Artykuł metodologiczny

Badanie indukowanej wcześniej fibrylami akumulacji α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych śródmózgowia myszy

11.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61118

⸱

16 sierpnia 2020

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Biotechnology, HiLIFE, University of Helsinki, 2Neuroscience Center, HiLIFE, University of Helsinki, 3Department of Brain Biochemistry, Maj Institute of Pharmacology, Polish Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania akumulacji neuronalnej α-synukleiny w pierwotnych mysich neuronach dopaminowych. Fosforylowane agregaty α-synukleiny w neuronach są indukowane za pomocą wstępnie uformowanych włókienek α-synukleinowych. Zautomatyzowane obrazowanie komórek znakowanych immunofluorescencyjnie i bezstronna analiza obrazu sprawiają, że ten solidny protokół nadaje się do średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, które hamują akumulację α-synukleiny.

Streszczenie

Celem tego protokołu jest stworzenie solidnego i powtarzalnego modelu akumulacji α-synukleiny w pierwotnych neuronach dopaminowych. W połączeniu z barwieniem immunologicznym i bezstronną automatyczną analizą obrazu, model ten pozwala na analizę wpływu leków i manipulacji genetycznych na agregację α-synukleiny w hodowlach neuronalnych. Pierwotne hodowle śródmózgowia stanowią wiarygodne źródło embrionalnych neuronów dopaminowych w dobrej wierze. W tym protokole charakterystyczna histopatologia choroby Parkinsona, ciała Lewy'ego (LB), jest naśladowana przez dodanie wstępnie uformowanych włókienek α-synukleiny (PFF) bezpośrednio do pożywek hodowlanych neuronów. Nagromadzenie endogennej fosforylowanej α-synukleiny w somie neuronów dopaminowych wykrywa się za pomocą barwienia immunologicznego już po 7 dniach od dodania PFF. Warunki hodowli komórkowej in vitro są również odpowiednie do stosowania i oceny metod leczenia zapobiegającego akumulacji α-synukleiny, takich jak leki małocząsteczkowe i czynniki neurotroficzne, a także wektory lentiwirusowe do manipulacji genetycznych (np. za pomocą CRISPR/Cas9). Hodowla neuronów na 96-dołkowych płytkach zwiększa solidność i moc konfiguracji eksperymentalnych. Pod koniec eksperymentu komórki są utrwalane paraformaldehydem do immunocytochemii i obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Wielospektralne obrazy fluorescencyjne uzyskuje się za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii 96-dołkowych płytek. Dane te są określane ilościowo (np. zliczając liczbę neuronów dopaminowych zawierających fosfo-α-synukleinę w dołku) za pomocą bezpłatnego oprogramowania, które zapewnia platformę do bezstronnej analizy fenotypu o wysokiej zawartości. Indukowane przez PFF modelowanie akumulacji fosforylowanej α-synukleiny w pierwotnych neuronach dopaminowych stanowi wiarygodne narzędzie do badania mechanizmów leżących u podstaw powstawania i eliminacji inkluzji α-synukleiny, z możliwością wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i analizy fenotypu komórkowego.

Wprowadzenie

Choroba Parkinsona (PD) jest zaburzeniem neurodegeneracyjnym charakteryzującym się śmiercią neuronów dopaminowych śródmózgowia w istocie czarnej (SN), późniejszą utratą tonu dopaminy w zwojach podstawy i wynikającym z tego upośledzeniem motorycznym1,2. Główną cechą histopatologiczną w mózgach pacjentów z chorobą Parkinsona są wewnątrzkomórkowe agregaty białkowo-lipidowe znajdujące się w somie neuronalnej, zwane ciałami Lewy'ego (LB) lub w neurytach, neuryty Lewy'ego (LN), zbiorczo znane jako patologia Lewy'ego3. Patologia Lewy'ego w mózgu wydaje się postępować wraz z postępującą chorobą Parkinsona, przypominającą rozprzestrzenianie się czynników chorobotwórczych poprzez połączenia neuronalne. Obfita patologia Lewy'ego występuje w neuronach dopaminowych w SN i komórkach w innych obszarach dotkniętych neurodegeneracją4. Jednak podczas progresji choroby, rozprzestrzenianie się i początek agregacji białek nie zawsze korelują ze śmiercią neuronów, a dokładny udział patologii Lewy'ego w śmierci neuronów jest nadal niejasny5.

Wykazano, że

LB i LN składają się ze składników błoniastych i białkowych3. Te pierwsze to fragmenty błony, struktury pęcherzykowe (ewentualnie lizosomy i autofagosomy) oraz mitochondria3. Ten ostatni składa się z co najmniej 300 różnych białek6. Charakterystyczne badanie przeprowadzone przez Spillantini et al.7 wykazało, że głównym składnikiem białkowym patologii Lewy'ego jest α-synukleina. Silnie eksprymowana w neuronach i związana z fuzją błony i uwalnianiem neuroprzekaźników, α-synukleina w patologii Lewy'ego występuje głównie w nieprawidłowo sfałdowanej formie fibryli amyloidowej, z której większość jest fosforylowana w Ser129 (pS129-αsyn)4,8.

Co ważne, wykazano również, że ze względu na swoje właściwości podobne do prionów, nieprawidłowo sfałdowana α-synukleina może odgrywać przyczynową rolę w powstawaniu patologii Lewy'ego4. Właściwości podobne do prionów nieprawidłowo sfałdowanej α-synukleiny wykazano zarówno w przypadku ekstraktów śródmózgowia od pacjentów, jak i egzogennie przygotowanych włókienek preformowanych α-synukleiną (PFF) w celu indukowania agregatów α-synukleiny w neuronach w hodowli i in vivo9,10. PFF stanowią wiarygodny i solidny model do badania progresji patologii α-synukleiny w neuronach dopaminowych. Kiedy PFF są stosowane do hodowanych neuronów pierwotnych lub wstrzykiwane do mózgu zwierzęcia, prowadzą do powstania inkluzji zawierających α-synukleinę w neurytach i soma11, które podsumowują wiele cech obserwowanych w patologii Lewy'ego. Obserwowane inkluzje są nierozpuszczalne w detergentach w Triton X, ubikwitynowane, barwione barwnikiem specyficznym dla amyloidu tioflawiną S i zawierają α-synukleinę hiperfosforylowaną w Ser12911,12. Co ważne, inkluzje te nie tworzą się u zwierząt z nokautem α-synukleiny11, co wskazuje na zależność ich powstawania od endogennej α-synukleiny.

Niemniej jednak, trudno jest bezpośrednio porównać inkluzje wywołane przez PFF i patologię Lewy'ego występujące u pacjentów z PD, ponieważ ludzkie LB i LN są bardzo niejednorodne3. Obserwowana niejednorodność patologii Lewy'ego może być spowodowana różnymi etapami powstawania, odmiennym położeniem anatomicznym lub różnicami w budowie nieprawidłowo sfałdowanej α-synukleiny inicjującej proces agregacji. Te same czynniki mogą wpływać na indukowane przez PFF inkluzje dodatnie pS129-αsyn. Rzeczywiście, niedawno wykazano, że indukowane przez PFF inkluzje dodatnie pS129-αsyn w pierwotnych kulturach neuronalnych reprezentują bardzo wczesne stadia patologii, które mogą dojrzeć do struktur bardzo przypominających LB po długotrwałym okresie inkubacji12,13.

Modelowanie wczesnego rozprzestrzeniania się i akumulacji nieprawidłowo sfałdowanej α-synukleiny za pomocą PFF jest cenne dla rozwoju leków, ponieważ rozprzestrzenianie się patologii Lewy'ego jest uważane za jeden z markerów wczesnego stadium choroby. W związku z tym terapie zapobiegające agregacji mogą być obiecujące w zatrzymywaniu lub spowalnianiu postępu choroby Parkinsona na bardzo wczesnych etapach. Obecnie prowadzonych jest kilka badań klinicznych mających na celu spowolnienie lub zatrzymanie akumulacji α-synukleiny14. Dla pacjentów w późniejszym stadium przeszczepienie progenitorów neuronów dopaminowych może być lepszą alternatywą leczenia15. Jednak patologia Lewy'ego została udokumentowana w przeszczepionych neuronach embrionalnych podczas analizy pośmiertnej mózgów pacjentów z chorobą Parkinsona 16,17, co również wskazuje na potrzebę ochrony przed akumulacją α-synukleiny.

In vitro, α-synukleinowe PFF są znane z indukowania agregacji w unieśmiertelnionych liniach komórkowych, lub częściej w pierwotnych neuronach hipokampa lub kory mózgowej gryzoni. Żaden z nich nie jest bliski rekapitulacji neuronów dopaminowych10. Hodowla tych neuronów wymaga gęstego posiewu pewnej liczby neuronów in vitro18. Aby osiągnąć wysoką gęstość posiewu przy użyciu ograniczonego materiału (np. pierwotnych neuronów dopaminowych), powszechnie stosuje się metodę hodowli mikrowyspowej. W hodowli mikrowyspowej komórki są początkowo umieszczane w małej kropli podłoża (zwykle kilka mikrolitrów) utrzymywanej razem przez napięcie powierzchniowe w środku dużej studni18. Po przyczepieniu się neuronów cała studzienka jest wypełniana pożywką, podczas gdy komórki pozostają zamknięte w dużej gęstości w małym obszarze poszycia. Oprócz osiągnięcia wysokiej gęstości posiewu, mikrowyspy zapobiegają również powlekaniu w pobliżu krawędzi studzienek, gdzie częste są różnice w gęstości komórek i przeżywalności. Mikrowyspy są często wykorzystywane w stosunkowo dużych studniach lub naczyniach; jednak ustanowienie kultur neuronów śródmózgowia na mikrowyspach w formacie płytki 96-dołkowej umożliwia badanie patologii Lewy'ego w neuronach dopaminowych działających w dobrej wierze o mocy od średniej do wysokiej przepustowości. Eksperymenty in vitro z tymi neuronami pozwoliły nam odkryć czynnik neurotroficzny pochodzenia z linii komórek glejowych (GDNF), który sprzyja przetrwaniu dojrzałych neuronów dopaminowych in vitro i in vivo19,20,21,22, a także zapobiega tworzeniu się agregatów α-synukleiny w neuronach dopaminowych23. Ludzkie, indukowane przez pacjenta pluripotencjalne neurony dopaminowe pochodzące z komórek macierzystych stanowią dokładniejszy model ze względu na ich ludzkie pochodzenie i dłuższy czas przeżycia in vitro. Jednak indukcja patologii α-synukleiny w ludzkich neuronach obserwuje się po wielu miesiącach, w porównaniu z tygodniem w mysich neuronach embrionalnych i/lub z wieloma stresorami (np. kombinacją nadekspresji α-synukleiny i PFF)24,25. Ponadto utrzymanie ludzkich neuronów dopaminowych jest bardziej kosztowne i pracochłonne w porównaniu z pierwotnymi neuronami embrionalnymi, co zasadniczo ogranicza ich wykorzystanie w zastosowaniach o wysokiej przepustowości.

Ponadto, pierwotne kultury neuronów dopaminowych mogą być genetycznie modyfikowane (np. za pomocą CRISPR/Cas9) i/lub leczone środkami farmakologicznymi23. Stanowią one szybką i powtarzalną platformę do zastosowań takich jak sekcja szlaków molekularnych i badania przesiewowe bibliotek leków. Mimo że z tych kultur można uzyskać ograniczony materiał, nadal możliwe jest przeprowadzanie analiz genomicznych/proteomicznych na małą skalę. Hodowla neuronów pierwotnych w formacie 96 dołków jest lepsza w przypadku technik immunocytochemicznych i mikroskopii fluorescencyjnej, a następnie analizy fenotypu o wysokiej zawartości. Wielospektralne obrazy fluorescencyjne pochodzące z automatycznego obrazowania 96 płytek dołkowych można przekształcić w wyniki ilościowe (np. liczbę neuronów zawierających LB w basenie). Takie analizy można wykonać za pomocą darmowego oprogramowania, takiego jak CellProfiler26,27. Ogólnie rzecz biorąc, pierwotne embrionalne kultury śródmózgowia posiane na 96-dołkowych płytkach stanowią solidną i wydajną platformę do badania neuronów dopaminowych i agregacji α-synukleiny z możliwością wysokoprzepustowych badań przesiewowych fenotypu.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Fińską Narodową Radę ds. Eksperymentów na Zwierzętach i przeprowadzone zgodnie z prawodawstwem europejskim dotyczącym ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych.

1. Przygotowanie

  1. Przygotować pożywkę dla neuronów dopaminergicznych (DPM) zawierającą 0,46% D-glukozy, 1% L-glutaminy, 1% N2 oraz 0,2% primocinu, uzupełnioną DMEM/F12. Po zmieszaniu składników przefiltrować DPM. Przechowywać DPM w temperaturze 4 °C i podgrzewać każdą alikwot tylko raz.
    UWAGA: DPM nie powinna zawierać GDNF, ponieważ zmniejsza on akumulację α-synukleiny w neuronach dopaminergicznych23.
  2. Przygotować silikonizowane pipety szklane, które są silnie hydrofobowe, co minimalizuje przyleganie do powierzchni i utratę komórek podczas początkowej manipulacji neuronami embrionalnymi.
    1. Dodać 10 mL płynu silikonizującego do 1 L wody destylowanej i wymieszać poprzez mieszanie w naczyniu o pojemności 2 L. Pozostawić szklane pipety zanurzone w roztworze silikonizującym na 15 min.
    2. Przepłukać pipety 3–5x wodą destylowaną. Suszyć pipety przez noc w temperaturze pokojowej (RT) lub przez 1–2 h w sterylnej przestrzeni nagrzanej do 100-120 °C, aby przyspieszyć suszenie.
    3. Sterylizować pipety standardową autoklawacją w zamkniętym worku do autoklawa.
  3. Przygotować płytki 96-dołkowe z przezroczystym dnem powleczone poli-L-ornityną (PO), dodając 60 μL roztworu PO do środkowych dołków płytki 96-dołkowej, która będzie użyta do wysiewania neuronów, pozostawiając co najmniej jeden rząd/kolumnę dołków na krawędziach płytki, aby uniknąć efektu brzegowego. Przechowywać powleczoną płytkę przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 4 h w RT.
  4. Przed wysiewaniem komórek całkowicie odessać PO i trzykrotnie przemyć komórki 100 μL 1x PBS. Odessać 1x PBS z dołków i pozostawić pokrywkę płytki otwartą do całkowitego wysuszenia.
    UWAGA: Można zbierać zużyty roztwór PO i filtrować go w celu ponownego użycia. Można to powtórzyć dwukrotnie dla tego samego roztworu PO.
  5. Dodać 50 μL DPM do uprzednio powleczonych dołków. Odessać DPM z dołków za pomocą plastikowego tipa 100 μL, jednocześnie wykonując okrężne ruchyścierające dno dołka, aby usunąć powłokę z obwodu każdego dołka. Na środku dołka pozostanie wyspa powleczona PO.
  6. Pod komorą laminarną dodać 10 μL DPM na środek każdej powleczonej wyspy, aby utworzyć mikro-wyspy.
    UWAGA: Płytkę z mikro-wyspami pokrytymi DPM można przechowywać pod komorą laminarną przez 1–2 h podczas izolacji komórek.

2. Izolacja dna brzusznej części śródmózgowia z embrionów myszy w stadium E13.5

UWAGA: Kroki sekcji dna śródmózgowia przedstawiono na Rysunku 1.

  1. Przed przeprowadzeniem sekcji napełnić szalkę Petriego o średnicy 10 cm buforem Dulbecco i przechowywać ją w lodzie.
  2. Eutanazować ciężarną samicę myszy w dniu E13.5 zgodnie z wytycznymi instytucji. Położyć mysz płasko na grzbiecie i spryskać przednią część ciała 70% etanolem. Podnieść skórę nad macicą za pomocą pęsety i wykonać nacięcie nożyczkami chirurgicznymi, aby odsłonić macicę.
  3. Ostrożnie usunąć macicę i umieścić ją w wcześniej przygotowanej szalce Petriego w lodzie.
  4. Używając nożyczek chirurgicznych pod dygestorium w temperaturze RT, ostrożnie wyjąć zarodki z macicy. Za pomocą pęsety usunąć z zarodków wszystkie pozostałości łożyska i umieścić je w nowej szalce Petriego o średnicy 10 cm wypełnionej buforem Dulbecco.
  5. Używając pęsety sekcyjnej lub igieł, odciąć tylną część głowy w miejscach zaznaczonych czarnymi strzałkami na Rysunku 1A. Oddzielić odcięty fragment od reszty zarodka (Rysunek 1B).
  6. Ułożyć tylną część odciętego fragmentu w stronę obserwatora (Rysunek 1C) i delikatnie rozciąć go od strony ogonowej do czaszkowej (Rysunek 1D). Z obszaru 0,5 mm poniżej otworu czaszkowego wyciąć region o powierzchni 2 mm2–3 mm2, pokazany na Rysunku 1E.
  7. Zebrać brzuszny dno śródmózgowia (patrz Rysunek 1F) do pustej probówki mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Przechowywać probówkę w lodzie do czasu zebrania wszystkich fragmentów dna śródmózgowia.
    UWAGA: Alternatywnie, fragmenty dna śródmózgowia można zebrać za pomocą mikropipety 1 mL po sekcji mózgów wszystkich zarodków.

Schemat procesu sekcji zarodka, kroki A-F, ilustrujący etapy wyodrębniania tkanek.
Rysunek 1: Sekcja dna śródmózgowia z zarodka myszy w stadium E13.5. (A) Miejsca cięcia w tylnej części głowy zaznaczono czarnymi strzałkami i białymi liniami przerywanymi. (B) Fragment został oddzielony od reszty zarodka. Wycięty fragment zaznaczono okręgiem. (C) Fragment obrócono o 90°, aby strona tylna była skierowana w stronę obserwatora. (D) Fragment otwarto wzdłuż czarnych strzałek, od strony ogonowej do czaszkowej (zaznaczono białą linią przerywaną). (E) W odległości 0.5 mm–1 mm poniżej otworu wycięto obszar o powierzchni 2 mm2–4 mm2 (zaznaczono czarnymi liniami). (F) Wyizolowano brzuszne dno śródmózgowia (zaznaczono czarnym kwadratem przerywanym). Pasek skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Zakładanie pierwotnych kultur embrionalnych śródmózgowia z embrionów myszy E13.5 w formacie płytek 96-dołkowych

  1. Po zebraniu podłóg śródmózgowia ze wszystkich embrionów do jednej probówki 1,5 mL, usunąć pozostały bufor Dulbecco i trzykrotnie przemyć fragmenty tkanki 500 μL zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) pozbawionego Ca2+ i Mg2+.
  2. Usunąć HBSS i dodać do probówki 500 μL 0,5% trypsyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
  3. Podczas inkubacji ogrzać 1,5 mL płatkowej surowicy bydlęcej (FBS) do 37 °C, dodać do FBS 30 μL DNazy I i wymieszać. Należy również wypalić końcówkę silikonizowanej pipety szklanej. Upewnić się, że otwór nie ma ostrych krawędzi i ma wielkość zbliżoną do końcówki mikropipety 1 mL.
    UWAGA: Alternatywnie do tryturacji można użyć końcówki mikropipety 1 mL o niskiej adhezji. Jednakże silikonizowane pipety szklane wydają się dawać najlepsze rezultaty.
  4. Natychmiast po zakończeniu inkubacji z kroku 3.2, dodać 500 μL mieszaniny FBS/DNaza do częściowo strawionej tkanki. Używając szklanej pipety, przeprowadzić tryturację tkanki w mieszaninie FBS/trypsyna. Tryturować aż do momentu, gdy tkanki rozpadną się na maleńkie, ledwo widoczne cząstki. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza podczas tryturacji.
  5. Pozostawić pozostałe cząstki, aby opadły na dno probówki do mikrocentryfugi pod wpływem grawitacji. Bez pobierania osadu z dna, zebrać nadsącz do pustej stożkowej probówki z polipropylenu o pojemności 15 mL.
  6. Rozcieńczyć FBS/DNazę I z kroku 3.3 (98:2) za pomocą 1 000 μL HBSS w celu otrzymania mieszaniny FBS/DNaza-I/HBSS (49:1:50). Wymieszać, pipetując w górę i w dół. Dodać 1 000 μL nowej mieszaniny do pozostałych cząstek w probówce do mikrocentryfugi. Ponownie przeprowadzić tryturację i powtórzyć krok 3.5.
  7. Powtórzyć poprzedni krok jeszcze raz, aby zużyć całą mieszaninę FBS/DNaza-I/HBSS (49:1:50).
  8. Po zebraniu całego nadsączu do probówki 15 mL (z kroków 3.5, 3.7 i 3.8), użyć wirówki stołowej, aby odwirować nadsącz (~3 mL) przy 100 x g przez 5 min. Usunąć nadsącz, nie dotykając osadu komórkowego na dnie.
  9. Przemyć pellet komórkowy, dodając do probówki 2 mL DPM i wirując przy 100 x g przez 5 min. Usunąć nadsącz i powtórzyć przemywanie 2x, aby zminimalizować ilość zanieczyszczeń w osadzie komórkowym.
    UWAGA: Do hodowlanych neuronów zawsze używać świeżego, ogrzanego DPM. W krokach przemywania DPM nie musi być świeży, ale powinien być wstępnie ogrzany do 37 °C.
  10. Rozcieńczyć komórki świeżym, ciepłym DPM i przenieść je do probówki do mikrocentryfugi. Ilość DPM do rozcieńczenia zależy od liczby embrionów użytych do preparatyki tkanki. Na przykład użyć 150 μL DPM do rozcieńczenia komórek uzyskanych z dziesięciu embrionów.
  11. Przenieść 10 μL komórek w DPM do probówki do mikrocentryfugi. Wymieszać je z 10 μL 0,4% barwnika Trypan blue. Policzyć żywe komórki (tj. negatywne pod kątem Trypan blue) za pomocą komory licznikowej lub automatycznego licznika komórek.
    UWAGA: Do wysiewu użyć 30 000 komórek na studzienkę, aby uzyskać ~1 000 neuronów dopaminergicznych na studzienkę. Jeśli gęstość komórek jest wyższa niż ~30 000 komórek na 6 μL, dodatkowo rozcieńczyć komórki w DPM przed wysiewem, tak aby objętość wysiewu nie była mniejsza niż 6 μL.
  12. Bez dotykania dna studzienek, usunąć DPM z mikro-wysepek utworzonych w kroku 1.6.
  13. W celu uzyskania powtarzalnej gęstości komórek w każdej studzience, wymieszać komórki poprzez delikatne pipetowanie przed wysianiem do studzienki. Za pomocą mikropipety 1–10 μL dodać 6 μL komórek na środek studzienki, w miejscu każdej z poprzednich mikro-wysepek.
  14. Wypełnić puste studzienki na brzegach płytki 150 μL wody lub 1x PBS, aby zminimalizować parowanie ze studzienek zawierających hodowle neuronalne. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 przez 1 h.
  15. Po 1 h wyjąć płytkę z inkubatora, dodać 100 μL DPM do każdej studzienki z komórkami i umieścić ją z powrotem w inkubatorze.
  16. Dwa dni po wysiewie (dzień in vitro 2, czyli DIV2), usunąć 25 μL i dodać 75 μL świeżego DPM, aby doprowadzić końcową objętość medium do 150 μL i w jak największym stopniu uniknąć parowania.
  17. Wymienić połowę medium na świeży DPM (tj. usunąć 75 μL i dodać 75 μL świeżego DPM) w DIV5. Nie przeprowadzać żadnych zmian medium po DIV5.

4. Indukcja agregatów α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminergicznych poprzez szczepienie preformowanymi fibrylami

Protokoły otrzymywania i walidacji PFF zostały szczegółowo opisane i omówione w kilku niedawnych publikacjach11,28,29,30. Po każdej pracy z PFF należy oczyścić komorę laminarną lub wszelki sprzęt, który mógł mieć kontakt z PFF, przy użyciu 1% SDS, a następnie 70% etanolu31.

  1. Przed eksperymentem rozcieńczyć PFF w 1x PBS do stężenia końcowego 100 μg/mL. Poddaj rozcieńczone PFF sonikacji w probówkach do mikrocentryfugi za pomocą sonikatora kąpielowego o wysokiej mocy, z chłodzeniem w kąpieli wodnej w temperaturze 4 °C przez 10 cykli (30 s włączone/30 s wyłączone).
    UWAGA: Kluczowe jest prawidłowe przeprowadzenie sonikacji włókien w celu uzyskania fragmentów o długości ~50 nm. Wielkość sonikowanych PFF można zmierzyć bezpośrednio na obrazach z transmisyjnego mikroskopu elektronowego PFF zabarwionych zgodnie z opisem Pattersona i współpracowników30. Sonikację można przeprowadzić w opisany wyżej sposób w sonikatorze kąpielowym o wysokiej mocy. Alternatywnie można zastosować sonikator z końcówką (tip sonicator)30. Sonikowane PFF można przechowywać w temperaturze -80 °C w małych alikwotach, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.
  2. W dniu DIV8 dodać 3,75 μL PFF o stężeniu 100 μg/mL na studzienkę do 150 μL pożywki w studzience, tak aby uzyskać stężenie końcowe 2,5 μg/mL. W przypadku grupy kontrolnej zastosować taką samą ilość 1x PBS.
  3. Przygotować 4% paraformaldehyd (PFA) w 1x PBS i przechowywać alikwoty w temperaturze -20 °C. W tym celu wykonać poniższe kroki.
    ​UWAGA: PFA jest toksyczny; podczas przygotowania należy nosić maskę i rękawice, zawsze pracować pod dygestorium z przepływem laminarnym i utylizować wszystkie odpady stałe i ciekłe z PFA zgodnie z wytycznymi instytucji.
    1. Podgrzać 500 mL 1x PBS w naczyniu o pojemności 1 L. Włożyć do naczynia mieszadło magnetyczne i postawić naczynie na mieszalce magnetycznej z funkcją grzania. Ustawić temperaturę w zakresie 40–60 °C, aby zapobiec wrzeniu, utrzymując jednocześnie roztwór w cieple.
    2. Odważyć pod dygestorium 20 g proszku PFA do jednorazowego plastikowego pojemnika pomiarowego. Ostrożnie dodać proszek PFA do naczynia wypełnionego 1x PBS. Rozpocząć mieszanie roztworu.
    3. Dodać do roztworu 200 μL 5 M wodorotlenku sodu i kontynuować mieszanie przez ~15 min, aż PFA całkowicie się rozpuści.
    4. Gdy roztwór stanie się jednorodny, dodać 168 μL 5 M chlorku wodoru, aby zrównoważyć pH do poziomu ~7. Sprawdzić pH za pomocą jednorazowych kolorystycznych pasków wskaźnikowych pH.
    5. Zdjąć naczynie z grzejnika i pozwolić mu ostygnąć do RT. Przefiltrować roztwór i rozdzielić na alikwoty do przechowywania w temperaturze -20 °C. Rozmrażać alikwoty w temperaturze RT przed użyciem i nie zamrażać ponownie.
  4. W dniu DIV15 usunąć całą pożywkę ze studzienek za pomocą pipety. Dodać 50 μL 4% PFA do każdej studzienki, aby utrwalić komórki, i inkubować przez 20 min w RT. Po inkubacji usunąć PFA ze studzienek i dodać 100 μL 1x PBS do każdej studzienki w celu przemycia komórek. Usunąć 1x PBS i przemyć komórki jeszcze 2 razy.
  5. Pozostawić 100 μL 1x PBS w każdej studzience, aby zapobiec wysychaniu. Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C do momentu przeprowadzenia immunochemii.

5. Barwienie immunofluorescencyjne i zautomatyzowane obrazowanie pierwotnych embrionalnych neuronów dopaminergicznych w płytkach 96-dołkowych

  1. Usunąć 1x PBS i przeprowadzić permeabilizację komórek, dodając 100 μL 0,2% Triton X-100 w PBS (PBST) do każdego dołka i inkubując w RT przez 15 min.
  2. Usunąć PBST i dodać 50 μL 5% normalnego surowicy konia (NHS) w PBST do każdego dołka. Aby zablokować niespecyficzną aktywność antygenową, inkubować w RT przez 1 h.
  3. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe przeciwko TH i pS129-αsyn (1:2 000) w 5% NHS w PBST. Dodać 50 μL rozcieńczonych przeciwciał do każdego dołka i inkubować przez noc w 4 °C.
  4. Usunąć przeciwciała i dodać 100 μL 1x PBS do każdego dołka, aby wypłukać komórki. Usunąć 1x PBS i powtórzyć płukanie 2x.
  5. Aby zapobiec blaknięciu cząsteczek fluorescencyjnych, należy rozpocząć pracę w warunkach minimalnego oświetlenia. Rozcieńczyć wtórne przeciwciała znakowane fluorescencyjnie (1:400) w PBST. Dodać 50 μL rozcieńczonych przeciwciał do każdego dołka i inkubować w RT przez 1 h.
  6. Usunąć roztwór przeciwciał i dodać 100 μL 1x PBS do każdego dołka, aby wypłukać komórki. Usunąć 1x PBS i powtórzyć płukanie 2x.
  7. Usunąć 1x PBS, dodać 50 μL 200 ng/mL 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) do każdego dołka w celu zabarwienia jąder hodowlanych komórek i inkubować w RT przez 10 min.
  8. Przepłukać komórki 3x za pomocą 100 μL 1x PBS przez 5 min każde płukanie. Po ostatnim płukaniu pozostawić 100 μL 1x PBS w każdym dołku. Przykryć płytkę folią aluminiową i przechowywać w 4 °C do czasu obrazowania.
  9. Obrazować pierwotne embrionalne neurony dopaminergiczne w płytce 96-dołkowej do obrazowania za pomocą wysokoprzepustowego skanera płytek (patrz Tabela Materiałów) wyposażonego w obiektyw 10x.
  10. Dostosować ustawienia na podstawie specyfikacji płytki 96-dołkowej, takiej jak typ płytki, producent, rozmiar, odległość między dołkami, a także typ i ilość medium.
  11. Wybrać obszar obrazowania dołka tak, aby objął wszystkie komórki w mikro-wyspie. Wybrać przykładowy dołek w celu dostrojenia autofokusa. Początkowe ogniskowanie oprzeć na sygnale DAPI.
  12. Zkalibrować czas akwizycji dla każdego kanału fluorescencyjnego na podstawie intensywności barwienia w dołkach kontrolnych. Dostosować parametry tak, aby w dołkach kontrolnych traktowanych PFF można było wyraźnie odróżnić komórki dopaminergiczne zawierające agregaty pS129-αsyn w somie komórki, co pozwoli na jednoznaczne ilościowe oznaczenie komórek pS129-αsyn pozytywnych i pS129-αsyn negatywnych.
    UWAGA: Dołki, które nie zawierają PFF, nie powinny wykazywać barwienia na pS129-αsyn; zatem dołki te mogą służyć jako kontrola negatywna do dostrojenia intensywności pS129-αsyn.
  13. Obrazować wszystkie wybrane dołki obiektywem 10x jednocześnie dla wszystkich kanałów barwienia immunofluorescencyjnego przy zastosowaniu dokładnie tych samych parametrów.
  14. Opcjonalnie oznakować inkluzje α-synukleiny w części dołków przeciwciałami specyficznymi dla włóknistej α-synukleiny, aby potwierdzić, że zmiany w liczbie inkluzji pS129-αsyn-pozytywnych odzwierciedlają redukcję akumulacji białka, a nie inhibicję fosforylacji lub defosforylację pS129-αsyn.
  15. Powtórzyć krok 5.3, zastępując przeciwciała pS129-αsyn przeciwciałami przeciwko włóknistym formom α-synukleiny (1:2 000). Obrazować zabarwioną agregowaną α-synukleinę zgodnie z krokiem 5.13.

6. Wysokoprzepustowa analiza obrazów (High-content image analysis)

UWAGA: Ten etap jest wykonywany przy użyciu otwartościowego oprogramowania CellProfiler w wersji 3.15 oraz CellProfiler Analyst w wersji 2.2.1.27,32. Jednakże, przy odpowiednim doświadczeniu, analogiczne potoki analizy obrazu można skonfigurować w innej wersji oprogramowania lub w programie o podobnym działaniu. Szczegółowe wyjaśnienia znajdują się na stronie oprogramowania (patrz Tabela materiałów).

  1. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie CellProfiler oraz CellProfiler Analyst.
  2. Uruchom program CellProfiler. Wybierz Plik|Importuj|Potok z pliku i załadować dostarczony przykładowy rurociąg analizy, TH_LB_V1.cpipe plik (patrz w Pliki uzupełniające).
    UWAGA: Przykładowe potoki przetwarzania będą wymagały specyficznych dostosowań w zależności od właściwości pozyskanych obrazów oraz platformy akwizycji obrazu. Przykładowe obrazymoże zostać wykorzystane do wstępnego przetestowania oprogramowania.
  3. Załaduj obrazy do analizy, przeciągając je do Moduł obrazówUżyj opcji filtrowania, aby wybrać tylko pliki obrazów z załadowanego folderu.
    1. Zastosowanie Moduł metadanych aby wyodrębnić informacje o studzience, polu widzenia oraz kanale z nazwy pliku obrazu. Kliknij w szkło powiększające symbol i wprowadź wyrażenie regularne, aby wyodrębnić informacje o płytce, studzience, miejscu obrazowania i kanale z nazw plików.
      UWAGA: Wyrażenie regularne będzie zależało od konwencji nazewnictwa plików mikroskopu płytkowego. Kliknięcie znak zapytania obok szkło powiększające przedstawi szczegóły składni.
    2. Pod moduł NamesAndTypes, wybierz odpowiednie numery kanałów dla barwień DAPI, TH oraz pS129-αsyn (domyślne kanały 1, 2i 3). W Moduł grup, wybierz „Nie”.
  4. Zastosowanie moduły IdentifyPrimaryObjects do segmentacji neuronów dopaminergicznych przy użyciu barwienia ciał komórkowych na TH.
    UWAGA: Konkretne wartości będą wymagały wstępnej optymalizacji w zależności od sposobu barwienia i obrazowania płytek. Jeśli kolejne płytki zostaną przetworzone w ten sam sposób, dalsze korekty nie będą potrzebne lub będą minimalne.
  5. Zastosowanie moduł MeasureObjectIntensity w celu uzyskania informacji o intensywności fluorescencji z kanałów TH i DAPI.
  6. Zastosowanie moduł MeasureObjectSizeShape do pomiaru cech rozmiaru i kształtu segmentowych neuronów dopaminergicznych.
  7. Zastosowanie Moduł MeasureTexture w celu pomiaru informacji o cechach tekstury z kanału TH w wysegmentowanych neuronach dopaminergicznych.
  8. Zastosowanie moduł ExportToDatabase w celu zapisania pomiarów w bazie danych.
    1. Nazwij plik bazy danych zgodnie ze schematem nazewnictwa eksperymentów (np. ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile1.db). Wybierz Folder wyjściowy dla pliku bazy danych. Plik bazy danych może mieć rozmiar kilku gigabajtów i powinien być zapisany najlepiej w folderze nadrzędnym plików obrazów.
  9. Otwórz program CellProfiler Analyst i wybierz Właściwości_komórek_TH_V1 plik utworzony w kroku 6.8. Otwórz Narzędzia|Klasyfikator.
  10. Podziel posegmentowane komórki na dwie kategorie: pozytywne (tj. prawidłowo posegmentowane ciała neuronów dopaminergicznych) i negatywne (tj. artefakty segmentacji i barwienia). Zobacz Rycina 2A i 2B.
    1. Ustaw liczbę pobranych komórek na 50 losowy komórki i kliknięcie Pobierz (operacja ta ładuje obrazy komórek wysegmentowanych w kroku 6.4). Posortuj co najmniej 30 komórek do każdego pojemnika, przeciągając je do odpowiedniego pojemnika na dole okna. W razie potrzeby pobierz więcej komórek.
    2. W menu rozwijanym wybierz Zastosowanie Szybkie delikatne wzbogacanie z 50 maksymalne zasady i kliknij Trenuj.
    3. Ustaw „Pobierzdo 50 dodatni komórki i prasa Pobierz w celu uzyskania komórek wykazujących pozytywną ekspresję TH zgodnie z klasyfikatorem (Rysunek 2A). Uzyskanego wyniku należy użyć do oceny jakości wytrenowanego klasyfikatora.
    4. Powtórz kroki 6.10.1–6.10.3, dodając nowe komórki przykładowe do trenowania klasyfikatora, aż do uzyskania satysfakcjonujących wyników.
    5. Wybierz Zaawansowane|Edytuj reguły… i w nowym oknie zaznacz cały tekst (Ctrl+a) i Kopia toKopiuj) do notatnik (Wklej). Zapisz jako plik TH_rules.txt.
      UWAGA: W zależności od gęstości hodowli neuronalnej oraz jakości barwienia i obrazowania, ten krok może nie być konieczny, ponieważ możliwe może być ustawienie parametrów w kroku 6.4 w celu segmentacji wyłącznie komórek TH-dodatnich z wysoką dokładnością. Jeśli tak jest, cała TH_LB_V1.cpipe uruchamianie nie jest konieczne, a prawidłowe parametry moduły IdentifyPrimaryObjects należy umieścić bezpośrednio w odpowiednim module w TH_LB_V2.cpipe.

Obraz mikroskopowy przedziałów komórkowych; lokalizacja białek w badaniu fluorescencyjnym; wyniki eksperymentu.
Rycina 2: Ilościowe oznaczenie neuronów dopaminergicznych i neuronów dopaminergicznych dodatnich pod kątem pS129-αsyn przy użyciu oprogramowania CellProfiler Analyst na podstawie immunofluorescencji DAPI, TH i pS129-αsyn.(A) Komórki TH w koszyku dodatnim zostały wybrane na podstawie barwienia DAPI (niebieski), oznaczonego małym kwadratem przy pierwszej wybranej komórce na obrazie, oraz otaczającego barwienia TH (szary) w obrębie somy. (B) Artefakty niebędące komórkami zostały umieszczone w koszyku ujemnym. (C) Neurony TH dodatnie pod kątem pS129-αsyn zostały wybrane na podstawie dużych inkluzji barwienia pS129-αsyn (czerwony), oznaczonych małym kwadratem przy pierwszej wybranej komórce na obrazie, otaczających jądra lub znajdujących się w somie komórkowej. (D) Komórki TH bez takich inkluzji pS129-αsyn zostały umieszczone w koszyku ujemnym. Paski skali = 10 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Otwórz program CellProfiler, wybierz File|Import|Pipeline from file i załaduj plik TH_LB_V2.cpipe . Powtórz kroki 6.3–6.7. Ta część potoku powinna być identyczna jak w przypadku TH_LB_V1.cpipe.
  2. Użyj modułu FilterObjects, aby przekazać do dalszej analizy tylko komórki prawdziwie dodatnie pod kątem TH.
    1. Ustaw filtering mode (tryb filtrowania) na Rules (reguły). W polu Rules lub classifier file name (nazwa pliku klasyfikatora) wybierz plik TH_rules.txt utworzony w kroku 6.10.5.
    2. Ustaw pole Class number na 1, jeśli komórki dodatnie pod kątem TH zostały posortowane do dolnego lewego okna.
  3. Użyj modułu MeasureObjectIntensity, aby uzyskać informacje o intensywności fluorescencji z kanału pS129-αsyn.
  4. Użyj modułu MeasureTexture , aby zmierzyć cechy tekstury w kanale TH dla przefiltrowanych komórek.
  5. Użyj modułu MeasureObjectSizeShape , aby zmierzyć cechy wielkości i kształtu przefiltrowanych komórek.
  6. Użyj modułu ExportToDatabase, aby zapisać pomiary w bazie danych.
    1. Nazwij plik bazy danych zgodnie ze schematem nazewnictwa Twojego eksperymentu (np. ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile2.db). Wybierz folder wyjściowy dla pliku bazy danych.
  7. Otwórz program CellProfiler Analyst i wybierz plik V2_THpos.properties .
    1. Posortuj segmentowane komórki na dwie kategorie – komórki dodatnie i ujemne pod kątem pS129-αsyn (Ryc. 2C,D).
    2. Ustaw liczbę pobieranych komórek na 50 random (50 losowych) i kliknij Fetch (załaduje to obrazy komórek segmentowanych w kroku 4). Posortuj co najmniej 30 komórek w każdym koszyku, przeciągając je do odpowiedniego koszyka na dole okna.
    3. Z menu drop-down (rozwijanego) wybierz klasyfikatory Use Fast Gentle Boosting z 50 max rules lub Random Forest. Kliknij Train.
    4. Ustaw „Fetch” na 50 positive (dodatnich) komórek i naciśnij Fetch, aby uzyskać komórki dodatnie pod kątem pS129-αsyn zgodnie z klasyfikatorem (Ryc. 2C). Ustaw „Fetch” na 50 negative (ujemnych) komórek i naciśnij Fetch, aby uzyskać komórki ujemne pod kątem pS129-αsyn zgodnie z klasyfikatorem (Ryc. 2D). Oceń jakość wytrenowanego klasyfikatora.
    5. Powtórz kroki 6.17.2–6.17.4, dodając nowe komórki przykładowe do trenowania klasyfikatora, aż wyniki będą satysfakcjonujące.
  8. Kliknij Score All, aby uzyskać tabelę wyników podsumowującą liczbę dodatnich i ujemnych pod kątem pS129-αsyn neuronów dopaminergicznych w każdej studni.

Wyniki

Kilka dni po wysiewaniu (DIV1–DIV3) wykonano mikroskopię w polu jasnym, aby ocenić stan zdrowia i jednorodność rozkładu hodowanych komórek oraz jednolitość tych warunków w poszczególnych studniach (Rysunek 3). Hodowane komórki śródmózgowia były rozmieszczone jednorodnie w obrębie mikro-wyspy utworzonej przed wysiewaniem (Rysunek 3A,B). Pierwotne neurony osiadły jednorodnie na powlekanym podłożu i wytworzyły wypustki neuronalne (Rysunek 3B). W studni zaobserwowano niewielki skupisk komórek (o średnicy mniejszej niż 150 μm), który przedstawiono jako przykład (Rysunek 3C).

Wypustki neuronalne i skupiska komórek na obrazie mikroskopowym; schemat przedstawia skalę pomiarową.
Rysunek 3: Kilka dni po wysiewaniu (np. DIV3) stan pierwotnych hodowli z mózgu środkowego obserwowano za pomocą mikroskopii w polu jasnym. (A) Hodowane komórki rozprzestrzeniły się w środkowej części studzienki w obrębie mikro wyspy pokrytej PO o przybliżonym promieniu 4,4 mm (wskazane białymi strzałkami), utworzonej poprzez zdrapanie PO z około 1 mm obwodu studzienki (wskazane czarnymi strzałkami). (B) Pierwotne neurony uległy jednorodnemu rozprzestrzenieniu w obrębie obszaru, zaobserwowano wypustki neuronalne (oznaczone czerwonymi grotami strzałek). (C) Skupisko komórek o średnicy mniejszej niż 150 μm jest oznaczone niebieskimi grotami strzałek. Paski skali = 100 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Pierwotne hodowle średniego mózgu myszy poddano immunobarwieniu z użyciem przeciwciał anty-TH i anty-pS129-αsyn, a następnie obrazowano za pomocą mikroskopu automatycznego po 15 dniach in vitro. Powlekane mikro wyspy zapewniały ograniczony obszar przylegania komórek w centrum studni (Rysunek 4A,B). Neurony dopaminergiczne immunoznakowane markerem TH były rozmieszczone wokół mikro wyspy w warstwie jednowarstwowej, oddzielone od siebie, bez żadnych skupisk (Rysunek 4A’ i 4B’).

Mikroskopia fluorescencyjna ekspresji neuronów TH/pS129-αsyn/DAPI; wykres słupkowy liczby komórek dodatnich pod kątem TH.
Rysunek 4: W 15. dniu in vitro (DIV15) z każdej mikro wyspy ilościowo oznaczono od 800 do 1 000 komórek dopaminergicznych, z zastosowaniem leczenia PFF lub bez. Reprezentatywne obrazy kultur embrionalnego śródmózgowia poddanych immunobarwieniu przeciwciałami anty-TH oraz anty-pS129-αsyn. (A, A’, A’’) Komórki kontrolne bez leczenia PFF. (B, B’, B’’) Komórki traktowane PFF z inkluzjami pS129-αsyn. (C) Ilościowe oznaczenie liczby komórek dodatnich pod kątem TH w dołkach traktowanych nośnikiem (kontrola), PFF lub PFF z dodatkiem 50 ng/mL GDNF. (D) Ilościowe oznaczenie agregatów pS129-αsyn w komórkach dodatnich pod kątem TH traktowanych nośnikiem (kontrola), PFF lub PFF z dodatkiem 50 ng/mL GDNF. Istotność statystyczną obliczono za pomocą analizy ANOVA z randomizacją blokową. **p < 0.01, n = 4 oddzielne płytki (powtórzenia biologiczne), każda z 3–6 dołkami na grupę traktowania (powtórzenia techniczne). Paski skali = 300 μm dla A, B; 50 μm dla A’, B’; 25 μm dla A’’, B’’. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Podczas gdy w kulturach bez podania PFF nie stwierdzono sygnału pS129- αsyn (Ryc. 4A’ oraz 4A’’), w kulturach traktowanych PFF α-synukleiny rozwinęły się inkluzje pS129-αsyn dodatnie (Ryc. 4B’ oraz 4B’’). Siedmiodniowe traktowanie PFF in vitro nie spowodowało istotnego spadku liczby neuronów TH-dodatnich w porównaniu z pozostałymi grupami eksperymentalnymi (Ryc. 4C). W kulturach traktowanych PFF populacja neuronów dopaminergicznych TH-dodatnich z pS129-αsyn dodatnią wynosiła ok. 40%. Podanie kontroli pozytywnej, GDNF, zmniejszyło odsetek neuronów dopaminergicznych TH-dodatnich z inkluzjami pS129-αsyn dodatnimi (Ryc. 4D, patrz również surowe dane i przykładowe obrazy w Plikach uzupełniających).

Pliki uzupełniające: Przykładowe potoki analizy obrazów wysokotreściowych (high-content image analysis) z wykorzystaniem pakietów oprogramowania CellProfiler i CellAnalyst, przykładowe obrazy oraz surowe dane do Rysunku 4E, F. (1-9) Example_Images. Otwórz te obrazy w programach ImageJ lub CellProfiler. (10) Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs. (11) TH_LB_V1.cpipe (Kroki 6.2–6.8), (12) TH_LB_V2.cpipe (Kroki 6.11–6.18) Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Dyskusja

Rozprzestrzenianie się patologii Lewy'ego, której głównym składnikiem jest pS129-αsyn, jest histopopatologicznym znakiem rozpoznawczym PD. Zatrzymanie lub spowolnienie akumulacji zagregowanego pS129-αsyn może spowolnić degenerację neuronów dopaminowych i postęp alfa-synukleinopatii. Jednak mechanistyczne zrozumienie, w jaki sposób agregacja pS129-αsyn przyczynia się do śmierci neuronów dopaminowych, nadal musi zostać ustalone. Dowody z ludzkich badań pośmiertnych na próbkach mózgu od pacjentów w różnych stadiach choroby, a także obserwacja dodatniej inkluzji pS129-αsyn w przeszczepionych neuronach płodowych silnie sugerują rozprzestrzenianie się patologii Lewy'ego między komórkami 16,17,33. W związku z tym podobne do prionów rozprzestrzenianie się pS129-αsyn zostało niedawno podsumowane za pomocą α-synukleiny PFF 9,10. Ustanowienie solidnego, opłacalnego i stosunkowo wysoko- lub średnioprzepustowego modelu rozprzestrzeniania i akumulacji pS129-αsyn, szczególnie w neuronach dopaminowych, może znacznie przyspieszyć poszukiwania nowych metod leczenia i związków modyfikujących ten proces.

Ponieważ utrata neuronów dopaminowych jest główną przyczyną objawów motorycznych w PD, a komórki te posiadają wiele unikalnych właściwości 2,34,35, modelowanie prionowego rozprzestrzeniania się pS129-αsyn w neuronach dopaminowych jest najbardziej odpowiednim typem modelu z perspektywy translacyjnej. Protokoły wykorzystujące mikrowyspy kultur embrionalnych neuronów śródmózgowia na 4-dołkowych płytkach i półautomatyczne oznaczanie ilościowe zostały opisane wcześniej18. Opisany tutaj protokół został dostosowany do płytek 96-dołkowych i zapewnia mniej pracochłonne przygotowanie mikrowysp, pozwalając na przygotowanie do czterech płytek zawierających po 60 dołków każda przez doświadczonego badacza w ciągu jednego dnia roboczego. Hodowla neuronów dopaminowych w 96-dołkowych płytkach pozwala na testowanie leków w mniejszych ilościach i umożliwia wysokie szybkości transdukcji z wektorami lentiwirusa. Możliwe jest również łączenie różnych zabiegów w celu przeprowadzenia bardziej złożonych eksperymentów.

Przed zastosowaniem jakichkolwiek zabiegów (w tym PFF) należy sprawdzić jakość hodowli za pomocą mikroskopii w jasnym polu. Jeśli system mikroskopowy nie wykorzystuje komory CO2 z ogrzewaniem, komórki nie powinny być trzymane poza inkubatorem dłużej niż kilka minut, ponieważ pierwotne neurony dopaminowe myszy są delikatne i łatwo się stresują. Z tego samego powodu zaleca się, aby pierwsze obrazowanie wykonać po 24 godzinach inkubacji (między DIV1-DIV3). Komórki powinny wydawać się żywe z obecnymi ciałami komórkowymi i jednorodnie rozmieszczone wewnątrz mikrowyspy. Neurony pierwotne osiadłyby na ziemi pokrytej PO i zaczęłyby tworzyć projekcje neuronalne. Możliwe jest zaobserwowanie małych skupisk komórek (tj. o średnicy mniejszej niż 150–200 μm), które mogą powstać, jeśli proces rozcierania nie zostanie przeprowadzony prawidłowo lub gęstość posiewu jest wyższa niż zalecana. Te małe grudki nie wpłynęłyby na eksperyment, chyba że jest ich więcej niż kilka na studzienkę i/lub więcej. Zbite komórki bardzo utrudniają identyfikację markerów immunohistochemicznych i poszczególnych komórek podczas analizy obrazu. Istotne jest, aby unikać takich grudek poprzez staranne powlekanie, trytuowanie i kontrolowanie gęstości poszycia. Jeśli nie można zaobserwować jednolitości tych warunków w niektórych studniach, nie należy uwzględniać tych wadliwych studni w eksperymencie. Takiego wykluczenia należy dokonać przed wykonaniem jakichkolwiek zabiegów.

Co więcej, zastosowanie 96-dołkowych płytek pozwala na wygodne korzystanie z wielokanałowych pipet podczas procedur barwienia i bezpośrednią wizualizację za pomocą automatycznych mikroskopów płytkowych, co dodatkowo zwiększa przepustowość. Wykorzystanie zautomatyzowanej kwantyfikacji obrazu jest niezbędne do analizy danych z platform obrazowania o wysokiej zawartości. Oprócz możliwości przetwarzania tysięcy obrazów uzyskanych z każdego eksperymentu, zapewnia bezstronną, identyczną kwantyfikację wszystkich grup leczenia. Przepływ pracy zaproponowany do analizy obrazu opiera się na prostych zasadach segmentacji neuronów dopaminowych, filtrowania prawidłowo segmentowanych komórek przez nadzorowane uczenie maszynowe, a następnie kwantyfikacji fenotypów (pS129-αsyn dodatni i pS129-αsyn ujemny), ponownie przez nadzorowane uczenie maszynowe. Chociaż można sobie wyobrazić kilka różnych podejść do tego zadania, stwierdziliśmy, że połączenie segmentacji z uczeniem maszynowym jest najbardziej niezawodne w przypadku kultur dopaminy ze względu na wysoką gęstość posiewu, zróżnicowane kształty neuronów dopaminowych i obecność silnie zabarwionych neurytów. Zaproponowany algorytm analizy obrazu został zaimplementowany w CellProfiler i CellProfiler Analyst, ogólnodostępnym, ogólnodostępnym oprogramowaniu do analizy obrazów o wysokiej zawartości26,27. Algorytm może być również zaimplementowany za pomocą innego oprogramowania do analizy obrazu, zarówno open source (np. ImageJ/FIJI, KNIME), jak i zastrzeżonego. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że często poświęcają one możliwości dostosowywania na rzecz łatwości użytkowania, a zatem mogą nie działać dobrze w skomplikowanych analizach. Odkryliśmy, że pakiety oprogramowania CellProfiler i CellProfiler Analyst dają szczególnie wiarygodne wyniki dzięki połączeniu znacznej liczby zaimplementowanych algorytmów, ekstremalnej elastyczności w projektowaniu przepływu pracy oraz jednoczesnej obsłudze i wydajnemu przetwarzaniu danych obrazowych o wysokiej zawartości.

Opisany protokół można również zaadaptować do oznaczania ilościowego innych fenotypów komórkowych charakteryzujących się barwieniem immunologicznym różnymi przeciwciałami, takimi jak markery innych populacji neuronów (np. DAT, GAD67, 5-HT itp.) oraz agregatów białkowych (np. fospo-Tau, ubikwityna). Można również połączyć wiele markerów fluorescencyjnych w celu rozróżnienia wielu fenotypów (np. komórek z inkluzjami na różnych etapach dojrzewania). Automatyczna klasyfikacja wielu fenotypów powinna być również łatwa do wdrożenia w opisanych potokach analizy obrazu, poprzez zwykłe dodanie kanału zawierającego obrazy immunofluorescencyjne dodatkowych markerów do etapów pomiaru i sortowanie komórek do wielu pojemników. Wykorzystanie wielu markerów w tym samym czasie wymagałoby jednak optymalizacji warunków barwienia immunologicznego i obrazowania. Dodatkowo, w celu uzyskania lepszej jakości obrazowania immunofluorescencyjnego, zaleca się stosowanie specjalnych czarnościennych 96-dołkowych płytek zaprojektowanych specjalnie dla mikroskopu fluorescencyjnego. Mogą one być jednak znacznie droższe niż standardowe płytki do hodowli komórkowych, które są wystarczające do analizy opisanej w naszym protokole.

Rodzaj i jakość zastosowanych PFF mają kluczowe znaczenie dla wyniku eksperymentów. PFF mogą mieć wpływ zarówno na rzetelność testu, jak i na interpretację wyników. Warunki przygotowania mogą mieć wpływ na efektywność wysiewu PFF i rzeczywiście odnotowano "szczepy" PFF o różnych właściwościach fizjologicznych36. Niemniej jednak przygotowanie i walidacja PFF wykraczają poza zakres niniejszego artykułu i zostały opisane w kilku publikacjach 11,28,29,30. Oprócz protokołu przygotowania należy wziąć pod uwagę gatunki pochodzenia α-synukleiny w PFF (np. mysz, człowiek) oraz zastosowanie białka typu dzikiego lub zmutowanego (np. ludzkiej A53T α-synukleiny), w zależności od szczególnych warunków doświadczalnych. Wykazano, że indukcja akumulacji pS129-αsyn przez PFF jest zależna od wieku hodowli (tj. dni in vitro), przy czym bardziej dojrzałe kultury wykazują wyraźniejszą indukcję11. Jest to prawdopodobnie spowodowane zwiększoną liczbą połączeń neuronalnych w bardziej dojrzałych kulturach i zwiększonym poziomem białka α-synukleiny. W naszych rękach leczenie PFF w DIV8 dało najbardziej wiarygodne wyniki, z wyraźną akumulacją pS129-αsyn w somie neuronów dopaminowych, nie zagrażając przy tym przeżyciu neuronów. Opisany protokół dobrze nadaje się do badania terapii modyfikujących wczesne zdarzenia prowadzące do agregacji endogennej α-synukleiny, ponieważ określamy ilościowo inkorpozycje pS129-αsyn dodatni w stosunkowo wczesnym punkcie czasowym, 7 dni po inokulacji PFF. W tym momencie inkluzje wewnątrzsomalne są obecne w znacznej części komórek i można je łatwo odróżnić za pomocą barwienia immunologicznego, podczas gdy nie obserwuje się śmierci komórek wywołanej przez PFF, co upraszcza interpretację wyników. Co ważne, ponieważ morfologia i skład inkluzji indukowanych przez PFF może zmieniać się w czasie12,13, opisany protokół można w zasadzie zmodyfikować w celu zbadania bardziej dojrzałych inkluzji poprzez utrwalenie i barwienie immunologiczne w późniejszych punktach czasowych. Jednak utrzymywanie neuronów dopaminowych w hodowli przez okres dłuższy niż 15 dni wymaga szczególnej ostrożności i może wywołać dodatkowe zmiany z powodu niezdolności komórek do przeżycia niezależnie od inokulacji PFF. Dodatkowo, bardziej rozszerzone posiewy komplikują harmonogramy leczenia farmakologicznego. Wiele związków ma ograniczoną lub źle scharakteryzowaną stabilność w pożywce do hodowli komórkowych, a uzupełnienie leku nie jest trywialne, ponieważ całkowita wymiana pożywki zagraża przetrwaniu kultur dopaminy.

Fosforylacja α-synukleiny w Ser129 jest konsekwentnie zgłaszana w modelach agregacji α-synukleiny opartych na PFF i kolokalizuje się z markerami nieprawidłowego fałdowania i agregacji, takimi jak tioflawina S, ubikwityna lub przeciwciała specyficzne dla konformacji11,12. W naszych rękach barwienie immunologiczne dla pS129-αsyn daje również najsilniejszy sygnał przy najniższym tle i jest najprostsze do analizy, dając solidne wyniki, gdy przeprowadza się wiele terapii. Co ważne, barwienie immunologiczne przeciwciałem pS129-αsyn nie wykrywa PFF, które pozostają poza komórkami, znacznie zmniejszając tło. Należy jednak pamiętać, że fosforylacja Ser129 jest prawdopodobnie jednym z najwcześniejszych procesów związanych z nieprawidłowym fałdowaniem α-synukleiny i może być różnie regulowana w określonych warunkach. Dlatego wszelkie wyniki, które wykazują pozytywny wpływ na pS129-αsyn, powinny być potwierdzone przez inne markery.

Analiza statystyczna powinna być dostosowana odpowiednio do projektu eksperymentalnego. Konieczne jest przeprowadzenie eksperymentów na co najmniej trzech niezależnych replikach biologicznych (tj. oddzielnych pierwotnych kulturach neuronalnych). Kontrpróby te powinny być posiane na różnych płytkach i poddawane niezależnej obróbce. Analizujemy dane uzyskane z powtórzeń na różnych płytkach z losową konstrukcją blokową ANOVA37 , aby uwzględnić parowanie danych dla różnych płytek eksperymentalnych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Prof. Kelvinowi Lukowi za hojny dar α-synukleinowych PFF, Conjung Zhengowi za stworzenie i hodowlę komórek neuronalnych, oraz Zakładowi Mikroskopii Świetlnej w Instytucie Biotechnologii Uniwersytetu w Helsinkach za obrazowanie komórek wybarwionych immunologicznie. Prace te były wspierane przez granty z 3i-Regeneration przez Business Finland (Fińska Agencja Finansowania Innowacji), Akademia Fińska #309489, #293392, #319195; Fundacji im. Sigrid Juselius oraz środków statutowych Instytutu Farmakologii im. M. Maja PAN.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,4% barwienie błękitu trypanowegoGibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA15250061
15 ml CELLSTAR Probówka polipropylenowaGreiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy188261
4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI)Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA10236276001
5 M HClN/A/A N/AKuchnia medialna, Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Helsiński
5 M NaOHN/AN/AKuchnia medialna, Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Helsiński
96-dołkowa płytka widokowa ()PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA6005182
99,5% etanolu (EtOH)Altia Oyj, Rajamä ki, FinlandiaN/A
AquaSil SiliconizingFluid Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USATS-42799
Autoklawizowana probówka mikrowirówkowa 1,5 mlN/A/AMedia kitchen, Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Helsiński
Urządzenie do sonikacji BioruptorDiagenode, Liège, BelgiaB01020001
Ca2+, Mg2+ wolny Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA14175-053
Pakiety oprogramowania CellProfiler i CellAnalystNiedotyczybezpłatnego oprogramowania typu open source
Wirówka 5702Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy5702000019
Inkubator CO2HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USANie dotyczy
Komora liczącaBioRad Inc., Hercules, Kalifornia, Stany Zjednoczone1450015
Mikroskop DeltaVision o ultrawysokiej rozdzielczości ze stołem powietrznym i szafkąGE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA29254706
Deoxyribonuclease-I (Dnase I)Roche, Bazylea, Szwajcaria22098700
D-glucoseSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAG8769
DMEM/F12Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone21331– 020
osł anty-mysz AlexaFluor 488Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USAA21202
osioł anty-królik AlexaFluor 647Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USAA31573
osł anty-owca AlexaFluor 488Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USAA11015
Bufor DulbeccoNieNie dotyczyMedia kitchen, Instytut Biotechnologii, Uniwersytet w Helsinkach
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone10500056
Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Barfisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA11507582
ImageXpress Nano Automated Imaging SystemUrządzenia molekularne, San Jose, Kalifornia, USANie dotyczy
L-glutaminaGibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA25030– 032
mysia monoklonalna hydroksylaza antytyrozynowaMillipore, Merck KGaA, Darmstadt, niemieckisuplement MAB318
N2Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA17502– 048
Normal Horse SerumVector Laboratories Inc., Burlingame, Kalifornia, Stany ZjednoczoneS-2000
paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA158127
proszek paraformaldehydu, 95%Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA158127
pH-Fix, paski wskaźnikowe z utrwalonym koloremMacherey-Nagel, Dü ren, Niemcy92110
Bufor fosfatowy sól fizjologiczna (PBS)N/AN/AMedia kuchnia, Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Helsiński
poli-L-ornitynaSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAP4957
PrimocinInvivoGen, San Diego, Kalifornia, USAant-pm-1, ant-pm-2
królik monoklonalny filament anty-alfa-synukleinowyAbcam, Cambridge, Wielka Brytaniaab209538
monoklonalny anty-fosfo-seryno129-alfa-synukleina królikaAbcam, Cambridge, Wielka Brytaniaab51253
RCT Basic, IKA Mieszadło magnetyczneIKA®-Werke GmbH, Staufen, Niemcy3810000
rekombinowany ludzki czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego (hGDNF)PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA lub Prospec, Ness-Ziona, Izrael450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec)
rekombinowana mysia alfa synukleina wstępnie uformowane fibryle (PFF)N/AN/APrezent od współpracownika, prof. Kelvina C Luk
Research Stereomicroscope SystemOlympus Corporation, Tokio, JaponiaSZX10
owcza poliklonalna hydroksylaza antytyrozynowaMillipore, Merck KGaA, Darmstadt, Niemcyab1542
TC 20 Zautomatyzowany Licznik komórekBioRad Inc., Hercules, Kalifornia, Stany Zjednoczone1450102
Triton X-100Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone11332481001
trypsynaMP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, Chiny2199700
N N dotyczy Nie dotyczy

Bibliografia

  1. Fearnley, J. M., Lees, A. J. Ageing and Parkinson's disease: substantia nigra regional selectivity. Brain. 114, Pt 5 2283-2301 (1991).
  2. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
  3. Shahmoradian, S. H., et al. Lewy pathology in Parkinson's disease consists of crowded organelles and lipid membranes. Nature Neuroscience. 22 (7), 1099-1109 (2019).
  4. Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nature Reviews Neurology. 9 (1), 13-24 (2013).
  5. Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease. Nature Reviews Neurosciences. 18 (2), 101-113 (2017).
  6. Leverenz, J. B., et al. Proteomic identification of novel proteins in cortical lewy bodies. Brain Pathology. 17 (2), 139-145 (2007).
  7. Spillantini, M. G., et al. Alpha-synuclein in Lewy bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
  8. Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).
  9. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
  10. Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).
  11. Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nature Protocols. 9 (9), 2135-2146 (2014).
  12. Osterberg, V. R., et al. Progressive aggregation of alpha-synuclein and selective degeneration of lewy inclusion-bearing neurons in a mouse model of parkinsonism. Cell Reports. 10 (8), 1252-1260 (2015).
  13. Mahul-Mellier, A. L., et al. The process of Lewy body formation, rather than simply alpha-synuclein fibrillization, is the major driver of neurodegeneration in synucleinopathies. J bioRxiv. , (2019).
  14. Elkouzi, A., Vedam-Mai, V., Eisinger, R. S., Okun, M. S. Emerging therapies in Parkinson disease - repurposed drugs and new approaches. Nature Reviews Neurology. 15 (4), 204-223 (2019).
  15. Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
  16. Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Olanow, C. W., Freeman, T. B. Transplanted dopaminergic neurons develop PD pathologic changes: a second case report. Movement Disorders. 23 (16), 2303-2306 (2008).
  17. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nature Medicine. 14 (5), 501-503 (2008).
  18. Planken, A., Porokuokka, L. L., Hanninen, A. L., Tuominen, R. K., Andressoo, J. O. Medium-throughput computer aided micro-island method to assay embryonic dopaminergic neuron cultures in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 194 (1), 122-131 (2010).
  19. Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science. 260 (5111), 1130-1132 (1993).
  20. Hoffer, B. J., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neuroscience Letters. 182 (1), 107-111 (1994).
  21. Kearns, C. M., Gash, D. M. GDNF protects nigral dopamine neurons against 6-hydroxydopamine in vivo. Brain Research. 672 (1-2), 104-111 (1995).
  22. Kirik, D., Rosenblad, C., Bjorklund, A., Mandel, R. J. Long-term rAAV-mediated gene transfer of GDNF in the rat Parkinson's model: intrastriatal but not intranigral transduction promotes functional regeneration in the lesioned nigrostriatal system. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4686-4700 (2000).
  23. Chmielarz, P., et al. GDNF/RET signaling pathway activation eliminates Lewy Body pathology in midbrain dopamine neurons. J bioRxiv. , 752899(2019).
  24. Ganjam, G. K., et al. Mitochondrial damage by α-synuclein causes cell death in human dopaminergic neurons. Cell Death & Disease. 10 (11), 865(2019).
  25. Bieri, G., et al. LRRK2 modifies α-syn pathology and spread in mouse models and human neurons. Acta Neuropathologica. 137 (6), 961-980 (2019).
  26. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  27. McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970(2018).
  28. Kumar, S. T., Donzelli, S., Chiki, A., Syed, M. M. K., Lashuel, H. A. A simple, versatile and robust centrifugation-based filtration protocol for the isolation and quantification of alpha-synuclein monomers, oligomers and fibrils: Towards improving experimental reproducibility in alpha-synuclein research. Journal of Neurochemistry. , (2020).
  29. Polinski, N. K., et al. Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents. Journal of Parkinsons Disease. 8 (2), 303-322 (2018).
  30. Patterson, J. R., et al. Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (148), e59758(2019).
  31. Bousset, L., Brundin, P., Bockmann, A., Meier, B., Melki, R. An Efficient Procedure for Removal and Inactivation of Alpha-Synuclein Assemblies from Laboratory Materials. Journal of Parkinsons Disease. 6 (1), 143-151 (2016).
  32. Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
  33. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
  34. Liss, B., Roeper, J. Individual dopamine midbrain neurons: functional diversity and flexibility in health and disease. Brain Research Reviews. 58 (2), 314-321 (2008).
  35. Sulzer, D., Surmeier, D. J. Neuronal vulnerability, pathogenesis, and Parkinson's disease. Movement Disorders. 28 (1), 41-50 (2013).
  36. Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
  37. Lew, M. Good statistical practice in pharmacology. Problem 1. British Journal of Pharmacology. 152 (3), 295-298 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Akumulacja alfa synukleinypreformowane w knapierwotne neurony dopaminergiczneimmunobarwieniezautomatyzowana analiza obrazuhodowla kom rkowafosfoseryna 129wysokoprzepustowe badanie tre ci High Content Screeningpowlekanie poli L ornitynmikroskopia fluorescencyjna
Badanie indukowanej wcześniej fibrylami akumulacji α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych śródmózgowia myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.