Artykuł metodologiczny

Zaawansowane modele 3D wątroby do badań genotoksyczności in vitro po długotrwałym narażeniu na nanomateriały

DOI:

10.3791/61141

⸱

5 czerwca 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1In vitro Toxicology Group, Swansea University Medical School

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta procedura została ustanowiona do wykorzystania do rozwoju zaawansowanych hodowli wątroby 3D in vitro, które mogą dostarczyć bardziej fizjologicznie istotną ocenę zagrożeń genotoksycznych związanych z ekspozycją na nanomateriały zarówno w ostrym, jak i długotrwałym, powtarzanym dawce.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na szybki rozwój i implementację różnorodnych nanomateriałów inżynieryjnych (ENM), narażenie na ENM jest nieuniknione, a rozwój solidnych, predykcyjnych systemów testowych in vitro jest niezbędny. Toksykologia wątroby ma kluczowe znaczenie przy rozważaniu narażenia na ENM, ponieważ wątroba odgrywa istotną rolę w homeostazie metabolicznej i detoksykacji, a także jest głównym miejscem akumulacji ENM po ekspozycji. Opierając się na tym i przyjętym zrozumieniu, że modele hepatocytów 2D nie naśladują dokładnie złożoności skomplikowanych interakcji wielokomórkowych i aktywności metabolicznej obserwowanej in vivo, kładzie się większy nacisk na rozwój fizjologicznie istotnych modeli 3D wątroby dostosowanych do celów oceny zagrożeń ENM in vitro. Zgodnie z zasadami zasady 3R w celu zastąpienia, ograniczenia i udoskonalenia eksperymentów na zwierzętach, opracowano model wątroby oparty na linii komórkowej 3D HepG2, który jest przyjaznym dla użytkownika, opłacalnym systemem, który może obsługiwać zarówno przedłużone, jak i powtarzające się reżimy ekspozycji ENM (≤14 dni). Te sferoidalne modele (o średnicy ≥500 μm) zachowują swoją zdolność proliferacyjną (tj. dzielące się modele komórek), co pozwala na ich sprzężenie ze "złotym standardem" testu mikrojądrowego w celu skutecznej oceny genotoksyczności in vitro. Ich zdolność do informowania o szeregu toksykologicznych punktów końcowych (np. czynność wątroby, odpowiedź (pro)zapalna, cytotoksyczność i genotoksyczność) została scharakteryzowana przy użyciu kilku ENM zarówno w reżimie ostrego (24 godziny), jak i długotrwałego (120 godzin). Ten trójwymiarowy model wątroby in vitro może być wykorzystany do oceny bardziej realistycznych ekspozycji na ENM, zapewniając w ten sposób przyszłe podejście in vitro, które lepiej wspiera ocenę zagrożeń ENM w rutynowy i łatwo dostępny sposób.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na szybki rozwój i implementację różnorodnego zestawu nanomateriałów inżynieryjnych (ENM) w wielu zastosowaniach opartych na ludziach (np. żywność, kosmetyki, odzież, sprzęt sportowy, elektronika, transport i medycyna), nieuniknione jest, że ludzie będą regularnie narażeni na działanie ENM. W związku z tym rosną obawy, że nowatorskie, specyficzne dla wielkości właściwości fizykochemiczne, które sprawiają, że materiały te są korzystne w wielu zastosowaniach, mogą jednocześnie powodować niekorzystne skutki dla zdrowia ludzkiego i środowiska. Obecnie prowadzonych jest wiele międzynarodowych działań mających na celu aktywne odzwierciedlenie bardziej fizjologicznie istotnych ekspozycji na te ENM i ocenę potencjalnej toksyczności tych materiałów w porównaniu z ostrymi, długoterminowymi i powtarzającymi się scenariuszami narażenia na niskie dawki.

Toksykologia wątroby jest kluczowa przy rozważaniu ekspozycji na ENM, ponieważ powszechnie wiadomo, że wątroba jest głównym miejscem akumulacji ENM po ekspozycji1,2. Co więcej, wątroba jest głównym układem narządowym odpowiedzialnym za metabolizm i detoksykację substancji, które wchodzą do krążenia ogólnoustrojowego3. Opierając się na przyjętym zrozumieniu, że modele hepatocytów 2D nie naśladują dokładnie złożoności skomplikowanych interakcji wielokomórkowych ani odpowiednio nie reprezentują aktywności metabolicznej obserwowanej in vivo, położono większy nacisk na opracowanie solidnych i fizjologicznie istotnych modeli wątroby 3D in vitro dla technologii zastępczych in vivo4,5. Wykorzystanie zaawansowanych technologii hodowli 3D poprawia trwałość modeli wątroby in vitro, umożliwiając badanie długoterminowych, powtarzających się reżimów ekspozycji. Dodatkowo, ten zaawansowany format hodowli sprzyja tworzeniu ulepszonych fizjologicznych, organotypowych cech, takich jak kanaliki żółciowe, aktywne procesy transportowe i ulepszone zdolności metabolizowania leków CYP450, poprawiając w ten sposób przewidywalność modeli6. Obecne modele wątroby 3D in vitro składające się z monokultur (tylko hepatocyty) lub kokultur (hepatocyty z komórkami niemiąższowymi) istnieją w kilku formatach, począwszy od mikrotkanek lub sferoid w płytkach o bardzo niskiej przyczepności, sferoid wiszących kropli, komórek osadzonych w matrycach i/lub rusztowaniach oraz mikroprzepływowych platform do hodowli komórek, z których wszystkie są uważane za skuteczne zaawansowane modele in vitro do oceny toksyczności wątrobowej6, 7. Jednak większość tych modeli systemów wymaga dużej konserwacji, wymaga specjalistycznego sprzętu i jest droga. Ponadto modele te są często statyczne (tj. niedzielące się modele komórek), co uniemożliwia ich wykorzystanie w ocenie punktów końcowych zagrożenia, takich jak badania genotoksyczności z wykorzystaniem metod określających ilościowo utrwalone uszkodzenia DNA. Genotoksyczność jest podstawowym warunkiem wstępnym w toksykologii regulacyjnej i jest istotnym elementem oceny ryzyka każdego produktu toksycznego8. Nie ma jednego testu, który można by zastosować do ilościowego określenia wszystkich form uszkodzeń DNA, które mogą powstać po ekspozycji na czynnik egzogenny. Jednak kluczowym elementem zestawu testów genotoksyczności in vitro jest test mikrojądrowy, który jest wiarygodną i wieloaspektową techniką pomiaru poważnych uszkodzeń chromosomów9. Jest to złoty standard techniki opisanej w Wytycznej OECD dotyczącej badań 487, służącej do oceny uszkodzeń DNA i genotoksyczności in vitro i jest częścią wymogu dotyczącego baterii testowej do oceny zagrożeń regulacyjnych10,11.

Linia komórkowa ludzkiego raka wątrobowokomórkowego, HepG2, jest szeroko stosowana do wstępnej oceny ryzyka, ponieważ komórki są łatwo dostępne, stosunkowo tanie w pozyskiwaniu, proste do hodowli i podatne na wysokoprzepustowe badania przesiewowe12,13. Wykazano, że po wyhodowaniu w sferycznych strukturach 3D dobrze podsumowują mikrośrodowisko wątroby i oferują model wątroby o wystarczających zdolnościach proliferacyjnych, aby wesprzeć test mikrojądrowy3. Dalsze prace nad modelami sferoidalnymi HepG2 miały na celu poprawę trwałości i funkcjonalności podobnej do wątroby modelu, aby ułatwić ocenę zagrożenia genotoksycznością w długotrwałych, powtarzających się reżimach narażenia (≤14 dni). W związku z tym, zgodnie z zasadami zasady 3R w celu zastąpienia, ograniczenia i udoskonalenia doświadczeń na zwierzętach, niniejszy protokół został ustanowiony w celu zapewnienia zaawansowanego modelu 3D wątroby in vitro, zdolnego do wiarygodnej oceny wielu toksykologicznych punktów końcowych (np. funkcjonalności wątroby, markerów (pro)zapalnych, cytotoksyczności i genotoksyczności) po ostrym, długotrwałym i powtarzającym się narażeniu na chemikalia i ENM w rutynowy i łatwo dostępny sposób.

Tutaj prezentujemy metodę tworzenia fizjologicznie istotnego systemu modelowego 3D hepatocytów opartego na modelu in vitro do oceny zagrożenia genotoksyczności po ostrych lub długotrwałych, powtarzających się ekspozycjach na ENM. Protokół można podzielić na 6 kluczowych etapów: hodowla kriokonserwowanych komórek HepG2; Preparat sferoidalny HepG2; Przeniesienie sferoidu HepG2 z wiszącej kropli do zawiesiny agarozy; Zbiór sferoidów HepG2; oznaczanie i punktowanie mikrojądrowe; i analiza danych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.Hodowla kriokonserwowanych komórek HepG2

UWAGA: Komórki HepG2, uzyskane z American Type Culture Collection (ATCC) były hodowane w 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z 4,5g/L D-glukozy i L-glutaminą uzupełnioną 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% antybiotyku penicyliny/streptomycyny.

  1. Wstępnie podgrzej pożywkę do hodowli komórkowych DMEM (wraz z suplementami) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  2. Wyjąć jedną fiolkę z komórkami HepG2 z ciekłego azotu i rozmrażać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty, delikatnie obracając fiolkę, aby umożliwić równomierne rozmrożenie zawiesiny komórek. Należy uważać, aby nie zanurzyć fiolki powyżej pierścienia uszczelniającego o przekroju okrągłym, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia.
  3. Po rozmrożeniu wyjmij fiolkę z łaźni wodnej i spryskaj obficie 70% etanolem w celu odkazania zewnętrznej powierzchni fiolki przed umieszczeniem pod sterylnym kapturem do laminarnej hodowli tkanek klasy II.
  4. Ostrożnie odpipetować zawartość kriowialnego komórek HepG2 do probówki wirówkowej zawierającej 9 ml wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych DMEM (z dodatkami).
  5. Używając 10 ml pasków, przenieś 10 ml zawiesiny komórkowej do jednorazowej kolby do hodowli komórkowych o średnicy 25cm2 i inkubuj kulturę przez 3 dni (od wysiewu) w temperaturze 5%CO2 i temperaturze 37 °C, aż do osiągnięcia ~80% zbiegu przed poddaniem podhodowli do większej jednorazowej kolby do hodowli komórkowej o średnicy 75cm2.
  6. Po osiągnięciu 80% zbieżności, subhodowla komórek w sterylnych warunkach przez trypsynizację 0,05% roztworem trypsyny/EDTA wstępnie podgrzanym w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez 30 minut. W żadnym momencie nie należy dopuścić do wyschnięcia komórek.
  7. Gdy komórki tworzą przylegającą monowarstwę, usuń pożywkę, wrzucając ją do pojemnika na odpady dezynfekujące. Następnie natychmiast umyj monowarstwę w celu usunięcia wszelkich śladów istniejącego podłoża, dwukrotnie przepłukując kolbę 3 ml sterylnego roztworu 1x PBS przechowywanego w temperaturze pokojowej. Wyrzuć również PBS do pojemnika na odpady dezynfekujące.
  8. Po usunięciu płukania PBS dodać 5 ml wstępnie podgrzanego 0,05% roztworu trypsyny-EDTA, upewniając się, że pokryjesz całą powierzchnię komórek i inkubuj komórki przez 6-8 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  9. Delikatnie postukać w kolbę, aby usunąć komórki z dna kolby, a następnie dodać 5 ml pożywki do hodowli komórek DMEM (z suplementami) w celu zneutralizowania enzymu trypsyny.
  10. Przenieś zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dokładnie pipetuj zawiesinę komórek w górę iw dół, aby upewnić się, że komórki są całkowicie oddzielone.
  11. Odwirować rozcieńczoną zawiesinę komórkową o sile 230 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant do środka dezynfekującego i ponownie zawiesić osad komórkowy w 25 ml pożywki do hodowli komórkowych DMEM (z dodatkami).
  12. Zawiesinę komórek przenieść do jednorazowej kolby do hodowli komórkowej o długości 75cm2 i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez kolejne 3 dni przed poddaniem ich przygotowaniu sferoidalnemu. Gdy HepG2 będą miały czas na aklimatyzację i ponownie osiągną ~80% konfluencji, określ stężenie komórek w ramach przygotowań do siewu sferoidalnego.

2. Preparat sferoidowy HepG2

  1. Powtórzyć kroki podhodowli wymienione powyżej, z wyjątkiem po odwirowaniu, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki hodowlanej DMEM wstępnie ogrzanej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Dokładnie pipetować zawiesinę kuwety w górę i w dół.
  2. Oceń żywotność komórek za pomocą testu wykluczania błękitu trypanowego (patrz OSHA SOP 3.21 Toksyny reprodukcyjne, mutageny, teratogeny i embriotoksyny – Procedury bezpiecznego obchodzenia się i przechowywania (2019) w celu uzyskania wskazówek dotyczących zdrowia i bezpieczeństwa)14 ze stosunkiem 1:1 zawiesiny komórek do wstępnie przefiltrowanego 0,4% roztworu błękitu trypanowego.
  3. Przed zliczeniem komórek należy pobrać 1 ml roztworu błękitu trypanowego za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i przefiltrować za pomocą jednostki filtrującej 0,45 μm do sterylnej probówki o pojemności 1 ml.
  4. Przenieś 10 μl przefiltrowanego roztworu błękitu trypanowego do probówki o pojemności 0,2 ml i dodaj 10 μl zawiesiny komórek. Pozostały przefiltrowany roztwór błękitu trypanowego można przechowywać do 3 miesięcy w temperaturze pokojowej do wykorzystania w przyszłości.
  5. Dokładnie spryskaj hemocytometr 70% etanolem i wytrzyj do sucha sterylnym ręcznikiem papierowym przed zabezpieczeniem szkiełka nakrywkowego na wierzchu za pomocą pary oddechowej. Przesuwanie szkiełka nakrywkowego po powierzchni zwilżonej oddechem indukuje siły kohezyjne poprzez generowanie pierścieni Newtona.
  6. Delikatnie odpipetować zawiesinę niebieskich krwinek Trypana w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1000 μl (w celu zmniejszenia naprężenia) przed dodaniem 10 μl do hemocytometru. Upewnij się, że roztwór jest rozproszony pod szkiełkiem nakrywkowym i pokrywa całą siatkę bez pęcherzyków powietrza.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Zliczanie komórek za pomocą hemocytometru. Schematyczne przedstawienie hemocytometru z zaznaczonym kwadrantem, z którego należy policzyć komórki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Pod mikroskopem policz żywe (niezabarwione) i martwe (zabarwione na niebiesko) komórki znajdujące się w czterech dużych kwadratach narożnych (Ryc. 1). Wyklucz wszystkie komórki, które zachodzą na siebie lub znajdują się na dwóch wewnętrznych krawędziach dużych kwadratów narożnych (tj. na liniach) w liczeniu.
  2. Korzystając z poniższego obliczenia, oblicz średnią liczbę żywych, żywotnych komórek (niebarwionych) obecnych w próbce:
    Całkowita liczba komórek/ml = liczba żywych komórek x figure-protocol-2 x 10 000
    gdzie rozcieńczenie odnosi się do tego, ile razy roztwór podstawowy został rozcieńczony w błękitu trypanowym (w tym przypadku 2x), a # policzonych kwadratów odnosi się do czterech dużych kwadratów narożnych zliczonego hemocytometru
  3. Na podstawie liczby żywotnych komórek HepG2 i przy użyciu następującego wzoru:
    C1V1=C2V2
    gdzie C1 = stężenie komórek żywotnych obecnie,
    V1 = objętość zawiesiny komórek obecnie,
    C2 = pożądane stężenie zawiesiny komórkowej,
    V2 = pożądana objętość zawiesiny komórek
  4. Przygotować 10 ml roztworu podstawowego zawiesiny komórek HepG2 z pożywką do hodowli komórek DMEM o stężeniu 2,0 x 105 komórek/ml w celu uzyskania 4000 komórek HepG2 na 20 μl wiszącej kropli. Dokładnie wymieszaj zawiesinę komórek, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1000 μl, aby upewnić się, że wszystkie komórki są całkowicie zawieszone w pożywce.
  5. Do studzienek 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej dodać 100 μl sterylnego PBS o temperaturze pokojowej, aby zapobiec wysychaniu wiszących kropli podczas inkubacji.
  6. Weź pokrywkę standardowej 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej z płaskim dnem, odwróć ją i ostrożnie odpipetuj 20 μl kropli zawiesiny komórkowej do środka każdego rowka w pokrywie, jak pokazano na Rysunek 2. Użyj pipety wielokanałowej, ale dodaj tylko 2-4 krople na raz, ponieważ wielokrotne wysiewanie może wpłynąć na dokładność i rozmieszczenie kropli.
    1. Wyśrodkuj krople w rowkach dołków ułożonych na pokrywie; w przeciwnym razie nie będą one wisiały na środku dołków, gdy pokrywka płytki zostanie odwrócona i istnieje ryzyko, że spadną do płyty. Delikatnie odchyl pokrywkę płytki 96-dołkowej, tak aby krople wisiały i ostrożnie umieść na wierzchu płytki 96-dołkowej.
  7. Umieścić całą 96-dołkową płytkę z pokrywką delikatnie w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 3 dni przed przeniesieniem sferoidów na agarozę.
    UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność nie tylko podczas transportu płytek do/z inkubatorów, ale ogólnie podczas otwierania i zamykania inkubatora, ponieważ nadmierny ruch może spowodować przesunięcie się płytek i opadnięcie lub nieprawidłowe uformowanie sferoid.

figure-protocol-3
Rysunek 2: Przygotowanie 3D modelu sferoidalnego HepG2 in vitro. (A) Komórki HepG2 wysiane w 20 μl kropli na pokrywie 96-dołkowej płytki. (B) Komórki HepG2 po wysiewie w modelu wiszącej kropli, aby umożliwić tworzenie sferoidów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Przeniesienie sferoidu HepG2 z wiszącej kropli do zawiesiny agarozy

UWAGA: W dniu 3 po wysiewie do wiszących kropli, sferoidy są przenoszone do dołków tej samej 96-dołkowej płytki, z których wszystkie zostały wcześniej pokryte cienką warstwą 1,5% żelu agarozowego.

  1. Przygotuj żele agarozowe i autoklaw (tj. dzień 2 po wysiewie) przed dniem powlekania płytki (tj. dniem 3 po wysiewie).
    1. Aby przygotować 1,5% żel agarozowy, odważ 0,30 g agarozy do czystej, szklanej butelki, a następnie dodaj 20 ml pożywki DMEM wolnej od czerwieni fenolowej. Agarozę należy sterylizować w autoklawie przez 1 godzinę w temperaturze 230 °C. Powłoka agarozowa zapobiega przyleganiu sferoid HepG2 do podstawy studzienek i tworzeniu monowarstwy komórkowej zamiast zachowywania ich sferoidalnej struktury 3D.
  2. W dniu 3 po wysiewie wyjmij z inkubatora 96-dołkową płytkę zawierającą zwisające sferoidy kroplowe HepG2 i ostrożnie odwróć pokrywę, aby sferoidy przestały zwisać.
  3. Za pomocą pipety wielokanałowej usuń i wyrzuć 100 μl PBS uprzednio dodanych do podstawy płytki 96-dołkowej. Pozostaw płytki do wyschnięcia na powietrzu przez 2-3 minuty, podgrzewając agarozę w ramach przygotowań do powlekania.
    UWAGA: W wyniku tego zabiegu powstaje bardzo gorąca, płynna agaroza, która po rozlaniu na skórę może spowodować oparzenia i obrażenia. Ponadto należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się ze szklaną butelką zawierającą płynną agarozę, ponieważ ona również może być bardzo gorąca.
  4. Używając wcześniej przygotowanych 1,5% żeli agarozowych, podgrzewaj szklaną butelkę zawierającą 20 ml żelu agarozowego przez 30 s w kuchence mikrofalowej z maksymalną mocą (tj. 900 W). Aby pokryć dwie 96-dołkowe płytki, powinna wystarczyć jedna butelka o pojemności 20 ml wstępnie przygotowanego 1,5% żelu agarozowego.
  5. Po stopieniu delikatnie zakręć agarozą, obracając szklaną butelkę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, a następnie dodaj 50 μl agarozy do podstawy każdej studzienki.
    UWAGA: Podczas dodawania agarozy należy uważać, aby nie ustawiać płytki pod kątem >45°, ponieważ agaroza szybko twardnieje i nie tworzy płaskiej, równej warstwy, która może zakłócić wzrost sferoidów. Na tym etapie ważne jest, aby pracować wydajnie, aby zapobiec zestaleniu się agarozy przed całkowitym pokryciem płytki.
  6. Pozostawić płytkę na 2 minuty w temperaturze pokojowej przed dodaniem 100 μl wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych DMEM (z dodatkami) na wierzch stałej warstwy agarozy w każdym dołku.
  7. Odwróć pokrywkę płytki 96-dołkowej i umieść ją z powrotem na płytce 96-dołkowej, tak aby sferoidy ponownie zwisały.
  8. Odwirować płytkę przez 3 minuty przy 200 x g w celu przeniesienia sferoid z wiszącej kropli do poszczególnych dołków 96-dołkowej płytki. Po przeniesieniu sferoidy HepG2 powinny być teraz zawieszone w pożywce do hodowli komórkowych. Pozostawić je na 24 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  9. Sferoidy HepG2 tej wielkości należy poddać zabiegom chemicznym lub ENM w 4 dniu po wysiewie (tj. 24 godziny po przeniesieniu na płytki pokryte agarozą).
  10. Aby utrzymać żywotność komórek przez dłuższe okresy hodowli, należy odświeżać pożywkę do hodowli komórkowych co 3 dni. Aby to zrobić, delikatnie odessać 50 μl pożywki do hodowli komórkowych z powierzchni studzienki i zastąpić świeżymi 50 μl pożywki do hodowli komórkowych DMEM. Uważaj, aby nie usunąć ani nie naruszyć sferoidy podczas wykonywania zmiany podłoża.

4. Nanomateriał/Narażenie chemiczne

UWAGA: Model sferoidów wątroby HepG2 może obsługiwać zarówno ENM, jak i reżimy ekspozycji oparte na chemikaliach, ale głównym celem tego protokołu jest narażenie na ENM. Przed narażeniem badany ENM musi być odpowiednio rozproszony; można to zrobić zgodnie z zaleceniami Protokołu Dyspersji NanoGenoTox (Umowa o udzielenie dotacji nr 20092101, 2018)15.

  1. Po dyspersji zgodnie z Protokołem Dyspersji NanoGenoTox, zawiesinę ENM należy rozcieńczyć od początkowego stężenia 2,56 mg/ml do końcowego pożądanego stężenia we wstępnie podgrzanej pożywce do hodowli komórkowych DMEM (w tym suplementach). Całkowita objętość 5 ml jest wymagana do dozowania jednej płytki 96-dołkowej.
  2. W celu wystawienia sferoidy HepG2 na działanie substancji chemicznej lub ENM, za pomocą pipety o pojemności 200 μl należy odessać 50 μl pożywki do hodowli komórkowych z powierzchni każdej studzienki (pozostawiając 50 μl w studzince, aby nie naruszyć sferoid) i zastąpić 50 μl pożywką zawierającą badany czynnik toksyczny w wymaganej dawce.
  3. Po nałożeniu badanego materiału inkubować płytki przez żądany czas ekspozycji w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Jeżeli przeprowadzany jest długotrwały (≥24 godziny) reżim narażenia, to natychmiast po upływie pożądanego okresu narażenia należy pobrać sferoidy do analizy mikrojądrowej punktu końcowego, jak opisano poniżej w krokach 6.1 – 6.4.
  5. Jednak w przypadku reżimów ostrego narażenia (np. ≤24 godziny), po zakończeniu okresu narażenia należy zebrać, zebrać i przechowywać 50 μl supernatantu z każdej studzienki na 96-dołkowej płytce w temperaturze -80 °C w celu dalszej analizy biochemicznej w późniejszym czasie. Zastąp pożywkę do hodowli komórkowej 50 μl świeżej pożywki zawierającej 6 μg/ml cytochalazyny B i pozostaw do inkubacji przez 1 – 1,5 cyklu komórkowego (tj. 24 – 26 godzin w przypadku HepG2) w ramach przygotowań do pobrania testu mikrojądrowego w bloku cytokinezy.
    UWAGA: W przypadku reżimów ostrej (≤24 godzin) ekspozycji można zastosować test mikrojądrowy bloku cytokinezy z cytochalazyną B, ale w przypadku długotrwałych (≥24 godzin) reżimów narażenia, należy zastosować wersję jednojądrzastą (bez cytochalazyny B) testu, jak opisano poniżej w Rysunek 4.

5. Zbieranie sferoidów HepG2

UWAGA: Po zabiegach chemicznych lub ekspozycji na ENM, można pobrać zarówno pożywkę do hodowli komórkowych, jak i tkankę sferoidalną do analizy wielu punktów końcowych. W zależności od analizy punktu końcowego, sferoidy mogą być zbierane pojedynczo (np. w celu analizy obrazu) lub łączone razem (np. w celu oznaczania mikrojądrowego bloku cytokinezy).

  1. Wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora.
  2. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl odessać 100 μl pożywki do hodowli komórkowych wraz z tkanką sferoidalną z każdej studzienki i zebrać w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Uważaj, aby uniknąć kontaktu z agarozą.
  3. Po zebraniu odwirować zawiesinę sferoidalną o sile 230 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i przechowywać w temperaturze -80 °C w celu dalszej analizy końcowej (np. testów czynnościowych wątroby) w późniejszym terminie.
  4. Ponownie zawiesić osad sferoidów w 1 ml sterylnego PBS o temperaturze pokojowej (1x).
  5. Po umyciu ponownie odwirować zawiesinę sferoidalną przy 230 x g przez 3 min. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić w 500 μl 0,05% roztworu trypsyny-EDTA i inkubować przez 6-8 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  6. Po inkubacji delikatnie pipetuj trypsynizowane komórki w górę iw dół, aby całkowicie oddzielić i ponownie zawiesić komórki HepG2 przed neutralizacją za pomocą 1 ml pożywki do hodowli komórek DMEM.
  7. Odwirować rozcieńczoną zawiesinę komórkową o sile 230 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant do środka dezynfekującego i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml PBS o temperaturze pokojowej (1x).
  8. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 230 x g przez 5 minut. Odlać supernatant do środka dezynfekującego, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml zimnego PBS (1x). Upewnij się, że komórki są dobrze rozproszone, aby zapobiec zasłanianiu pola widzenia przez grudki komórek po zamontowaniu na szkiełkach mikroskopowych.

6. Test mikrojądrowy i punktacja

Dla ręcznej metody badania mikrojądrowego, cytowirówka jest wymagana do wytworzenia cytodotu (określonego, skoncentrowanego obszaru komórek) w środku szkiełka mikroskopowego. Proces ten wspiera bardziej efektywne ocenianie slajdu, ponieważ pozwala oceniającemu łatwo zlokalizować interesujące go komórki, w przeciwieństwie do oceny całego slajdu, w którym komórki mogą być szeroko rozproszone.

  1. Zanurz matowe szkiełka mikroskopowe (trzy na dawkę) w 70% etanolu, a następnie ddH2O i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu na 5 minut.
  2. Umieść przygotowane szkiełka mikroskopowe w lejku kuwetowym, jak pokazano na Rysunek 3A, gdzie szklane szkiełko (iii) jest umieszczone w metalowym wsporniku (iv) z kartą filtracyjną (ii) i lejkiem kuwetowym (i) zabezpieczonym na górze.
  3. Ułóż lejki kuwetowe w cytowirówce z lejkiem skierowanym do góry, tak aby do każdego z nich można było bezpośrednio dodać 100 μl zawiesiny komórek.
  4. Cytowirować przez 5 minut przy 500 x g, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozprowadzone na powierzchni szkiełka.

figure-protocol-4
Rycina 3: Układ cytospinowy do przygotowania leczonych komórek na szkiełkach mikroskopowych. (A) Wyświetla poszczególne elementy, (i) lejek kuwetowy, (ii) kartę filtracyjną, (iii) szklane szkiełko mikroskopowe i (iv) metalową podporę wymaganą do cytospinowania komórek HepG2 na szkiełkach mikroskopowych. (B) Ustawienie końcowego lejka kuwetowego. (C) Prawidłowe umieszczenie lejka kuwety w cytowirówce. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przed utrwaleniem w lodowatym, 90% metanolu na 10 minut.
  2. Po zamocowaniu pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej przed przechowywaniem w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
  3. W razie potrzeby wyjmij wstępnie przygotowane szkiełka mikroskopowe z zamrażarki w temperaturze -20 °C i pozostaw do ogrzania do temperatury pokojowej przed przystąpieniem do barwienia Giemsa.
    UWAGA: Zgodnie z rozporządzeniem (WE) nr 1272/2008 [CLP] roztwór barwiący Giemsa jest wysoce łatwopalną cieczą, która może być toksyczna w przypadku połknięcia i spowodować uszkodzenie w kontakcie z oczami, skórą lub wdychaniem. Zapoznaj się z powiązanym arkuszem SDS, aby uzyskać szczegółowe porady dotyczące przechowywania, obsługi oraz zdrowia i bezpieczeństwa dotyczące tej substancji chemicznej przed użyciem.
  4. Podczas rozmrażania szkiełek przygotuj 20% roztwór barwiący Giemsa (25 ml wymagane do zabarwienia ~ 30 szkiełek) rozcieńczony w buforze fosfatazy (pH 6,8). Dokładnie wymieszaj, delikatnie mieszając roztwór przed filtrowaniem za pomocą złożonej bibuły filtracyjnej umieszczonej w lejku.
  5. Za pomocą pipety Pasteura dodaj 3 – 5 kropli przefiltrowanego roztworu Giemsy do cytozy na każdym szkiełku i pozostaw na 8 – 10 minut.
  6. Umyj szkiełka w dwóch kolejnych płukaniach buforem fosfatazy, a następnie krótko spłucz pod zimną wodą, aby usunąć nadmiar pozostałej plamy. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu.
  7. Po wyschnięciu w dygestorium zanurz poplamione szkiełka w ksylenie na 10 sekund, a następnie dodaj kroplę podłoża mocującego do środka cytozy i umieść na wierzchu szklane szkiełko nakrywkowe.
  8. Szkiełka mikroskopowe należy pozostawić na noc w dygestorii do wyschnięcia przed ręcznym ocenianiem; można je przechowywać przez czas nieokreślony w temperaturze pokojowej.

7. Analiza danych

  1. Zgodnie z opisem w Wytycznych OECD dotyczących badań 487 (2014)11, aby ocenić i określić ilościowo uszkodzenia DNA wywołane w wyniku ekspozycji na ENM lub środek chemiczny, użyj mikroskopu świetlnego (obiektyw 100x z olejkiem immersyjnym) 2000 komórek jednojądrowych lub 1000 komórek dwujądrowych na kontrpróbę biologiczną, aby ocenić obecność mikrojąder, jak pokazano na Rysunek 4.

figure-protocol-5
Rysunek 4: Drzewo decyzyjne oceny testów mikrojądrowych. Schematyczne drzewo decyzyjne w celu podkreślenia konieczności stosowania różnych procedur oceny punktowej i cytotoksyczności podczas stosowania testu mikrojądrowego z modelami 3D po reżimach ostrego lub długotrwałego narażenia. Ostre (≤24 h) narażenie pozwala na zastosowanie testu mikrojądrowego z zablokowaną cytokinezą, podczas gdy długotrwałe (≥24 h) narażenie wymaga jednojądrzastej wersji testu; z których oba są opisane w wytycznej OECD dotyczącej badań nr 487. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Na podstawie proporcji obecnych mikrojąder w stosunku do liczby ocenionych komórek jednojądrowych lub dwujądrowych należy obliczyć wartość procentową genotoksyczności.
  2. Aby ocenić, czy zaobserwowane uszkodzenia DNA nie są wynikiem szczątków komórkowych spowodowanych przez wysoki odsetek komórek apoptotycznych, należy wziąć pod uwagę pomiar cytotoksyczności. W takim przypadku, w zależności od obecności cytochalazyny B, należy użyć obliczeń CPBI lub RVCC (zgodnie z opisem w Rysunek 4). Genotoksyczność może być oceniana wyłącznie w próbkach, w których cytotoksyczność jest mniejsza niż 55% ± 5%, zgodnie z definicją zawartą w wytycznej OECD dotyczącej badań 48711.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przydatność tego opartego na linii komórkowej modelu sferoidalnego wątroby 3D do długoterminowej hodowli i oceny ryzyka genotoksycznego została oceniona poprzez przeprowadzenie charakterystyki wyjściowej w celu określenia żywotności i funkcjonalności podobnej do wątroby modelu w czasie trwania 14 dni w hodowli, jak również jego przydatności do testu mikrojądrowego.

Podstawowa charakterystyka 3D HepG2 Liver Spheroid Model
Przed jakąkolwiek oceną toksykologiczną in vitro ważne jest, aby sprawdzić, czy sferoidy 3D HepG2 uformowały się prawidłowo przed wykonaniem transferu agarozy lub obróbki chemicznej/ENM. Sferoidy HepG2 wytwarzane metodą wiszącej kropli zwykle potrzebują 2 - 3 dni po wysiewie (4000 komórek/sferoidę), aby utworzyć zwarte, kuliste sferoidy o średniej średnicy 495,52 μm W x 482,69 μm H, jak pokazano w Rysunek 5A-5C. Sferoidy HepG2, które uformowały się prawidłowo i są dopuszczalne do stosowania do oceny toksykologicznej in vitro, muszą mieć zwartą, kulistą strukturę o gładkiej powierzchni i bez wystających elementów wizualnych. Rysunek 5 przedstawia przykłady sferoid dobrej jakości (Figure 5D-F) i słabej jakości (Figure 5G-I). Te ostatnie należy wyrzucić. Zazwyczaj 90-95% sferoid utworzonych na płytkę uformuje się prawidłowo i będzie nadawało się do dalszych eksperymentów.

figure-results-1
Ryc. 5: Obrazy z mikroskopii świetlnej przedstawiające naturalną morfologię sferoid HepG2 utworzonych metodą wiszącej kropli. (A-C) pokazują dzień 2 i (D-I) dzień 4 sferoidy wątroby HepG2 po wysiewie. (D-F) są przykładami dobrej jakości sferoid HepG2, podczas gdy (G-I) pokazuje sferoidy słabo uformowane. Wszystkie zdjęcia zostały wykonane obiektywem X20 przy użyciu mikroskopu. Podziałka reprezentuje 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby dodatkowo potwierdzić żywotność sferoidów HepG2, można przeprowadzić podstawowy test kolorymetryczny Bromokrezolowej Zielonej Albuminy (BCG) lub test mocznikowy w celu oceny ich funkcjonalności podobnej do wątroby. Funkcjonalność podobną do wątroby oceniono pod kątem żywotności za pomocą testu wykluczającego błękit trypanowy w ciągu 14-dniowego okresu hodowli w celu określenia długowieczności modelu sferoidalnego wątroby i ustalenia, czy może on wspierać długoterminową lub powtarzaną ocenę zagrożeń opartą na ENM/chemikaliach (Rysunek 6). Stężenie albuminy utrzymywało się na stałym poziomie przez cały okres hodowli. Produkcja mocznika wykazuje wzrost stężenia mocznika wytwarzanego na sferoidę w ciągu tygodnia w kulturze, zanim osiągnie plateau do 7 dnia. Ważne jest, aby zauważyć, że poziomy albuminy i mocznika wytwarzane w sferoidach 3D HepG2 są znacznie wyższe niż obserwowane w tej samej linii komórkowej hodowanej w formacie 2D. Rzeczywiście, hodowle 2D komórek HepG2, szczytowe poziomy albuminy i mocznika wynosiły odpowiednio 0,001 mg / ml i 0,010 ng / μl. Co więcej, w poprzedniej pracy opublikowanej przez Shah i wsp., w której użyto prawie identycznego systemu sferoidalnego HepG2, autorzy podkreślają zauważalną poprawę aktywności metabolicznej (CYP1A1 i CYP1A2) w systemach modelowych 3D HepG2 in vitro w porównaniu z hodowanymi w 2D komórkami HepG25.

figure-results-2
Rycina 6: 14-dniowe dane wyjściowe dotyczące sferoid wątroby HepG2. Po przeniesieniu z wiszącej kropli, (A) podkreśla żywotność modelu sferoidalnego HepG2 w okresie 14 dni, podczas gdy (B) i (C) podkreślają odpowiednio funkcjonalność albuminy i mocznika podobną do wątroby. Średnie dane ± przedstawionych SEM, n = 4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wraz z nieuniknionym rozwojem nekrotycznego rdzenia, znanym ograniczeniem 3D kultur sferoidalnych wątroby, trzeba było ustalić żywotność tego modelu opartego na HepG2, aby wykazać, że jest on w stanie utrzymać długoterminowe (5-10 dni) reżimy ekspozycji, zachowując jednocześnie zdolność proliferacyjną wymaganą do obsługi testu mikrojądrowego5. Rzeczywiście, wykazano, że ten trójwymiarowy model sferoidy wątroby zachowuje >70% żywotności przez 10 dni w hodowli. Opierając się na tym i w połączeniu z utrzymującą się funkcjonalnością podobną do wątroby obserwowaną w okresie hodowli ≥14 dni, ten 3D sferoidalny model wątroby może zatem wspierać długotrwałe, powtarzające się reżimy ekspozycji na ENM do 10 dni (tj. zanim żywotność sferoid spadnie poniżej 70%). Dla porównania, zaleca się, aby poziomy albuminy dla sferoidów HepG2 wysiewanych przy 4000 komórek/sferoidę wynosiły ≥20,0 ng/μL, podczas gdy produkcja mocznika powinna wynosić ≥0,25 ng/μL przed przeprowadzeniem oceny toksykologicznej in vitro za pomocą tego modelu.

Ocena genotoksyczności nanomateriałów
Do oceny genotoksyczności wykorzystano test mikrojądrowy w celu określenia obecności mikrojąder zarówno po ostrym (24 godziny), jak i długotrwałym (120 godzin) narażeniu na ENM. Aflatoksyna B1 jest znaną substancją rakotwórczą dla wątroby16,17 i jest zalecaną kontrolą dodatnią dla testu mikrojądrowego. Eksperymenty optymalizacyjne wykazały, że 0,1 μM Alfatoksyny B1 indukuje znaczną dodatnią (≥2,0-krotny wzrost) odpowiedź genotoksyczną w sferoidach wątroby 3D HepG2, a zatem jest stosowane w każdym teście mikrojądrowym przeprowadzonym za pomocą tego modelu. Aby zapewnić wiarygodność wyników testu mikrojądrowego przy użyciu modelu sferoidalnego HepG2, częstość tła mikrojądrowego dla komórek HepG2 użytych w tym modelu 3D in vitro powinna mieścić się w zakresie 0,6% – 1,2%. W rezultacie, alfatoksyna B1 powinna wywołać odpowiedź genotoksyczną co najmniej dwukrotnie wyższą niż obserwowana w przypadku kontroli ujemnej; zatem 0,1 μM alfatoksyny B1 powinno indukować częstotliwość mikrojąder między 1,5% a 3,0%. Korzystając z tych parametrów kontrolnych, można następnie wiarygodnie ocenić genotoksyczność in vitro związaną z ENM. W oparciu o wytyczną OECD dotyczącą badań nr 487 należy zauważyć, że podczas badania ENM lub substancji chemicznej wybrane stężenia nie powinny wywoływać więcej niż 55% ± 5% cytotoksyczności (na co wskazuje zmniejszenie wartości CPBI lub RVCC w stosunku do kontroli ujemnej)11. Rysunek 7 ilustruje dane wygenerowane, gdy aflatoksyna B1 i dwa ENM (dwutlenek tytanu (TiO2) i sreszek (Ag)) były oceniane zarówno po ostrych, jak i długotrwałych ekspozycjach w sferoidach HepG2, a późniejszy potencjał genotoksyczny był analizowany za pomocą testu mikrojądrowego. Oba oceniane ENM badano w niecytotoksycznej, niskiej dawce 5,00 μg/ml w reżimie ostrej ekspozycji (24 godziny) i długotrwałej (120 godzin). Można zaobserwować podobną tendencję genotoksyczności zarówno w przypadku TiO2, jak i Ag ENM, przy czym podwyższona reakcja genotoksyczna, która nastąpiła po 24-godzinnym narażeniu, nie była widoczna po długotrwałym 5-dniowym narażeniu. Działo się tak pomimo utrzymującej się genotoksyczności wywołanej przez pozytywną kontrolę aflatoksyny B1 w obu punktach czasowych.

figure-results-3
Rycina 7: Ocena genotoksyczności po ekspozycji na TiO2 i Ag ENM na sferoidy wątroby HepG2. Ocena genotoksyczności (częstość występowania mikrojąder) przy użyciu testu mikrojądrowego po (A) ostrym (24 godziny) i (B) długotrwałym (120 godzin) narażeniu na 5,00 μg/ml TiO2 i Ag ENM. Kontrola ujemna dotyczy wyłącznie pożywki, podczas gdy kontrola dodatnia wynosi 0,1 μM aflatoksyny B1. Średnia wartość (n=2) przedstawiona ± SD. Istotność wskazana w odniesieniu do kontroli ujemnej: * = p≤ 0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowania modeli 3D wątroby różnią się znacznie w zależności od konkretnego biochemicznego punktu końcowego lub szlaku działań niepożądanych, na który jest celowany. Każdy model ma swoje zalety i ograniczenia, od zmienności między dawcami w pierwotnych modelach ludzkich hepatocytów (PHH) po zmniejszoną aktywność cytochromu p450 w modelach opartych na liniach komórkowych, ale wszystkie są cenne same w sobie 6,12,18,19. Podczas oceny genotoksyczności istnieją ograniczenia w zgodności modeli z zatwierdzonymi przez organy regulacyjnymi punktami końcowymi, takimi jak test mikrojądrowy in vitro, ponieważ wymagana jest aktywna proliferacja. Jest to konieczne, ponieważ ocena genotoksyczności wymaga ilościowego określenia utrwalonych uszkodzeń DNA, które mają być oceniane po podziale komórki, gdy istnieje możliwość naprawy DNA w celu skorygowania przejściowych zmian. Niestety, wysoce zróżnicowane sferoidy lub mikrotkanki PHH oparte na hepatocytach (tj. HepaRG), które uważa się za wykazujące najbardziej fizjologicznie istotne cechy podobne do wątroby, tworzą modele statyczne (nieproliferacyjne) 12,19,20. W rezultacie, przedstawiony tutaj model sferoidalny 3D HepG2 stanowi odpowiedni, alternatywny model, który może wspierać badania genotoksyczności. Sferoidy oparte na linii komórkowej HepG2 mają wystarczającą ilość aktywnie dzielących się komórek na zewnętrznej powierzchni sferoid, zachowując jednocześnie podstawowe cechy podobne do wątroby, takie jak produkcja albuminy i mocznika oraz pewną aktywność CYP450 5,12,19. Zasadniczo ten model wątroby in vitro został opracowany w celu uzupełnienia testu mikrojądrowego, ponieważ jest to jeden z dwóch testów in vitro zalecanych w zestawie do badań genotoksyczności 8,10,11,21. Jednak model ten może być z łatwością zastosowany do analizy sekwencjonowania DNA i technologii ekspresji genów (RNA), a jednocześnie ma potencjał do dalszej adaptacji i wykorzystania do innych punktów końcowych uszkodzeń DNA, takich jak test komety. Niemniej jednak ważne jest, aby wziąć pod uwagę rolę, jaką interferencja ENM odgrywa w niektórych analizach punktów końcowych. Na przykład analizy oparte na cytometrii przepływowej mogą nie być odpowiednie do oceny genotoksyczności ENM, w szczególności ze względu na interferencję cząstekstałych 22.

Jednym z czynników ograniczających modele sferoidalne, które aktywnie ulegają podziałowi komórkowemu, jest ich rozmiar. Optymalizacja gęstości wysiewu ma kluczowe znaczenie, ponieważ musi być wystarczająca liczba komórek, które pozwolą modelowi na dalsze rozprzestrzenianie się; ale niezbyt duża liczba komórek, co powoduje, że sferoida staje się nadmiernie zwarta, co prowadzi do zwiększonego rdzenia nekrotycznego. Uważa się, że przyczyną tej martwicy jest ograniczona dyfuzja tlenu i składników odżywczych, ponieważ uważa się, że granica tej dyfuzji wynosi około 100 – 150 μm tkanki23,24. Zależy to jednak od typu komórki, liczby komórek, interakcji na rusztowaniu i warunków hodowli25. Ponieważ wykazano, że średnica około 700 μm jest granicą pozwalającą uniknąć przedwczesnego wystąpienia nekrozy w centrum sferoid C3A, wysiewanie 4000 komórek HepG2 na sferoidę zapewnia, że średnica modelu w momencie ekspozycji wynosi ≤500 μm26. Ponadto Shah i in. ustalili, że komórki HepG2 wysiane powyżej 5000 komórek na sferoidę wykazywały 25% zmniejszenie żywotności po 7 dniach hodowli, co może odnosić się do średniej średnicy 680 μm i ograniczonej dostępności składników odżywczych w wiszącej kropli o pojemności 20 μl5. Aby temu zaradzić, model opracowany w niniejszym protokole przechodzi krytyczny etap, w którym zwisająca kropla jest przenoszona do studzienek pokrytych agarozą po początkowym uformowaniu się sferoidy. Zapewnia to większą objętość pożywki hodowlanej, aby utrzymać stale rosnącą liczbę komórek w sferoidach. W rezultacie, model sferoidalny HepG2 pozostaje w ponad 70% żywotny po 10 dniach hodowli i może być wykorzystany do długoterminowej oceny zagrożeń in vitro.

Podczas gdy model sferoidalny HepG2 może obsługiwać zarówno ostre, jak i długotrwałe reżimy ekspozycji, odświeżanie pożywki do hodowli komórkowej podczas dłuższych okresów hodowli jest ograniczone w przypadku tego modelu, ponieważ całkowita wymiana pożywki nie jest zalecana ze względu na potencjalną utratę sferoid. Przypuszcza się, że przy ekspozycjach na ENM tendencja do aglomeracji i osadów jednorodnych dyspersji ENM jest wysoka. Warto jednak zauważyć, że szybkość, z jaką osady ENM mogą się zmieniać w zależności od parametrów cząstek (np. rozmiaru, kształtu i gęstości) i może być określona teoretycznie przy użyciu modelu sedymentacji, dyfuzji i dozymetrii in vitro (ISDD) lub jego najnowszych pochodnych, często przywoływanych w odniesieniu do podejść do ekspozycji na ENM (zawiesinę)27,28. Mając to na uwadze, zakłada się, że jeśli tylko 50% pożywki do hodowli komórkowej zostanie ostrożnie usunięte z powierzchni hodowli komórkowej, zakłócenie i późniejsze usunięcie dawki ENM powinno być teoretycznie minimalne. Biorąc jednak pod uwagę ruchy Browna, może to nie być ściśle prawdą i należy podjąć dalsze prace nad osadzaniem i sedymentacją każdego konkretnego ENM, który ma być badany, w celu zapewnienia utrzymania prawidłowej dozymetrii przez cały okres długotrwałego narażenia27. Zasadniczo jest to potencjalne ograniczenie, które należy wziąć pod uwagę podczas wykonywania powtarzających się schematów dawkowania, ponieważ może to mieć kluczowe znaczenie dla końcowego, skumulowanego stężenia. Z drugiej strony, narażenie na działanie substancji chemicznych, choć nie jest pozbawione własnych ograniczeń, które należy wziąć pod uwagę, oferuje bardziej uproszczone podejście, ponieważ substancje chemiczne mają tendencję do pozostawania w roztworze, a zatem bezpośrednia zamiana pierwotnego stężenia chemicznego oprócz nowo dodanego stężenia gwarantuje, że wszelkie substancje chemiczne utracone podczas odświeżania pożywki zostaną odpowiednio zastąpione29. Przyszłe zastosowania obejmowałyby ocenę przydatności modelu do powtarzających się reżimów narażenia w długotrwałych okresach hodowli, ponieważ strategie wielokrotnego dawkowania mają kluczowe znaczenie dla oceny zdolności określonego układu narządów do łagodzenia lub przezwyciężania ewentualnych niekorzystnych skutków wywołanych bioakumulacją substancji ksenobiotycznej.

Podsumowując, ten trójwymiarowy model wątroby in vitro może być wykorzystany do oceny szeregu realistycznych scenariuszy narażenia, zapewniając w ten sposób przyszłe podejście in vitro, które lepiej wspiera zarówno ENM, jak i ocenę zagrożeń chemicznych w rutynowy i łatwo dostępny sposób.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną potwierdzić, że te badania otrzymały finansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji dla projektu PATROLS, na podstawie umowy o grant nr 760813

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aflotoksyna B1Sigma Aldrich, Wielka BrytaniaA6636-5MG
AgarozaSigma Aldrich, Wielka BrytaniaA9539-50G
Taśma
BCG Test albuminySigma Aldrich, Wielka BrytaniaMAK124
Albumina w surowicy bydlęcejw proszku Sigma Aldrich, Wielka BrytaniaA9418
Środek wspomagający zamrażanie komórekThermo Fisher Naukowy, Wielka Brytania5100-0001 - Wirówka Mr Frosty
Eppendorf5810 R
Cytochalazyna BMerck, Wielka Brytania250233
Cytologia Metalowe klipsy
Wirówka Cytospin 4ThermoFisher Scientific, Wielka BrytaniaCM00730202
DMEM z 4,5 g / L D-glukozy, L-glutaminaGIBCO, Paisley, Wielka Brytania41965-039
DMEM, bez czerwieni fenolowej z 4,5 g / L D-glukozy, L-glutamina z HepesGIBCO, Paisley, Wielka Brytania21063-029
Podłoże montażowe DPXFisherScientific, Wielka BrytaniaD/5330/05
EtanolFisherScientific, Wielka Brytania10048291
FBSGIBCO, Paisley, Wielka Brytania10270-106
Karty filtracyjne do Shandon CytospinFisherScientific, Wielka Brytania15995742
Szkiełka z matowego szkłaThermoFisher Scientific, Wielka Brytania
Roztwór R66 do poprawy plam Giemsa, GurrVWR Chemicals, Wielka BrytaniaMFCD00081642
Szkiełka nakrywkowe (24 x 60)Deckglaser, VWRECN631-1575
Hemocytometr i olejek immersyjny do szkiełek nakrywkowych
MikroskopZeiss, Wielka Brytania518F, ISO8034
Laminarny kaptur do hodowli tkanek klasy IIScanlaf Mars
Light MicroscopeZeiss, Wielka BrytaniaAxiovert 40C
Metanol z ciekłym azotem
FisherScientific, Wielka Brytania10284580
Kuchenka mikrofalowa
Niefiltrowane, sterylne 200 i mikro; L oraz 1000&Micro; l Końcówki do pipetGreiner-Bio-One, Wielka Brytania
NuncMicroWell 96-dołkowe mikropłytkiThermoFisher Scientific, Dania167008
Mikropipety P1000 i P200 Pipety
wielokanałowe P300 i P50
PBS pH 7,4 1X, MgCl2 i CaCl2 FreeGIBCO, Paisley, Wielka Brytania14190-094
Długopis/paciorkowiecGIBCO, Paisley, Wielka Brytania15140-122, Penicylina/Strepmyocyna 100X lub 10 000U/ml
Tabletki buforowe fosfatazyGIBCO, Paisley, Wielka Brytania10582-013
Pipeta Chłopiec
Simport Scientific CytoSep Lejki do wirówek Shandon Cytospin 4FisherScientific, Wielka Brytania11690581
Sonifier SFX 550 240V CE 1/2" - SondaBranson, USA101-063-971R
Kolba do hodowli tkankowych T-25 i T-75Greiner-Bio-One, Wielka BrytaniaT-25 (690175) i T-75 (660175)
Roztwór błękitu trypanowegoSigma Aldrich, Wielka BrytaniaT8154-100 ml
Sigma Aldrich, Wielka BrytaniaMAK006
Środek dezynfekujący VirkonDuPont, Wielka BrytaniaRely+On Virkon
Kąpiel wodna (37?) C)Grant JBNova 18
Waga
XyleneFisherScientific, Wielka Brytania10588070
0,05% trypsyna-EDTAGIBCO, Paisley, Wielka Brytania5300-054
0,2 ml i 1,0 ml Probówki EppendorfGreiner-Bio-One, Wielka Brytania
0,45 i mikro; m Jednostka filtrującaMillex HA, MF-Millipore, Wielka BrytaniaSLHA033SS
Strzykawka 1,0 mlBD Plastipak, FisherScientific, Wielka Brytania300185
Fiolki ze szkła scyntylacyjnego LS 20 mL, 22-400 Nasadki PP wyłożone foliąDWK Life Sciences GmbH, NiemcyWHEA986581
37? C i 5% CO2 Inkubator z filtrem Hepa klasy ISO 5NUAIRE DHD Autoflow
3 ml Pipeta PasteuraGreiner-Bio-One, Wielka Brytania
50 ml Stożkowe probówki FalconGreiner-Bio-One, Wielka Brytania
50 ml lub 100 ml Butelki
50 ml Rurki Falcon z listwą podłogowąGreiner-Bio-One, Wielka Brytania
5 ml, 10 ml i Pipety 25 mlGreiner-Bio-One, Wielka Brytania
9,4 cm kwadratowy, szalka PetriegoGreiner-Bio-One, Wielka Brytania688161
autoklawu Zestaw do oznaczania mocznika wagowaszklane

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geiser, M., Kreyling, W. G. Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 7, 2(2010).
  2. Modrzynska, J. Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver. Kgs. Lyngby, Denmark: Technical University of Denmark. , (2018).
  3. Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).
  4. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
  5. Shah, U. -K., et al. A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 51-58 (2018).
  6. Lauschke, V. M., Hendriks, D. F. G., Bell, C. C., Andersson, T. B., Ingelman-Sundberg, M. Novel 3D Culture Systems for Studies of Human Liver Function and Assessments of the Hepatotoxicity of Drugs and Drug Candidates. Chemical Research in Toxicology. 29, 1936-1955 (2016).
  7. van Grunsven, L. A. 3D in vitro models of liver fibrosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 121, 133-146 (2017).
  8. Corvi, R., Madia, F. In vitro genotoxicity testing - can the performance be enhanced. Food and Chemical Toxicology. 106, 600-608 (2017).
  9. Doak, S. H., Manshian, B., Jenkins, G. J. S., Singh, N. In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 745, 104-111 (2012).
  10. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
  11. OECD. OECD Guidelines. Test 489: In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. , (2016).
  12. Gerets, H. H. J., et al. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28, 69-87 (2012).
  13. Sison-Young, R. L., et al. A multicenter assessment of single-cell models aligned to standard measures of cell health for prediction of acute hepatotoxicity. Archives of Toxicology. 91, 1385-1400 (2017).
  14. European Guidelines 2019. European Agency for Safety and Health at Work. , Available from: https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines (2019).
  15. Jensen, K. A. The NANOGENOTOX Dispersion Protocol for NANoREG. European Union Grant Agreement n° 2009. 21, 01(2014).
  16. Marchese, S., et al. Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development. Toxins. 10, 214(2018).
  17. Rushing, B. R., Selim, M. I. Aflatoxin B1: A review on metabolism, toxicity, occurrence in food, occupational exposure, and detoxification methods. Food and Chemical Toxicology. 124, 81-100 (2019).
  18. Kermanizadeh, A., Brown, D. M., Moritz, W., Stone, V. The importance of inter-individual Kupffer cell variability in the governance of hepatic toxicity in a 3D primary human liver microtissue model. Scientific Reports. 9, 7295(2019).
  19. Berger, B., et al. Comparison of Liver Cell Models Using the Basel Phenotyping Cocktail. Frontiers in Pharmacology. 7, 443(2016).
  20. Ramaiahgari, S. C., et al. A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liver-like properties for repeated dose high-throughput toxicity studies. Archives of Toxicology. , (2014).
  21. Li, Y., et al. Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials. Mutagenesis. 32 (1), 151-159 (2016).
  22. Kirkland, D., Reeve, L., Gatehouse, D., Vanparys, P. A core in vitro genotoxicity battery comprising the Ames test plus the in vitro micronucleus test is sufficient to detect rodent carcinogens and in vivo genotoxins. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 721 (1), 27-73 (2011).
  23. Curcio, E., et al. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).
  24. Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).
  25. Asthana, A., Kisaalita, W. S. Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures. Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).
  26. Gaskell, H., et al. Characterization of a functional C3A liver spheroid model. Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).
  27. Cho, E. C., Zhang, Q., Xia, Y. The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles. Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).
  28. Hinderliter, P. M., et al. ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies. Particle and Fiber Toxicology. 7, 36(2010).
  29. Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies. Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure
Posted by JoVE Editors on 1/26/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure. The Representative Results section was updated.

Figure 6 in the Representative Results section was updated from:

Cell culture analysis; graph of cell viability and bar charts of albumin, urea over time in days.

to:

Cell viability, albumin, and urea levels over 14 days in culture; graphs of cell culture analysis.

The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:

With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain >70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the ≥14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be ≥0.06 mg/mL whilst urea production should be ≥0.4 ng/µL before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

to:

With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain >70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the ≥14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be ≥50.0 ng/μL whilst urea production should be ≥0.25 ng/µL before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

Tagi

Tr jwymiarowe modele w trobysferoidy HepG2test mikroj derd ugotrwa a ekspozycjaywotno kom rekfunkcja w trobyocena cytotoksyczno cimodele in vitro

Powiązane artykuły