Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Skalowalne generowanie dojrzałych organoidów móżdżku z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i charakterystyka za pomocą barwienia immunologicznego

10.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61143

⸱

13 czerwca 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1iBB - Institute for Bioengineering and Biosciences and Department of Bioengineering, Instituto Superior Técnico, Universidade de Lisboa, 2Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 3The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine, Lisbon Campus, Universidade de Lisboa, 4PBS Biotech, Inc, Camarillo, CA, USA

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje dynamiczny system hodowli do produkcji kontrolowanych agregatów ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i dalszego stymulowania różnicowania w organoidach móżdżku w chemicznie zdefiniowanych warunkach i bez karmienia za pomocą jednorazowego bioreaktora.

Streszczenie

Móżdżek odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu równowagi i koordynacji ruchowej, a defekt funkcjonalny w różnych neuronach móżdżku może wywołać dysfunkcję móżdżku. Większość obecnej wiedzy na temat fenotypów neuronalnych związanych z chorobą opiera się na tkankach pośmiertnych, co utrudnia zrozumienie progresji i rozwoju choroby. Modele zwierzęce i unieśmiertelnione linie komórkowe były również wykorzystywane jako modele zaburzeń neurodegeneracyjnych. Nie oddają one jednak w pełni chorób człowieka. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) mają ogromny potencjał w modelowaniu chorób i stanowią cenne źródło dla podejść regeneracyjnych. W ostatnich latach wytworzenie organoidów mózgowych z iPSC pochodzących od pacjentów poprawiło perspektywy modelowania chorób neurodegeneracyjnych. Brakuje jednak protokołów, które produkują dużą liczbę organoidów i wysoką wydajność dojrzałych neuronów w systemach hodowli 3D. Przedstawiony protokół jest nowym podejściem do powtarzalnego i skalowalnego generowania ludzkich organoidów pochodzących z iPSC w zdefiniowanych chemicznie warunkach przy użyciu skalowalnych bioreaktorów jednorazowego użytku, w których organoidy uzyskują tożsamość móżdżku. Wygenerowane organoidy charakteryzują się ekspresją specyficznych markerów zarówno na poziomie mRNA, jak i białka. Analiza określonych grup białek pozwala na wykrycie różnych populacji komórek móżdżku, których lokalizacja jest ważna dla oceny struktury organoidów. Kriosekcja organoidów i dalsze barwienie immunologiczne wycinków organoidów służą do oceny obecności określonych populacji komórek móżdżku i ich organizacji przestrzennej.

Wprowadzenie

Pojawienie się ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) stanowi doskonałe narzędzie dla medycyny regeneracyjnej i modelowania chorób, ponieważ komórki te mogą być zróżnicowane w większość linii komórkowych ludzkiego ciała1,2. Od czasu ich odkrycia, różnicowanie PSC przy użyciu różnych podejść zostało zgłoszone do modelowania różnych chorób, w tym zaburzeń neurodegeneracyjnych3,4,5,6.

Ostatnio pojawiły się doniesienia o kulturach 3D pochodzących z PSC przypominających ludzkie struktury mózgowe; są to tzw. organoidy mózgowe3,7,8. Generowanie tych struktur zarówno ze zdrowych, jak i specyficznych dla pacjenta PSC stanowi cenną okazję do modelowania rozwoju człowieka i zaburzeń neurorozwojowych. Jednak metody stosowane do generowania tych dobrze zorganizowanych struktur mózgowych są trudne do zastosowania w ich produkcji na dużą skalę. Aby wytworzyć struktury, które są wystarczająco duże, aby podsumować morfogenezę tkanek bez nekrozy wewnątrz organoidów, protokoły opierają się na początkowym zaangażowaniu neuronalnym w warunkach statycznych, następnie enkapsulacji w hydrożelach, a następnie hodowli w układach dynamicznych3. Takie podejścia mogą jednak ograniczać potencjalne zwiększenie skali produkcji organoidów. Mimo że podjęto wysiłki, aby skierować różnicowanie PSC do określonych regionów ośrodkowego układu nerwowego, w tym neuronów kory mózgowej, prążkowia, śródmózgowia i rdzenia kręgowego9,10,11,12, generowanie określonych regionów mózgu w warunkach dynamicznych nadal stanowi wyzwanie. W szczególności generowanie dojrzałych neuronów móżdżku w strukturach 3D nie zostało jeszcze opisane. Muguruma i in. byli pionierami w generowaniu warunków hodowlanych, które podsumowują wczesny rozwój móżdżku13 i niedawno opisali protokół, który pozwala ludzkim embrionalnym komórkom macierzystym na generowanie spolaryzowanej struktury przypominającej móżdżek w pierwszym trymestrze ciąży7. Jednak dojrzewanie neuronów móżdżku w zgłoszonych badaniach wymaga dysocjacji organoidów, sortowania progenitorów móżdżku i kokultury z komórkami karmicielskimi w systemie hodowli jednowarstwowej7,14,15,16. W związku z tym powtarzalne wytwarzanie pożądanych organoidów móżdżku do modelowania chorób w określonych warunkach jest nadal wyzwaniem związanym ze zmiennością hodowli i źródeł żywieniowych.

Ten protokół przedstawia optymalne warunki hodowli dla ekspansji 3D i efektywnego różnicowania ludzkich PSC w neurony móżdżku za pomocą jednorazowych pionowych bioreaktorów kołowych (specyfikacja znajduje się w Tabeli Materiałów), zwanych dalej bioreaktorami. Bioreaktory są wyposażone w duży pionowy wirnik, który w połączeniu z dnem w kształcie litery U zapewnia bardziej jednorodny rozkład ścinania wewnątrz zbiornika, umożliwiając delikatne, równomierne mieszanie i zawieszenie cząstek przy zmniejszonych prędkościach mieszania17. Dzięki temu systemowi można uzyskać agregaty komórkowe o kontrolowanym kształcie i wielkości, co jest ważne dla bardziej jednorodnego i wydajnego różnicowania. Co więcej, w mniej pracochłonny sposób można wygenerować większą liczbę organoidów pochodzących z iPSC.

Główną cechą organoidów, które są wielokomórkowymi strukturami 3D, zwykle tworzonymi z komórek macierzystych, jest samoorganizacja różnych typów komórek, które tworzą specyficzne kształty, takie jak te obserwowane w ludzkiej morfogenezie18,19,20. Dlatego morfologia organoidów jest ważnym kryterium, które należy ocenić podczas procesu różnicowania. Kriosekcja organoidów i dalsze barwienie immunologiczne wycinków organoidów za pomocą określonego zestawu przeciwciał pozwala na przestrzenną wizualizację markerów molekularnych w celu analizy proliferacji, różnicowania, tożsamości populacji komórek i apoptozy. Dzięki temu protokołowi, poprzez immunobarwienie kriosekcji organoidów, początkowe skuteczne zaangażowanie neuronalne obserwuje się do 7dnia różnicowania. Podczas różnicowania obserwuje się kilka populacji komórek o tożsamości móżdżku. Po 35 dniach w tym dynamicznym układzie neuronabłonek móżdżku organizuje się wzdłuż osi wierzchołkowej, z wierzchołkową warstwą proliferujących komórek progenitorowych i podstawowo zlokalizowanymi neuronami postmitotycznymi. Podczas procesu dojrzewania, od 35 do 90 dnia różnicowania, można zaobserwować różne typy neuronów móżdżku, w tym komórki Purkinjego (Calbindin+), komórki ziarniste (PAX6+/MAP2+), komórki Golgiego (Neurogranina+), jednobiegunowe komórki szczotkowe (TBR2+) oraz neurony projekcyjne głębokich jąder móżdżku (TBR1+). Obserwuje się również nieznaczną śmierć komórki w wygenerowanych organoidach móżdżku po 90 dniach w hodowli.

W tym systemie, ludzkie organoidy pochodzące z iPSC dojrzewają do różnych neuronów móżdżku i przeżywają do 3 miesięcy bez potrzeby dysocjacji i kokultury żywieniowej, stanowiąc źródło ludzkich neuronów móżdżku do modelowania chorób.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pasażowanie i utrzymywanie ludzkich iPSC w hodowli monowarstwowej

  1. Przygotowanie płytek
    1. Rozmrozić zapas macierzy błony podstawnej (patrz Tabela materiałów) w temperaturze 4 °C i przygotować aliquoty po 60 μL. Zamrozić aliquoty w temperaturze -20 °C.
    2. Aby pokryć dołki płytki 6-dołkowej, rozmrozić jeden aliquot macierzy błony podstawnej na lodzie. Po rozmrożeniu dodać 60 µL do 6 mL DMEM-F12. Ostrożnie resuspendować poprzez pipetowanie w górę i w dół.
    3. Dodać 1 mL rozcieńczonego roztworu macierzy błony podstawnej do każdego dołka płytki 6-dołkowej i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 1 h przed pasażowaniem lub przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.
  2. Pasażowanie kolonii iPSC z użyciem EDTA
    1. Utrzymywać iPSC w hodowli monowarstwowej na płytkach 6-dołkowych w inkubatorze w temperaturze 37 °C, przy 95% wilgotności i 5% CO2.
      UWAGA: W tym protokole użyto trzech różnych linii ludzkich iPSC: F002.1A.1321, ludzkiej episomalnej linii iPSC (iPSC6.2)22 oraz komercyjnie pozyskanej iPS-DF6-9-9T.B (patrz Tabela materiałów).
    2. Przed pasażowaniem inkubować przechowywane płytki (krok 1.1) w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 min i przygotować medium mTesR1 (Tabela 1).
    3. Odssać roztwór z płytki za pomocą pipety serologicznej i natychmiast dodać 0,5 mL medium mTeSR1 do każdego dołka.
    4. Odssać zużyte medium z dołka zawierającego iPSC i wypłukać raz, używając 1 mL 0,5 mM EDTA na dołek.
    5. Dodać 1 mL 0,5 mM EDTA do każdego dołka i inkubować w RT przez 5 min.
    6. Odssać EDTA i usunąć komórki z dołków poprzez ostrożne dodanie medium mTeSR1 i pipetowanie kolonii za pomocą mikropipety P1000. Zebrać komórki do probówki stożkowej.
      UWAGA: Nie pipetować komórek w górę i w dół więcej niż 3 razy.
    7. Dodać 1 mL zawiesiny komórkowej (rozcieńczonej 1:4) do każdego dołka w taki sposób, aby po dodaniu zawiesiny każdy dołek zawierał 1,5 mL medium. Przenieść komórki do inkubatora z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
    8. Wymieniać zużyte medium codziennie i pasażować co 3 dni po osiągnięciu 75%–80% konfluencji.

2. Wysiewanie ludzkich iPSC w bioreaktorze

  1. Inkubować iPSC hodowane w monowarstwach w mTeSR1 uzupełnionym o 10 µM inhibitora ROCK Y-27632 (ROCKi). Do każdego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej dodać 1 mL uzupełnionego medium i inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C, przy 95% wilgotności i 5% CO2.
    UWAGA: ROCKi jest stosowany w celu ochrony dysocjowanych iPSC przed apoptozą23.
  2. Po 1 h inkubacji odessać zużyte medium z każdego dołka i przemyć 1x 1 mL 1× PBS na dołek.
  3. Do każdego dołka 6-dołkowej płytki dodać 1 mL medium do odrywania komórek (patrz Tabela materiałów) i inkubować w 37 °C przez 7 min, aż komórki łatwo oddzielą się od ścianek dołków po delikatnym wstrząsaniu.
  4. Przenieść medium do odrywania komórek pipetą mikrolitrową P1000 ruchem góra-dół, aż komórki oddzielą się i zdysocjują do postaci pojedynczych komórek. Do każdego dołka dodać 2 mL pełnego medium hodowlanego, aby dezaktywować trawienie enzymatyczne, a następnie delikatnie przenieść komórki pipetą do sterylnej probówki stożkowej.
  5. Wirować przy 210 × g przez 3 min i usunąć nadsącz.
  6. Resuspendować osad komórkowy w medium hodowlanym (tj. mTeSR1 uzupełnionym o 10 µM ROCKi) i policzyć iPSC za pomocą hemocytometru z użyciem barwnika trypan blue.
  7. Zasiać 15 × 106 pojedynczych komórek w bioreaktorze (maksymalna objętość 100 mL) w 60 mL mTeSR1 uzupełnionego o 10 µM ROCKi, przy końcowym zagęszczeniu komórek 250,000 cells/mL.
  8. Umieścić naczynie zawierające iPSC w uniwersalnej jednostce bazowej umieszczonej w inkubatorze w 37 °C, 95% wilgotności i 5% CO2.
    UWAGA: Mieszanie w bioreaktorze jest utrzymywane przez 24 h poprzez ustawienie kontrolera jednostki bazowej na 27 rpm, aby wspomóc agregację iPSC.

3. Różnicowanie i dojrzewanie agregatów pochodzących z ludzkich iPSC w organoidach móżdżku

  1. Przyjmij dzień wysiewu pojedynczych komórek jako dzień 0.
  2. W dniu 1 pobierz 1 mL próbki agregatów iPSC za pomocą pipety serologicznej. Przed pobraniem próbki umieść jednostkę bazową z bioreaktorem zawierającym agregaty w sterylnym przepływie, aby utrzymać mieszanie w bioreaktorze tak jak wcześniej. Przenieś zawiesinę komórkową na płytkę 24-dołkową o ultra-niskim wiązaniu (ultra-low attachment). Sprawdź, czy utworzyły się agregaty pochodzące z iPSC.
  3. Wykonaj zdjęcia za pomocą mikroskopu optycznego przy całkowitym powiększeniu 40x lub 100x, aby zmierzyć średnicę agregatów.
  4. Zmierz pole powierzchni agregatów na każdym zdjęciu przy użyciu oprogramowania FIJI.
    1. Z paska menu wybierz “Analyze | Set Measurements”, zaznacz „Area” i kliknij „OK”.
    2. Z paska menu wybierz „File | Open”, aby otworzyć zapisany plik obrazu. Wybierz narzędzie wyboru linii z paska narzędzi i narysuj linię prostą wzdłuż skali przedstawionej na zdjęciu. Z paska menu wybierz „Analyze | Set scale”.
    3. W polu “Known distance” wpisz długość paska skali obrazu w µm. Jako „Unit of length” określ µm. Kliknij „Global”, aby zapisać ustawienia, a następnie „OK”. Wybierz narzędzie Oval Selection z paska narzędzi.
    4. Dla każdego agregatu obrysuj jego powierzchnię za pomocą narzędzia owalnego. Wybierz „Analyze | Measure”. Oblicz średnicę na podstawie zmierzonej powierzchni, przyjmując, że agregaty mają kształt zbliżony do sfery, korzystając ze wzoru:
      Wzór na obliczanie średnicy, geometria, równanie, symbol matematyczny, A=pole powierzchni.
      gdzie A to pole powierzchni agregatu.
  5. Gdy średnia średnica agregatów wyniesie 100 µm, wymień 80% zużytego medium na świeże mTeSR1 bez ROCKi. Gdy agregaty osiągną średnicę 200–250 μm, wymień całe zużyte medium na gfCDM (Tabela 1), pozwalając organoidom opaść na dno bioreaktora.
    UWAGA: Jeśli średnia średnica agregatów przekroczy 350 μm, nie rozpoczynaj protokołu różnicowania. Powtórz wysiew pojedynczych komórek. Zazwyczaj agregaty osiągają średnią średnicę 100 µm w ciągu około 1 dnia.
  6. Włóż bioreaktor zawierający agregaty do jednostki bazowej umieszczonej w inkubatorze w temperaturze 37 °C, przy wilgotności 95% i stężeniu 5% CO2.
  7. Zmniejsz intensywność mieszania w bioreaktorze do 25 rpm.
  8. W dniu 2 powtórz kroki 3.2, 3.3 i 3.4, aby ocenić średnicę agregatów. Do 60 mL medium do różnicowania gfCDM (Tabela 1) dodaj 30 μL FGF2 (stężenie końcowe 50 ng/mL) oraz 60 μL SB431542 (stężenie końcowe 10 μM). Wymień całe zużyte medium z bioreaktora na uzupełnione gfCDM. Powtórz krok 3.6.
    UWAGA: SB431542 jest niezbędny do zahamowania różnicowania mezendodermalnego, co indukuje różnicowanie neuronalne24. FGF2 jest stosowany w celu promowania kaudalizacji tkanki neuroepithelialnej25.
  9. W dniu 5 powtórz kroki 3.2, 3.3, 3.4 i 3.8.
    UWAGA: Rozmiar agregatów powinien zwiększać się w trakcie protokołu różnicowania. Jednak średnica jest krytyczna tylko w momencie rozpoczynania różnicowania, ponieważ parametr ten może wpływać na efektywność procesu.
  10. W dniu 7 powtórz kroki 3.2, 3.3 i 3.4. Zmniejsz stężenie FGF2 i SB431542 do 2/3: dodaj 20 μL FGF2 i 40 μL SB431542 do 60 mL medium do różnicowania gfCDM. Wymień całe zużyte medium z bioreaktora na uzupełnione gfCDM. Powtórz krok 3.6 i zwiększ intensywność mieszania w bioreaktorze do 30 rpm.
  11. W dniu 14 powtórz kroki 3.2, 3.3 i 3.4. Do 60 mL medium do różnicowania gfCDM dodaj 60 μL FGF19 (stężenie końcowe 100 ng/mL). Wymień całe zużyte medium z bioreaktora na gfCDM uzupełnione o FGF19. Powtórz krok 3.6.
    UWAGA: FGF19 jest stosowany w celu promowania polaryzacji struktur mózgu średniego i tylnego26.
  12. W dniu 18 powtórz kroki 3.2, 3.3, 3.4 i 3.11.
  13. W dniu 21 powtórz kroki 3.2, 3.3 i 3.4. Wymień całe zużyte medium z bioreaktora na kompletne medium neurobasal (Tabela 1). Powtórz krok 3.6.
    UWAGA: Medium neurobasal jest medium podstawowym stosowanym do utrzymania populacji komórek neuronalnych wewnątrz organoidu7.
  14. W dniu 28 powtórz kroki 3.2, 3.3 i 3.4. Do 60 mL kompletnego medium neurobasal dodaj 180 μL SDF1 (stężenie końcowe 300 ng/mL). Wymień całe zużyte medium z bioreaktora na kompletne medium neurobasal uzupełnione o SDF1. Powtórz krok 3.6.
    UWAGA: SDF1 jest stosowany w celu ułatwienia organizacji odrębnych warstw komórkowych27.
  15. W dniu 35 powtórz kroki 3.2, 3.3 i 3.4. Wymień całe zużyte medium z bioreaktora na kompletne medium BrainPhys (Tabela 1). Powtórz krok 3.6.
    UWAGA: BrainPhys jest medium neuronalnym wspomagającym neurony aktywne synaptycznie28.
  16. Co 3 dni wymieniaj 1/3 całkowitej objętości na kompletne medium BrainPhys aż do 90. dnia różnicowania.

4. Przygotowanie organoidów do kriosiekcji i immunohistochemii

  1. Zbieranie organoidów do immunobarwienia
    1. Za pomocą pipety serologicznej pobrać z bioreaktora 1 mL próbki medium zawierającego organoidy do probówki stożkowej o pojemności 15 mL.
      UWAGA: Organoidy należy zbierać w różnych punktach czasowych w celu oceny wydajności różnicowania, w tym w dniach 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80 i 90.
    2. Usunąć nadosad i wypłukać raz 1 mL 1× PBS.
      UWAGA: Nie wirować organoidów. Pozostawić organoidy, aby opadły na dno probówki pod wpływem grawitacji.
    3. Usunąć nadosad i dodać 1 mL 4% paraformaldehydu (PFA). Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 min. Usunąć zużyte PFA i dodać 1 mL 1× PBS.
    4. Przechowywać organoidy w 1 mL 1× PBS w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do kriosiekcji.
      UWAGA: Przechowywać organoidy w 1x PBS nie dłużej niż przez 1 tydzień po utrwaleniu.
  2. Przygotowanie organoidów do kriosiekcji
    1. Usunąć nadosad z przechowywanych organoidów. Dodać 1 mL 15% sacharozy (w/v, rozcieńczonej w 1× PBS), dobrze wymieszać delikatnie okrążając probówkę i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować roztwór 15% sacharozy/7,5% żelatyny (Tabela 2) i utrzymywać go w temperaturze 37 °C podczas przygotowania, aby zapobiec zestaleniu żelatyny.
    3. Usunąć roztwór 15% sacharozy, dodać do organoidów 1 mL 15% sacharozy/7,5% żelatyny i szybko wymieszać delikatnie okrążając probówkę. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 h.
    4. Wlać roztwór 15% sacharozy/7,5% żelatyny do plastikowego pojemnika do połowy jego objętości. Odczekać do zestalenia w temperaturze pokojowej (RT).
    5. Po 1 h inkubacji ostrożnie nanieść za pomocą pipety Pasteura kroplę sacharozy/żelatyny zawierającą organoidy na zestaloną żelatynę. Pozostawić do zestalenia w temperaturze pokojowej przez około 15 min. Należy zadbać o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza.
    6. Wylać 15% sacharozy/7,5% żelatyny na wierzch organoidów, aż pojemnik zostanie wypełniony. Odczekać do całkowitego zestalenia w temperaturze pokojowej.
    7. Po zestaleniu inkubować przez 20 min w temperaturze 4 °C.
    8. Wyciąć z żelatyny sześcian z organoidami w centrum i przymocować sześcian żelatyny do kawałka tektury za pomocą kropli związku O.C.T.
    9. Wlać 250 mL izopentanu do kubka o pojemności 500 mL i napełnić odpowiedni pojemnik ciekłym azotem. Używając pęsety i grubych rękawic, ostrożnie umieścić kubek z izopentanem na powierzchni ciekłego azotu i schłodzić izopentan do -80 °C.
    10. Po osiągnięciu -80 °C umieścić sześcian żelatyny w kubku z izopentanem do momentu zamrożenia, utrzymując temperaturę -80 °C. W zależności od wielkości sześcianu może to zająć 1–2 min.
      UWAGA: Unikać temperatur poniżej -80 °C lub zbyt długiego mrożenia, ponieważ może to spowodować pękanie sześcianu.
    11. Po zamrożeniu szybko przenieść sześcian żelatyny do -80 °C i przechowywać do czasu kriosiekcji.
  3. Kriosiekcja organoidów
    1. Włączyć kriotom i ustawić temperaturę preparatu (OT) oraz komory chłodzącej (CT) na -25 °C.
    2. Po ustabilizowaniu się obu temperatur przymocować sześcian żelatyny z organoidami do uchwytu preparatu za pomocą związku O.C.T.
    3. Ustawić grubość przekroju na 12 µm.
    4. Wyciąć sześcian i zebrać 3–4 skrawki na przylepnych szkiełkach mikroskopowych (patrz Tabela materiałów).
    5. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  4. Immunobarwienie skrawków organoidów
    1. Umieścić szkiełka mikroskopowe z przekrojami organoidów w naczyniu do barwienia z 50 mL podgrzanego 1x PBS, układając do 10 szkiełek tyłem do siebie.
      UWAGA: Wszystkie przekroje organoidów powinny być zanurzone w cieczy.
    2. Inkubować przez 45 min w temperaturze 37 °C w celu usunięcia żelatyny ze szkiełek.
    3. Wypłukać 1x w 50 mL 1× PBS przez 5 min w temperaturze pokojowej: przenieść szkiełka do naczynia z nowym 1× PBS.
    4. Przenieść szkiełka do naczynia zawierającego 50 mL świeżo przygotowanej glicyny (Tabela 2) i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    5. Przenieść szkiełka do naczynia zawierającego 50 mL 0,1% tritonu (Tabela 2) i permeabilizować przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    6. Wypłukać w 1× PBS przez 5 min (2x).
    7. Przygotować naczynie do immunobarwienia z papierem o grubości 3 mm nasączonym 1× PBS. Osuszyć szkiełka chusteczką wokół przekrojów i położyć je na papierze 3 mm. Za pomocą pipety Pasteura pokryć całą powierzchnię szkiełek roztworem blokującym (Tabela 2), stosując ~0,5 mL na szkiełko. Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej.
    8. Usunąć nadmiar roztworu blokującego i osuszyć szkiełka chusteczką wokół przekrojów. Nanieść 50 µL przeciwciała pierwszorzędowego (Tabela 3) rozcieńczonego w roztworze blokującym na przekroje i przykryć szkiełkami podstawowymi. Umieścić skrawki w wcześniej przygotowanym naczyniu do immunobarwienia. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    9. Przenieść szkiełka do naczynia z 50 mL TBST (Tabela 2), pozwolić szkiełkom podstawowym opaść i wypłukać w TBST przez 5 min (3x).
    10. Nanieść 50 µL przeciwciała wtórnego rozcieńczonego w roztworze blokującym na przekroje i przykryć szkiełkami podstawowymi. Umieścić skrawki w wcześniej przygotowanym naczyniu do immunobarwienia. Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
    11. Ponownie przenieść szkiełka do naczynia i wypłukać w 50 mL TBST przez 5 min (3x).
    12. Osuszyć szkiełka chusteczką wokół przekrojów i umieścić skrawki w wcześniej przygotowanym naczyniu do immunobarwienia. Nanieść 0,5 mL roztworu DAPI na całą powierzchnię szkiełek za pomocą pipety Pasteura. Inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    13. Powtórzyć krok 4.4.9.
    14. Ostrożnie osuszyć szkiełka chusteczką. Nanieść 50 µL medium montującego kropla po kropli wzdłuż szkiełka, a następnie ostrożnie nałożyć szkiełko podstawowe na każde szkiełko, lekko je wyginając, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół rozpoczęto od indukcji agregacji komórek z wykorzystaniem bioreaktorów o pojemności 0,1 L (Rycina 1A). Wykonano inokulację iPSC w formie pojedynczych komórek, wysiewając 250 000 komórek/mL w 60 mL pożywki przy prędkości mieszania 27 rpm. Moment ten określono jako dzień 0. Po 24 h komórki efektywnie utworzyły agregaty o kształcie sferoidów (dzień 1, Rycina 1B), a ich morfologia była dobrze zachowana aż do dnia 5, przy stopniowym wzroście rozmiaru, co wyk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Konieczność uzyskiwania dużej liczby komórek, jak również zdefiniowanych warunków hodowli w celu generowania specyficznych typów komórek do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej, napędza rozwój skalowalnych systemów hodowli. W ostatnich latach kilka grup badawczych zgłosiło możliwość skalowalnego generowania progenitorów neuronalnych i funkcjonalnych neuronów32,33,34, co stanowi znaczący postęp w opra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy YH i SJ są pracownikami PBS Biotech. Autor BL jest dyrektorem generalnym i współzałożycielem PBS Biotech, Inc. Współpracujący autorzy uczestniczyli w opracowaniu bioreaktorów wykorzystanych w manuskrypcie. Nie wpływa to jednak na przestrzeganie przez autorów wszystkich zasad czasopisma dotyczących udostępniania danych i materiałów. Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugalia (UIDB/04565/2020 przez Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 do T.P.S i PD/BD/128376/2017 do D.E.S.N.), projekty współfinansowane przez FEDER (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) i FCT poprzez grant PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 i CEREBEX Generation of Ancebellar Organoids for Grant badawczy na ataksję LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Pozyskano również dofinansowanie z Programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy o grant nr 739572 – The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Papier 3MMWHA3030861Merck
AccutaseA6964 - 500 mlPożywka do odrywania komórekSigma
Przeciwciało anty-BARHL1HPA004809Przeciwciała
Przeciwciała anty-kalbindyny D-28k PrzeciwciałoCB28Millipore
Przeciwciało anty-MAP2M4403Przeciwciało
610921transdukcji
MAB1259-SPR& D
Przeciwciało anty-OLIG2MABN50Millipore
Przeciwciało anty-PAX6PRB-278PPrzeciwciało
MAB2018R& D
Przeciwciało anty-TBR1AB2261Przeciwciało anty-TBR2 Millipore
ab183991Przeciwciało Abcam
anty-TUJ1801213Biolegend
Apo-transferynaT1147Sigma
BrainPhys Pożywka neuronalna N2-A i Zestaw SM15793 - 500 mlkomórek macierzystych
Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy11905031ThermoFisher
Szkiełka nakrywkowe 24x60mm631-1575VWR
BSA5470Sigma
Dibutyryl cAMPSC- 201567B -500mgFrilabo
DMEM-F1232500-035ThermoFisher
Płodowa surowica bydlęcaA3840001ThermoFisher
Żelatyna ze skóry bydlęcejG9391Sigma
E94ThermoFisher
Glutamax I10566-016ThermoFisher
GlicynaMB014001Szynka NZYtech
' s F1221765029ThermoFisher
Human Episomal iPSC LineA18945ThermoFisheriPSC6.2
IMDM12440046ThermoFisher
Insulina91077CSigma
iPS DF6-9-9T. BWiCell
Izo-pentanPHR1661-2MLSigma
A-92902Sigma
Matrigel354230Matryca membrany podstawnejCorning
MonotioglycerolM6154Sigma
Mowiol475904Miliporemedium montażowe
mTeSR185850 -500mlz technologiami
17502048ThermoFisher
Neurobasal12348017ThermoFisher
Paraformaldehyde158127Sigma
PBS-0.1SKU: IA-0.1-D-001PBS
PBS-MINI MagDriveSKU: IA-UNI-B-501PBS Biotech
Rekombinowany ludzki BDNF450-02Peprotech
Rekombinowany ludzki bFGF/FGF2100-18BPeprotech
Rekombinowany ludzki FGF19100-32Peprotech
Rekombinowany ludzki GDNF450-10Peprotech
Rekombinowany ludzki SDF1300-28APeprotech
ROCK inhibitor Y-2763272302komórek macierzystych
SB431542S4317Sigma
SacharozaS7903Sigma
Szkiełka mikroskopowe SuperFrost12372098Szkiełka mikroskopoweThermoFisher
Tissue-Tek OCT Compound25608-930VWR
Tris-HCL 1MT3038-1LSigma
Triton X-1009002-93-1Sigma
Tween-20P1379Sigma
UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,015575020ThermoFisher
Atlasa anty-N-kadheryny Sigma Przeciwciało anty-NESTIN BD anty-SOX2 Covance Technologie DAPI 10236276001 Sigma Szklany słoik do kopania Kwas L-askorbinowy Suplement N2 komórek macierzystych Naczynie jednorazowego użytku Jednostka bazowa Biotech Technologie

Bibliografia

  1. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Ishida, Y., et al. Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs. Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).
  5. Liu, Y., Zhang, S. C. Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).
  6. Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162 (2), 375-390 (2015).
  7. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  8. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  9. Aubry, L., et al. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).
  10. Gunhanlar, N., et al. A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).
  11. Hu, B. Y., Zhang, S. C. Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells. Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).
  12. Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  13. Muguruma, K., et al. Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells. Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).
  14. Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).
  15. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Science Reports. 5, 9232(2015).
  16. Tao, O., et al. Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).
  17. Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies. Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).
  18. Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
  19. Lou, Y. R., Leung, A. W. Next generation organoids for biomedical research and applications. Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).
  20. Silva, T. P., et al. Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering. Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).
  21. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).
  22. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293(2011).
  23. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  24. Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).
  25. Yaguchi, Y., et al. Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development. Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).
  26. Fischer, T., et al. Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis. Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).
  27. Bagri, A., et al. The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells. Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).
  28. Bardy, C., et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).
  29. Bauwens, C. L., et al. Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  30. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
  31. Miranda, C. C., et al. Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment. Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  32. Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells. Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).
  33. Bardy, J., et al. Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells. Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).
  34. Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
  35. Arora, N., et al. A process engineering approach to increase organoid yield. Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).
  36. Gimeno, L., Martinez, S. Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh. Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ludzkie iPSCskalowalny bioreaktorwarunki chemicznie zdefiniowaneanaliza immunobarwieniatechnika kriosekcjonowaniazaanga owanie neuronalnemarkery m d kucharakterystyka organoid wmedium r nicuj ce
Skalowalne generowanie dojrzałych organoidów móżdżku z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i charakterystyka za pomocą barwienia immunologicznego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.