanego, aby upewnić się, że nie ma nieostrych obrazów, lub w przypadku w pełni zautomatyzowanego obrazowania, ta sama ostrość może być używana między rybami, które nie są ostrzone obrazy, które są odrzucane, lub rybami ponownie obrazowanymi przed wykonaniem analizy. Co więcej, eksperyment ten można przeprowadzić przy użyciu dowolnego obrazowania fluorescencyjnego, a następnie określić ilościowo fluorescencję za pomocą oprogramowania ImageJ.

6. Kwantyfikacja fluorescencji za pomocą ImageJ

  1. Otwórz oprogramowanie ImageJ.
  2. Przejdź do punktu menu Plik | Otwórz i wybierz żądany plik .czi. Oprogramowanie wyświetli okno opcji importu.
    1. Aby wyświetlić stos, wybierz pozycję Hyperstacks, zaznacz opcję Otwórz pliki pojedynczo, zaznacz opcję Automatyczne skalowanie i zaznacz opcję Podziel kanały. W polu opcji koloru wybierz opcję Kolorowane.
  3. Kliknij Wtyczki | Makra | Rekord.
  4. Kliknij Obraz | Dostosuj | Próg. Wybierz typ obrazu jako czerwony z menu rozwijanego po prawej stronie okna progu. Dostosuj minimalny próg, aż oprogramowanie będzie podświetlać tylko obszary z fluorescencją (Rysunek 3A) i kliknij przycisk Zastosuj. Oprogramowanie przekonwertuje zdjęcie na czarno-białe, z wybranym obszarem w kolorze czarnym.
    nuta: Użyj tego samego progu dla każdego obrazu na ekranie leku, aby wyniki były ustandaryzowane i porównywalne.
  5. Kliknij pozycję Analizuj | Miara. Oprogramowanie wyświetli okno wyników zawierające obszar fluorescencyjny dla tego obrazu.
  6. Kliknij przycisk Create (Utwórz) w oknie Macro Recorder (Rejestrator makr). Spowoduje to otwarcie nowego okna z kodem makra. Zaznacz wszystkie żądane obrazy do analizy i otwórz je tak, jak w kroku 6.2.
  7. Wybierz opcję Uruchom w oknie z makrem. Okno wyników będzie teraz zawierać obszar dla każdego obrazu.
    nuta: Analizę obrazu można przeprowadzić indywidualnie bez nagrywania i uruchamiania makra, a także poprzez powtarzanie powyższych kroków dla każdego obrazu.
  8. Skopiuj zmierzone dane do arkusza kalkulacyjnego. Uśrednić całkowitą fluorescencję wszystkich próbek kontrolnych (DMSO). Oblicz procentową różnicę, korzystając z następującego wzoru: –[(średnia powierzchnia DMSO – obszar eksperymentalny)/średnia powierzchnia DMSO] x 100% (Rysunek 3B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z opisanym powyżej protokołem, w żółtku i osierdziu rybek zebrafish wykonano ksenoprzeszczepy z pierwotnych PBMC pacjenta, które zostały pierwotnie wyizolowane od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną z komórek T (T-ALL) w momencie diagnozy i zamrożone jako żywa próbka. W 48. godzinie po infekcji (hpi) przefiltrowano ksenoprzeszczepione ryby pod kątem obecności fluorescencyjnie znakowanych komórek nowotworowych (Rycina 2C,D) i poddano je leczeniu chemioterapeuty...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu wykazaliśmy standaryzowaną metodę rozmrażania i wstrzykiwania pierwotnych komórek białaczkowych pacjenta do danio pręgowanego jako modelu ksenoprzeszczepu. Opracowaliśmy również protokół wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków u ksenografowanych ryb danio pręgowanego przy użyciu urządzenia do obrazowania wyposażonego w mikroskop fluorescencyjny i automatycznego próbnika. Wcześniej ksenoprzeszczepy były zgłaszane z ludzkimi liniami komórkowymi, a kwantyfikacja ksenoprzeszczepowanych guzów w sposób wyso...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez V Foundation V Scholar Award oraz NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (dla J.S. Blackburna) i NIH Training Grant T32CA165990 (dla M.G. Haney).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x Koncentrat płynny TBEVWR0658-5L
Płytka 96-dołkowa, płaska dnoCELLTREAT229195VAST jest kompatybilna z różnymi standardowymi lub głębokimi płytkami 24, 48 lub 96-dołkowymi
AgarozaFisher ScientificBP160-500
Kapilara ze szkła borokrzemianowego bez filamentuSutter Instrument CompanyB100-50-10
DeksametazonEnzo Life SciencesBML-EI126-0001
DMSOSigma-AldrichD2438-5X10ML
E3 podłożeN/A5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4
Femtotips Końcówki do mikroładowarekEppendorf930001007
Płodowa surowica bydlęca (Premium inaktywowana termicznie)Atlanta BiologicalsS11150H
ImageJFIDŻINIE DOTYCZY
Zmodyfikowany Iscove's Dulbecco's MediumSTEMCELL Technologies36150
Próbnik dużych cząstek (LP) UnionBiometricaN/AAutomatyczny próbnik http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8
Olej mineralny MetotreksatSigma-AldrichA6770-10MG
Fisher ScientificBP26291
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x)Caisson labsPBL06-6X500ML
Mikrometr stopniowy (400-stopniowy)Hausser Scientific400-S
Tricaine-SPentair AquaticTRS1
Trypan BlueThermo FisherT10282
VAST BioimagerUnion BiometricaN/ Mikroskop wyposażony we fluorescencje https://www.unionbio.com/vast/
Vincristine SulfateEnzo Life SciencesBML-T117-0005
Vybrant DiI StainThermo FisherV22885
https://imagej.net/Fiji

Bibliografia

  1. Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).
  2. Topczewska, J. M., et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness. Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).
  3. Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).
  4. Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).
  5. Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. 15 years of zebrafish chemical screening. Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).
  6. Ghotra, V. P., et al. Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination. PLoS One. 7 (2), 31281(2012).
  7. Chang, T. -Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).
  8. Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).
  9. Pulak, R. Tools for automating the imaging of zebrafish larvae. Methods. 96, 118-126 (2016).
  10. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).
  11. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  12. Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay. Bio-Protocol. 8 (18), (2018).
  13. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).
  14. Cold Spring Harbor Laboratory Press. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
  15. Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).
  16. Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
  17. Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
  18. Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
  19. Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Ksenoprzeszczep u rybek zebrafishmikroskopia fluorescencyjnaobrazowanie zautomatyzowanekwantyfikacja powierzchni guzaengraftment komórek nowotworowychanaliza odpowiedzi na lekiprotokół mikroiniekcjiwysokoprzepustowe przesiewanie
Badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.