Ten protokół opisuje dynamiczny system hodowli do produkcji kontrolowanych agregatów ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i dalszego stymulowania różnicowania w organoidach móżdżku w chemicznie zdefiniowanych warunkach i bez karmienia za pomocą jednorazowego bioreaktora.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Skalowalne generowanie dojrzałych organoidów móżdżku z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i charakterystyka za pomocą barwienia immunologicznego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Móżdżek odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu równowagi i koordynacji ruchowej, a defekt funkcjonalny w różnych neuronach móżdżku może wywołać dysfunkcję móżdżku. Większość obecnej wiedzy na temat fenotypów neuronalnych związanych z chorobą opiera się na tkankach pośmiertnych, co utrudnia zrozumienie progresji i rozwoju choroby. Modele zwierzęce i unieśmiertelnione linie komórkowe były również wykorzystywane jako modele zaburzeń neurodegeneracyjnych. Nie oddają one jednak w pełni chorób człowieka. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) mają ogromny potencjał w modelowaniu chorób i stanowią cenne źródło dla podejść regeneracyjnych. W ostatnich latach wytworzenie organoidów mózgowych z iPSC pochodzących od pacjentów poprawiło perspektywy modelowania chorób neurodegeneracyjnych. Brakuje jednak protokołów, które produkują dużą liczbę organoidów i wysoką wydajność dojrzałych neuronów w systemach hodowli 3D. Przedstawiony protokół jest nowym podejściem do powtarzalnego i skalowalnego generowania ludzkich organoidów pochodzących z iPSC w zdefiniowanych chemicznie warunkach przy użyciu skalowalnych bioreaktorów jednorazowego użytku, w których organoidy uzyskują tożsamość móżdżku. Wygenerowane organoidy charakteryzują się ekspresją specyficznych markerów zarówno na poziomie mRNA, jak i białka. Analiza określonych grup białek pozwala na wykrycie różnych populacji komórek móżdżku, których lokalizacja jest ważna dla oceny struktury organoidów. Kriosekcja organoidów i dalsze barwienie immunologiczne wycinków organoidów służą do oceny obecności określonych populacji komórek móżdżku i ich organizacji przestrzennej.
Wprowadzenie
Pojawienie się ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) stanowi doskonałe narzędzie dla medycyny regeneracyjnej i modelowania chorób, ponieważ komórki te mogą być zróżnicowane w większość linii komórkowych ludzkiego ciała1,2. Od czasu ich odkrycia, różnicowanie PSC przy użyciu różnych podejść zostało zgłoszone do modelowania różnych chorób, w tym zaburzeń neurodegeneracyjnych3,4,5,6.
Ostatnio pojawiły się doniesienia o kulturach 3D pochodząc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Pasażowanie i utrzymywanie ludzkich iPSC w hodowli monowarstwowej
- Przygotowanie płytek
- Rozmrozić zapas macierzy błony podstawnej (patrz Tabela materiałów) w temperaturze 4 °C i przygotować aliquoty po 60 μL. Zamrozić aliquoty w temperaturze -20 °C.
- Aby pokryć dołki płytki 6-dołkowej, rozmrozić jeden aliquot macierzy błony podstawnej na lodzie. Po rozmrożeniu dodać 60 µL do 6 mL DMEM-F12. Ostrożnie resuspendować poprzez pipetowanie w górę i w dół.
- Dodać 1 mL rozcieńczonego roztworu macierzy błony podstawnej do każdego dołka płytki 6-dołkowej i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 1 h....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Protokół rozpoczęto od indukcji agregacji komórek z wykorzystaniem bioreaktorów o pojemności 0,1 L (Rycina 1A). Wykonano inokulację iPSC w formie pojedynczych komórek, wysiewając 250 000 komórek/mL w 60 mL pożywki przy prędkości mieszania 27 rpm. Moment ten określono jako dzień 0. Po 24 h komórki efektywnie utworzyły agregaty o kształcie sferoidów (dzień 1, Rycina 1B), a ich morfologia była dobrze zachowana aż do dnia 5, przy stopniowym wzroście rozmiaru, co wyk.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Konieczność uzyskiwania dużej liczby komórek, jak również zdefiniowanych warunków hodowli w celu generowania specyficznych typów komórek do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej, napędza rozwój skalowalnych systemów hodowli. W ostatnich latach kilka grup badawczych zgłosiło możliwość skalowalnego generowania progenitorów neuronalnych i funkcjonalnych neuronów32,33,34, co stanowi znaczący postęp w opra.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy YH i SJ są pracownikami PBS Biotech. Autor BL jest dyrektorem generalnym i współzałożycielem PBS Biotech, Inc. Współpracujący autorzy uczestniczyli w opracowaniu bioreaktorów wykorzystanych w manuskrypcie. Nie wpływa to jednak na przestrzeganie przez autorów wszystkich zasad czasopisma dotyczących udostępniania danych i materiałów. Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugalia (UIDB/04565/2020 przez Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 do T.P.S i PD/BD/128376/2017 do D.E.S.N.), projekty współfinansowane przez FEDER (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) i FCT poprzez grant PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 i CEREBEX Generation of Ancebellar Organoids for Grant badawczy na ataksję LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Pozyskano również dofinansowanie z Programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy o grant nr 739572 – The Discoveries ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Papier 3MM | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 - 500 ml | Pożywka do odrywania komórek | Sigma |
| Przeciwciało anty-BARHL1 | HPA004809 | Przeciwciała | |
| Przeciwciała anty-kalbindyny D-28k Przeciwciało | CB28 | Millipore | |
| Przeciwciało anty-MAP2 | M4403 | Przeciwciało | |
| 610921 | transdukcji | ||
| MAB1259-SP | R& D | ||
| Przeciwciało anty-OLIG2 | MABN50 | Millipore | |
| Przeciwciało anty-PAX6 | PRB-278P | Przeciwciało | |
| MAB2018 | R& D | ||
| Przeciwciało anty-TBR1 | AB2261 | Przeciwciało anty-TBR2 Millipore | |
| ab183991 | Przeciwciało Abcam | ||
| anty-TUJ1 | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferyna | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Pożywka neuronalna N2-A i Zestaw SM1 | 5793 - 500 ml | komórek macierzystych | |
| Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy | 11905031 | ThermoFisher | |
| Szkiełka nakrywkowe 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| BSA | 5470 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Płodowa surowica bydlęca | A3840001 | ThermoFisher | |
| Żelatyna ze skóry bydlęcej | G9391 | Sigma | |
| E94 | ThermoFisher | ||
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glicyna | MB014001 | Szynka NZYtech | |
| ' s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulina | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T. B | WiCell | ||
| Izo-pentan | PHR1661-2ML | Sigma | |
| A-92902 | Sigma | ||
| Matrigel | 354230 | Matryca membrany podstawnej | Corning |
| Monotioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Milipore | medium montażowe |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | z technologiami | |
| 17502048 | ThermoFisher | ||
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS | |
| PBS-MINI MagDrive | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Rekombinowany ludzki BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Rekombinowany ludzki bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Rekombinowany ludzki FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Rekombinowany ludzki GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Rekombinowany ludzki SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | komórek macierzystych | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sacharoza | S7903 | Sigma | |
| Szkiełka mikroskopowe SuperFrost | 12372098 | Szkiełka mikroskopowe | ThermoFisher |
| Tissue-Tek OCT Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0 | 15575020 | ThermoFisher |
Bibliografia
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
