Pierwotne rzęski to struktury zewnątrzkomórkowe związane z centriolem. Pierwotne wykrywanie rzęsek za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego jest stosunkowo prostą procedurą, która pozwala uzyskać obrazy o niezwykle wysokiej jakości. W tym protokole fibroblasty wyrażające rzęski pierwotne zostały utrwalone, wybarwione immunologicznie i zobrazowane w mikroskopie fluorescencyjnym lub konfokalnym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Proste wykrywanie rzęsek pierwotnych za pomocą immunofluorescencji
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pierwotne rzęski są dynamicznie regulowane podczas progresji cyklu komórkowego, szczególnie podczas faz G0/G1 cyklu komórkowego, będąc resorbowane przed mitozą. Rzęski pierwotne można wizualizować za pomocą wysoce wyrafinowanych metod, w tym transmisyjnej mikroskopii elektronowej, obrazowania 3D lub za pomocą oprogramowania do automatycznego wykrywania rzęsek pierwotnych. Jednak do wykonania tych metod potrzebne jest barwienie immunofluorescencyjne rzęsek pierwotnych. W niniejszej publikacji opisano protokół łatwego wykrywania rzęsek pierwotnych in vitro poprzez barwienie acetylowanej alfa tubuliny (aksonem) i gamma tubuliny (ciało podstawne). Ten protokół barwienia immunofluorescencyjnego jest stosunkowo prosty i daje wysokiej jakości obrazy. Niniejszy protokół opisuje, w jaki sposób cztery linie komórkowe (C2C12, MEF, NHLF i fibroblasty skóry) wyrażające rzęski pierwotne zostały utrwalone, wybarwione immunologicznie i zobrazowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego.
Wprowadzenie
Pierwotne rzęski to czuciowe, pojedyncze, związane z błoną, nieruchome struktury związane z macierzystą centriolem komórki. Rzęski pierwotne znajdują się na większości komórek kręgowców, z wyjątkiem czerwonych krwinek, adipocytów1 i hepatocytów2. Rzęski pierwotne powstają jako wydłużony aksonem złożony z mikrotubul, którego głównym składnikiem jest α-tubulina. Aksonem wyrasta z ciała podstawnego, które jest zbudowane z γ-tubuliny. Długość rzęsek pierwotnych waha się od 2 do 10 μm; Jednak jego wymiary mogą ulec zmianie podczas glicylacji, głodu, niedotlenienia, stresu cytotoksycznego lub po ekspozycji na promieniowanie jonizujące3,4,5,6,7. Zazwyczaj komórki mają tylko jedną rzęskę pierwotną, która bierze udział w morfogenezie i szlakach sygnalizacji komórkowej ważnych dla proliferacji i różnicowania komórek8,9.
Pierwotne rzęski są dynamicznie regulowane podczas progresji cyklu komórkowego, szczególnie podczas faz G0/G1, i resorbowane przed wejściem w mitozę w procesie związanym z deacetylacją tubuliny, w której pośredniczy HDAC6 (deacetylaza histonów 6)10. Dokładny moment resorpcji rzęsek pierwotnych zależy od typu komórki i ekspresji genów bezpośrednio zaangażowanych w ten proces, takich jak Aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13. W zależności od typu komórki, rzęski pierwotne wyrażają różne typy receptorów, kanałów jonowych i aktywnych szlaków sygnałowych. Należą do nich najważniejsze receptory sygnałowe wpływające na proliferację i przeżycie, EGFR, PDGFR i FGFR. Uwzględniono również niektóre szlaki sygnałowe, które mogą wpływać na funkcję jednego lub więcej narządów, w tym Hedgehog, Notch i Wnt. Dzięki tym receptorom i szlakom sygnałowym rzęski pierwotne pełnią również funkcję chemosensoryczną. Ta funkcja umożliwia rzęskom pierwotnym wykrywanie specyficznych ligandów dla Notch, hormonów i substancji biologicznie czynnych, takich jak serotonina lub somatostatyna. Inne specyficzne funkcje wykazywane przez rzęski pierwotne o różnej długości obejmują reakcję na zmiany temperatury, grawitacji i osmolalności14.
Pierwotne rzęski mogą być wizualizowane za pomocą różnych metod, takich jak wizualizacja na żywo, transmisyjna mikroskopia elektronowa, obrazowanie 3D, lub za pomocą oprogramowania do automatycznego wykrywania rzęsek pierwotnych5,15,16,17. Metody te są jednak wysoce specjalistyczne, a trwające badania wymagają podstawowych, szybkich i łatwych metod barwienia rzęsek pierwotnych na każdym etapie badań. Opisana jest łatwa i użyteczna metoda wykrywania rzęsek pierwotnych w hodowanych komórkach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie pożywek hodowlanych, roztworów i potraw
- Szkiełka nakrywkowe należy sterylizować w autoklawie (22 x 22 mm). Przygotuj 6 dołków. Rozmrozić płodową surowicę bydlęcą (FBS) i antybiotyk penicylinę/streptomycynę i ogrzać pożywkę hodowlaną do temperatury pokojowej (RT). Użyj trypsyny-EDTA (0,25%) i 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami z wapniem i magnezem), aby przejść przez komórki.
- Przygotować świeży 4% paraformaldehyd (PFA) w dH2O (800 mg PFA w 20 ml dH2O). PFA musi być świeżo przygotowany do każdego eksperymentu. Wymieszać i podgrzewać roztwór w temperaturze 55 °C przez 30 minut w okapie. Schłodzić w temperaturze pokojowej. Dodać 1 M wodorotlenek sodu, aż roztwór stanie się klarowny (pH = 7,2–7,4). Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.
Uwaga: PFA jest toksyczny; Zawsze noś odpowiednie środki ochrony osobistej i przygotuj się w kapturze chemicznym. - Przygotuj 500 ml pożywki hodowlanej, DMEM (pożywka Dulbecco's Modified Eagle's Medium) zawierającej 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 2% glutaminy.
- Przygotować 13 ml 1% roztworu żelatyny w sterylnym dH2O (130 mg żelatyny w 13 ml dH2O). Użyj 2 ml 1% żelatyny na każdą studzienkę w 6-dołkowej płytce. Utrzymuj sterylność.
- Wyczyść okap z przepływem laminarnym przy użyciu 70% etanolu. Umieść wymagany materiał w okapie z przepływem laminarnym przed rozpoczęciem eksperymentu.
2. Hodowla komórkowa do barwienia immunocytochemicznego
- Rozmrozić komórki (w tym badaniu C2C12, MEF, NHLF i fibroblasty skóry) przy użyciu standardowych technik i umieścić je w kolbie T75 uzupełnionej ~10-12 ml przygotowanej pożywki. Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 / wilgotności względnej (RH), aż komórki osiągną 70% zbieżności.
- Wyjmij komórki z inkubatora i umieść je w okapie z przepływem laminarnym. Usuń pożywkę hodowlaną i krótko przepłucz komórki 2x 1x PBS. Dodać ~2 ml 0,25% trypsyny-EDTA do kolby T75 i inkubować w temperaturze 37 °C przez ~5 min. Okresowo sprawdzaj pod mikroskopem odwróconym, aby monitorować odwarstwienie komórek.
UWAGA: Czas inkubacji zależy od linii komórkowej i dlatego musi być określony empirycznie. - Delikatnie zawiesić komórki w 10 ml pożywki hodowlanej, ostrożnie pipetując, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. W razie potrzeby ponownie przepłukać kolbę.
- Umieść zawiesinę komórek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i odwiruj przez 5 minut przy ~200 x g. Zdekantować supernatant, dodać 10 ml pożywki hodowlanej i delikatnie zawiesić osad. Pobrać 20 μl zawiesiny komórkowej i wymieszać w stosunku 1:1 z błękitem trypanowym i odliczyć w cytometrze zgodnie ze standardową metodą.
- Umieść jedno szkiełko nakrywkowe w każdym dołku płytki 6-dołkowej za pomocą pęsety. Pokryj szkiełka nakrywkowe żelatyną, wlewając ~ 2 ml do studzienek. Pomoże to komórkom przyczepić się do szkiełek nakrywkowych. Usuń roztwór żelatyny i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu na kilka minut. Szkiełka nakrywkowe są teraz gotowe do hodowli komórek. Natychmiast rozpocznij uprawę.
- Wysiewaj 100 000 fibroblastów do każdej studzienki i dodaj 2 ml pożywki hodowlanej. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C/5% CO2/90% wilgotności względnej. W tym momencie komórki mogą być poddawane obróbce zgodnie z potrzebami użytkownika. Zabiegi mające na celu wywołanie rzęski zostały wcześniej opisane4,5.
UWAGA: Początkowa liczba wysiewu zależy od czasu podwojenia komórek i powinna być odpowiednio określona.
3. Barwienie immunofluorescencyjne rzęsek pierwotnych in vitro
- Podgrzej 4% paraformaldehyd do RT. Przygotuj pipety Pasteura, 1x PBS (RT), pojemnik na odpady, 15 ml stożkowe probówki, mikropipety (0,5–10 μl, 20–200 μl i 100–1 000 μl) i końcówki. Pobrać komórki z inkubatora i umieścić je na ławce.
UWAGA: Procedura barwienia nie musi być wykonywana w sterylnych warunkach. Wszystkie rozwiązania muszą znajdować się w RT. - Usuń media z każdej studzienki. Pozostaw szkiełko nakrywkowe w studzience. Bardzo delikatnie umyj komórki 3x 2 ml 1x PBS. Za pomocą pipety Pasteura dodaj 2 ml 4% PFA do każdej studzienki, aby utrwalić komórki. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć PFA i przemyć 3x 1x PBS.
UWAGA: W okresie inkubacji należy zawsze użyć wystarczającej objętości, aby pokryć całe szkiełko nakrywkowe. Nigdy nie pozwól, aby komórki wyschły. Nigdy nie wylewaj żadnego z roztworów bezpośrednio na szkiełko nakrywkowe. - Przygotować 0,5% Triton X-100 w 13 ml 1x PBS 10 minut przed użyciem. Dodaj 2 ml do każdej studzienki. Inkubować przez 15 minut. Umyj delikatnie 4x z 1x PBS.
UWAGA: Triton X-100 jest nierozpuszczalny w PBS w temperaturze pokojowej. Podgrzej 0,5% roztwór Triton X-100 do temperatury 37 °C w łaźni wodnej, aby go rozpuścić. - Rozmrozić kozią surowicę 5 minut przed użyciem. Rozcieńczyć kozią surowicę w 1x PBS w stosunku 1:20 jako roztwór blokujący. Dodać 150 μl do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubować przez 20 minut w temperaturze RT.
UWAGA: W razie potrzeby wydłuż okres blokady do 60 minut. Nie myj komórek po zablokowaniu kozią surowicą. - Rozmrozić przeciwciała pierwszorzędowe (tj. antyacetylowaną alfa-tubulinę i anty-gamma tubulinę) 5 minut przed użyciem. Rozcieńczyć przeciwciała oddzielnie w 1x PBS w następujący sposób: mysia antyacetylowana alfa tubulina w stosunku 1:800 i królicza anty-gamma tubulina w stosunku 1:300. Usuń roztwór blokujący. Nie prać. Dodać 150 μl obu rozcieńczeń przeciwciał do szkiełek nakrywkowych i inkubować przez 60 minut w temperaturze RT.
UWAGA: W przypadku inkubacji przez noc należy użyć 500–1 000 μl roztworów przeciwciał pierwotnych, uszczelnić płytkę 6-dołkową folią parafinową i przechowywać w temperaturze 4 °C. Alternatywnie należy użyć 150 μl przeciwciała i inkubować w komorze wilgotnościowej. - Usuń przeciwciała pierwszorzędowe. Umyj szkiełka nakrywkowe bardzo delikatnie 3x za pomocą 2 ml 1x PBS. Przygotuj przeciwciała drugorzędowe w 1x PBS, oddzielnie rozcieńczając Cy3 anty-mysi owiec i kozy Alexa Fluor488 anty-królika w stosunku 1:300. Dodać 150 μl obu rozcieńczeń przeciwciał drugorzędowych do szkiełek nakrywkowych. Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
UWAGA: Inkubuj w ciemności, aby uniknąć fotowybielania. W razie potrzeby można zastosować inne kombinacje przeciwciał drugorzędowych. - Przygotuj roztwór DAPI (4', 6-diamidyno-2-fenyloindol) zgodnie z instrukcjami producenta. Nadmiar porcji przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć 10 μl z podwielokrotności podstawowej (1:5 000) w 50 ml 1x PBS. Dodać 2 ml tego rozcieńczenia do szkiełek nakrywkowych. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
UWAGA: Ważne jest, aby inkubować komórki w ciemności, aby uniknąć fotowybielania. Rozcieńczenie DAPI można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca. - Przygotuj 2 igły, szkiełka, pęsety i podłoża montażowe. Oznacz slajdy etykietami.
- Usuń roztwór DAPI ze studzienek. Umyć 3x za pomocą 1x PBS. Umieść jedną kroplę nośnika montażowego na każdym szkiełku. Użyj igły, aby delikatnie podnieść szkiełko nakrywkowe z dna studzienki. Odwróć szkiełko nakrywkowe za pomocą pęsety i delikatnie umieść je na kropli nośnika montażowego. Ostrożnie usuń wszelkie bąbelki.
- Chroń szkiełka przed światłem i przechowuj je przez noc w temperaturze 4 °C.
- Użyj mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego o dużym powiększeniu, aby uwidocznić rzęski pierwotne.
UWAGA: Szkiełka można przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Barwienie immunofluorescencyjne rzęsek pierwotnych jest stosunkowo prostą procedurą, która pozwala na uzyskanie wysokiej jakości obrazów. W ramach tych eksperymentów fibroblasty wykazujące obecność rzęsek pierwotnych zostały utrwalone, poddane immunostainingowi i zobrazowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Rzęskę pierwotną wykryto z wykorzystaniem acetylowanej α-tubuliny oraz γ-tubuliny. Ocena rzęsek pierwotnych może być przeprowadzana na różnych poziomach, a...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kilku autorów opisało różne metody wykrywania rzęsek pierwotnych, czasami opisując również różne metody utrwalania, które mogą wpływać na ich wykrywanie 6,20,21,22. Niezależnie od tego trudno jest znaleźć kompletny i prosty protokół wykrywania. Łatwa dostępność takiej metody byłaby niewątpliwie bardzo pomocna w badaniu rzęsek pierwotnych, zwłaszcza we wczesnych etapach badań lub w szybkiej i ł...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Ministerstwo Obrony Republiki Czeskiej - Długoterminowy plan rozwoju organizacji Medyczne aspekty broni masowego rażenia Wydziału Wojskowych Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Obronnego; Ministerstwo Edukacji, Młodzieży i Sportu, Republika Czeska (Konkretny Projekt Badawczy No: SV/ FVZ201703) oraz PROGRES Q40/06. Podziękowania należą się również Danielowi Diazowi za życzliwą pomoc w powtórce języka angielskiego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Płytka 6-dołkowa | TPP | 92406 | Wymiary 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')? Fragment kozy anty-króliczej IgG |
| antytubuliny i gamma; | Sigma-Aldrich | T5192 | Poliklonalny królik anty-mysi IgG2a |
| C2C12 | ATCC CRL-1772 | Myoblast (mysz) | |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (cała cząsteczka) F(ab′)2 fragment– Przeciwciało Cy3 wytwarzane u owiec |
| Dapi (dichlorowodorek 4&,6-diamidyn-2-fenyloindolu) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´ s Zmodyfikowany orzeł i ostry; s medium | Thermo Scientific | 11960044 | Wysoka zawartość glukozy, Bez glutaminy, Gibco |
| Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Sigma-Aldrich | D8662 | z MgCl2 i CaCl2, Sterylnie filtrowany, Nadaje się do hodowli komórkowych |
| Płodowa surowica bydlęca | Thermo Scientific | 16000044 | Sterylnie filtrowana, Gibco |
| L-Glutamina | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mysi fibroblast zarodkowy |
| Monoklonalna antyacetylowana tubulina | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoklonalne przeciwciało antyacetylowane tubuliny wytwarzane u myszy |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Pierwotne fibroblasty płuc (ludzkie) |
| Normalna surowica kozia | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Proszek |
| Penicylina-Streptomycyna | Sigma-Aldrich | P0781 | 10 000 jednostek penicyliny i 10 mg streptomycyny na ml w 0,9% NaCl, sterylnie filtrowany |
| ProLong Diamond Anti Blaknięcie Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Fibroblasty skóry | Uprzejmie podarowany z Uniwersytetu Karola, Wydziału Lekarskiego w Hradec Krá Miłośćé. | ||
| Szkiełka nakrywkowe kwadratowe | Thermo Scientific | 22X22-1,5 | Szkło borokrzemowe, 22x22mm, kwadratowe |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterylnie filtrowane, Gibco |
Bibliografia
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Primary cilia. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).
- Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
- Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
- Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
- Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
- Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677(2017).
- Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
- Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
- Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
- Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
- Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
- Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
- Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905(2019).
- Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).
- Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
- Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1(2019).
- Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
- Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).
- Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
- Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
- Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381(2019).
- Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5(2017).
- Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11(2015).
- DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
