Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dotętnicze dostarczanie nerwowych komórek macierzystych do mózgu szczura i myszy: zastosowanie do niedokrwienia mózgu

10.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61119

⸱

26 czerwca 2020

 ,  ,  , 
1College of Public Health, Shaanxi University of Chinese Medicine, 2Spinal Cord and Brain Injury Research Center, Department of Physiology, University of Kentucky

W tym artykule

Podsumowanie

Zgłaszana jest metoda dostarczania nerwowych komórek macierzystych, przystosowanych do wstrzykiwania roztworów lub zawiesin, przez wspólną tętnicę szyjną (mysz) lub tętnicę szyjną zewnętrzną (szczur) po udarze niedokrwiennym. Wstrzyknięte komórki są szeroko rozmieszczone w miąższu mózgu i można je wykryć do 30 dni po porodzie.

Streszczenie

Terapia neuronalnymi komórkami macierzystymi (NSC) jest innowacyjną metodą leczenia udaru, urazowego uszkodzenia mózgu i zaburzeń neurodegeneracyjnych. W porównaniu z podawaniem wewnątrzczaszkowym, dotętnicze podawanie NSC jest mniej inwazyjne i powoduje bardziej rozproszoną dystrybucję NSC w miąższu mózgu. Co więcej, dostarczanie dotętnicze umożliwia efekt pierwszego przejścia w krążeniu mózgowym, zmniejszając możliwość uwięzienia komórek w narządach obwodowych, takich jak wątroba i śledziona, co jest powikłaniem związanym z zastrzykami obwodowymi. W tym miejscu szczegółowo opisujemy metodologię, zarówno u myszy, jak i szczurów, dostarczania NSC przez tętnicę szyjną wspólną (mysz) lub tętnicę szyjną zewnętrzną (szczur) do półkuli ipsilateralnej po udarze niedokrwiennym. Korzystając z NSC znakowanych GFP, ilustrujemy rozległą dystrybucję osiągniętą w całej półkuli ipsibocznej gryzoni po 1 dniu, 1 tygodniu i 4 tygodniach po porodzie niedokrwiennym, z większą gęstością w miejscu uszkodzenia niedokrwiennego lub w jego pobliżu. Oprócz długoterminowego przeżycia pokazujemy dowody na różnicowanie się komórek znakowanych GFP po 4 tygodniach. Opisane tutaj podejście do dostarczania dotętniczego dla NSC może być również stosowane do podawania związków terapeutycznych, a zatem ma szerokie zastosowanie w różnych modelach uszkodzeń i chorób OUN u wielu gatunków.

Wprowadzenie

Terapia komórkami macierzystymi (SC) ma ogromny potencjał w leczeniu chorób neurologicznych, w tym udaru, urazów głowy i demencji1,2,3,4,5,6. Jednak skuteczna metoda dostarczania egzogennych SC do chorego mózgu pozostaje problematyczna2,6,7,8,9,10,11,12,13. SC dostarczane obwodowymi drogami, w tym dożylnie (IV) lub dootrzewnowe (IP), podlegają pierwszej filtracji w mikrokrążeniu, zwłaszcza w płucach, wątrobie, śledzionie i mięśniach8,9,13,14, co zwiększa prawdopodobieństwo akumulacji komórek w obszarach niedocelowych. Inwazyjna metoda iniekcji domózgowej powoduje miejscowe uszkodzenie tkanki mózgowej i bardzo ograniczoną dystrybucję SC w pobliżu miejsca wstrzyknięcia2,6,8,14,15,16. Niedawno opracowaliśmy metodę iniekcji dotętniczej opartej na cewniku w celu dostarczania egzogennych neuronalnych SC (NSC), która jest opisana tutaj stosowana w modelu ogniskowego udaru niedokrwiennego u gryzoni. Indukujemy przejściowe (1 h) uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne w jednej półkuli za pomocą filamentu pokrytego gumą silikonową, aby zamknąć lewą środkową tętnicę mózgową (MCA) u myszy lub szczura17,18,19. W tym modelu zaobserwowaliśmy w sposób powtarzalny około 75-85% depresję przepływu krwi w mózgu (CBF) w półkuli ipsilateralnej za pomocą laserowego dopplera lub laserowego obrazowania plamkowego17,19, co daje stałe deficyty neurologiczne17,18,19.

Dla oszczędności czasu, wideo jest ustawione na odtwarzanie z dwukrotnie większą prędkością, a rutynowe procedury chirurgiczne, takie jak przygotowanie skóry i zamykanie ran za pomocą szwu oraz użycie i konfiguracja pompy strzykawkowej z napędem silnikowym, nie są prezentowane. Sposób dotętniczego dostarczania NSC przedstawiono w kontekście modelu niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO) eksperymentalnego udaru mózgu u gryzoni. Dlatego uwzględniamy procedurę przejściowego udaru niedokrwiennego, aby później zademonstrować, w jaki sposób druga operacja, wstrzyknięcie dotętnicze, jest wykonywana przy użyciu poprzedniego miejsca operacyjnego u tego samego zwierzęcia. Wykonalność dotętniczego podawania NSC w modelach udaru gryzoni wykazano poprzez ocenę dystrybucji i przeżycia egzogennych NSC. Skuteczność terapii NSC w łagodzeniu patologii mózgu i dysfunkcji neurologicznych zostanie opisana oddzielnie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kentucky, a także podjęto odpowiednie starania, aby zminimalizować stres lub ból związany z operacją.

1. Przygotowanie cewnika iniekcyjnego i haków chirurgicznych

  1. Zbuduj cewnik do iniekcji (Rysunek 1). Zbierz niezbędne materiały, w tym: rurki MRE010, MRE025 i MRE050, igły iniekcyjne 20 G, 26 G i 27 G (Rysunek 2A), papier ścierny o ziarnistości 600, superglue i dwuskładnikowa 5-minutowa żywica epoksydowa.
    1. Odciąć igły 20 G i 26 G w odległości 1 cm od piasty igły i wypolerować koniec na papierze ściernym (Rysunek 2B). Przepłukać igły 10 ml podwójnie destylowanej wody, aby oczyścić otwór igły.
      UWAGA: Używane są dwa różne projekty (Rysunek 1). Konstrukcja 1 ma pojedyncze złącze i służy do wstrzykiwania roztworów lub zawiesin. Konstrukcja 2 posiada złącza Luer lock 20 G i 26 G do wstrzykiwania komórek (igła 20 G) i przepłukiwania martwej objętości (igła 26 G) w celu zapewnienia dostarczenia pełnej objętości roztworu zawierającego NSC.
  2. Wzór 1: Włożyć cewnik MRE010 o długości 3-4 cm do cewnika MRE025 o długości 15 cm i zabezpieczyć klejem superglue.
    1. Podłącz drugi koniec rurki MRE025 do segmentu cewnika MRE050 i zabezpiecz klejem superglue. Włóż stępioną igłę 20 G do pozostałego końca cewnika MRE050 i zabezpiecz klejem superglue (Rysunek 1).
    2. Dodatkowo wzmocnij miejsca połączeń klejem epoksydowym. Ta konstrukcja cewnika jest optymalna do wstrzykiwania odczynników (takich jak roztwory chemiczne lub leki lub inne leki biologiczne, takie jak cytokiny).
  3. Wzór 2: Włóż cewnik MRE010 o długości 3-4 cm do cewnika MRE025 o długości 15 cm i zabezpiecz klejem superglue.
    1. Podłącz drugi koniec rurki MRE025 do segmentu cewnika MRE050 i zabezpiecz klejem superglue. Włóż stępioną igłę 20 G do pozostałego końca cewnika MRE050 i zabezpiecz klejem superglue.
    2. Włóż stępioną igłę 26 G do probówki MRE050 w pobliżu końcówki pierwszej igły, zgodnie z kierunkiem przepływu wtrysku i zabezpiecz klejem superglue (Rysunek 1 i Rysunek 2C). Wzmocnij obie igły i segment rurki MRE050 przezroczystą żywicą epoksydową (Rysunek 2C). Taka konstrukcja umożliwia wstrzyknięcie roztworu nośnika przez igłę 2 (26 G) po wstrzyknięciu NSC przez igłę 1 (20 G) w celu wypłukania martwej objętości cewnika do krążenia mózgowego, uzyskując bardziej precyzyjną kontrolę objętości wstrzyknięć.
    3. Do wstrzykiwania NSC należy użyć igły 20 G, aby zminimalizować uszkodzenia NSC, które mogłyby niekorzystnie wpłynąć na ich żywotność.
  4. Po zbudowaniu przepłucz cewniki 10 ml podwójnie destylowanej wody, a następnie 70% etanolu, a następnie zanurz je w 70% etanolu przez noc.
  5. Przed zabiegiem należy usunąć cewniki z 70% etanolu i przepłukać 10 ml sterylnego PBS, a następnie umieścić je w autoklawizowanej skrzynce z narzędziami chirurgicznymi do przechowywania i transportu.
  6. Przygotowanie haczyków chirurgicznych
    1. Wytnij trzon igły o długości 1,5-2 cm z igły 27 G i wypoleruj oba końce na papierze ściernym, aż będzie matowy. Następnie użyj małego zacisku hemostatycznego, aby zgiąć wałek w hak na jednym końcu i w kształt pierścienia na drugim końcu.
    2. Przełóż cewnik MRE025 o długości 10-15 cm przez pierścień i zabezpiecz przezroczystą taśmą chirurgiczną (Rysunek 2D). Wykonaj jeszcze 2 haczyki tą samą metodą.
    3. Namocz wszystkie haczyki i systemy cewników w 70% etanolu do czasu użycia.

2. Przygotowanie zwierząt: dostawa, trzymanie, adaptacja do środowiska

  1. W badaniu wykorzystano samce i samice myszy C57BL/6 (10-12 tygodni, n=10/punkt czasowy) oraz szczury Wistar (10-12 tygodni, n=10).
  2. Umieść je w kontrolowanym środowiskowo wiwarium dla zwierząt z jedzeniem i wodą ad libitum.
  3. Pozwól im przystosować się do środowiska co najmniej 1 tydzień przed zabiegiem mózgu.
    UWAGA: Jedna mysz i jeden szczur zmarły w wieku 1 dni po operacji udaru, a jedna mysz została poddana eutanazji w 3 dniu po udarze przed wstrzyknięciem NSC z powodów humanitarnych z powodu ciężkiego paraliżu.

3. Hodowla mysich i szczurzych nerwowych komórek macierzystych (NSC)

UWAGA: NSC zostały odizolowane i hodowane zgodnie z ustalonym protokołem20.

  1. mysz
    1. Wyizoluj NSC typu dzikiego (WT) i znakowane GFP z kory embrionalnej E18 od samic myszy C57BL / 6 w ciąży w czasie połączonych z samcami myszy GFP-dodatnich (B6 ACTb-EGFP). Aby zidentyfikować zarodki GFP (+), należy obserwować pobrane zarodki pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu kanału FITC. Zarodki GFP (+) dają zielony sygnał fluorescencji, podczas gdy zarodki WT wykazują tylko słabą autofluorescencję (Rysunek 3A).
  2. szczur
    1. Wyizolować NSC ze strefy podkomorowej (SVZ) młodych dorosłych szczurów WT. Oznacz je DiI tuż przed wstrzyknięciem, postępując zgodnie z instrukcjami producenta21.
  3. Hoduj myszy lub szczury NSC, aż rozwiną się w neurosfery i przejdź przez nie, gdy średnica kuli osiągnie około 100 μm (Rysunek 3B). Do wstrzykiwań między przejściami 3 i 5 należy stosować NSC.
  4. Sprawdź ich właściwości komórek macierzystych za pomocą panelu markerów embrionalnych komórek macierzystych (Rysunek 3C).
  5. W dniu wstrzyknięcia zebrać kulki NSC i zdysocjować z roztworem do odrywania komórek, zawiesić w PBS wolnym od wapnia i magnezu do stężenia 10-7 komórek/ml i umieścić na mokrym lodzie do momentu wstrzyknięcia.

4. Przygotowanie chirurgiczne

  1. Przed zabiegiem należy zaznaczyć kropkę na komercyjnym szwie MCAO srebrnym markerem w odległości 9 mm (dla myszy) lub 15 mm (dla szczurów) od końcówki, aby uzyskać odniesienie do długości wprowadzenia podczas operacji. Autoklaw w autoklawie narzędzi chirurgicznych (nożyczki, kleszcze) i narzędzia przed każdym zabiegiem i sterylizuj je na gorąco w sterylizatorze z kulkami szklanymi między operacjami.
  2. Wywołać znieczulenie u zwierząt za pomocą 5% izofluranu poprzez inhalację i utrzymać znieczulenie za pomocą 1-2% izofluranu. Oceń głębokość znieczulenia poprzez obserwację warunków ogólnych (wzorzec oddychania, ruch wąsów i spontaniczna postawa korekcyjna ciała), odruchu rogówkowego i reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
  3. Połóż zwierzę na wznak na poduszce grzewczej i przygotuj miejsce operacji na zwierzęciu, przycinając i szorując roztworem betadyny, a następnie 70% etanolem. Chroń oczy zwierzęcia przed wysuszeniem, stosując maść okulistyczną (np. maść na sztuczne łzy) podczas zabiegu.
  4. Niech chirurdzy dokładnie wyszorują ręce peelingiem bakteriobójczym i załóż maskę, sterylne rękawiczki i czysty fartuch laboratoryjny.

5. Operacja udaru z powodu niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO)

UWAGA: Operacje mające na celu wywołanie udaru niedokrwiennego u jednej półkuli myszy lub szczura są podobne pod tym względem, że szew jest wprowadzany do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) w celu zablokowania przepływu krwi (Rysunek 4)17,18,19,22. Jednak tętnica wybrana do wprowadzenia szwów różni się w zależności od dostępnej przestrzeni operacyjnej wymaganej do późniejszego wstrzyknięcia komórek macierzystych. Szczur ma wystarczająco dużo miejsca w segmencie tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA), aby umożliwić dwie oddzielne, sekwencyjne operacje (udar i wstrzyknięcie NSC), ale mysz nie ma, co wymaga alternatywnego podejścia. Wywołane udarem zmiany przepływu krwi w mózgu, rozmiar zawału mózgu i deficyty neurologiczne zostały zgłoszone tak, jak w poprzednich raportach autorów17,18,19.

  1. Aby wywołać udar niedokrwienny, należy rozpocząć operacje zarówno na myszach, jak i szczurach od nacięcia w linii środkowej w obszarze szyjki macicy i izolacji lewej tętnicy szyjnej wspólnej (CCA), ECA i ICA (Ryc. 4). Zachowaj ostrożność, aby nie rozciągać, nie przesuwać ani nie ściskać CCA lub nerwu błędnego. Ponieważ wybór tętnicy i etapy chirurgiczne są później różne, operacja MCAO na myszy i szczurze zostanie opisana osobno.
  2. Operacja MCAO na myszy (Rysunek 4A)
    1. Umieść trzy plecione nylonowe szwy 6-0 pod CCA (Rysunek 4A, krok 1) i wykonaj jeden ciasny węzeł chirurgiczny, aby zamknąć naczynie jak najdalej od rozwidlenia za pomocą proksymalnego sznurka (Rysunek 4A, krok 2). Przytnij końce szwów.
    2. Zrób węzeł ślizgowy po dystalnej stronie CCA (uwaga: nie zaciskaj zbyt mocno, ponieważ zostanie zwolniony w kroku 6) i jeden luźny węzeł pomiędzy dwoma zaciśniętymi węzłami (Rysunek 4A, krok 2).
    3. Wytnij małe nacięcie (~ 1/4 - 1/3 obwodu) w pobliżu bliższego węzła na CCA za pomocą mikronożyczek (Rysunek 4A, krok 3) i ostrożnie włóż komercyjny szew nylonowy 7-0 pokryty gumą silikonową (Rysunek 4A, krok 4). Zabezpiecz ten szew środkowym sznurkiem, zaciskając go wystarczająco (Rysunek 4A, krok 5), aby zapewnić brak wycieku krwi z nacięcia i ruch włókna nylonowego pokrytego gumą silikonową przez przepływ wsteczny z ICA, jednocześnie umożliwiając przesuwanie szwu w kierunku ECA za pomocą delikatnego naciśnięcia pęsetą.
    4. Zwolnij górny (dystalny) węzeł ślizgowy (Rysunek 4A, krok 6) i wsuń nylonowy szew do ICA, aż jego końcówka przejdzie przez rozwidlenie na 9 mm (używając srebrnego markera na szwie jako odniesienia). Zaciśnij dwa górne węzły, aby zabezpieczyć szew i zapobiec cofaniu się krwi.
    5. Wyjmij filament 1 godzinę później (Rysunek 4A, krok 7) i podwiąż CCA za pomocą środkowego węzła, aby zapobiec krwawieniu (Rysunek 4A, kroki 5-7 w odwrotnej kolejności, końcowe wyniki jak pokazano w kroku 8). Zwolnij górny węzeł. Zamknij ranę szwem chirurgicznym 4-0.
  3. Operacja MCAO na szczurze (Rysunek 4B)
    1. Umieść dwa plecione szwy nylonowe 6-0 pod ECA (Rysunek 4B, krok 1) i wykonaj jeden ciasny węzeł na dystalnym końcu tak daleko, jak to możliwe (Rysunek 4B, krok 2).
    2. Umieść klipsy naczyń na ICA i CCA, aby zablokować przepływ krwi tętniczej (Rysunek 4B, krok 3). Węzeł slipknot może być używany jako alternatywa dla klipsa do naczynia.
    3. Wykonaj małe nacięcie na ECA za pomocą mikronożyczek (Rysunek 4B, kroki 3-4), włóż komercyjne nylonowe włókno 6-0 pokryte gumą silikonową (Rysunek 4B, krok 5) i odpowiednio zabezpiecz węzłem ślizgowym na ECA.
    4. Zwolnij zacisk naczynia na ICA, wsuń włókno do ICA, aż srebrny znacznik (15 mm) osiągnie rozwidlenie (Rysunek 4B, krok 6), a następnie zabezpiecz szew 2. węzłem na ECA (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B, krok 6).
    5. Po 1 godzinie niedokrwienia wycofaj to włókno i podwiąż nacięcie, aby zapobiec krwawieniu (Rysunek 4B, krok 7), usuń klips do naczynia z CCA (wynik końcowy jak w kroku 8) i zamknij ranę szwem chirurgicznym 4-0.

6. Odzyskiwanie

  1. Po operacji udaru należy umieścić zwierzęta na poduszce grzewczej, aż w pełni odzyskają przytomność.
  2. Zapewnić analgezję poprzez wstrzyknięcie podskórne. Powrót zwierząt do ich domowych klatek z dostępem do wody i pożywienia ad libitum.

7. Wstrzyknięcie dotętnicze

  1. Umyj cały cewnik 70% etanolem i moczyć przez noc do użycia. Tuż przed wstrzyknięciem należy połączyć blokadę Luer igły ze sterylną strzykawką i przemyć całą stronę światła układu cewnika 10 ml jałowego PBS.
  2. Okno czasowe i przygotowanie do iniekcji NSC
    UWAGA: Opierając się na doświadczeniu i raportach innych zespołów badawczych, czas wstrzyknięcia NSC ma kluczowe znaczenie dla przeżycia zarówno pacjentów, jak i egzogennych NSC. W naszym badaniu pilotażowym wstrzyknięcie NSC we wczesnych punktach czasowych (w ciągu pierwszych 6 godzin po reperfuzji) prowadziło do wyższej śmiertelności. W związku z tym przetestowaliśmy późniejsze punkty czasowe wstrzyknięcia i ustaliliśmy, że okno czasowe między 2 d (48 h) a 3 d (72 h) po udarze jest bezpieczne i tolerowane dla zwierząt oraz jest skuteczne w osiąganiu intraparenchymalnego rozkładu NSC. Wyniki przedstawione w niniejszym dokumencie pochodzą od zwierząt, którym wstrzyknięto NSC w 3 dniu po urazie.
    1. Ustawić szybkość wstrzykiwania pompy strzykawkowej na 20 μl/min dla myszy i 50 μl/min dla szczurów. Nadmierna prędkość lub czas trwania wstrzyknięcia może powodować ogólnoustrojowe przeciążenie objętościowe, na które myszy są bardziej podatne niż szczury.
    2. Krótko mówiąc, po 3 dniach od operacji udaru znieczulij zwierzęta izofluranem i połóż je na wznak na poduszce grzewczej.
    3. Ponownie otwórz ranę szyjki macicy i ponownie odsłonij ECA, ICA i CCA (Rysunek 5, krok 1). Podobnie jak w przypadku operacji udarowych, należy określić drogę wstrzyknięcia w zależności od gatunku. Użyj CCA do wstrzyknięcia NSC do myszy i ECA do klasy rat23.
  3. Wstrzyknięcie dotętnicze przez CCA u myszy
    1. Umieść dwa plecione nylonowe szwy 6-0 pod CCA. Utwórz luźny węzeł ślizgowy z każdym z nich między rozwidleniem a dolnymi węzłami z poprzedniej operacji udaru (Rysunek 5, krok 2).
    2. Zaciśnij górny węzeł ślizgowy, a następnie wykonaj małe nacięcie powyżej dolnego węzła (Rysunek 5, krok 3). Wprowadzić cewnik MRE010 przez nacięcie (Rysunek 5, krok 4) i zabezpieczyć środkowym węzłem bez blokowania przepływu iniekcji (Rysunek 5, krok 5). Cofanie się krwi powinno być widoczne w cewniku po zwolnieniu górnego węzła i regulacji położenia cewnika.
    3. Umieścić klips do naczynia w ECA, wstrzyknąć 1 x 106 GFP-NSC przez ten cewnik z prędkością 20 μl/min przez 5 minut za pomocą pompy strzykawkowej, a następnie przepłukać 50-100 μl PBS z tą samą prędkością.
    4. Po wstrzyknięciu podwiązać CCA powyżej nacięcia za pomocą górnego węzła poślizgowego i wycofać cewnik MRE010 (Rysunek 5, krok 6). Zaciśnij i przytnij środkowy węzeł i górny węzeł. Zdemontować zacisk naczynia z ECA. Zapoznaj się z ostatnim obrazem w Rysunek 5, krok 7.
    5. Zamknij ranę szwem chirurgicznym 4-0.
    6. Po zapewnieniu odpowiedniej rekonwalescencji na poduszce grzewczej i podskórnym wstrzyknięciu przeciwbólowym, zwierzęta należy umieścić z powrotem w ich domowej klatce.
  4. Wstrzyknięcie dotętnicze przez ECA u szczura
    1. Tymczasowo zasłoń ECA i CCA za pomocą klipsów do naczyń (Rysunek 5, krok 2).
    2. Wykonaj małe nacięcie po bliższej stronie ECA (Rysunek 5, krok 3), włóż cewnik MRE010 i zabezpiecz węzłem (Rysunek 5, krok 4).
    3. Usuń oba zaciski naczyń, wstrzyknij 5 x 106 NSC w 100 μl PBS przy 50 μl/min przez 2 minuty, a następnie przepłucz 50-100 μl PBS (Rysunek 5, krok 5) z tą samą prędkością, używając zmotoryzowanej pompy strzykawkowej.
    4. Po wstrzyknięciu ponownie zamknij CCA i ECA za pomocą klipsów naczyniowych i podwiąż ECA po bliższej stronie drugiego nacięcia po wycofaniu cewnika iniekcyjnego (Rysunek 5, krok 6).
    5. Usuń dwa klipsy do naczyń krwionośnych (Rysunek 5, krok 7) i zamknij ranę szwem chirurgicznym 4-0.
    6. Po zapewnieniu odpowiedniej rekonwalescencji na poduszce grzewczej i podskórnym wstrzyknięciu przeciwbólowym, zwierzęta należy umieścić z powrotem w ich domowej klatce.
  5. Test histologiczny
    1. Zbierz mózgi myszy i szczurów, które otrzymały udar niedokrwienny, a następnie wstrzyknięcie NSC lub roztworu nośnika po eutanazji i perfuzji wewnątrzsercowej z 4% paraformaldehydem w 1 dniu (mysz i szczur), 7 dni (mysz) i 30 dni (mysz) po wstrzyknięciu. Każda z tych czterech grup składała się z 5 zwierząt z NSC i 5 zwierząt, którym wstrzyknięto pojazd.
    2. Napraw mózgi na noc i kriokonserwuj w 30% sacharozie przez 3 dni.
    3. Osadź mózgi w OCT, pokrój na plasterki o grubości 40 μm i zbadaj rozkład NSC po barwieniu immunologicznym markerami specyficznymi dla komórek, w tym kwaśnym białkiem fibrylarnym gleju (GFAP, astrocyty), Tuj1 (dojrzałe neurony) i podwójną kortyną (DCX, niedojrzałe neurony).
      UWAGA: Ze względu na brak szczepu szczura, który wykazuje ekspresję GFP, zastosowaliśmy DiI, przejściowy znacznik fluorescencyjny, dla NSC szczurów, który pozwala tylko na stosunkowo krótkotrwałą obserwację. W związku z tym dystrybucję NSC badano tylko po 1 dniu po udarze u szczurów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Oznakowane GFP komórki NSC zostały łatwo wykryte w niedokrwiennym mózgu, głównie w półkuli ipsilateralnej, zwłaszcza w penumbrze oraz wzdłuż krawędzi uszkodzenia (Rysunek 6). Badacz podczas obrazowania i analizy działał w trybie pojedynczej ślepej próby.

Na przykład w 1 d po wstrzyknięciu w hipokampie myszy wykryto komórki NSC. Podgrupa komórek NSC wykazała koekspresję markera niedojrzałych neuronów DCX w zakręcie zębatym nawet w tym wczesnym punkcie czasowym (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Terapia komórkami macierzystymi w chorobach neurologicznych jest wciąż na wczesnym etapie badań. Jednym z głównych problemów jest to, że nie ma ustalonej metody wystarczającego dostarczania SC lub NSC do mózgu.

Chociaż egzogenne SC/NSC można wykryć w mózgu po wstrzyknięciu dożylnym (IV), dootrzewnowym (IP) lub śródmiąższowym/domózgowym, każde podejście do podawania ma wady. Szacuje się, że wykrywalna populacja w mózgu jest bardzo niska w przypadku wstrzyknięcia obwodowego (IV lub IP), stanowią...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez: AHA Award 14SDG20480186 dla LC, Zespół ds. innowacji tematycznych Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Shanxi 2019-QN07 dla BZ oraz grant Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust 14-12A dla KES i LC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła 20 GBecton & DickinsonBD PrecisionGlide 305175przygotowanie cewnika iniekcyjnego
igła 26 GBecton & DickinsonBD PrecisionGlide 305111przygotowanie cewnika iniekcyjnego
igła 27 GBecton & DickinsonBD PrecisionGlide 305136przygotowanie cewnika iniekcyjnego
4-0 NFS-2 szew z igłąHenry Schein Animal Health56905chirurgia
6-0 szew nylonowyTeleflex/Braintree Scientific104-schirurgia
AccutaseSTEMCELL Technologies7922roztworu do odrywania komórek
Bard-Parker10chirurgia
Buprenorphine-SR LabZooPharmBuprenorphine-SR Lab®analgezja (0,6-1 mg/kg powyżej 3 dni)
Bez wapnia/magnisum PBSVWR02-0119-0500NSC dysocjacja
przeciwciało DCXMilliporeAB2253immunostaining
przeciwciało GFAPInvitrogen180063barwienie immunologiczne
IsofluranHenry Schein Animal Health50562-1chirurgia
Filament MCAO dla myszyDoccol702223PK5Rechirurgia
Filament MCAO dla szczuraDoccol503334PK5Rechirurgia
Cewnik MRE010Braintree ScientificMRE010przygotowanie cewnika iniekcyjnego
Cewnik MRE025Braintree ScientificMRE025przygotowanie cewnika iniekcyjnego
Cewnik MRE050Braintree ScientificMRE050przygotowanie cewnika iniekcyjnego
Nu-Tears MaśćNuLife PharmaceuticalsNu-Tears Maść pielęgnacjaoczu podczas zabiegu
S& Kleszcze T - Końcówki SuperGrip JF-5TC Kątowenarzędzia naukowe00649-11chirurgia
S& Kleszcze T - Końcówki SuperGrip JF-5TC Prostenarzędzia do nauki00632-11chirurgia
SupergluePacer Technology15187przygotowanie cewnika iniekcyjnego
pompa strzykawkowaKent ScientificGenieTouchchirurgia
Przeciwciało Tuj1MilliporeMAb1637dwuskładnikowa
żywica epoksydowaDevcon20445przygotowanie cewnika iniekcyjnego
Nożyczki sprężynowe VannasFine Science Tools15000-08chirurgia
zaciski naczynioweFine Science Tools00400-03chirurgia
Mikroskop ZeissMikroskopia ZeissAxio Imager 2
ostrze precyzyjnej do barwienia immunologicznego

Bibliografia

  1. Wang, Y. Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances. The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).
  2. Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke. 38, 817-826 (2007).
  3. Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke. Stem Cell Research & Therapy. 9, 154(2018).
  4. Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells. Stroke. 49, 1091-1098 (2018).
  5. Savitz, S. I. Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics. Stroke. 49, 1056-1057 (2018).
  6. Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. Cell Therapy for Chronic Stroke. Stroke. 49, 1066-1074 (2018).
  7. Muir, K. W. Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned. Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).
  8. Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke. Stroke. 49, 1075-1082 (2018).
  9. Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke. Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).
  10. Argibay, B., et al. Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia. Scientific Reports. 7, 40758(2017).
  11. Kelly, S., et al. Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).
  12. Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).
  13. Fischer, U. M., et al. Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect. Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).
  14. Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy. Neurology. 79, 207-212 (2012).
  15. Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. Intracranial delivery of stem cells. Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).
  16. Boltze, J., et al. The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke. Frontiers in Neurology. 6, 155(2015).
  17. Huang, C., et al. Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats. Neuroimage. 198, 160-169 (2019).
  18. Wong, J. K., et al. Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice. PLoS One. 10, 0136967(2015).
  19. Zhang, B., et al. Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke. Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).
  20. Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells. The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, 20130001(2013).
  22. Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  23. Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  24. Chua, J. Y., et al. Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).
  25. Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies. Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).
  26. Duma, C., et al. Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients. Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

wspólna tętnica szyjnazewnętrzna tętnica szyjnazamknięcie tętnicy środkowej mózgukomórki znakowane GFPhaczyki chirurgicznecewnik do iniekcjiterapia komórkami macierzystymi
Dotętnicze dostarczanie nerwowych komórek macierzystych do mózgu szczura i myszy: zastosowanie do niedokrwienia mózgu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.