Celowanie in vivo w ksenoprzeszczepowane ludzkie komórki rakowe za pomocą funkcjonalizowanych fluorescencyjnych nanocząstek krzemionki u danio pręgowanego

Podsumowanie

Opisana tutaj jest metoda wykorzystania embrionów danio pręgowanego do badania zdolności funkcjonalizowanych nanocząsteczek do celowania w ludzkie komórki rakowe in vivo. Metoda ta pozwala na ocenę i wybór optymalnych nanocząstek do przyszłych badań na dużych zwierzętach oraz w badaniach klinicznych.

Streszczenie

Rozwój nanocząsteczek zdolnych do wykrywania, namierzania i niszczenia komórek nowotworowych jest bardzo interesujący w dziedzinie nanomedycyny. Modele zwierzęce in vivo są niezbędne do połączenia nanotechnologii z jej zastosowaniem biomedycznym. Mysz reprezentuje tradycyjny model zwierzęcy do badań przedklinicznych; Jednak myszy są stosunkowo drogie w utrzymaniu i mają długie cykle eksperymentalne ze względu na ograniczone potomstwo każdej matki. Danio pręgowany stał się potężnym systemem modelowym dla badań rozwojowych i biomedycznych, w tym badań nad rakiem. W szczególności, ze względu na przezroczystość optyczną i szybki rozwój, zarodki danio pręgowanego dobrze nadają się do monitorowania in vivo w czasie rzeczywistym zachowania komórek nowotworowych i ich interakcji z ich mikrośrodowiskiem. Metoda ta została opracowana w celu sekwencyjnego wprowadzania ludzkich komórek rakowych i funkcjonalizowanych nanocząstek do przezroczystych zarodków zebry zebry Casper oraz monitorowania in vivo rozpoznawania i celowania w komórki rakowe za pomocą nanocząstek w czasie rzeczywistym. Ten zoptymalizowany protokół pokazuje, że znakowane fluorescencyjnie nanocząstki, które są funkcjonalizowane grupami folianów, mogą specyficznie rozpoznawać i celować w przerzutowe ludzkie komórki nabłonka szyjki macicy znakowane innym fluorochromem. Proces rozpoznawania i celowania może nastąpić już po 30 minutach od wstrzyknięcia badanych nanocząstek. Cały eksperyment wymaga jedynie wyhodowania kilku par dorosłych ryb i trwa mniej niż 4 dni. Co więcej, zarodki danio pręgowanego nie mają funkcjonalnego adaptacyjnego układu odpornościowego, co pozwala na wszczepienie szerokiej gamy ludzkich komórek rakowych. W związku z tym użyteczność opisanego tutaj protokołu umożliwia testowanie nanocząstek na różnych typach ludzkich komórek nowotworowych, ułatwiając wybór optymalnych nanocząstek w każdym konkretnym kontekście nowotworu do przyszłych testów na ssakach i w klinice.

Wprowadzenie

Rozwój nanocząsteczek, które są zdolne do wykrywania, namierzania i niszczenia komórek rakowych, jest bardzo interesujący zarówno dla fizyków, jak i badaczy biomedycznych. Pojawienie się nanomedycyny doprowadziło do opracowania kilku nanocząstek, takich jak te sprzężone z ligandami celującymi i/lub lekami chemioterapeutycznymi^1,2,3. Dodane właściwości nanocząstek umożliwiają ich interakcję z systemem biologicznym, wykrywanie i monitorowanie zdarzeń biologicznych z wysoką wydajnością i dokładnością wraz z zastosowaniami terapeutycznymi. Nanocząstki złota i tlenku żelaza są stosowane głównie w zastosowaniach związanych z tomografią komputerową i rezonansem magnetycznym. Podczas gdy aktywność enzymatyczna nanocząstek złota i tlenku żelaza pozwala na wykrywanie komórek rakowych za pomocą testów kolorymetrycznych, nanocząstki fluorescencyjne dobrze nadają się do zastosowań w obrazowaniu in vivo⁴. Wśród nich szczególnie korzystne są ultrajasne nanocząstki fluorescencyjne, ze względu na ich zdolność do wczesnego wykrywania nowotworów przy mniejszej liczbie cząstek i zmniejszonej toksyczności⁵.

Pomimo tych zalet, nanocząstki wymagają eksperymentów z wykorzystaniem modeli zwierzęcych in vivo w celu wyboru odpowiednich nanomateriałów i optymalizacji procesu syntezy. Ponadto, podobnie jak leki, nanocząstki opierają się na modelach zwierzęcych do badań przedklinicznych w celu określenia ich skuteczności i toksyczności. Najczęściej stosowanym modelem przedklinicznym jest mysz, która jest ssakiem, którego utrzymanie wiąże się ze stosunkowo wysokimi kosztami. Do badań nad rakiem zwykle używa się myszy modyfikowanych genetycznie lub myszy ksenoprzeszczepionych^6,7. Czas trwania tych eksperymentów często wynosi od tygodni do miesięcy. W szczególności w przypadku badań nad przerzutami nowotworowymi komórki rakowe są bezpośrednio wstrzykiwane do układu krążenia myszy w miejscach takich jak żyły ogonowe i śledziona^8,9,10. Modele te reprezentują tylko końcowe etapy przerzutów, gdy komórki nowotworowe wynaczyniają się i kolonizują odległe narządy. Ponadto, ze względu na problemy z widocznością, szczególnie trudne jest monitorowanie migracji komórek nowotworowych i celowanie w nanocząstki komórek nowotworowych u myszy.

Danio rerio danio pręgowany (Danio rerio) stał się potężnym systemem kręgowców do badań nad rakiem ze względu na swoją wysoką płodność, niski koszt, szybki rozwój, przejrzystość optyczną i ochronę genetyczną^11,12. Kolejną przewagą danio pręgowanego nad modelem mysim jest zapłodnienie jaj ryb ex utero, co pozwala na monitorowanie zarodków przez cały okres ich rozwoju. Rozwój embrionalny u danio pręgowanego jest szybki, a w ciągu 24 godzin po zapłodnieniu (hpf) płaszczyzna ciała kręgowców już się uformowała¹³. Do 72 hpf jaja wykluwają się z kosmówki, przechodząc z etapu embrionalnego do narybku. Przezroczystość danio pręgowanego, w szczególności szczepu Casper¹⁴, daje wyjątkową okazję do wizualizacji migracji komórek rakowych oraz ich rozpoznawania i celowania przez nanocząstki u żywego zwierzęcia. Wreszcie, danio pręgowany rozwija swój wrodzony układ odpornościowy o 48 hpf, przy czym adaptacyjny układ odpornościowy pozostaje w tyle i staje się funkcjonalny dopiero po 28 dniach od zapłodnienia¹⁵. Ta luka czasowa jest idealna do przeszczepiania różnych typów ludzkich komórek rakowych do zarodków danio pręgowanego bez doświadczania odrzucenia immunologicznego.

Opisana tutaj jest metoda, która wykorzystuje przejrzystość i szybki rozwój danio pręgowanego, aby zademonstrować rozpoznawanie i celowanie w ludzkie komórki rakowe za pomocą fluorescencyjnych nanocząsteczek in vivo. W tym teście ludzkie komórki raka szyjki macicy (komórki HeLa) genetycznie zmodyfikowane w celu ekspresji białka czerwonej fluorescencji zostały wstrzyknięte do unaczynionego obszaru w jamie okołopęcherzowej 48 zarodków hpf. Po 20-24 godzinach komórki HeLa rozprzestrzeniły się już po zarodkach przez układ krążenia ryb. Zarodkom z widocznymi przerzutami wstrzyknięto mikroiniekcję ~0,5 nL roztworu nanocząstek bezpośrednio za okiem, gdzie znajduje się bogate łożysko kapilarne. Korzystając z tej techniki, ultrajasne fluorescencyjne nanocząstki krzemionki mogą celować w komórki HeLa już po 20-30 minutach od wstrzyknięcia. Ze względu na swoją prostotę i skuteczność, danio pręgowany stanowi solidny model in vivo do testowania różnych nanocząstek pod kątem ich zdolności do celowania w określone komórki rakowe.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Boston University School of Medicine zgodnie z protokołem #: PROTO201800543.

1. Generacja zarodków zebry zebry Casper

1. Wybierz dorosłe ryby Casper, które mają co najmniej 3 miesiące do naturalnej hodowli, aby wygenerować przezroczyste zarodki zebry zebryka.
2. Napełnij dwukomorowe zbiorniki godowe wodą rybną wieczorem, oddziel górne zbiorniki za pomocą przegród, umieść jednego samca ryby po jednej stronie komory, a jedną lub dwie samice po drugiej stronie komory i pozostaw ryby oddzielone na noc przegrodami.
3. Wyciągnij przegrody następnego ranka o 8:00, kiedy światła są włączone. Dodaj sztuczne rośliny wzbogacające i lekko przechyl górną komorę, aby uzyskać płytki obszar wody. Pozwól rybom rozmnażać się przez 3-4 godziny.
4. Podnieś górne komory zbiorników łączących, w których znajdują się ryby i włóż je z powrotem do oryginalnych zbiorników.
5. Zbieraj jaja znajdujące się w dolnych komorach, przelewając wodę przez siatkę. Przenieść jaja na sterylną szalkę Petriego o gęstości nie większej niż 200 jaj na szalkę. Usuń martwe lub niezapłodnione jaja i napełnij naczynie do 2/3 świeżą wodą rybną.
   UWAGA: Zapłodnione i zdrowe jaja powinny być przezroczyste i okrągłe. Wszelkie jaja, które są mętne, białe lub zniekształcone, należy usunąć. Woda dla ryb pozyskiwana jest ze zbiorników rybnych w obiekcie rybnym.
6. Inkubować zarodki w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C przez noc.
7. Następnego ranka należy wybielić zarodki przy użyciu standardowego protokołu opisanego w The Zebrafish Book¹⁶, a następnie umieścić zarodki z powrotem w inkubatorze (krok opcjonalny).
8. Po południu wyjąć 24 zarodki hpf z inkubatora i dokonać dechorionacji zarodków za pomocą pronazy.
   1. Usunąć jak najwięcej wody rybnej z zarodków na szalce Petriego i dodać kilka kropli roztworu pronazy (1 mg/ml w wodzie dla ryb) do szalki. Delikatnie zakręć szalką Petriego. Gdy kosmówka wykazuje oznaki rozpadu, należy kilkakrotnie pipetować zarodki w górę iw dół, aby rozbić zarodki i uwolnić zarodki.
   2. Natychmiast dodaj świeżą wodę rybną do szalki Petriego, aby zakończyć proces, gdy większość zarodków wyjdzie z kosmówki. Opłucz zarodki jeszcze 3 razy za pomocą wody rybnej, aby usunąć pływające kosmówki. Umieść zarodki z powrotem w inkubatorze.

2. Przygotowanie ludzkich komórek nowotworowych do przeszczepu

1. Ustaw temperaturę inkubatora dokładnie na 35,5 °C. Monitoruj inkubator, aby zapewnić stałą i stabilną temperaturę za pomocą termometru wewnątrz inkubatora.
2. Autoklaw 1 l wody rybnej w szklanej butelce. Przygotuj 3% roztwór agarozy, dodając 3 g agarozy do elektroforezy do 100 ml autoklawowanej wody dla ryb i podgrzewając w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
   1. Wlej gorący roztwór agarozy do szalki Petriego, aż będzie wypełniona w 3/4. Umieść formę do mikroiniekcji na agarozie. Upewnij się, że forma nie styka się z dnem szalki Petriego i nie tworzy się pod nią bąbelki.
   2. Poczekaj, aż roztwór stwardnieje i ostrożnie usuń formę z płyty. Napełnij płytkę autoklawowaną wodą rybną i przechowuj płytkę w temperaturze 4 °C. Przed pobraniem komórek HeLa podgrzej płytkę agarozową i wodę rybną w inkubatorze o temperaturze 35,5 °C.
3. Pociągnij kapilary ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1,0 mm x 0,78 mm na ściągaczu do pipet, stosując następujące ustawienia: ciśnienie na 500, ciepło na 560, pociągnięcie na 100, prędkość na 100 i czas/opóźnienie na 200. Igły na szpachli należy przechowywać na dużej szalce Petriego, którą przetarto ręcznikiem etanolowym.
   UWAGA: Ciągnięte igły są bardzo ostre i delikatne. Zachowaj ostrożność podczas obsługi.
4. Przygotować roztwór podstawowy metanosulfonianu trikainy (MS222, 4 mg/ml), rozpuszczając MS222 w autoklawowanej wodzie dla ryb. Dobrze wymieszać przed użyciem. Rozcieńczyć roztwór podstawowy MS222 w stosunku 1:100 w wodzie dla ryb (tj. dodać 200 μl roztworu podstawowego MS222 do 20 ml wody dla ryb do końcowego stężenia 40 μg/ml) w celu znieczulenia zarodków do następujących procedur.
5. Hodowla hZnakuj komórki HeLa, transdukując je PLenti6.2_miRFP670 lentiwirusem przy użyciu opisanego protokołu¹⁷. Pobrać komórki RFP+ HeLa 30 min-1 h przed przeszczepem.
   UWAGA: Ludzkie komórki HeLa hodowano w inkubatorze do hodowli tkankowych do 70% zbiegu w kompletnym pożywce wzrostowej (pożywka DMEM z 10% FBS) w temperaturze 37 °C uzupełnionej 5% CO₂ .
   1. Usunąć pożywkę z komórek HeLa przez aspirację do hodowli tkankowej. Krótko przepłucz warstwę komórkową sterylnym PBS, aby usunąć wszelkie ślady surowicy.
   2. Dodać 3,0 ml sterylnego roztworu trypsyny-EDTA do kolby T-75 i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 3-5 minut, aby ułatwić trawienie enzymatyczne. Obserwuj kolbę pod mikroskopem, aż ~80% komórek zostanie zawieszonych.
   3. Dodać 6-8 ml kompletnej pożywki wzrostowej do kolby. Zebrać komórki do sterylnej probówki o pojemności 15 ml, delikatnie pipetując. Wirować przy 135 x g przez 5 min.
   4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki HeLa w 3 ml kompletnej pożywki wzrostowej. Powtórz powyższy krok prania 2x. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnej pożywki wzrostowej i policzyć komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru.
   5. Ponownie odwiruj komórki, usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml o stężeniu 5 x 10⁷ komórek/ml. Utrzymuj komórki w cieple, trzymając rurkę jedną ręką podczas transportu do obiektu rybnego.
      UWAGA: Zawsze utrzymuj komórki w cieple, przechowując je w inkubatorze w temperaturze 35,5 °C przed lub w trakcie wstrzykiwania zarodków.

3. Przeszczepianie ludzkich komórek nowotworowych

1. Przed przeszczepem oczyść miejsce pracy za pomocą ręczników etanolowych (np. nożyczek, pęsety, plastikowych pipet, żyletek).
2. Wyrównaj zarodki w rowkach płytki agarozowej za pomocą plastikowej pipety. Połóż zarodki na boku z przodem skierowanym do przodu.
   UWAGA: Upewnij się, że woda dla ryb zakrywa zarodki. Odłóż niektóre embriony na bok, aby nie wstrzykiwać komórek rakowych i użyj ich jako kontroli.
3. Włącz źródło powietrza i mikrowtryskiwacz. Wyjmij komórki HeLa z inkubatora i pipetuj komórki w górę i w dół 20-30 razy za pomocą końcówki P200. Natychmiast załaduj 3 μl mieszaniny komórek do igły za pomocą żelowej końcówki ładującej z odciętym końcem. Ostrożnie włóż końcówkę w kierunku ostrego dolnego końca igły. W razie potrzeby potrząśnij igłą, aby upewnić się, że mieszanina komórek przesuwa się w dół igły, aby wypełnić ostry koniec.
   1. Włożyć igłę do uchwytu igły. Użyj pęsety, aby ostrożnie otworzyć końcówkę igły. Dostosuj ciśnienie i czas działania mikrowtryskiwacza, aby wypchnąć wszystkie pęcherzyki powietrza znajdujące się wewnątrz końcówki igły. Zmniejszyć ciśnienie i czas wstrzykiwania do momentu, gdy wielkość kropelek do wstrzykiwań osiągnie ~1 nL.
   2. Umieścić płytkę do wstrzykiwań pod mikroskopem w odpowiedniej pozycji, tak aby żółtkowa strona zarodków była skierowana w stronę igły. Znieczulić zarodki, dodając pięć kropli rozcieńczonego roztworu MS222 (40 μg/ml).
   3. Ustawić wstrzykiwacz i pozwolić, aby igła dotknęła jamy okołoopyleninowej każdego zarodka.
4. Wstrzyknąć mieszaninę komórek do zarodków w unaczynionym obszarze pod jamą okołonogową, naciskając pedał nożny.
5. Ręką niedominującą przesunąć płytkę iniekcyjną do następnego zarodka. Użyj dominującej ręki, aby wysunąć i schować wtryskiwacz, jednocześnie naciskając pedał nożny, aby kontynuować wstrzykiwanie. Odpipetować kilka kropli sterylnej wody rybnej na zarodki, które zostały wstrzyknięte. Po zakończeniu wstrzykiwania wszystkich zarodków na płytkę, należy zmyć je sterylną wodą dla ryb, umieścić na sterylnej szalce Petriego i natychmiast przenieść do inkubatora o temperaturze 35,5 °C.
6. Po 3 godzinach należy zbadać wstrzyknięte zarodki i usunąć martwe.
7. Żywe zarodki należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 35,5 °C i inkubować przez 20-24 godziny, aby umożliwić komórkom HeLa rozprzestrzenienie się z miejsca wstrzyknięcia na inne części ciała.
   UWAGA: Zarodki są trzymane w inkubatorze o temperaturze 35,5 °C, aby umożliwić przeżycie i migrację ludzkich komórek rakowych, ponieważ komórki nie radzą sobie dobrze w temperaturze 28,5 °C, w której zwykle inkubuje się zarodki ryb.

4. Wstrzykiwanie nanocząsteczek lub pojazdu

1. Znieczulenie przeszczepionych zarodków należy znieczulić następnego ranka pięcioma kroplami rozcieńczonego roztworu MS222. Nie należy dodawać zbyt dużej ilości MS222, ponieważ spowoduje to śmierć zarodków. Pod mikroskopem fluorescencyjnym ostrożnie podnieś zarodki z przerzutami komórek HeLa RFP+ do ogona i umieść je na nowej szalce Petriego ze sterylną wodą dla ryb.
2. Przygotować igły do wstrzykiwań zgodnie z wcześniejszym opisem w punkcie 2, stosując następujące ustawienia: ciśnienie na 500, ciepło na 645, pociągnięcie na 60, prędkość na 50 i czas/opóźnienie na 100.
3. Postępuj zgodnie z procedurami opisanymi w krokach 3.1-3.3, aby wyrównać zarodki i załadować nośnik (np._H2O) lub roztwór nanocząstek do igły.
4. Wstrzyknąć 0,5 nl roztworu nanocząstek o stężeniu 1 mg/ml za okiem i kontynuować wstrzykiwanie zgodnie z opisem w krokach 3.5-3.6 (Rysunek 1B). To miejsce za oczami jest wzbogacone naczyniami włosowatymi, dzięki czemu nanocząsteczki mogą dostać się do krążenia.
5. Postępując zgodnie z podobną procedurą, wstrzyknij nośnik (np._H2O), który został użyty do zawieszenia nanocząstek do zarodków z przeszczepionymi komórkami HeLa i tych bez (tj. kontrolnych) (Rysunek 1A, C).
6. Inkubować wszystkie wstrzyknięte zarodki w temperaturze 35,5 °C.

5. Obrazowanie i śledzenie nanocząsteczek i komórek nowotworowych

1. Zbadaj wstrzyknięte zarodki pod mikroskopem fluorescencyjnym w 0, 30, 60, 90, 120, 180 i 210 minutach po wstrzyknięciu nanocząstek, aby monitorować ich rozmieszczenie w krążeniu i stopień celowania w komórki rakowe. Celowanie nanocząstek w komórki nowotworowe można zaobserwować już po 30 minutach od wstrzyknięcia, w zależności od rodzaju badanej nanocząstki.
2. Pobrać pipetą 2-3 zarodki na szalkę Petriego i unieruchomić je, dodając pięć kropli rozcieńczonego roztworu MS222 (40 μg/ml). Gdy zarodki przestaną pływać, usuń większość wody, aby zarodki mogły leżeć na boku.
3. Użyj pipety z cienką, miękką szczoteczką przymocowaną do jej końca, aby wyrównać zarodki tak, aby leżały na boku, z przednią częścią skierowaną do przodu i widocznym tylko jednym okiem.
4. Wyobraź sobie zarodki w kanałach czerwonym, niebieskim i jasnym polu przy małym powiększeniu (2x), aby uchwycić cały zarodek i powtórz w większym powiększeniu (6,4x), aby uchwycić obszar ogona. Skoncentruj zarodek pod czerwonym kanałem, aby uniknąć krwawienia nanocząstek.
   UWAGA: Zarodki nie mogą się poruszać podczas obrazowania. Każdy ruch doprowadzi do rozmycia obrazów i niemożności nałożenia na siebie obrazów z różnych kanałów.
5. Natychmiast po obrazowaniu należy dodać świeżą wodę z ryb do zarodków i umieścić je z powrotem w inkubatorze. Powtórz kroki 5.2-5.4, aby zobrazować zarodki w różnych punktach czasowych.

Wyniki

Schemat protokołu na Rysunku 1 przedstawia ogólne procedury zastosowane w niniejszym badaniu. Przezroczyste dorosłe ryby Casper (samce i samice) rozmnażano w celu uzyskania embrionów (sekcja 1). Komórki HeLa RFP+ wstrzykiwano w obszar unaczyniony pod jamą okożółtkową embrionów danio pręgowanego w 48 hpf; embriony niewstrzyknięte służyły jako kontrole (sekcja 3). W przypadku osób doświadczonych w mikroiniekcjach przeżywalność embrionów jest często wys...

Dyskusja

Opisany tutaj protokół wykorzystuje danio pręgowanego jako system in vivo do testowania zdolności nanocząstek do rozpoznawania i celowania w przerzutowe ludzkie komórki rakowe. Na pomyślne przeprowadzenie eksperymentów może mieć wpływ kilka czynników. Po pierwsze, zarodki muszą być w pełni rozwinięte przy 48 hpf. Prawidłowy etap rozwojowy zarodków umożliwia im przetrwanie i przetrwanie przeszczepu ludzkich komórek nowotworowych. Zarodki młodsze niż 48 hpf mają znacznie niższy wskaźnik przeżycia w porównaniu ze starszymi ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agaroza	KSE scientific	BMK-A1705
Kapilary ze szkła borokrzemianowego	World Precision Instruments	1,0 mm OD x 0,78 mm
Komputer i monitor	ThinkCentre	X000335
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Corning	10-013-CV	sprzedawany przez Fisher
Płodowa surowica bydlęca	Sigma-Aldrich	F0926
Inkubator do ryb	VWR	35960-056
Hemocytometr	marki Fishersci	02-671-51B
Stojak magnetyczny	World Precision Instruments	M10
Końcówka do mikroładowarki	Eppendorf	E5242956003	sprzedawana przez Fisher
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MMPI-3
Ściągacz igieł	Instrumenty Sutter	P-97
Mikroskop fluorescencyjny Olympus MVX-10	Olympus	MVX-10
P200	Marka	Fishersci07-200-293
PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X)	Corning	21-030-CV	sprzedawany przez Fisher
Petri szalka Corning		SB93102	sprzedawany przez Fisher
Plastikowa pipeta	marki Fishersci	50-998-100
pLenti6.2_miRFP670	Addgene	13726
Pneumatyczna pompa pico	World Precision Instruments	SYSPV820
Pronase	Roche-Sigma-Fisher	50-100-3275	Produkt Roche firmy Sigma - sprzedawany przez Fisher
Żyletka	marki Fishersci	12-640
Mikroskop preparacyjny SZ51	Olympus	SZ51
Metanosulfonian trikainy	Western Chemicals	NC0872873	sprzedawane przez Fisher
Trypsin-EDTA	Corning	MT25053CI	sprzedawany przez
pęsetę	Fisher marki Fishersci	12-000-122

Końcówka