Artykuł metodologiczny

Izolacja ludzkich kardiomiocytów komorowych z plastrów mięśnia sercowego wycinanych wibratomem

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61167

⸱

10 maja 2020

 ,  , 
1Institute of Cellular and Molecular Physiology, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Muscle Research Center Erlangen (MURCE), Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany jest protokół izolacji ludzkich i zwierzęcych kardiomiocytów komorowych z wyciętych wibratomem plastrów mięśnia sercowego. Wysoką wydajność komórek tolerujących wapń (do 200 komórek/mg) można uzyskać z niewielkich ilości tkanek (<50 mg). Protokół ma zastosowanie do mięśnia sercowego narażonego na zimne niedokrwienie przez okres do 36 godzin.

Streszczenie

Izolacja komorowych miocytów serca od serc zwierzęcych i ludzkich jest podstawową metodą w badaniach kardiologicznych. Kardiomiocyty zwierzęce są zwykle izolowane przez perfuzję wieńcową z enzymami trawiennymi. Jednak izolowanie ludzkich kardiomiocytów jest trudne, ponieważ próbki ludzkiego mięśnia sercowego zwykle nie pozwalają na perfuzję wieńcową, a alternatywne protokoły izolacji skutkują słabą wydajnością żywotnych komórek. Ponadto próbki ludzkiego mięśnia sercowego są rzadkie i regularnie dostępne tylko w placówkach z chirurgią kardiochirurgiczną na miejscu. Utrudnia to translację wyników z kardiomiocytów zwierzęcych na ludzkie. Opisano tutaj niezawodny protokół, który umożliwia skuteczną izolację miocytów komorowych z mięśnia sercowego ludzkiego i zwierzęcego. Aby zwiększyć stosunek powierzchni do objętości przy jednoczesnej minimalizacji uszkodzeń komórek, z próbek mięśnia sercowego za pomocą wibratomu generowane są plastry tkanki mięśnia sercowego o grubości 300 μm. Plastry tkanek są następnie trawione za pomocą proteazy i kolagenazy. Mięsień sercowy szczura wykorzystano do ustalenia protokołu i ilościowego określenia plonów żywotnych, tolerujących wapń miocytów za pomocą cytometrycznego zliczania komórek. Porównanie z powszechnie stosowaną metodą fragmentów tkanek wykazało istotnie wyższą wydajność kardiomiocytów pręcikowych (41,5 ± 11,9 vs. 7,89 ± 3,6%, p < 0,05). Protokół został przełożony na uszkodzony i niezawodny ludzki mięsień sercowy, gdzie wydajność była podobna jak w mięśniu sercowym szczura i, ponownie, znacznie wyższa niż w przypadku metody fragmentów tkanki (45,0 ± 15,0 vs. 6,87 ± 5,23 komórek/mg, p < 0,05). Warto zauważyć, że dzięki przedstawionemu protokołowi możliwe jest wyizolowanie rozsądnej liczby żywotnych ludzkich kardiomiocytów (9–200 komórek/mg) z minimalnych ilości tkanki (<50 mg). W związku z tym metoda ma zastosowanie do zdrowego i niewydolnego mięśnia sercowego zarówno z serca, jak i ludzkiego. Ponadto możliwe jest wyizolowanie pobudliwych i kurczliwych miocytów z próbek tkanek ludzkich przechowywanych do 36 godzin w zimnym roztworze kardioplegicznym, co czyni tę metodę szczególnie przydatną w laboratoriach w placówkach, w których nie przeprowadza się kardiochirurgii na miejscu.

Wprowadzenie

Przełomowa technika, która utorowała drogę do ważnych wglądów w fizjologię kardiomiocytów, polega na izolowaniu żywych kardiomiocytów komorowych z nienaruszonych serc1. Izolowane kardiomiocyty mogą być wykorzystywane do badania normalnej struktury i funkcji komórkowej lub konsekwencji eksperymentów in vivo; Na przykład do oceny zmian w elektrofizjologii komórkowej lub sprzężenia pobudzenie-skurcz w zwierzęcych modelach chorób serca. Dodatkowo izolowane kardiomiocyty mogą być wykorzystywane do hodowli komórkowych, interwencji farmakologicznych, transferu genów, inżynierii tkankowej i wielu innych zastosowań. W związku z tym skuteczne metody izolacji kardiomiocytów mają fundamentalną wartość dla podstawowych i translacyjnych badań kardiologicznych.

Kardiomiocyty małych ssaków, takich jak gryzonie, oraz większych ssaków, takich jak świnie czy psy, są zwykle izolowane przez perfuzję wieńcową serca roztworami zawierającymi prymitywne kolagenazy i/lub proteazy. Została ona opisana jako "złoty standard" metody izolacji kardiomiocytów, w wyniku której uzyskuje się do 70% żywotnych komórek2. Podejście to zostało również zastosowane w przypadku ludzkich serc, co dało akceptowalną wydajność kardiomiocytów3,4,5. Ponieważ jednak perfuzja wieńcowa jest możliwa tylko wtedy, gdy dostępne jest nienaruszone serce lub duży klin mięśnia sercowego zawierający gałąź tętnicy wieńcowej, większość próbek serca u ludzi nie nadaje się do tego podejścia ze względu na ich mały rozmiar i brak odpowiedniego unaczynienia. Dlatego izolacja ludzkich kardiomiocytów jest wyzwaniem.

Ludzkie próbki mięśnia sercowego składają się głównie z fragmentów tkanek o różnych rozmiarach (około 0,5 x 0,5 x 0,5 cm do 2 x 2 x 2 cm), uzyskanych poprzez biopsje endomięśnia sercowego6, miektomie przegrody międzymięśniowej7, implantacje VAD8, lub z eksplantowanych serc9. Najczęstsze procedury izolacji kardiomiocytów rozpoczynają się od rozdrobnienia tkanki za pomocą nożyczek lub skalpela. Kontakty międzykomórkowe są następnie zakłócane przez zanurzenie w bezwapniowych lub o niskiej zawartości wapnia. Następnie następuje wiele etapów trawienia z surowymi ekstraktami enzymatycznymi lub oczyszczonymi enzymami, takimi jak proteazy (np. Trypsyna), kolagenaza, hialuronidaza lub elastaza, co powoduje rozpad macierzy zewnątrzkomórkowej i uwolnienie kardiomiocytów. W ostatnim, krytycznym kroku, fizjologiczne stężenie wapnia musi zostać ostrożnie przywrócone, w przeciwnym razie może dojść do uszkodzenia komórek z powodu paradoksu wapnia10,11,12. Takie podejście do izolacji jest wygodne, ale zwykle nieefektywne. Na przykład jedno z badań wykazało, że prawie 1 g tkanki mięśnia sercowego był potrzebny do uzyskania wystarczającej liczby kardiomiocytów odpowiednich do kolejnych eksperymentów13. Możliwą przyczyną niskich plonów jest stosunkowo surowa metoda mielenia tkanki. Może to szczególnie uszkodzić kardiomiocyty znajdujące się na krawędziach kawałków, chociaż te miocyty najprawdopodobniej zostaną uwolnione przez trawienie enzymatyczne.

Innym aspektem, który może wpływać na skuteczność izolacji i jakość komórek uzyskanych z próbek ludzkich, jest czas trwania niedokrwienia tkanek. Większość protokołów wspomina o krótkim czasie transportu do laboratorium jako warunku wstępnym dobrych wyników. Ogranicza to badania ludzkich kardiomiocytów komorowych do laboratoriów z pobliskimi ośrodkami kardiochirurgicznymi. Łącznie ograniczenia te utrudniają weryfikację ważnych wyników z modeli zwierzęcych w ludzkich kardiomiocytach. W związku z tym pożądane są ulepszone protokoły izolacji, które pozwalają na uzyskanie wysokiej wydajności kardiomiocytów z niewielkich ilości tkanki, najlepiej bez poważnych uszkodzeń po dłuższym czasie transportu.

Opisany tutaj jest protokół izolacji oparty na enzymatycznym trawieniu cienkich wycinków tkanki mięśnia sercowego generowanych za pomocą vibratome14,15. Pokazujemy, że izolacja z wycinków tkanek jest znacznie bardziej efektywna niż izolacja z kawałków tkanek zmielonych nożyczkami. Opisana metoda nie tylko pozwala na uzyskanie wysokiej wydajności żywotnych ludzkich kardiomiocytów z niewielkich ilości tkanki mięśnia sercowego, ale ma również zastosowanie do próbek przechowywanych lub transportowanych w zimnym roztworze kardioplegicznym przez okres do 36 godzin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na szczurach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Mittelfranken, Bawaria, Niemcy. Pobieranie i wykorzystywanie próbek tkanek ludzkiego serca zostało zatwierdzone przez Instytucjonalne Komisje Rewizyjne Uniwersytetu w Erlangen-Norymberdze i Uniwersytetu Ruhry w Bochum. Badania przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Deklaracji Helsińskiej. Pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę przed pobraniem tkanek.

Samice szczurów rasy Wistar (150–200 g) zostały pozyskane komercyjnie, znieczulone przez wstrzyknięcie 100 mg/kg tiopentalu sodowego dootrzewnowo i poddane eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy, a następnie torakotomię i wycięcie serca. Próbki tkanki ludzkiego serca pobierano z rdzenia wierzchołkowego lewej komory podczas implantacji mechanicznych urządzeń wspomagających, z miektomii przegrody, z tetralogii chirurgii korekcyjnej Fallota lub z wolnej ściany lewej komory eksplantowanych serc. Poniższy protokół opisuje izolację z ludzkiej tkanki komorowej. Izolację kardiomiocytów szczurów przeprowadzono odpowiednio, ale przy użyciu różnych enzymów (patrz tabela materiałów). Schematyczny przebieg działania protokołu jest zilustrowany w Rysunek 1.

1. Przygotowanie, roztworów i enzymów

  1. Przygotować i roztwory zgodnie z tabelą 1.
  2. Rozgrzać roztwory 1, 2, 3 i zmodyfikowany roztwór Tyrode'a do temperatury 37 °C. Roztwór do cięcia przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
    UWAGA: W przypadku 1-2 wycinków mięśnia sercowego do izolacji w jednym naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm wymagane jest łącznie około 15 ml, 8 ml i 5 ml roztworów 1, 2 i 3. Odpowiednio zwiększ skalę, aby uzyskać jednoczesne izolacje miocytów w wielu naczyniach. Roztwór do cięcia można zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
  3. Odważyć 1 mg proteinazy XXIV (patrz tabela materiałów) do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i przechowywać na lodzie do czasu użycia. Służy to do przetworzenia jednej próbki. Odpowiednio zwiększ kwotę. Nie mieszaj proteinazy i kolagenazy.
  4. Odważyć 8 mg kolagenazy CLSI (patrz Tabela Materiałów) do wstępnie schłodzonej 15 ml probówki wirówkowej i przechowywać na lodzie do czasu użycia. Służy to do przetworzenia jednej próbki. Odpowiednio zwiększ kwotę. Nie mieszaj proteinazy i kolagenazy.
    UWAGA: Nosić maskę na twarz lub pracować pod wyciągiem, aby uniknąć wdychania proszku enzymatycznego.
    UWAGA: Aktywność enzymu może się różnić w zależności od partii. W związku z tym optymalne stężenie może się różnić i powinno być ustalane dla każdego nowo zakupionego enzymu16.

2. Przechowywanie i transport tkanki mięśnia sercowego

  1. Przechowuj i transportuj próbki serca ludzkiego w schłodzonym roztworze tnącym o temperaturze 4 °C (Tabela 1).
  2. Użyj tego samego roztworu do dalszego przetwarzania tkanek i krojenia wibratomem.
    UWAGA: Biopsje i chirurgiczne próbki serca należy natychmiast przenieść do roztworu tnącego w temperaturze 4 °C, a następnie przechowywać lub transportować w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 36 godzin przed zastosowaniem tego protokołu.

3. Przetwarzanie i krojenie tkanki

UWAGA: Protokół krojenia tkanek jest zgodny z Fischer et al.15.

  1. Przycinanie bloku tkankowego
    UWAGA: Ludzka tkanka serca jest potencjalnie zakaźna. Zawsze używaj odzieży ochronnej i przestrzegaj przepisów bezpieczeństwa obowiązujących w Twojej instytucji. Ostrożnie obchodź się ze zużytymi ostrzami i wyrzuć je do bezpiecznych pojemników.
    1. Umieścić próbkę w naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 100 mm wypełnionym 20 ml roztworu do cięcia na zimno i przechowywać na schłodzonej płytce o temperaturze 4 °C.
    2. Usuń nadmiar tkanki zwłóknieniowej i tłuszczu nasierdziowego za pomocą skalpela. W przypadku próbki przezściennej należy usunąć beleczki i warstwy tkanek w pobliżu wsierdzia.
      UWAGA: Tkanka zwłóknieniowa jest sztywna i wydaje się biała. Tłuszcz jest zazwyczaj miękki i ma barwę od białej do żółtej. Beleczki i warstwy tkanki wsierdzia można zidentyfikować na podstawie ich luźnego składu tkankowego i niewyrównanej orientacji włókien w porównaniu z mięśniem sercowym warstw nasierdzia
    3. Aby uzyskać optymalną obróbkę wibratomową, wytnij skalpelem prostokątne bloki tkanek o wymiarach około 8 mm x 8 mm x 8 mm z większej próbki tkanki. W przypadku mniejszych biopsji pomiń ten krok i przejdź do osadzania agarozy.
  2. Osadzanie tkanki serca w agarozie o niskiej temperaturze topnienia
    1. Zagotować 400 mg agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 10 ml roztworu tnącego w szklanej zlewce.
      UWAGA: Nosić rękawice i okulary ochronne, aby uniknąć oparzeń. Z gorącymi naczyniami szklanymi należy obchodzić się tylko w odzieży chroniącej przed wysoką temperaturą.
    2. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml gorącym, rozpuszczonym żelem agarozowym. Zamknąć strzykawkę i pozostawić agarozę do zrównoważenia w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez co najmniej 15 minut.
    3. Za pomocą kleszczy umieść przyciętą próbkę serca lub biopsję w czystym naczyniu do hodowli tkanek o średnicy 35 mm z nasierdziem skierowanym w dół i usuń nadmiar płynu sterylnym wacikiem.
    4. Wylać zrównoważoną agarozę (krok 3.2.2) na tkankę, opróżniając strzykawkę. Zabezpiecz tkankę przed ruchem kleszczami podczas nalewania agarozy. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w agarozie.
    5. Natychmiast umieść naczynie na lodzie i pozwól agarozie zastygnąć przez 10 minut.
  3. Cięcie mięśnia sercowego
    1. Zamontuj nową żyletkę do uchwytu ostrza wibratomu i skalibruj wibratom, regulując ugięcie ostrza w osi z, jeśli to możliwe.
      UWAGA: W tym protokole wykorzystuje wibratomium z urządzeniem do kalibracji wspomaganym podczerwienią w celu wyrównania ostrza w pozycji poziomej z minimalnym ugięciem z (zmierzone ugięcie <0,1 μm).
    2. Użyj skalpela, aby wyciąć blok tkanki agarozowej, który pasuje do uchwytu próbki wibratomu. Aby zapewnić stabilność, upewnij się, że tkanka jest nadal wystarczająco zanurzona w agarozie (brzegi agarozy ≥ 8 mm).
    3. Przymocuj blok agarozy do uchwytu próbki za pomocą cienkiej warstwy kleju cyjanoakrylowego i delikatnego nacisku.
    4. Umieść uchwyt na próbkę wraz z chusteczką w kąpieli wibratomowej. Napełnić kąpiel roztworem tnącym i utrzymywać temperaturę 4–6 °C przez cały czas przetwarzania za pomocą kruszonego lodu, napełnionego zewnętrznym zbiornikiem chłodzącym wibratomu.
    5. Generuj plastry o grubości 300 μm z prędkością posuwania ≤0,1 mm/s, częstotliwością oscylacyjną 80 Hz, amplitudą boczną 1,5 mm i kątem ostrza 15°. Podczas obchodzenia się z plastrami trzymaj agarozę zamiast samej tkanki, aby uniknąć uszkodzenia tkanki. Przechowywać plastry w roztworze do krojenia w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 2 godziny, jeśli to konieczne.
      UWAGA: Kardiomiocyty są zorientowane równolegle do nasierdzia. Dlatego ważne jest, aby ciąć równolegle do nasierdzia, aby uniknąć nadmiernego uszkodzenia miocytów. Zaleca się wyrzucenie pierwszych 1–3 plastrów, ponieważ do izolacji należy używać tylko jednolitych plastrów o stałej grubości. Jednak w przypadku biopsji małych tkanek należy wyrzucić tylko pierwszy plasterek.
    6. Sprawdź ustawienie kardiomiocytów pod standardowym mikroskopem świetlnym o powiększeniu 40-100x.

4. Trawienie tkankowe

  1. Umieść płytę grzewczą na wytrząsarce laboratoryjnej i podgrzej ją do 37 °C. Uruchom wytrząsarkę laboratoryjną z prędkością 65 obr./min.
  2. Rozpuścić proteinazę (przygotowaną w kroku 1.3) w 2 ml roztworu 1 (etapy 1.1 i 1.2) i inkubować w temperaturze 37 °C aż do użycia. Nie mieszaj proteinazy i kolagenazy.
  3. Rozpuścić kolagenazę (przygotowaną w kroku 1.4) w 2 ml roztworu 1 (etapy 1.1 i 1.2) i inkubować w temperaturze 37 °C aż do użycia. Nie mieszaj proteinazy i kolagenazy.
    UWAGA: Nosić okulary i rękawice ochronne, ponieważ rozpuszczone enzymy mogą powodować urazy skóry i oczu.
  4. Dodać chlorek wapnia (CaCl2) do roztworu zawierającego kolagenazę (przygotowanego w kroku 4.3) do końcowego stężenia 5 μM.
  5. Za pomocą kleszczy przenieś plasterek tkanki z kąpieli wibratomicznej do czystego naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm wypełnionego 5 ml wstępnie schłodzonego roztworu do cięcia (kroki 1.1 i 1.2) i trzymaj na lodzie.
  6. Ostrożnie usuń agarozę z tkanki mięśnia sercowego za pomocą ostrza lub kleszczy.
    UWAGA: Unikaj nadmiernego napięcia i naprężeń ścinających na plasterkach mięśnia sercowego, ponieważ mogą one uszkodzić kardiomiocyty.
  7. Aby przeprowadzić wstępne płukanie, umieść czyste naczynie do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm na płycie grzewczej i napełnij je 2 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) roztworu 1. Przenieś 1-2 plastry mięśnia sercowego do przygotowanego naczynia za pomocą kleszczy. Odessać roztwór pipetą o pojemności 1 ml i wykonać czynności płukania 2x, aby usunąć resztki roztworu tnącego.
    UWAGA: Nie zasysaj plastrów serca. Roztwory i plastry powinny pozostawać w stałej temperaturze 35 °C na wymieszanej płycie grzewczej. W razie potrzeby wyreguluj temperaturę płyty grzewczej.
  8. Wyjąć roztwór 1 z naczynia i dodać 2 ml roztworu proteinazy (krok 4.2). Inkubować przez 12 minut na płycie grzewczej z prędkością 65 obr./min.
  9. Przemyć 2x 2 ml podgrzanego roztworu 1 (37 °C).
  10. Usunąć roztwór 1 z naczynia i dodać 2 ml roztworu kolagenazy (kroki 4.3 i 4.4). Inkubować co najmniej 30 minut na płycie grzewczej z prędkością 65 obr./min.
  11. Sprawdź wolne pojedyncze miocyty po 30, 35, 40 minutach itd., umieszczając naczynie pod mikroskopem świetlnym. Pracuj szybko, aby uniknąć znacznego wychłodzenia roztworu.
    UWAGA: Wymagany czas trawienia może się różnić w zależności od budowy tkanki i stopnia zwłóknienia. Gdy tylko tkanka stanie się widocznie miękka i łatwo dysocjuje po delikatnym pociągnięciu, osiągnięty został optymalny czas trawienia. Jeśli dostępna jest wystarczająca ilość tkanki, kilka plastrów może być trawionych równolegle z różnym czasem trawienia.
  12. Gdy tkanka zostanie strawiona i widoczne są poszczególne miocyty (krok 4.11), przemyć 2x 2 ml podgrzanego roztworu 2 (37 °C) i ponownie napełnić 2 ml.

5. Dysocjacja tkanek

  1. Oddziel strawione plastry tkanki za pomocą kleszczy, ostrożnie rozsuwając włókna.
  2. Ostrożnie odpipetować kilka razy jednorazową pipetą Pasteura (średnica otworu >2 mm).
    UWAGA: Stosowanie kleszczy i pipetowania może wywoływać naprężenia mechaniczne i powodować uszkodzenie kardiomiocytów. Jest to jednak kluczowy krok do rozdzielenia komórek. Użyj cienkich kleszczy, aby zminimalizować uszkodzenia komórek i ostrożnie rozdziel plasterki na mniejsze kawałki.
  3. Sprawdź, czy pod mikroskopem świetlnym nie ma uwolnionych kardiomiocytów w kształcie pręcików.

6. Przywrócenie fizjologicznego stężenia wapnia

  1. Powoli zwiększać stężenie wapnia z 5 μM do 1,5 mM, mieszając w temperaturze 35 °C na płycie grzewczej. Stosować roztwory podstawowe CaCl2 o stężeniach 10 mM i 100 mM. Zalecane kroki: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1,200, 1,500 μM. Pozwól komórkom przystosować się do zwiększonego poziomu wapnia w 5-minutowych odstępach inkubacji między każdym etapem.
  2. Ostrożnie usuń niestrawione kawałki tkanki za pomocą kleszczy lub przefiltruj zawiesinę komórkową przez nylonową siatkę o wielkości porów 180 μm pod koniec wzrostu wapnia.

7. Usunięcie mechanicznego środka rozprzęgającego

  1. Przestań mieszać i powoli usuń jedną trzecią roztworu (~700 μL) z góry za pomocą pipety o pojemności 1 000 μL. Unikać aspiracji kardiomiocytów.
    UWAGA: Jeśli niestrawiona tkanka została usunięta, kardiomiocyty zgromadzą się w środku naczynia, co ułatwi aspirację roztworu bezkomórkowego. W przeciwnym razie przenieść roztwór komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i pozostawić komórki do osadzania się przez 10 minut w temperaturze 35 °C, następnie odessać 700 μl supernatantu i wyrzucić, ponownie zawiesić komórki, przenieść je z powrotem do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm i postępować zgodnie z krokiem 7.2.
  2. Dodać 700 μl roztworu 3 do komórek, wznowić mieszanie na płytce grzewczej i inkubować przez 10 minut.
  3. Powtórz kroki 7.1 i 7.2.
  4. Przenieść roztwór do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i pozostawić kardiomiocyty do osadu przez co najmniej 10 minut, a maksymalnie 30 minut w temperaturze pokojowej lub wirować przy 50 x g przez 1 minutę. Całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić w zmodyfikowanym roztworze Tyrode'a lub w żądanym buforze eksperymentalnym.
    UWAGA: Kardiomiocyty mogą być przechowywane w zmodyfikowanym roztworze Tyrode'a (Tabela 1) przez kilka godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed użyciem.
  5. Sprawdź jakość komórek za pomocą standardowego mikroskopu świetlnego przy powiększeniu 40x i 200x.
    UWAGA: Około 30–50% kardiomiocytów powinno mieć kształt pręcików, być gładkie, bez pęcherzyków błonowych i mieć wyraźne poprzeczne prążki. Tylko 5-10% żywotnych komórek powinno wykazywać spontaniczne skurcze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zweryfikować wydajność izolacji, protokół zastosowano w odniesieniu do mięśnia sercowego szczura, a otrzymaną liczbę żywych miocytów porównano z liczbą uzyskaną drogą izolacji poprzez perfuzję wieńcową oraz izolacji z małych fragmentów tkanki (izolacja z fragmentów, Rycina 2). Izolację z fragmentów tkanki oraz izolację z plastrów tkanki przeprowadzono z tych samych serc. W przypadku izolacji poprzez perfuzję wieńcową wykorzystano jednak całe serce. Perfuzja wieńcowa pozwoliła na uzyskani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż izolacja żywych kardiomiocytów została ustalona ponad 40 lat temu i nadal stanowi warunek wstępny dla wielu podejść eksperymentalnych w badaniach kardiologicznych, pozostaje trudną techniką o nieprzewidywalnych wynikach. Izolacja kardiomiocytów poprzez perfuzję tętnic wieńcowych roztworem enzymu jest powszechnie stosowana w przypadku serc małych zwierząt i daje dużą liczbę żywotnych komórek. Wymaga to jednak stosunkowo złożonego systemu i specjalistycznej wiedzy. Ponadto większość próbek tkanek ludzkich nie nadaj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Andreasowi Dendorferowi z Centrum Medycyny Eksperymentalnej im. Waltera Brendela, LMU w Monachium, za pomoc w opracowaniu protokołu krojenia. Za dostarczenie próbek tkanek mięśnia sercowego chcielibyśmy podziękować Ghazali Minabari i Christianowi Heimowi z Oddziału Kardiochirurgii Szpitala Uniwersyteckiego w Erlangen, Hendrikowi Miltingowi z Instytutu Ericha i Hanny Klessmannów Uniwersytetu Ruhry w Bochum oraz Muhannadowi Alkassarowi z Oddziału Kardiologii Dziecięcej Szpitala Uniwersyteckiego w Erlangen. Za wsparcie w zakresie cytometrii przepływowej chcielibyśmy podziękować Simonowi Völklowi i kolegom z Centrum Badań Translacyjnych (TRC) Szpitala Uniwersyteckiego w Erlangen. Chcielibyśmy również podziękować Lorenzowi McCargo i Celine Grüninger z Instytutu Fizjologii Komórkowej i Molekularnej w Erlangen za doskonałe wsparcie techniczne.

Ta praca była wspierana przez DZHK (Niemieckie Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych), przez Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych (IZKF) w Szpitalu Uniwersyteckim Uniwersytetu w Erlangen-Norymberdze oraz Universitätsbund Erlangen-Nürnberg.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicals
2,3-butanodionemonoksymCarl Roth3494.1Czystość>99%
Albumina surowicy bydlęcejCarl Roth163.2
CaCl2Carl Roth5239.2
Monohydrat kreatynyAlfa AesarB250009
GlukozaMerck50-99-7
HEPESCarl Roth9105.3
KClCarl RothP017.1
KH2PO4Carl Roth3904.2
Kwas L-glutaminowyFluka Biochemica49450
Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaCarl Roth6351.5
MgCl2 x 6H2OCarl RothA537.1
MgSO4Sigma AldrichM-7506
NaClCarl Roth9265.1
NaHCO3Carl Roth8551.2
ParaformaldehydSigma AldrichP6148
TaurynaSigma AldrichT8691
Dyes
Di-8-ANEPPSThermo Fisher ScientificD3167
Fluo-4 AMThermo Fisher ScientificF14201
FluoVoltThermo Fisher ScientificF10488
Enzymes
Kolagenaza CLS typu IWorthingtonLS004196Stosowana do tkanek ludzkich w dawce 4 mg / ml < br / > (aktywność: 280 U / mg)
Kolagenaza CLS typu IIWorthingtonLS004176Stosowana do tkanek szczurów w dawce 1,5 mg / ml < br / > (aktywność 330 U / mg)
Proteaza XIVSigma AldrichP8038Stosowana do tkanek szczurów w dawce 0,5 mg / ml
(aktywność & 3,5 U / mg)
Proteinaza XXIVSigma AldrichP5147Używany do tkanek ludzkich w ilości 0,5 mg / ml < br / > (aktywność: 7-14 U / mg)
Materiał
Analizator komórek (LSR Fortessa)BD Bioscience649225
Probówka wirówkowa, 15 mlCorning430790
Probówka wirówkowa, 50 mlCorning430829
Kompaktowa wytrząsarkaEdmund Bü hlerKS-15 B SterowanieKierunek mieszania: poziomy
Jednorazowe plastikowe pipety pasteuraCarl RothEA65.1Do rozcierania komórek należy używać wyłącznie pipet o wewnętrznej średnicy końcówki ≥
Kleszczyki2 mm FST11271-30
Blok grzewczyVWRBARN88880030
Filtr siatkowy nylonowy, 180 &mikro; mMerckNY8H04700
TC Dish 100, StandardSarstedt83.3902
TC Dish 35, StandardSarstedt83.3900
TC Dish 60, StandardSarstedt83.3901
Vibratome (VT1200S)Leica1491200S001Zawiera VibroCheck do wspomaganej podczerwienią korekcji odchylenia Z

Bibliografia

  1. Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 13, 258-283 (1976).
  2. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 288-298 (2011).
  3. Isenberg, G., Klockner, U. Calcium Tolerant Ventricular Myocytes Prepared by preincubation in a KB Medium. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 395, 6-18 (1982).
  4. Beuckelmann, D. J., Näbauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  5. Brixius, K., Hoischen, S., Reuter, H., Lasek, K., Schwinger, R. H. G. Force/shortening-frequency relationship in multicellular muscle strips and single cardiomyocytes of human failing and nonfailing hearts. Journal of Cardiac Failure. 7, 335-341 (2001).
  6. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  7. Coppini, R., et al. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. Journal of Visualized Experiments. (86), e51116(2014).
  8. Seidel, T., et al. Sheet-Like Remodeling of the Transverse Tubular System in Human Heart Failure Impairs Excitation-Contraction Coupling and Functional Recovery by Mechanical Unloading. Circulation. 135, 1632-1645 (2017).
  9. Hartmann, N., et al. Antiarrhythmic effects of dantrolene in human diseased cardiomyocytes. Heart Rhythm. 14, 412-419 (2017).
  10. Bkaily, G., Sperelakis, N., Doane, J. A new method for preparation of isolated single adult myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 247, 1018-1026 (1984).
  11. Trube, G. Enzymatic Dispersion of Heart and Other Tissues. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Springer. Boston, MA. 69-76 (1983).
  12. Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult Ventricular Cardiomyocytes. Basic Cell Culture Protocols. 290, 305-314 (2004).
  13. Del Monte, F., et al. Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a. Circulation. 100, 2308-2311 (1999).
  14. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93, 50-59 (2012).
  15. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, (2019).
  16. Worthington-Biochemical. Worthington Tissue Dissociation Guide. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html (2019).
  17. Seidel, T., et al. Glucocorticoids preserve the t-tubular system in ventricular cardiomyocytes by upregulation of autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 114 (6), 47(2019).
  18. Lipsett, D. B., et al. Cardiomyocyte substructure reverts to an immature phenotype during heart failure. Journal of Physiology. 597, 1833-1853 (2019).
  19. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12, 2623-2639 (2017).
  20. Guo, G. R., et al. A modified method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases. Journal of Translational Medicine. 16, 1-9 (2018).
  21. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
  22. Gomez, L. A., Alekseev, A. E., Aleksandrova, L. A., Brady, P. A., Terzic, A. Use of the MTT assay in adult ventricular cardiomyocytes to assess viability: Effects of adenosine and potassium on cellular survival. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 1255-1266 (1997).
  23. Zimmerman, A. N. E., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
  24. Piper, H. M. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovascular Research. 45, 123-127 (2000).
  25. Boink, A. B. T. J., Ruigrok, T. J. C., de Moes, D., Maas, A. H. J., Zimmerman, A. N. E. The effect of hypothermia on the occurrence of the calcium paradox. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 385, 105-109 (1980).
  26. Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circulation Research. 65, 1441-1444 (1989).
  27. Busselen, P. Effects of sodium on the calcium paradox in rat hearts. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 408, 458-464 (1987).
  28. Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+Transients and Membrane Currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235(2013).
  29. Leor, J., Kloner, R. An Experimental Model Examining the Role of Magnesium in the Therapy of Acute Myocardial Infarction. The American Journal of Cardiology. 75, 1292-1293 (1995).
  30. Herzog, W. R., et al. Timing of Magnesium Therapy Affects Experimental Infarct Size. Circulation. 92, 2622-2626 (1995).
  31. Stringham, J. C., Paulsen, K. L., Southard, J. H., Mentzer, R. M., Belzer, F. O. Forty-hour preservation of the rabbit heart: Optimal osmolarity, [Mg2+], and pH of a modified UW solution. The Annals of Thoracic Surgery. 58, 7-13 (1994).
  32. Hall, S. K., Fry, C. H. Magnesium affects excitation, conduction, and contraction of isolated mammalian cardiac muscle. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263 (2), Pt 2 622-633 (1992).
  33. Bussek, A., et al. Tissue Slices from Adult Mammalian Hearts as a Model for Pharmacological Drug Testing. Cellular Physiology and Biochemistry. 24, (2009).
  34. Wang, K., et al. Living cardiac tissue slices: An organotypic pseudo two-dimensional model for cardiac biophysics research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 314-327 (2014).
  35. Thomas, R. C., et al. A Myocardial Slice Culture Model Reveals Alpha-1A-Adrenergic Receptor Signaling in the Human Heart. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1, 155-167 (2016).
  36. Perreault, C. L., et al. Cellular basis of negative inotropic effect of 2,3-butanedione monoxime in human myocardium. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263, 503-510 (1992).
  37. Vahl, C. F., Bonz, A., Hagl, C., Hagl, S. Reversible desensitization of the myocardial contractile apparatus forcalcium: A new concept for improving tolerance to cold ischemia in human myocardium. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 8, 370-378 (1994).
  38. Horiuti, K., et al. Mechanism of action of 2, 3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 9, 156-164 (1988).
  39. Li, T., Sperelakis, N., Teneick, R. E., Solaro, R. J. Effects of diacetyl monoxime on cardiac excitation-contraction coupling. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 232, 688-695 (1985).
  40. Sellin, L. C., Mcardle, J. J. Multiple Effects of 2,3 Butanedione Monoxime. Pharmacology and Toxicology. 74, 305-313 (1993).
  41. Eghbali-Webb, M., Agocha, A. E. A simple method for preparation of cultured cardiac fibroblasts from adult human ventricular tissue. Novel Methods in Molecular and Cellular Biochemistry of Muscle. Pierce, G. N., Claycomb, W. C. , Springer US. 195-198 (1997).
  42. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 390-398 (2011).
  43. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168(2019).
  44. Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33, 239-244 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Platki wycinane w wibratomieizolacja plastr w tkankiwydajno kardiomiocyt wcytometria przep ywowatrawienie kolagenaz proteolitycznpr cikowate miocytytolerancja wapniaanaliza elektrofizjologicznaludzkie mi sie sercowy

Powiązane artykuły