Artykuł metodologiczny

Separacja bioaktywnych małych cząsteczek, peptydów ze źródeł naturalnych i białek od drobnoustrojów metodą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (IEF)

DOI:

10.3791/61101

⸱

14 czerwca 2020

 ,  ,  , 
1Division of Biology, Kansas State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem jest frakcjonowanie i izolowanie bioaktywnych małych cząsteczek, peptydów z złożonego ekstraktu roślinnego oraz białek z drobnoustrojów chorobotwórczych za pomocą metody ogniskowania izoelektrycznego w fazie ciekłej (IEF). Ponadto zidentyfikowano oddzielone cząsteczki i potwierdzono ich bioaktywność.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naturalne produkty pochodzące z roślin i mikrobów są bogatym źródłem bioaktywnych molekuł. Przed ich użyciem aktywne cząsteczki z ekstraktów złożonych muszą zostać oczyszczone do dalszych zastosowań. W tym celu dostępne są różne metody chromatograficzne, jednak nie wszystkie laboratoria mogą sobie pozwolić na metody o wysokiej wydajności, a izolacja od złożonych próbek biologicznych może być trudna. Tutaj pokazujemy, że preparatywne ogniskowanie izoelektryczne w fazie ciekłej (IEF) może oddzielać cząsteczki, w tym małe cząsteczki i peptydy, od złożonych ekstraktów roślinnych, na podstawie ich punktów izoelektrycznych (pI). Zastosowaliśmy tę metodę do złożonego frakcjonowania i charakterystyki próbek biologicznych. Jako dowód słuszności koncepcji, frakcjonowaliśmy ekstrakt roślinny Gymnema sylvestre, izolując rodzinę małych cząsteczek saponin terpenoidowych i peptyd. Wykazaliśmy również skuteczną separację białek mikrobiologicznych przy użyciu grzyba Candida albicans jako systemu modelowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczyszczanie biomolekuł ze złożonych próbek biologicznych jest niezbędnym i często trudnym krokiem w eksperymentach biologicznych1. Ogniskowanie izoelektryczne (IEF) dobrze nadaje się do separacji złożonych biomolekuł w wysokiej rozdzielczości, w których amfolity nośnikowe przemieszczają się zgodnie ze swoim ładunkiem i ustalają gradient pH w polu elektrycznym3. Pierwszy komercyjny amfolit dla IEF został opracowany przez Olofa Vesterberga w 1964 roku i opatentowany4,5. Amfolity nośne to alifatyczne cząsteczki kwasu oligo-aminooligokarboksylowego o różnej długości i rozgałęzieniu6. Następnie Vesterberg i inni udoskonalili amfolity nośnikowe w celu ich rozszerzonego zastosowania w rozdzielaniu biomolekuł6,7.

Metody rozdzielania biomolekuł obejmują elektroforezę w żelu agarozowym i poliakrylamidowym, dwuwymiarową elektroforezę żelową (2-DE), ogniskowanie izoelektryczne, elektroforezę kapilarną, izotachotezę i inne techniki chromatograficzne (np. TLC, FPLC, HPLC)2. IEF w fazie ciekłej wykonywany w instrumencie zwanym "Rotofor" został wynaleziony przez Milana Bier8. Był pionierem koncepcji i konstrukcji tego instrumentu i wniósł duży wkład w teorię migracji elektroforetycznej. Jego zespół opracował również matematyczny model procesu separacji elektroforetycznej na potrzeby symulacji komputerowych9.

Aparat IEF w fazie ciekłej to poziomo obracająca się cylindryczna komórka składająca się z nylonowego rdzenia podzielonego na 20 porowatych komór i ceramicznego pręta chłodzącego wodę w obiegu. Porowate komory umożliwiają cząsteczkom migrację przez fazę wodną między elektrodami i umożliwiają pobieranie oczyszczonych próbek w próżni w postaci frakcji. Ten system oczyszczania może zapewnić do 1000-krotnego oczyszczenia określonej cząsteczki w ciągu <4 godzin. Cenną cechą tego instrumentu jest to, że może być stosowany jako pierwszy krok do oczyszczania ze złożonej mieszaniny lub jako ostatni krok do osiągnięcia czystości10. Jeśli cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest białkiem, kolejną zaletą jest to, że jej natywna konformacja zostanie zachowana podczas separacji.

Szeroko opisywane stosowanie IEF w fazie ciekłej do oczyszczania białek, enzymów i przeciwciał6,10,11,12,13,14. Tutaj opisujemy zastosowanie tego podejścia do oddzielania i oczyszczania małych cząsteczek i peptydów z rośliny leczniczej Gymnema sylvestre. Protokół ten pomoże naukowcom skoncentrować i oczyścić aktywne małe cząsteczki z ekstraktu roślinnego do dalszych zastosowań przy niskich kosztach. Ponadto pokazujemy również, że wzbogacenie białek ze złożonego ekstraktu białkowego z Candida albicans fungus15 w tym systemie opartym na IEF jako drugi przykład.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja i wstępne uruchomienie standardowej jednostki IEF w fazie ciekłej

  1. Elektrody IEF w fazie ciekłej (przycisk anody w kolorze czerwonym i przycisk katody w kolorze czarnym) należy zmontować z odpowiednimi membranami wymiennymi zgodnie z instrukcją obsługi (patrz tabela materiałów). Zrównoważyć membrany anionowymienne z 0,1 M NaOH, a membrany kationitowe z 0,1 M H3PO4 co najmniej przez 16 godzin, gdy stosowane są nowe membrany.
    1. Przechowuj membrany w elektrolitach (0,1 M NaOH lub 0,1 M H3PO4) między cyklami i nie pozwól im wyschnąć.
  2. Zamontuj wewnętrzną i zewnętrzną część elektrody, ustawiając trzy podłużne otwory w uszczelkach jonowymiennych. Napełnij elektrody odpowiednimi elektrolitami (~25-30 ml), aby zapobiec wysychaniu ich membran.
    1. Nie dodawaj nadmiaru (więcej niż 1/3 objętości komory elektrody) elektrolitu, który może wytworzyć ciśnienie wewnątrz elektrody i spowodować wyciek.
  3. Zakryj porty pobierania próbek taśmą uszczelniającą, która jest dostarczana z częściami montażowymi przyrządu (patrz Tabela materiałów). Po stronie portów do pobierania próbek można rozpoznać po dwóch pionowych metalowych kołkach wyrównujących. Alternatywnie użyj standardowej taśmy uszczelniającej, aby uszczelnić porty.
  4. Zamontuj kolejno wszystkie części zespołu komory ostrości (elektroda anodowa, rdzeń membrany nylonowej, komora ostrości i elektroda katodowa) nad ceramicznym palcem chłodzącym.
  5. Napełnij komorę ostrości wstępnie schłodzoną wodą destylowaną (całkowita objętość 60 ml dla standardowej celi IEF) za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml.
  6. Podłącz przyrząd IEF w fazie ciekłej do krążącej wody chłodzącej o temperaturze 4 ºC i uruchom urządzenie przy 15 W i 3,000 V przez 3-5 minut lub do momentu, gdy napięcie się ustabilizuje.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, w ciągu jednej minuty voltage osiągnie maksymalne ustawione wartości. Wstępne uruchamianie wodą destylowaną pomaga usunąć resztki jonów z komory ogniskowania i rdzenia membrany nylonowej.
  7. Wyłącz źródło zasilania i usuń wodę z ogniwa za pomocą kolektora frakcji. Ponownie uszczelnij otwory zbiorcze taśmą uszczelniającą.
    UWAGA: Teraz przyrząd jest gotowy do użycia w kroku 2.4.

2. Separacja i oczyszczanie małych cząsteczek i peptydów z ekstraktu z Gymnema sylvestre

  1. Odmierzyć 0,6 g ekstraktu roślinnego i rozpuścić w wodzie destylowanej (60 ml), mieszając w bułce przez 5 min.
    UWAGA: Każda próbka biologiczna, która jest rozpuszczalna i wolna od soli, może być użyta do separacji i oczyszczania za pomocą tego przyrządu IEF. Próbki o stężeniu soli buforowej do 10 mM mogą być używane z nieznacznie zmniejszoną rozdzielczością. Interesuje nas rodzina saponin związków triterpenoidowych, kwasów gymnemowych, z rośliny G. sylvestre ze względu na ich unikalne właściwości przeciwgrzybicze16.
  2. Odwirować rozpuszczony ekstrakt roślinny o sile 10 000 x g przez 5 minut, aby usunąć nierozpuszczalne cząstki.
  3. Przenieść supernatant (~60 ml) do probówki wirówkowej o pojemności 80 ml i wymieszać go z 0,6 ml amholytu (pH 3-10) do 1% (v/v).
  4. Wykonaj kroki 1.1 – 1.7, aby przygotować jednostkę IEF w fazie ciekłej. Komora jest teraz gotowa do załadowania próbki.
  5. Użyj strzykawki o pojemności 50 ml z igłą o końcu 1-1/2 cala 19 G (w zestawie z instrumentem) i załaduj przygotowaną próbkę amfoliitem (łącznie 60 ml) do celi przez porty do pobierania próbek.
  6. Usuń pęcherzyki powietrza z sample cela, wyjmując celę skupiającą ze stojaka i stukając w komorę elektrody, aby usunąć pęcherzyki. Obecność pęcherzyków powietrza spowoduje wahania napięcia i prądu oraz wpłynie na przebieg.
  7. Podłączyć urządzenie do wodnego płynu chłodzącego (4 °C) i rozpocząć frakcjonowanie przy zasilaniu ze stałą mocą 15 W.
  8. Uruchom aparat na 3 godziny lub do momentu, gdy napięcie osiągnie stałą wartość.
    UWAGA: Gdy próbka zacznie się ogniskować, napięcie zacznie stopniowo rosnąć, aż osiągnie stałą wartość.
  9. Po zakończeniu pracy przygotuj się do zebrania frakcji w skrzynce zbiorczej (zawierającej 20 plastikowych rurek o wymiarach 12 mm x 75 mm, objętości 5-6 ml) podłączonej do pompy próżniowej, naciskając przycisk zbioru ON w jednostce IEF.
  10. Dopasuj kołki zbierające 20 do portów 20 odbiorników komórki ostrości, która jest uszczelniona taśmą.
    11. Przepchnij kołki zbierające przez taśmę uszczelniającą i jednocześnie włącz pompę próżniową (patrz Rysunek 2 B, 2C i 2D).
  11. UWAGA: Za każdym razem do probówek będzie zbieranych około 3 ml frakcji z każdej komory. Frakcje mogą być wykorzystywane do późniejszych zastosowań (SDS-PAGE do oznaczania ilościowego peptydów, TLC i testu biologicznego dla małych cząsteczek).

3. Separacja i oczyszczanie białek z C. albicans

  1. Hoduj pojedynczą kolonię C. albicans w bulionie drożdżowo-peptonowo-dekstrozowym (YPD) class16 w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem (200 obr./min) przez noc.
  2. Zebrać komórki drożdży przez odwirowanie (10 000 x g przez 5 minut).
  3. Zawiesić komórki drożdży C. albicans w buforze węglanu amonu (1,89 g/l) zawierającym 1% (v/v) beta-merkaptoetanolu (β-ME) (1/10 objętości hodowli) i obracać w rurze rolkowej przez 1 godzinę w temperaturze 5 °C15.
  4. Usunąć komórki drożdży przez odwirowanie (10 000 x g przez 5 min) i przefiltrować ekstrakt białkowy przez filtr 0,45 μm.
    UWAGA: Próbki białek z cytozolu, błony lub ściany komórkowej C. albicans można przygotować i wykorzystać do frakcjonowania IEF. Podobnie białka pochodzące z bakterii lub innych próbek biologicznych (ekstrakt z tkanek zwierzęcych) mogą być stosowane po usunięciu soli odpowiednimi metodami (np. przez dializę lub za pomocą kolumn odsalających).
  5. Dializować ekstrakt białkowy w rurze dializacyjnej (3 500 MWCO) w wodzie przez 15 godzin w temperaturze 4 °C. Oszacuj stężenie białka metodą wiązania barwnika Bradforda, używając gamma globuliny jako standardu17.
  6. Do frakcj>C. albicans przyłączonych do glukanu, należy użyć amfolitu o wąskim zakresie (pH 5-8). Można zastosować stężenie amfolitu do 2%, jeśli stężenie białka w próbce jest większe niż 2 mg/ml; Minimalizuje to agregację białek podczas ustawiania ostrości. Próbki, amfolity i wodę należy zawsze wstępnie schłodzić na lodzie.
  7. Powtórz kroki 1.1-1.7, aby przygotować jednostkę IEF i użyj roztworu białkowego z kroku 3.6, aby załadować do komórki IEF.
  8. Po 4 godzinach ogniskowania przy stałym 15 W, zbierz frakcje białkowe (1-20) zgodnie z powyższym opisem (kroki 2.9-2.11) i przeanalizuj na 12,5% SDS-PAGE po redukcji i zagotowaniu próbek białka18.
  9. Uwolnione białka należy wybarwić, barwiąc żel SDS-PAGE roztworem niebieskiego barwnika Coomassie (0,01%) przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej na bujaku. Usunąć żel i zarejestrować obraz żelu za pomocą urządzenia do obrazowania żelu.
    UWAGA: Niebieski barwnik Coomassie (0,01%) można przygotować przez zmieszanie 0,01 g niebieskiego proszku Coomassie w roztworze odbarwiającym zawierającym 40% metanolu i 10% kwasu octowego.

4. Bioaktywność oczyszczonych małych cząsteczek z ekstraktu roślinnego Gymnema sylvestre

  1. Hoduj C. albicans w komórkach drożdży, jak w kroku 3.1.
  2. Aby przygotować zawiesinę komórkową, należy rozcieńczyć nocną hodowlę komórek drożdży C. albicans (rozcieńczenie 1/1000) na świeżej pożywce do hodowli komórkowych RPMI uzupełnionej 50 mM glukozy.
    UWAGA: C. albicans przekształca się ze wzrostu drożdży w strzępki w warunkach indukowania strzępek (RPMI w temperaturze 37 °C). Wykazano, że małe cząsteczki kwasu gymnemowego hamują przekształcanie komórek drożdży w strzępki w warunkach indukowania strzępek16. Naszym celem było ustalenie, czy ekstrakt z G. sylvestre oddzielony fazą ciekłą i IEF zawiera te bioaktywne cząsteczki.
  3. Z przygotowanej zawiesiny komórkowej dodać 90 μl do każdego dołka 96-dołkowej płytki.
  4. Z każdej frakcji (1-20 zebranych frakcji ekstraktu G. sylvestre uzyskanego z IEF w fazie ciekłej, Rysunek 4), dodaj 10 μl do studzienek z 90 μl powyższej zawiesiny komórek (krok 4.2). Wykonać test w trzech egzemplarzach.
  5. Dodaj 10 μl wody zawierającej amfoliten (1%) do oddzielnych studzienek z 90 μl zawiesiny komórek drożdży C. albicans jako kontroli ujemnej.
    UWAGA: Amfolity mają potencjał bioaktywny, dlatego ważne jest, aby uwzględnić kontrolę amfolitu podczas wykonywania dowolnego testu biologicznego19.
  6. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C przez 12 godzin i obserwować hamowanie konwersji drożdży C. albicans do strzępek pod mikroskopem16. Określ również procent zahamowania konwersji drożdży na strzępki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Separacja i oczyszczanie małych cząsteczek i peptydów z ekstraktu roślinnego Gymnema sylvestre
Stosując preparatywną metodę IEF w fazie ciekłej, frakcjonowaliśmy ekstrakty z roślin leczniczych i białka powierzchniowe komórek z ludzkiego grzyba chorobotwórczego, C. albicans. Schemat tych protokołów frakcjonowania jest pokazany w Rysunek 1.

Z 20 frakcji ekstraktu z G. sylvestre uzyskanego z IEF w fazie ciekłej, stwierd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Małe cząsteczki pochodzące z naturalnych źródeł produktów (np. roślin) zawierają złożone metabolity wtórne, które są bardzo zróżnicowane pod względem struktury chemicznej. Uważa się, że biorą udział w mechanizmach obronnych roślin. Ponadto polipeptydy są również obecne w tkankach roślinnych22. Te małe cząsteczki produktów naturalnych są bogatym źródłem cząsteczek testowych do odkrywania i opracowywania leków. Jednak trudne i żmudne metody wymagane do ich izolacji i oczyszczenia ograniczają ich zas...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną zadeklarować brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni za źródła finansowania z Wydziału Biologii i Centrum Badań nad Rakiem Johnsona dla nagród BRIEF i IRA, odpowiednio dla GV. Dziękujemy również za przyznanie RV nagrody podoktorskiej K-INBRE. Prace te były częściowo wspierane przez Institutional Development Award (IDeA) przyznaną przez National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health w ramach grantu nr P20 GM103418. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych lub Narodowych Instytutów Zdrowia. Dziękujemy anonimowym recenzentom za pomocne komentarze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,45 &mikro; m filtr strzykawkowyFisher scientfic09-720-004
2-MerkaptoetanolSigmaM3148
Węglan amonuSigma-Aldrich207861-500
Bio-Lyte 3/10 AmfoliteBio-Rad163-1113
Bio-Lyte 5/8 AmpholyteBio-Rad163-1192
Kompaktowy termostat niskotemperaturowyLauda - BrinkmannRM 6TUstaw chłodzenie wodne na 4 oC i może pracować nawet w 0 oC, ponieważ gdy przechodzi przez rdzeń chłodzący Rotofor, temperatura wody obiegowej będzie wynosić około 5 lub więcej w zależności od napięcia.
Coomassie Brilliant Blue RSigma-AldrichB7920
(3,500 MWCO)Spectrum Spectra/Por132112T
Ekstrakt z liści roślin Gymnema w proszku (>25% kwasów gymnemowych)Suan Farma, NJ USA
InkubatorTowarzysz laboratoryjnySI 300R
MikroskopLeicaDM 6B
Mini protean elektroforezaBio-Rad pH-metr
Mettler ToledoS20Przydatny do oznaczania pH frakcji Rotofor (IEF w fazie ciekłej)
RotoforBio-Rad170-2972http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instrukcja obsługi montażu urządzenia)
RPMI-1640 ŚredniHyCloneDH30255.01
taśmę uszczelniającąBio-Rad170-2960Taśma klejąca.
Wirówka Sorvall legend micro 17Thermo scientific75002432
płytka do hodowli tkankowej TPP -96 dołków płaskie dnoTP92696TPP
Rurki do dializy Można również zastosować

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jankowska, U., et al. Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).
  2. Pergande, M. R., Cologna, S. M. Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins. Proteomes. 5 (1), (2017).
  3. Stoyanov, A. IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution. Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).
  4. Vesterberg, O. A. Y. Method of Isoelectric Fractionation. , US3485736A (1964).
  5. Vesterberg, O., Svensson, H. Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins. Acta Chemica Scandinavica. 20 (3), 820-834 (1966).
  6. Righetti, P. G. Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. , Elsevier Science. 1(1983).
  7. Vesterberg, O. Synthesis and Isoelectric Fractionation of Carrier Ampholytes. Acta Chemica Scandinavica. 23, 2653-2666 (1969).
  8. Bier, M. Recycling isoelectric focusing and isotachophoresis. Electrophoresis. 19 (7), 1057-1063 (1998).
  9. Bier, M., Palusinski, O. A., Mosher, R. A., Saville, D. A. Electrophoresis: mathematical modeling and computer simulation. Science. 219 (4590), 1281-1287 (1983).
  10. Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure. Applied Biochemistry and Biotechnology. 69 (1), 11-16 (1998).
  11. Wagner, L., et al. Isolation of dipeptidyl peptidase IV (DP 4) isoforms from porcine kidney by preparative isoelectric focusing to improve crystallization. Biological Chemistry. 392 (7), 665-677 (2011).
  12. Hosken, B. D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing. Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).
  13. Yu, J. J., et al. Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice. Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).
  14. Riyong, D., et al. Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis. Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).
  15. Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins. Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).
  16. Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d'Enfert, C. Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans. PLoS One. 8 (9), 74189(2013).
  17. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  18. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  19. Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides. Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).
  20. Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre. Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).
  21. Craik, D. J. Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends. Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).
  22. Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif. Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).
  23. Stoecklin, W. Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).
  24. Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).
  25. Veerapandian, R., Vediyappan, G. Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms. Frontiers in Microbiology. 10, 2328(2019).
  26. Chaffin, W. L. Candida albicans cell wall proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rozdzia produkt w naturalnychfrakcjonowanie ekstraktu ro linnegoanaliza bia ek mikrobiologicznychroztw r amfolit wmonta elektrodyzbieranie frakcjianaliza SDS PAGEbarwienie b kitem Coomassiehamowanie przej cia dro d y w strz pki

Powiązane artykuły