Artykuł metodologiczny

Zakażenie larw danio pręgowanego zarodnikami Aspergillus w celu analizy interakcji gospodarz-patogen

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61165

⸱

16 maja 2020

 , 
1Department of Biological Sciences, Clemson University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje model infekcji Aspergillus u larw danio pręgowanego. Zarodniki Aspergillus są mikrowstrzykiwane do tyłomózgowia larw, a leczenie chemiczne stosuje się w celu wywołania immunosupresji. Postęp infekcji jest monitorowany za pomocą codziennego zestawu do obrazowania w celu monitorowania wzrostu grzybów i odpowiedzi immunologicznej, a także liczenia żywych zarodników przez posiewanie jednostek tworzących kolonie.

Streszczenie

Inwazyjna aspergiloza (IA) jest jedną z najczęstszych infekcji grzybiczych wśród osób z obniżoną odpornością. Pomimo dostępności leków przeciwgrzybiczych, IA może powodować >50% śmiertelności u zakażonych pacjentów z obniżoną odpornością. Kluczowe znaczenie ma określenie zarówno czynników gospodarza, jak i patogenu, które przyczyniają się do podatności na infekcje i niskich wskaźników przeżycia u zakażonych pacjentów, w celu opracowania nowych metod leczenia. Wrodzone odpowiedzi immunologiczne odgrywają kluczową rolę w rozpoznawaniu i usuwaniu zarodników Aspergillus, chociaż niewiele wiadomo o dokładnych mechanizmach komórkowych i molekularnych. Potrzebne są wiarygodne modele do badania szczegółowych interakcji mechanistycznych między gospodarzem a patogenem. Przejrzystość optyczna i podatność genetyczna larw danio pręgowanego sprawiają, że są one intrygującym modelem do badania interakcji gospodarz-patogen wielu ludzkich infekcji bakteryjnych i grzybiczych w żywym i nienaruszonym żywicielu. Protokół ten opisuje model infekcji Aspergillus u larw danio pręgowanego. Najpierw zarodniki Aspergillus są izolowane i wstrzykiwane do tylnej komory mózgowia danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji. Następnie inhibitory chemiczne, takie jak leki immunosupresyjne, są dodawane bezpośrednio do wody larwalnej. Opisano dwie metody monitorowania infekcji u larw, którym wstrzyknięto, w tym: 1) homogenizacja larw w celu zliczenia jednostek tworzących kolonie (CFU) oraz 2) powtarzany, codzienny zestaw obrazowania na żywo. Ogólnie rzecz biorąc, techniki te mogą być wykorzystywane do mechanicznej analizy postępu infekcji Aspergillus in vivo i mogą być stosowane do różnych środowisk gospodarzy i szczepów Aspergillus w celu zbadania interakcji gospodarz-patogen.

Wprowadzenie

Aspergillus fumigatus jest wszechobecnym grzybem saprofitycznym, a jego zarodniki unoszące się w powietrzu można znaleźć zarówno w pomieszczeniach, jak i na zewnątrz1. Zarodniki te są wdychane przez wszystkich, ale zostają skutecznie usunięte z płuc osób immunokompetentnych1,2. Jednak u osób ze zmienionymi chorobami płuc, takimi jak mukowiscydoza, może rozwinąć się aspergiloza oskrzelowo-płucna z powodu kiełkowania grzybów w płucach3. Najcięższa postać tej infekcji, inwazyjna aspergiloza (IA), dotyka osoby z obniżoną odpornością i wiąże się z przedostaniem się grzyba do innych narządów2,3. IA prowadzi do >50% zgonów zakażonych pacjentów, pomimo dostępności terapii przeciwgrzybiczych4. U osób immunokompetentnych wrodzona odpowiedź immunologiczna odgrywa główną rolę w usuwaniu wdychanych zarodników1. Jednak specyficzne mechanizmy, które przyczyniają się do tego wrodzonego klirensu immunologicznego, nie są dobrze poznane. Ważne jest, aby zrozumieć mechanizmy komórkowe i molekularne głównych wrodzonych komórek odpornościowych (tj. makrofagów i neutrofili) w klirensie Aspergillus, aby znaleźć nowe strategie terapeutyczne dla IA.

Podczas gdy modele ssaków odegrały kluczową rolę w identyfikacji czynników wirulencji grzybów i odpowiedzi immunologicznych gospodarza5,6, dostępność wizualna interakcji gospodarz-patogen na poziomie komórkowym jest ograniczona. Eksperymenty z hodowlami tkankowymi nie są w stanie w pełni podsumować złożonego środowiska wielokomórkowego i interakcji, które występują u całych zwierząt7. W związku z tym danio pręgowany zyskał popularność jako alternatywny organizm modelowy, który wypełnia tę lukę i ułatwia badanie interakcji gospodarz-patogen w żywym, nienaruszonym żywicielu podczas wielodniowej infekcji8,9. Wrodzony układ odpornościowy danio pręgowanego rozwija się już po 24 godzinach od zapłodnienia (hpf)10, a system adaptacyjny rozwija się po 4–6 tygodniach11, zapewniając okno czasowe, w którym można ocenić wrodzoną odpowiedź immunologiczną w izolacji. Wrodzone odpowiedzi immunologiczne są dobrze zachowane między ludźmi a danio pręgowanym11. Danio pręgowany ma wiele cech, które ułatwiają badanie tych reakcji, w tym przejrzystość optyczną (która pozwala na obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości nienaruszonych gospodarzy) i wykonalność genetyczną (co ułatwia molekularne badania mechanistyczne).

Opisany tutaj model infekcji larwalnego danio pręgowanego Aspergillus został pierwotnie opracowany przez Knox et al.12. Został on niedawno rozszerzony przez naszą grupę i inne podmioty w celu zbadania mechanizmów immunologicznych gospodarza12,13, interakcje gospodarz-patogen13,14,15, mechanizmy immunosupresji13,16,17, zjadliwość grzybów18, oraz Skuteczność leków przeciwgrzybiczych19,20. Model ten podsumowuje wiele aspektów ludzkiej aspergilozy. Podczas gdy larwy immunokompetentne są oporne, larwy z obniżoną odpornością mogą ulec infekcji12,13,16,17.

W tym modelu, miejscowa infekcja jest ustalana przez wstrzyknięcie zarodników do tylnej komory mózgu larwy, obszaru mniej zaludnionego przez fagocyty, a rekrutacja i zachowanie fagocytów mogą być oceniane12,13. Uważa się, że makrofagi działają jako pierwsza linia obrony przed zarodnikami Aspergillus u ludzi1 i modele ssaków6,21. Podobnie w modelu danio pręgowanego makrofagi są rekrutowane do wstrzykniętych zarodników Aspergillus, podczas gdy neutrofile są rekrutowane wtórnie w odpowiedzi na wzrost strzępek12,13,22. Z tego modelu dowiedziano się również, że Aspergillus może utrzymywać się w larwach immunokompetentnych typu dzikiego po ponad 7 dniach infekcji. Co więcej, cały przebieg infekcji może być śledzony u tych samych żywych zwierząt poprzez codzienne obrazowanie konfokalne.

Ten protokół opisuje technikę mikroiniekcji do wstrzykiwania zarodników do tylnej komory mózgu 2 dni po zapłodnieniu (2 dpf) larw. Infekcja jest następnie monitorowana przez okres do 7 dni, ponieważ larwy danio pręgowanego mogą żyć do 10 dpf bez żerowania. Immunosupresję można wywołać przez leczenie farmakologiczne, opisano również stosowanie leków na larwy. Na koniec opisano dwie metody śledzenia postępu infekcji, w tym oznaczanie ilościowe CFU z poszczególnych larw oraz codzienną konfigurację obrazowania na żywo.

Protokół

Badacze powinni uzyskać zgodę na wszystkie eksperymenty na zwierzętach od odpowiednich komitetów ds. opieki i użytkowania zwierząt. Reprezentatywne dane przedstawione w tym artykule pochodzą z eksperymentów przeprowadzonych zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Clemson University Institutional Animal Care and Use Committee (AUP2018-070, AUP2019-012).

1. Przygotowanie zarodników Aspergillus do wstrzyknięcia

  1. Z zawiesiny zarodników Aspergillus oblicz objętość potrzebną do uzyskania 1 x 106 zarodników. Objętość powinna wynosić 20–100 μl; jeśli nie, należy wykonać 10-krotne rozcieńczenie w 0,01% (v/v) sterylnym Tween-20 (Tween-water; Tabela materiałów). Na przykład, jeśli obliczona objętość wynosi 5 μl, należy wykonać 10-krotne rozcieńczenie i użyć 50 μl rozcieńczonego roztworu.
    UWAGA: Dwie płytki/szczep mogą być przygotowane w celu zebrania większej ilości zarodników lub jako zapas w przypadku zanieczyszczenia.
  2. Rozprowadź 1 x 106 zarodników Aspergillus na jednej płytce z minimalną pożywką glukozy (GMM) (tabela materiałów) za pomocą sterylnego jednorazowego rozsiewacza w kształcie litery L w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Unikaj rozprowadzania na marginesie talerza. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3–4 dni, z płytką skierowaną do góry nogami.
  3. W dniu zbiórki przynieś sterylną miracloth i stożkowe probówki o pojemności 50 ml (po dwie na szczep), świeże butelki sterylnej wody Tween-water (po jednej na szczep) oraz sterylne jednorazowe rozsiewacze w kształcie litery L do szafki bezpieczeństwa biologicznego.
    UWAGA: Miracloth można pokroić na ~8 cali x 6 na kawałki, zawinąć w folię i autoklawować w celu sterylizacji.
  4. Umieść jeden kawałek miracloth w każdej oznaczonej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i ponownie zakryj. Wyjmij pozostałą paczkę miracloth z maski.
  5. Wnieś płytki do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Otwórz jeden talerz, a następnie wlej na wierzch wodę Tween, aby pokryć około trzech czwartych talerza.
  6. Za pomocą jednorazowego rozsiewacza w kształcie litery L delikatnie zeskrob powierzchnię kultury grzybów ruchem w przód iw tył, jednocześnie obracając płytkę drugą ręką. Zeskrobuj, aż prawie wszystkie zarodniki zostaną zhomogenizowane w Tween-water.
    UWAGA: Ze względu na wysoką hydrofobowość zarodniki mogą tworzyć "zaciągnięcia" po dodaniu wody Tween lub podczas skrobania. Należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia pobliskich rurek lub płytek. Zaleca się zmianę rękawiczek i wytarcie powierzchni 70% etanolem między ekstrakcją różnych szczepów.
  7. Weź jedną stożkową probówkę o pojemności 50 ml i usuń kawałek miracloth. Złóż go na pół i przełóż do filtra umieszczonego w górnej części stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  8. Wlej homogenat grzybów z płytki na miracloth do probówki.
    UWAGA: Jeśli przygotowane są dwie płytki jednego szczepu, zeskrob obie płytki i wlej je do tej samej stożkowej probówki.
  9. Wlej Tween-water, aby całkowita objętość w stożkowej probówce wynosiła 50 ml.
  10. Wirować z prędkością 900 x g przez 10 minut. Upewnij się, że w wirówce używasz nasadek zapobiegających aerozolowaniu.
  11. Wlej supernatant do ~10% roztworu wybielacza w celu odkażenia. Wlej 50 ml sterylnego 1x PBS do stożkowej probówki, a następnie zwiruj lub wstrząśnij, aby ponownie zawiesić granulkę.
  12. Wirować ponownie przy 900 x g przez 10 minut. Odlewać supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml sterylnego 1x PBS. Przefiltruj przez świeży kawałek miracloth do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  13. Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia (10x, 100x, 1000x) homogenatu grzybów w probówkach wirówkowych o pojemności 1,7 ml (np. dla 10-krotnego roztworu zmieszać 100 μl homogenatu grzybowego z 900 μl wody tween-water).
  14. Wybierz pierwsze rozcieńczenie, w którym zarodniki nie są widoczne, gdy jest ono odprowadzane do wody Tween-water i użyj tego rozcieńczenia, aby policzyć liczbę zarodników za pomocą hemocytometru.
  15. Obliczyć stężenie przetrwalników w przygotowanym homogenacie grzybów (zawiesinie wodnej) według następującego wzoru:

    Stężenie (zarodniki/ml) = liczba zarodników w środku 25 pudełek x współczynnik rozcieńczenia x 104
  16. Przygotuj 1 ml zapasu 1,5 x 108 zarodników/ml w sterylnym 1x PBS w probówce mikrowirówki o pojemności 1,7 ml. Ten preparat przetrwalnikowy może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez ~ 4 tygodnie.
  17. Przed użyciem w iniekcjach należy zmieszać 20 μl preparatu przetrwalnikowego z 10 μl 1% sterylnej czerwieni fenolowej w probówce wirówkowej o pojemności 1,7 ml, aby uzyskać końcowe stężenie zarodników 1 x 108 zarodników/ml. Dokładnie przetrząsnąć przed wstrzyknięciem.
    UWAGA: 1% roztwór czerwieni fenolowej powinien być sterylizowany filtrem i przechowywany w podwielokrotnościach.
  18. W przypadku próbnego wstrzyknięcia należy zmieszać 20 μl 1x PBS z 10 μl 1% sterylnej czerwieni fenolowej.

2. Przygotowanie płytek agarowych do wstrzykiwań

  1. Przygotuj 2% agarozy w podłożu E3 i rozpuść w kuchence mikrofalowej.
  2. Wlać do szalki Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm (~25 ml na płytkę), zamieszać, aby równomiernie pokryć płytkę i ostudzić.
  3. Owinąć płytkę folią parafinową i przechowywać w pozycji odwróconej w temperaturze 4 °C.
  4. Przed wstrzyknięciem należy doprowadzić płytkę do temperatury pokojowej (RT).
  5. Wlej ~1 ml wysterylizowanej przez filtr 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) na płytkę, przechyl płytkę, aby rozprowadzić i przykryj całe dno, a następnie spłucz E3.
    UWAGA: 2% roztwór BSA może być sterylizowany przez filtr i przechowywany w postaci 1 ml podwielokrotności w temperaturze -20 °C. 2% wstępna obróbka BSA zapobiega przywieraniu larw do powierzchni agarozy.
  6. Wylać E3 z buforowaną trickainą na płytkę i pozostawić do momentu wstrzyknięcia.

3. Mikroiniekcja do tylnej komory larwy danio pręgowanego

  1. Ręcznie dechorionować larwy za pomocą kleszczy w ilości 2 dpf na szalce Petriego.
    UWAGA: Dechorionację można wykonać w dowolnym momencie od 1,5 dpf do momentu wstrzyknięcia.
  2. Usunąć jak najwięcej E3 z szalki Petriego i dodać buforowaną 300 μg/ml trikainy w E3 w celu znieczulenia larw.
    UWAGA: Można przygotować i przechowywać roztwór podstawowy buforowanej 4 mg/ml trikainy w E3 w temperaturze 4 °C. Roztwór roboczy można przygotować przez rozcieńczenie 4 ml roztworu podstawowego do 50 ml z E3.
  3. Użyj zestawu do mikroiniekcji dostarczonego z wtryskiwaczem ciśnieniowym, jednostką przeciwciśnieniową, przełącznikiem nożnym, uchwytem na mikropipety, mikromanipulatorem oraz stojakiem magnetycznym i płytką, a wszystko to podłączone do źródła sprężonego powietrza (tabela materiałów).
  4. Otwórz zawór sprężonego powietrza i włącz mikrowtryskiwacz. Ustaw ciśnienie na ~25 PSI, czas trwania impulsu na 60 ms, a jednostkę ciśnienia zwrotnego na 1 PSI.
  5. Do igły do mikroiniekcji za pomocą końcówki pipety z mikroładowarką (tabela materiałów) należy naładować około 3–5 μl przygotowanej zawiesiny PBS lub zawiesiny zarodników z czerwienią fenolową. Zamontuj igłę na mikromanipulatorze.
    UWAGA: Igły do mikroiniekcji można przygotować zgodnie z wcześniejszym opisem23. Mikroskop stereoskopowy używany do mikroiniekcji powinien być wyposażony w siatkę okularową do kalibracji igły do mikroiniekcji. Siatkę należy skalibrować za pomocą mikrometru stopniowego i określić długość skali siatki celowniczej (μm). Średnica kropli zawiesiny zarodników, która wyrzuca się z igły, jest mierzona w zależności od liczby haszyszów (siatki), które nakładają się na kroplę.
  6. Ustaw mikromanipulator tak, aby koniec igły był widoczny przy najmniejszym powiększeniu pod mikroskopem stereoskopowym. Powiększ do 4-krotnego powiększenia, utrzymując igłę w zasięgu wzroku.
  7. Za pomocą ostrych kleszczy przytnij koniec igły. Nacisnąć pedał wtrysku, aby uwidocznić wielkość wydostającej się kropli. Kontynuuj przycinanie, aż ~ 3 nL zawiesiny zarodników zostanie wstrzyknięte (tutaj jest to pięć haszyszów).
  8. Odsunąć mikromanipulator i igłę na bok, aby uniknąć przypadkowego uderzenia w igłę, gdy larwy są ułożone na płytce iniekcyjnej.
  9. Wylać E3-trikainę z płytki iniekcyjnej, a następnie przenieść ~24 znieczulone larwy na płytkę iniekcyjną z jak najmniejszą ilością E3 za pomocą pipety do przenoszenia.
  10. Za pomocą małego narzędzia do manipulowania larwami danio pręgowanego (tj. narzędzia do pętli do włosów lub narzędzia do rzęs), ułóż larwy zgodnie z kierunkiem, w którym są zwrócone. W szczególności umieść wszystkie zwrócone w prawo w jednym rzędzie, a wszystkie skierowane w lewo w rzędzie poniżej.
    UWAGA: Ten układ jest trudny, jeśli na talerzu jest zbyt dużo płynu, ponieważ larwy będą "unosić się" na swoim miejscu. Jednak zbyt mała ilość płynu jest również problematyczna, jeśli zastrzyki trwają długo, ponieważ larwy mogą wyschnąć lub znieczulenie zniknie. Dlatego należy zwrócić szczególną uwagę na ilość płynu na płytce podczas całego procesu mikroiniekcji.
  11. Dostosuj zoom mikroskopu do najmniejszego powiększenia. Sprowadź mikromanipulator z powrotem i ułóż tak, aby igła znajdowała się blisko larw, pod kątem ~30°–60°, w środku pola widzenia.
  12. Powiększ do największego powiększenia i użyj pokręteł precyzyjnej regulacji, aby jeszcze bardziej dostosować położenie igły. Sprawdź, czy ~30–70 zarodników wydostaje się z igły, wstrzykując zawiesinę zarodników do płynu na płytce obok larw. W razie potrzeby dostosuj czas i ciśnienie w konfiguracji wtrysku.
    UWAGA: Test ten należy powtarzać po każdych pięciu do sześciu larwach, ponieważ liczba zarodników wychodzących z igły może z czasem wzrosnąć lub zmaleć.
  13. Zaczynając od rzędu, w którym larwy są skierowane w stronę igły, przesuń płytkę tak, aby igła znajdowała się bezpośrednio nad i znajdowała się w pobliżu pierwszych larw.
  14. Przesuwając igłę za pomocą mikromanipulatora, włóż igłę przez tkankę wokół pęcherzyka usznego, aby przebić się do komory tylnomózgowia. W razie potrzeby przesuń płytkę drugą ręką, aby uzyskać właściwą orientację larwy wraz z kątem igły.
  15. Sprawdzić wzrokowo, czy koniec igły znajduje się pośrodku komory tyłomózgowia, nacisnąć pedał nożny, aby wstrzyknąć zarodniki i delikatnie schować igłę.
    UWAGA: Czerwony barwnik fenolowy powinien przede wszystkim pozostać w komorze tylnej części mózgu. Niewielka ilość może dostać się do śródmózgowia, ale nie powinna dotrzeć do przodomózgowia ani na zewnątrz mózgu. Jeśli tak się stanie, oznacza to, że wstrzykiwana objętość jest zbyt duża, a ciśnienie i czas powinny zostać odpowiednio zmniejszone lub należy skalibrować nową igłę.
  16. Przesuwając się w dół płytki, wstrzyknij wszystkie larwy w tym rzędzie. Następnie odwróć płytkę i wstrzyknij wszystkie larwy w drugim rzędzie.
    UWAGA: Nieudane wstrzyknięcia lub przypadkowo uszkodzone larwy można oznaczyć poprzez 1) kilkukrotne wstrzyknięcie do żółtka w celu utworzenia czerwonego znaku lub 2) wyciągnięcie larwy z rzędu za pomocą igły.
  17. Przesuń igłę w górę i ponownie usuń z drogi. Pomniejsz do mniejszego powiększenia mikroskopu. Czerwony barwnik fenolowy powinien być nadal widoczny w tyłomózgowiu każdej larwy.
  18. Najpierw odciągnij za pomocą pętli do włosów i pipety do góry, aby pozbyć się larw po nieudanych wstrzyknięciach. Przenieść pozostałe larwy na nową szalkę Petriego, zmywając je z płytki świeżym sterylnym E3 i pipetą do przenoszenia.
  19. W razie potrzeby powtórzyć tę czynność dla żądanego końcowego numeru próbki doświadczalnej.
  20. Wypłucz larwy co najmniej 2x E3 i zapewnij powrót do zdrowia po znieczuleniu.
  21. Aby określić ilościowo przeżycie bez dalszego leczenia, za pomocą pipety transferowej przenieś larwy do płytki 96-dołkowej (1 larwa na studzienkę) w E3.

4. Ustalanie liczby wstrzykniętych i zdolnych do życia zarodników

  1. Natychmiast po wstrzyknięciu, za pomocą pipety transferowej, losowo wybierz około ośmiu wstrzykniętych larw i przenieś je do probówek wirówkowych o pojemności 1,7 ml (jedna larwa na probówkę).
  2. Eutanazja larw za pomocą trikainy lub poprzez umieszczenie ich w temperaturze 4 °C na 0,5–2,0 h.
  3. Przygotuj 1 ml 1 mg / ml ampicyliny i 0,5 mg / ml roztworów antybiotyków kanamycyny w sterylnym 1x PBS. Pozostały roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć później.
    UWAGA: Roztwory podstawowe ampicyliny w stężeniu 100 mg/ml i kanamycyny 50 mg/ml mogą być wstępnie przygotowane, wysterylizowane przez filtr i przechowywane w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć je 100x w 1x PBS, aby otrzymać roztwór roboczy.
  4. Za pomocą pipety usuń jak najwięcej płynu z probówki wirówkowej, pozostawiając larwę i dodaj 90 μl 1x PBS z antybiotykami.
    UWAGA: Antybiotyki są stosowane w celu zapobiegania rozwojowi bakterii na płytkach GMM, które mogą zakłócać liczenie kolonii Aspergillus.
  5. Homogenizować larwy w lizerze tkankowym przy 1 800 oscylacjach/min (30 Hz) przez 6 minut. Wirować w dół przy 17 000 x g przez 30 s.
  6. Oznaczyć płytki GMM (jedna płytka na homogenizowane larwy). Używając palnika Bunsena, aby stworzyć sterylne środowisko, odpipetuj homogenizowaną zawiesinę z jednej probówki do środka płytki GMM, a następnie rozprowadź za pomocą jednorazowego rozsiewacza w kształcie litery L. Unikaj rozprowadzania homogenatu na krawędzi.
  7. Inkubować płytki do góry nogami w temperaturze 37 °C przez 2–3 dni i policzyć liczbę utworzonych kolonii (CFU).
  8. Aby zmierzyć liczbę żywych zarodników w okresie infekcji, należy pobrać larwy z płytki 96-dołkowej po 1–7 dniach od wstrzyknięcia (dpi) i przenieść je do probówek wirówkowych. Poddaj eutanazji i homogenizacji larwy w celu rozprzestrzenienia się na płytkach GMM, jak opisano w krokach 4.1–4.5.

5. Leczenie farmakologiczne wstrzykniętych larw

  1. Po sekcji 4 podziel pozostałe wstrzyknięte larwy na dwie szalki o średnicy 3,5 mm: jedną do leczenia farmakologicznego, a drugą do kontroli. Użyj około 24 zainfekowanych larw na warunek.
    UWAGA: Szalki o średnicy 3,5 mm można traktować 2% beztłuszczowym mlekiem w proszku w wodzie, płukać, suszyć na powietrzu i przechowywać w temperaturze pokojowej. Powlekanie mlekiem zapobiegnie przywieraniu larw do plastiku.
  2. Przygotować pożądany roztwór leku i nośnik w E3 bez błękitu metylenowego w stożkowych probówkach zgodnie z wymaganym końcowym stężeniem, a następnie dobrze wymieszać. Na przykład, aby monitorować przeżywalność larw narażonych na deksametazon, należy użyć 24 larw (kontrprób) dla deksametazonu i 24 dla kontroli nośnika, takich jak DMSO. Przygotować 5 ml roztworu leku o wymaganym stężeniu. Tutaj użyto 5 ml 0,1% DMSO i 10 μM deksametazonu, a 24 larwy/stan przeniesiono do ~200 μl nośnika/roztworu leku/larw.
  3. Usunąć jak najwięcej płynu z jednego naczynia za pomocą pipety transferowej i dodać wstępnie zmieszany E3 zawierający kontrolę pojazdu. Powtórz z wstępnie zmieszanym E3 zawierającym leczenie będące przedmiotem zainteresowania dla drugiego dania.
  4. Za pomocą pipety przenieś larwy na płytkę 96-dołkową (jedna larwa na studzienkę). Należy monitorować przeżywalność larw po wstrzyknięciu narażonym na działanie nośnika lub leku przez 7 dni.
    UWAGA: Lek może być stosowany wyłącznie w dniu zakażenia i trzymany na larwach przez cały eksperyment lub może być codziennie odświeżany.

6. Codzienne obrazowanie zakażonych larw za pomocą urządzenia do zranień i pułapek dla ryb pręgowanych do wzrostu i obrazowania (zWEDGI)

  1. Upewnij się, że larwy są traktowane 100 μM N-fenylotiomocznik (PTU) w temperaturze 24 hpf, aby zapobiec pigmentacji, oraz że PTU jest utrzymywane na larwach przez cały czas trwania eksperymentu.
    UWAGA: PTU na poziomie 75–100 μM zapobiega pigmentacji larw bez żadnych poważnych wad rozwojowych24. Jednak PTU może zakłócać niektóre procesy biologiczne25, a badacze powinni wcześniej ustalić, czy lek może wpływać na jakiekolwiek badane procesy.
  2. Zakażone transgeniczne larwy znakowanymi populacjami komórek będących przedmiotem zainteresowania w temperaturze 2 dpf należy zaszczepić zarodniki Aspergillus zaprojektowane do ekspresji białka fluorescencyjnego, jak opisano w sekcji 3. Następnie przenieś zakażone larwy do studzienek na 48-dołkowej płytce w około 500 μl/studzienkę E3 bez błękitu metylenowego.
    UWAGA: Stosuje się tutaj płytkę 48-dołkową, ponieważ łatwiej jest przenosić larwy do i z niej podczas wielokrotnego codziennego obrazowania.
  3. W dniu obrazowania należy przygotować dwie szalki Petriego o średnicy 3,5 mm: jedną z 100 μM PTU i jedną z E3-trikainą.
  4. Dodaj E3-trikainę do komór urządzenia zWEDGI26,27. Pod mikroskopem stereoskopowym usuń pęcherzyki powietrza z komór i kanału ograniczającego za pomocą mikropipety P100. Usuń cały nadmiar E3-tricaine, tak aby była tylko w komorach.
  5. Odpipetować jedną larwę z płytki za pomocą pipety transferowej. Jeśli do usunięcia użyto dużej ilości płynu, należy przelać pipetę do naczynia o średnicy 3,5 mm zawierającego E3-PTU. Następnie ponownie odpipetować pipetę, używając jak najmniejszej ilości płynu, i przenieść do E3-trikainy.
  6. Odczekać ~30 s na znieczulenie, a następnie przenieść do komory załadowczej urządzenia do nawijania i uwięzienia, np. zWEDGI).
  7. Pod mikroskopem stereoskopowym umieść larwę. Za pomocą mikropipety P100 usuń E3-trikainę z komory nawijania i uwolnij do komory załadowczej, aby przesunąć ogon larwy do kanału ograniczającego. Upewnij się, że larwa znajduje się po swojej bocznej, grzbietowej lub grzbietowo-bocznej stronie, tak aby można było zobrazować tyłomózgowie za pomocą odwróconej soczewki obiektywu.
  8. Obraz larwy za pomocą mikroskopu konfokalnego.
  9. Po obrazowaniu za pomocą pipety P100 uwolnij E3-trikainę do komory nawijania, aby wepchnąć larwę z kanału ograniczającego do komory ładowania.
  10. Za pomocą pipety transferowej zebrać larwę i przenieść ją z powrotem na szalkę Petriego z E3-Trikainą. Używając jak najmniejszej ilości płynu, przenieś go na szalkę Petriego za pomocą E3-PTU. Wypłukać w PTU i przenieść z powrotem do płytki 48-dołkowej.

Wyniki

Po mikroiniekcji zarodników Aspergillus do tylnego mózgu larw danio pręgowanego, przebieg infekcji można monitorować za pomocą wielu testów, w tym oceny przeżywalności, oznaczania CFU oraz obrazowania na żywo. W teście przeżywalności monitorowano liczbę zainfekowanych larw, które przeżyły od 1 do 7 dpi. W przypadku nieleczonych larw typu dzikiego zaobserwowano bardzo niską śmiertelność, przy czym ~80%–100% larw przeżyło cały eksperyment (Rysunek 1). W przypadku larw z immunosupresją, np. wywołaną ekspozycją na lek kortykosteroidowy – deksametazon (10 µM), zaobserwowano znacząco obniżoną przeżywalność (Rysunek 1).

Podczas ilościowego oznaczania CFU w ciągu 7-dniowego eksperymentu u larw typu dzikiego zainfekowanych zarodnikami A. fumigatus, zaobserwowano utrzymywanie się zarodników, przy czym ich eliminacja następowała powoli w czasie (Rycina 2A). Liczbę zarodników przeżywających w 1, 2, 3, 5 i 7 dni po infekcji (dpi) znormalizowano do liczby zarodników wstrzykniętych w 0 dpi, aby porównać trwałość i szybkość eliminacji między powtórzeniami (Rycina 2B).

Transgeniczne linie ryb wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w leukocytach, wraz z zarodnikami Aspergillus wykazującymi ekspresję białek fluorescencyjnych, mogą być wykorzystywane do wizualizacji zarówno rekrutacji i zachowania leukocytów, jak i kiełkowania oraz wzrostu grzyba13. Po oznakowaniu makrofagów (np. Tg(mpeg1:H2B-GFP)), w około 50% larw zazwyczaj obserwowano agregację makrofagów, która rozpoczynała się w 2–3 dpi (Rysunek 3A). Rekrutacja neutrofili (Tg(lyz:BFP)) była zazwyczaj opóźniona i następowała głównie po kiełkowaniu grzyba (Rysunek 3A). Podczas gdy w większości larw obciążenie grzybicze utrzymywało się przez cały eksperyment (Rysunek 3A), obserwowano również przypadki eliminacji patogenu (Rysunek 3B). U niektórych larw, w późniejszej fazie infekcji, obserwowano obecność grzyba poza obszarem tylnego mózgu, co było wynikiem rozsiewu grzyba, prawdopodobnie za pośrednictwem makrofagów.

Obszar wokół pęcherzyka słuchowego jest jednym z możliwych miejsc, w których można zaobserwować tę dysseminację (Rycina 3C). Obserwacje te poddano ilościowej analizie u wielu pojedynczych larw w trakcie całego eksperymentu (Rycina 4). Zazwyczaj do 5 dpi kiełkowanie stwierdzano u ~60% larw (Rycina 4A). Powierzchnia skupisk fagocytów, rekrutacja makrofagów oraz rekrutacja neutrofili różnią się zarówno w czasie, jak i między larwami, przy czym w niektórych przypadkach trendy były wzrostowe przez cały czas trwania eksperymentu, a w innych procesy te wygasły z czasem (Rycina 4B,C,D).

Wykres analizy przeżywalności; leczenie DMSO vs Dex; % przeżywalności gospodarza w czasie; istotność statystyczna.
Rycina 1: Reprezentatywna analiza przeżywalności zainfekowanych larw.Aspergillus-zainfekowane larwy poddano działaniu kontroli nośnika (DMSO) lub deksametazonu (Dex), a następnie monitorowano przeżywalność. Dane reprezentują trzy połączone powtórzenia. Średnie CFU w zastrzyku: DMSO = 30, Dex = 29 (wartość p oraz współczynnik hazardu obliczono za pomocą analizy regresji proporcjonalnego hazardu Coxa, ****p < 0.0001). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres pomiaru CFU; wykres redukcji obciążenia przetrwalnikami; dni po iniekcji; eksperyment mikrobiologiczny.
Rysunek 2: Reprezentatywne wartości CFU z poszczególnych zainfekowanych larw bezpośrednio po iniekcji (0 dpi) oraz w trakcie przebiegu infekcji (2, 3, 5 i 7 dpi). Osiem zainfekowanych larw poddano homogenizacji i wysiano na podłoża w celu zliczenia CFU dla każdego punktu czasowego i powtórzenia. (A) Przykładowe dane z jednego powtórzenia. Każdy punkt reprezentuje jedną larwę, słupki reprezentują wartości średnie dla każdego punktu czasowego. (B) Wartości CFU znormalizowano do liczby CFU w 0 dpi dla każdego powtórzenia, a następnie połączono dane z trzech powtórzeń. Dane z różnych warunków eksperymentalnych porównano za pomocą analizy wariancji i przedstawiono w formie szacowanych średnich marginalnych oraz błędów standardowych. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczną w porównaniu do CFU w 0 dpi (*p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazy mikroskopowe A. fumigatus, makrofagów i neutrofili w larwach w różnych dniach po infekcji.
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy z eksperymentów nad infekcją.Larwy traktowane PTU z fluorescencyjnymi makrofagami (mpeg1:H2B-GFP) i neutrofilami (lyz:BFP) zostały wstrzyknięte z A. fumigatus wykazującym ekspresję RFP. Obrazy żywych, zainfekowanych larw były wielokrotnie pobierane w 2., 3. i 5. dniu po infekcji (dpi) przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Przedstawiono obrazy z maksymalną projekcją intensywności w osi Z. Schematy larw wskazują miejsce obrazowania dla każdego panelu. Wszystkie paski skali reprezentują 100 µm, z wyjątkiem pasków skali na wstawkach, które wynoszą 25 µm. (A) Przedstawione obrazy pochodzą z jednej larwy pobranej w 2., 3. i 5. dpi, co reprezentuje typowy przebieg infekcji. Wstawki pokazują kiełkowanie grzyba w 3. i 5. dniu. (B) Reprezentatywny obraz podgrupy larw zdolnych do zwalczenia infekcji, z niskim obciążeniem grzybiczym i niewielkim stanem zapalnym w 5. dpi. (C) Reprezentatywny obraz podgrupy larw, w których infekcja rozprzestrzenia się poza tylny mózg w późniejszych punktach czasowych. Na tym obrazie grzyb, makrofagi i neutrofile znajdują się wokół i poniżej pęcherzyka słuchowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy analizy infekcji larw; kiełkowanie zarodników, obszar fagocytów, makrofagi, neutrofile.
Rycina 4: Reprezentatywna kwantyfikacja eksperymentów obrazowych. Analizie pod kątem kiełkowania grzybów i rekrutacji leukocytów poddano obrazy z układu eksperymentalnego przedstawionego na Rycini 3. (A) Larwy oceniano każdego dnia pod kątem obecności wykiełkowanych zarodników, a następnie obliczano procent larw z kiełkowaniem. (B,C,D) Każda pojedyncza larwa jest reprezentowana przez linię w innym kolorze. Pojawienie się i wielkość skupisk fagocytów (B), rekrutacja makrofagów (C) oraz rekrutacja neutrofili (D) były monitorowane w każdej larwie w ciągu 5-dniowego eksperymentu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Opisany tutaj model infekcji jest korzystny dla analizy odpowiedzi immunologicznej gospodarza, interakcji gospodarz-patogen i patogenezy grzybów 12,13,14,15. Informacje te można uzyskać z obrazowania w wysokiej rozdzielczości patogenów znakowanych fluorescencyjnie i komórek gospodarza13, przeżywalności larw i trwałości CFU w czasie.

Technika mikroiniekcji ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego protokołu i może wymagać dostosowania w przypadku korzystania z różnych urządzeń i konfiguracji do mikroiniekcji. W szczególności ciśnienie i czas wstrzyknięcia to dwie główne zmienne, które można regulować, aby zapewnić, że objętość wyrzucana przez igłę wynosi ~3 nL. Rozmiar igły, określony przez przycięcie jej kleszczami, reguluje również liczbę wstrzykiwanych zarodników; Chociaż większy otwór może spowodować uszkodzenie tkanek larwy. Z drugiej strony, zbyt mały otwór nie pozwoli stosunkowo dużym zarodnikom (>2 μm) na zewnątrz i może prowadzić do zatkania igieł. W takim przypadku igłę można odchylić, aby uzyskać nieco większy otwór.

Inne protokoły mikroiniekcji bakterii wykorzystują PVP-40, aby pomóc w utrzymaniu jednorodnej mieszaniny iniekcyjnej, ale nie znaleźliśmy żadnej korzyści w stosowaniu tego nośnika z zarodnikami Aspergillus . Zatkanie igły można złagodzić, dokładnie mieszając preparat grzybowy, aby rozbić wszelkie grudki przed załadowaniem igły. Czasami zatkanie igły może również zostać usunięte poprzez tymczasowe zwiększenie ciśnienia lub czasu wstrzyknięcia i uruchomienie mikrowstrzykiwacza, gdy igła znajduje się w płynie otaczającym larwy. Następnie ciśnienie i czas wtrysku należy ponownie zmniejszyć do poprzednich poziomów. W innych przypadkach nie można usunąć zatoru i należy załadować nową igłę i ponownie skalibrować.

Protokół ten ma na celu wstrzyknięcie ~ 30–70 zarodników na larwę. Wiadomo, że w oparciu o stężenie preparatu zarodnikowego i wstrzykniętą objętość, liczba ta jest dość niska. Stwierdzono jednak empirycznie, że jest to liczba zarodników wstrzykniętych w tych warunkach. Nie wiadomo, dlaczego występuje ta różnica, ale może to być spowodowane zbrylaniem się zarodników w igle. Nasze własne próby wstrzyknięcia większej liczby zarodników były w dużej mierze nieskuteczne.

Aby upewnić się, że wstrzykuje się około 30–70 zarodników i utrzymać spójność wstrzyknięć we wszystkich larwach, należy sprawdzić liczbę zarodników, wstrzykując je do E3 otaczającego larwy. Powtarzaj to co pięć do sześciu larw we wszystkich wstrzyknięciach. Jeśli liczba zarodników wydaje się zmieniać, ciśnienie i/lub czas wstrzykiwania można dostosować, aby wstrzyknąć stałą liczbę zarodników do wielu larw. Należy jednak zachować ostrożność, aby dawka do wstrzykiwań pozostała głównie w tyłomózgowiu i nie wypełniała śródmózgowia i przodomózgowia.

Aby zapewnić miejscową infekcję, zawiesina zarodników powinna znajdować się w komorze tylnego mózgu. Można to uwidocznić za pomocą czerwonego zabarwienia fenolowego tuż po wstrzyknięciu, chociaż czerwony kolor rozprasza się z czasem. W przypadku wstrzyknięć obszar wokół pęcherzyka usznego służy do przebicia i dotarcia do komory pod kątem 45°–65°. Obszar ten nie ma głównych naczyń krwionośnych, powoduje mniejsze uszkodzenia tkanek i goi się natychmiast. Jeśli skóra nad komorą zostanie przebita, zawiesina zarodników może wyciekać, ponieważ igła, która musi być używana do wstrzykiwań zarodników Aspergillus , jest większa niż ta, która jest używana do zawiesin bakteryjnych. Nieskutecznie wstrzyknięte lub przypadkowo uszkodzone larwy można oznaczyć, kilkakrotnie wstrzykując do żółtka w celu utworzenia czerwonego znaku lub przeciągając larwę z rzędu za pomocą igły. Po wykonaniu zestawu wstrzyknięć larwy te należy usunąć i zutylizować, zanim reszta zostanie zmyta z płytki. E3 bez błękitu metylenowego służy do znieczulania larw przed wstrzyknięciem, a także do zatrzymywania larw po wstrzyknięciach, ponieważ błękit metylenowy działa przeciwgrzybiczo.

W momencie wstrzyknięcia liczba CFU reprezentuje liczbę żywotnych zarodników w zakażonym gospodarzu. Jeśli jednak zarodniki wykiełkują w strzępki, mogą one zostać rozbite na oddzielne żywotne "jednostki grzybowe" podczas homogenizacji i mogą dać początek wielu koloniom. Lub nieprzerwana wielokomórkowa strzępka może dać początek pojedynczej kolonii, co skutkuje uśrednionym, ale nieprecyzyjnym przedstawieniem obciążenia grzybami. Można temu zapobiec, łącząc liczbę CFU z mikroskopią podłużną poszczególnych larw, która dostarcza wizualnych danych o losie wstrzykniętych zarodników.

W porównaniu z systemem ssaków, model infekcji larwami danio pręgowanego jest szczególnie istotny ze względu na jego dostępność optyczną. Rekrutację i odpowiedź wrodzonych komórek odpornościowych można uwidocznić w żywym, nienaruszonym gospodarzu. Można to połączyć z genetycznym lub chemicznym hamowaniem celów molekularnych, aby przeanalizować, jak każdy cel wpływa na reakcję makrofagów lub neutrofili przeciwko zarodnikom Aspergillus u żywego zwierzęcia.

Podczas gdy model infekcji larwami danio pręgowanego Aspergillus nadal odgrywa zasadniczą rolę w opisywaniu różnych aspektów IA 12,13,14,15,16,17,18,19,20,22, są też inne obszary ekspansji. Od strony gospodarza służy do opisywania odpowiedzi immunologicznych na poziomie komórkowym, ale można to rozszerzyć o analizę mechanizmów immunologicznych na poziomie molekularnym, łącząc go z ukierunkowanym morfolinem, CRISPR, stabilnymi liniami mutantów lub ekspozycją chemiczną. Jednym zastrzeżeniem jest to, że homologi dla wszystkich znanych składników wrodzonego szlaku immunologicznego ssaków nie zostały zidentyfikowane u danio pręgowanego.

Od strony patogenów opisano zjadliwość różnych gatunków i szczepów. Obiecującym kierunkiem przyszłych badań jest wykorzystanie zmutowanych szczepów Aspergillus do przetestowania, w jaki sposób określone geny lub białka przyczyniają się jako czynniki wirulencji. W ten sposób można opracować nowe leki przeciwgrzybicze ukierunkowane na te białka. Obecne leki przeciwgrzybicze mają niską skuteczność u ludzi, a u grzybów rośnie oporność na te leki28. Ten model in vivo może być wykorzystany do zbadania, dlaczego te leki zawodzą i jako model pośredni do testowania skuteczności nowych leków przeciwgrzybiczych. Ogólnie rzecz biorąc, odkrycia odkryte przy użyciu tego modelu mogą ułatwić w przyszłości opracowanie skutecznych metod leczenia pacjentów zakażonych Aspergillus.

Oświadczenia

Brak konfliktów lub interesów finansowych do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych Narodowych Instytutów Zdrowia pod numerem nagrody K22AI134677. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kleszcze Dumont #5Roboz Instrument chirurgiczny Co.RS-5045
Siatka do okularówMikroskop WorldRETR10Do kalibracji igieł, używany w
konfiguracji mikrowtryskiwaczy stereoskopowych: Jednostka ciśnienia zwrotnegoZastosowane oprzyrządowanie naukowePrzełącznik
Stosowane oprzyrządowanie naukoweFTSW
Zestaw uchwytów na mikropipetyStosowane oprzyrządowanie naukoweM-
Wtryskiwacz ciśnieniowyApplied Scientific InstrumentationMPPI-3
Konfiguracja mikromanipulatora: MikromanipulatorNarashige (Tritech)M-152
Stojak magnetyczny i płytkaTritechMINJ-HBMB
Ściągacz igiełSutter InstrumentP-97
Mikroskop stereoskopowyNikonSMZ-745
Tissuelyser IIQiagen85300Do homogenizacji larw<
silny>MateriałFirmaNumer katalogowyKomentarze/Opis
AgarozaFisherBP160-500
Sólsodowa ampicylinyFisherAAJ6380706
BSA, frakcja VVWRAAJ65855-22
Siarczan kanamycynyFisherAAJ1792406
L RozsiewaczeFisher14 665 230
Igły mikrokapilarne (bez filamentu)World Precision Instruments (WPI)TW100-3
Końcówki do pipet do mikroładowarekVWR89009-310Aby załadować igłę zawiesiną Aspergillus
MiraclothVWREM475855-1RDo filtrowania zawiesiny Aspergillus
N-fenylotiomocznikFisherAAL0669009Aby zapobiec pigmentacji
Czerwień fenolowa, 1% roztwórFisher57254
Trikaina (3-aminobenzoesan etylu, sól kwasu metanosulfonowego)FisherAC118000500Do znieczulania larw
Tween-20FisherBP337-500
Media i roztworyComponents/Recipe
E3 podłoża: 60x E317,2 g NaCl, 0,76 g KCl, 2,9 g CaCl2, 4,9 g MgSO4 · 7H2O, do 1 l z H2O
1x E316,7 ml 60x bulion, 430 ul 0,05 M NaOH, do 1 l z H2O (opcjonalnie: + 3 ml 0,01% błękitu metylenowego)
Roztwór podstawowy trikainy2 g Trikaina, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4,2 ml 60X E3, do 500 ml z H2O, pH do 7,0-7,5 z NaOH
Minimalne podłoże glukozy (GMM) agar: agar GMM10 g glukozy (dekstroza), 50 ml 20x sole azotanowe, 1 ml TE, do 1 l z H2O, pH do 6,5 z NaOH, + 16 g Agar, autoklaw
20x Sole azotanowe120 g NaNO3, 10,4 g KCl, 10,4 g, MgSO4 · 7H2O, 30,4 g, KH2PO4, do 1 L z H2O, autoklaw
Pierwiastki śladowe (TE)2,20 g ZnSO4 · 7H2O, 1,10 g H3BO3, 0,50 g MnCl2 · 4H2O, 0,16 g FeSO4 · 7H2O, 0,16 g CoCl2 · 6H2O, 0,16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5,00 g Na2EDTA, do 100 ml z H2O, rozpuścić mieszając przez noc, autoklaw
nożny BPU

Bibliografia

  1. Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
  2. Denning, D. W. Invasive aspergillosis. Clinical Infectious Diseases. 26 (4), 781-803 (1998).
  3. Dagenais, T. R., Keller, N. P. Pathogenesis of Aspergillus fumigatus in Invasive Aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 22 (3), 447-465 (2009).
  4. Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: systematic review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 32 (3), 358-366 (2001).
  5. Mirkov, I., Popov, A., Lazovic, B., Glamoclija, J., Kataranovski, M. Usefulness of animal models of aspergillosis in studying immunity against Aspergillus infections. Journal de Mycologie Médicale. 29 (1), 84-96 (2019).
  6. Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. Journal of Clinical Investigation. 69 (3), 617-631 (1982).
  7. Behnsen, J., et al. Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. PLoS Pathogens. 3 (2), 13(2007).
  8. Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).
  9. Rosowski, E. E., et al. The Zebrafish as a Model Host for Invasive Fungal Infections. Journal of Fungi. 4 (4), (2018).
  10. Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126 (17), 3735-3745 (1999).
  11. Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 254-330 (2003).
  12. Knox, B. P., et al. Distinct innate immune phagocyte responses to Aspergillus fumigatus conidia and hyphae in zebrafish larvae. Eukaryotic Cell. 13 (10), 1266-1277 (2014).
  13. Rosowski, E. E., et al. Macrophages inhibit Aspergillus fumigatus germination and neutrophil-mediated fungal killing. PLoS Pathogens. 14 (8), 1007229(2018).
  14. Koch, B. E. V., Hajdamowicz, N. H., Lagendijk, E., Ram, A. F. J., Meijer, A. H. Aspergillus fumigatus establishes infection in zebrafish by germination of phagocytized conidia, while Aspergillus niger relies on extracellular germination. Scientific Reports. 9 (1), 12791(2019).
  15. Pazhakh, V., Ellett, F., Croker, B. A. beta-glucan-dependent shuttling of conidia from neutrophils to macrophages occurs during fungal infection establishment. PLoS Biology. 17 (9), 3000113(2019).
  16. Herbst, S., et al. Phagocytosis-dependent activation of a TLR9-BTK-calcineurin-NFAT pathway co-ordinates innate immunity to Aspergillus fumigatus. EMBO Molecular Medicine. 7 (3), 240-258 (2015).
  17. Shah, A., et al. Calcineurin Orchestrates Lateral Transfer of Aspergillus fumigatus during Macrophage Cell Death. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (9), 1127-1139 (2016).
  18. Jain, S., et al. Selenate sensitivity of a laeA mutant is restored by overexpression of the bZIP protein MetR in Aspergillus fumigatus. Fungal Genetics and Biology. 117, 1-10 (2018).
  19. Jones, C. N., et al. Bifunctional Small Molecules Enhance Neutrophil Activities Against Aspergillus fumigatus in vivo and in vitro. Frontiers in Immunology. 10, 644(2019).
  20. Rosowski, E. E., He, J., Huisken, J., Keller, N. P., Huttenlocher, A. Efficacy of voriconazole against A. fumigatus infection depends on host immune function. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 00917-00919 (2019).
  21. Herbst, S., et al. A new and clinically relevant murine model of solid-organ transplant aspergillosis. Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 643-651 (2013).
  22. Knox, B. P., Huttenlocher, A., Keller, N. P. Real-time visualization of immune cell clearance of Aspergillus fumigatus spores and hyphae. Fungal Genetics and Biology. 105, 52-54 (2017).
  23. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection. Journal of Visualized Experiments. (98), e52788(2015).
  24. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
  25. Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
  26. Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
  27. Huemer, K., et al. Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (128), e56340(2017).
  28. Perlin, D. S., Shor, E., Zhao, Y. Update on Antifungal Drug Resistance. Current Clinical Microbiology Reports. 2 (2), 84-95 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Technika mikrowstrzykiwaniakomora tylnom zgowiajednostka tworz ca koloniobrazowanie na ywomikroskopia konfokalnainterakcje kom rek odporno ciowychanaliza obci enia grzybami
Zakażenie larw danio pręgowanego zarodnikami Aspergillus w celu analizy interakcji gospodarz-patogen
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.