Artykuł metodologiczny

Model nabłonka oskrzeli na granicy faz powietrze-ciecz do realistycznego, powtarzającego się narażenia inhalacyjnego na cząstki unoszące się w powietrzu do testów toksyczności

13.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61210

⸱

13 maja 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Institute for Public Health and the Environment (RIVM), 2Institute for Risk Assessment Sciences (IRAS)

W tym artykule

Podsumowanie

Opisana jest metoda hodowli komórkowej i ekspozycji modelu oskrzelowego in vitro dla realistycznej, powtarzającej się ekspozycji inhalacyjnej na cząstki do testów toksyczności.

Streszczenie

Do testowania toksyczności cząstek unoszących się w powietrzu, opracowano systemy ekspozycji na granicy powietrze-ciecz (ALI) do testów in vitro, aby naśladować realistyczne warunki ekspozycji. Stawia to szczególne wymagania modelom kultur komórkowych. Na wiele typów komórek negatywnie wpływa ekspozycja na powietrze (np. wysuszenie) i zachowują żywotność tylko przez kilka dni. Ogranicza to warunki ekspozycji, które można zastosować w tych modelach: zwykle stosunkowo wysokie stężenia są stosowane jako chmura (tj. kropelki zawierające cząstki, które szybko osiadają) w krótkim czasie. Takie warunki eksperymentalne nie odzwierciedlają realistycznego długotrwałego narażenia na niskie stężenia cząstek. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zbadano zastosowanie ludzkiej linii komórek nabłonka oskrzeli, Calu-3. Komórki te mogą być hodowane w warunkach ALI przez kilka tygodni, zachowując zdrową morfologię i stabilną monowarstwę ze ścisłymi połączeniami. Ponadto ten model oskrzelowy nadaje się do testowania skutków powtarzających się ekspozycji na niskie, realistyczne stężenia cząstek unoszących się w powietrzu przy użyciu systemu ekspozycji ALI. System ten wykorzystuje ciągły przepływ powietrza, w przeciwieństwie do innych systemów naświetlania ALI, które wykorzystują pojedynczą nebulizację wytwarzającą chmurę. Dlatego system ciągłego przepływu nadaje się do powtarzającego się i długotrwałego narażenia na cząstki unoszące się w powietrzu przy ciągłym monitorowaniu charakterystyki cząstek, stężenia ekspozycji i dostarczonej dawki. Podsumowując, ten model oskrzelowy, w połączeniu z systemem ciągłego narażenia przepływowego, jest w stanie naśladować realistyczne, powtarzające się warunki narażenia inhalacyjnego, które można wykorzystać do badań toksyczności.

Wprowadzenie

Płuca są narażone na narażenie na wdychanie cząstek unoszących się w powietrzu. Aby ocenić potencjalną toksyczność cząstek unoszących się w powietrzu, poczyniono postępy w opracowywaniu systemów ekspozycji na interfejs powietrze-ciecz (ALI)1,2,3,4,5. Systemy ekspozycji ALI pozwalają na bardziej odpowiednie i realistyczne modele ekspozycji w porównaniu z tradycyjną ekspozycją zanurzoną za pomocą pożywki hodowlanej, która zmienia charakterystykę i kinetykę cząstek6. Systemy ekspozycji ALI stawiają szczególne wymagania modelom hodowli komórkowych, ponieważ modele te nie mają pożywki hodowlanej, a tym samym składników odżywczych po stronie wierzchołkowej. Na wiele modeli komórkowych negatywny wpływ ma hodowla i wystawienie na działanie powietrza (np. wysychanie) i zachowują żywotność tylko przez kilka dni. Ogranicza to warunki ekspozycji, które można zastosować w tych modelach: zwykle stosunkowo wysokie stężenia są stosowane w krótkim czasie jako chmura (tj. kropelki zawierające cząstki, które szybko osiadają). Takie warunki doświadczalne nie odzwierciedlają realistycznego długotrwałego narażenia na niskie stężenia cząstek; W związku z tym można zakwestionować przydatność wyników. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zoptymalizowano protokół hodowli i ekspozycji dla modelu oskrzelowego składającego się z ludzkiej linii komórek nabłonka oskrzeli Calu-37.

Większość modeli płuc in vitro używanych do ekspozycji ALI zawiera inne linie komórkowe, takie jak A549, BEAS-2B i 16HBE14o- (16HBE) lub komórki pierwotne jako podstawę8. Te linie komórkowe mają tę wadę, że zachowują żywotność tylko przez kilka dni, gdy są hodowane w ALI. Ponadto niektóre z tych linii komórkowych przerastają, gdy są hodowane przez okres dłuższy niż 5 dni. Wreszcie, komórki A549 pomijają funkcjonalne ścisłe połączenia i dlatego nie mogą tworzyć szczelnej bariery, która jest potrzebna do naśladowania płuc 9,10. Pierwotne komórki nabłonkowe mogą być dobrym rozwiązaniem do ekspozycji na ALI, ponieważ mogą być hodowane w ALI przez tygodnie. Jednak ogniwa pierwotne różnią się w zależności od partii, są trudniejsze w utrzymaniu i droższe w porównaniu z liniami komórkowymi, co czyni je mniej odpowiednimi do testów toksyczności i badań przesiewowych. Porównując różne ludzkie linie komórkowe nabłonka oskrzeli (16HBE, Calu-3, H292 i BEAS-2B), tylko komórki Calu-3 spełniają wszystkie kryteria potrzebne do realistycznej, powtarzalnej ekspozycji na ALI: pozostają żywotne przez tygodnie, gdy są hodowane w ALI, zapewniają wysoką integralność barierową, nie przerastają i są łatwe do hodowli i utrzymania. Komórki Calu-3 wywodzą się z gruczolakoraka i są zdolne do wytwarzania śluzu11,12. Istnieją niespójności co do tego, czy komórki mogą rozwijać rzęski11,13. Komórki Calu-3 są również odpowiednim modelem do badania zakażeń syncytialnym wirusem oddechowym (RSV), które infekują komórki nabłonka rzęsek dróg oddechowych14.

Oprócz modelu komórkowego, do ekspozycji aerozoli powietrze-ciecz używany jest automatyczny system ekspozycji (AES) na aerozole15,16. AES ma tę zaletę, że wykorzystuje ciągły przepływ powietrza do wystawiania modelu komórkowego na działanie aerozoli. Jest to przeciwieństwo innych systemów ekspozycji powietrze-ciecz, które zwykle wykorzystują stosunkowo wysokie stężenia w krótkim czasie jako chmurę (tj. kropelki zawierające cząstki, które szybko osiadają)17,18,19. Te systemy chmur nie odzwierciedlają realistycznego długotrwałego narażenia na niskie stężenia cząstek. Dzięki zastosowaniu ciągłego przepływu powietrza za pomocą AES, model ogniwa może być wystawiony na działanie niskiego stężenia cząstek w dłuższym okresie czasu, odzwierciedlając realistyczne warunki ekspozycji. Kolejną zaletą w porównaniu z systemami chmurowymi jest to, że AES ma możliwość podłączenia instrumentów do charakteryzacji cząstek, co pozwala na pomiar wielkości cząstek, stężenia liczbowego i masy w czasie. Ograniczeniem AES jest to, że wykorzystuje stosunkowo duże przepływy powietrza od 10 ml/min do 100 ml/min.

Protokół

1. Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowych (CCM)

  1. Przygotuj butelkę zawierającą 500 ml minimalnej ilości niezbędnej pożywki (MEM) uzupełnionej glutaminą.
  2. Dodać 5 ml penicyliny-streptomycyny (tj. 100 j./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny).
  3. Dodać 5 ml roztworu aminokwasów endogennych (NEAA).
  4. Dodać 10 ml amfoterycyny B (opcjonalnie).
  5. Dodaj 50 ml FBS (inaktywowany termicznie, postępuj zgodnie z protokołem ATCC w celu inaktywacji ciepła; (https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/AnimCellCulture_Guide.ashx, strona 19)).

2. Hodowla komórek Calu-3

UWAGA: Komórki Calu-3 są hodowane w kolbach do hodowli komórkowych T75 lub T175 w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Komórki są pasażowane przy 60–80% zbiegu co 7 dni z odnawianiem CCM co 2–3 dni. CCM wylewa się, a świeży CCM (T25 = 5 ml, T75 = 15 ml i T175 = 25 ml) pipetuje się do kolby, a kolbę umieszcza się z powrotem w inkubatorze. Komórki powinny być pasażowane co najmniej 2 razy po rozmrożeniu, przed użyciem w eksperymentach lub przed zamrożeniem, a łącznie nie powinny być pasażowane więcej niż 25 razy.

  1. Sprawdź, czy kolba zlewa się w 60–80%, sprawdzając pod mikroskopem świetlnym.
  2. Odlać CCM z kolby.
  3. Umyj komórki 2x 5 ml 1x Zbilansowanego Roztworu Soli Hanksa (HBSS) bez wapnia i bez magnezu. Wyrzuć HBSS po każdym praniu. HBSS usuwa surowicę, która hamuje trypsynę.
  4. Dodać 3 ml trypsyny-EDTA dla T75 (4 ml dla T175) i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 10–15 minut. Sprawdź po 10 minutach, upewniając się, że komórki oderwały się od powierzchni kolby. W przypadku, gdy komórki są hodowane do zbiegu >80%, nie odłączą się przy użyciu trypsyny 0,05% i można użyć trypsyny 0,25%.
  5. Dodać 6 ml (tj. podwoić objętość trypsyny-EDTA pierwotnie dodaną) CCM do kolby i delikatnie kołysać kolbami, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie. Ma to na celu upewnienie się, że trypsyna została zneutralizowana przez FBS w CCM, a jej aktywność na komórkach została zatrzymana. Jeśli trypsyna pozostanie w kontakcie z komórkami zbyt długo, nie przyczepią się one ponownie po umieszczeniu w nowej kolbie do hodowli komórkowej.
  6. Wlać całą zawartość kolby do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
  7. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 130 x g, upewniając się, że wirówka jest prawidłowo zbalansowana.
  8. Przywrócić fiolkę zawierającą komórki z powrotem do warunków aseptycznych i delikatnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu. Supernatant można wylać, a pozostałą część odpipetować, upewniając się, że osad nie zostanie naruszony.
  9. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml CCM, pipetując w górę iw dół, aż wszystkie komórki zostaną zawieszone (tj. nie zaobserwuje się żadnych osadów ani aglomeratów komórkowych). Można dodać dodatkowy CCM w celu rozcieńczenia zawiesiny komórek.
  10. Policz komórki, zarówno martwe, jak i żywe, w 1 ml CCM za pomocą hemocytometru. Jeśli jest to konieczne do prawidłowego liczenia, rozcieńczyć komórki w 3 lub 4 ml.
  11. Zawiesić komórki w wymaganej objętości CCM i dodać zawiesinę komórek do każdej kolby. Aby osiągnąć około 80% konfluencji w ciągu tygodnia, zasiej 2 x 106 komórek w T75 lub 6 x 106 komórek w T175.
  12. Delikatnie kołysać kolbą, a następnie umieścić ją z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  13. Zastąp świeżym CCM co 2-3 dni i subkulturą, gdy komórki osiągną 60-80% zbieżności.

3. Wysiewanie komórek Calu-3 na wkładki hodowlane

UWAGA: Wkładki są dostępne z różnymi rozmiarami porów. Małe rozmiary porów (np. 0,4 μm) mają tę zaletę, że komórki łatwiej rosną i mogą osiągnąć dobrą barierę już po 5 dniach hodowli w warunkach zanurzonych, mierzonej za pomocą trans epithelial electric resistance (TEER). Jednak, gdy interesuje nas translokacja cząstek, pory te są zbyt małe i zatrzymują cząstki. Dlatego do badania cząstek zwykle wybiera się większe rozmiary porów (np. 3 μm). W przypadku stosowania większego rozmiaru porów, komórki potrzebują dłuższych okresów czasu (np. 7–10 dni hodowli w warunkach zanurzenia), aby osiągnąć dobry TEER.

  1. Przygotować zawiesinę komórek o znanym stężeniu, wykonując czynności 2.1–2.10.
  2. Rozcieńczyć komórki do stężenia 5 x 105 komórek/ml we wstępnie podgrzanym CCM dla wkładek 6-dołkowych lub 2,5 x 10 5 komórek/ml dla wkładek 12-dołkowych.
  3. Weź płytkę do hodowli komórkowej z wkładkami i umieść w warunkach aseptycznych.
  4. Napełnij stronę podstawno-boczną 2 ml wstępnie podgrzanego CCM dla wkładek 6-dołkowych lub 1 ml dla wkładek 12-dołkowych. Dodając pożywkę, wyjmij wkładkę za pomocą pęsety.
  5. Ostrożnie wymieszaj zawiesinę komórek, pipetując w górę i w dół. Pipeta 1,0 ml dla wkładek 6-dołkowych i 500 μL dla wkładek 12-dołkowych (co odpowiada 100 000 komórek/cm2) na górze błony we wstawce do hodowli komórkowej z porami 0,4 μm. W przypadku porów 3,0 μm zwiększ gęstość komórek do 128 000 komórek/cm2.
  6. Przykryć płytkę do hodowli komórkowej i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  7. Zmieniaj CCM co 2–3 dni.
  8. Pozwól komórkom zlać się przez 7 dni w warunkach zanurzonych przed kontynuowaniem hodowli w ALI.
  9. Zmierz TEER.
    1. Weź woltoomomierz nabłonkowy uzupełniony zestawem elektrod pałeczek i naładuj system akumulatora przez noc.
    2. Odłącz woltoomomierz od ładowarki i podłącz elektrodę pałeczki.
    3. Oczyść elektrodę 70% etanolem.
    4. Umieść elektrodę w CCM, umieszczając dłuższą elektrodę w zewnętrznym pożywce hodowlanej, aż dotknie dna naczynia i umieszczając krótszą elektrodę w pożywce bez dotykania membrany.
    5. Zacznij od pustej wkładki bez komórek. Poczekaj, aż pomiar się ustabilizuje i zapisz rezystancję w omach. Miarą tą jest rezystancja membrany wkładki bez żadnych komórek (tj. rezystancja ślepej próby).
    6. Powtórz pomiar dla każdej płytki i odejmij rezystancję ślepej próby, aby uzyskać rzeczywistą rezystancję.
    7. W celu analizy danych należy pomnożyć wartości rezystancji przez pole powierzchni wkładki przez Ω x cm2. W przypadku wkładu 6-dołkowego powierzchnia wynosi 4,67 cm2. Tak więc, jeśli mierzona jest rezystancja 600 omów, a tło wynosi 120 omów, rezystancja wynosi 480 omów, którą następnie mnoży się przez powierzchnię 4,67 cm2 , co daje w sumie 2 241,6 oma x cm2. Aby kontynuować, TEER powinien wynosić >1,000 Ω xcm2.
  10. Usuń CCM z wierzchołkowej strony wkładek.
  11. Dodać 2 ml wstępnie podgrzanego CCM na 6 dołków i 1 ml na 12 dołków do podstawno-bocznej strony dołka (tj. pod wkładką do hodowli komórkowej). CCM powinien dotykać membrany od dołu, ale nie przeciekać na górę wkładu.
  12. W tym momencie komórki są wierzchołkowo wystawione na działanie powietrza, co określa się jako hodowlę w ALI.
  13. Hodowla komórek w ALI w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 7 dni przed narażeniem.
  14. Zmieniaj podstawno-boczny CCM co 2–3 dni. Ogniwa mogą być używane w ALI przez 6 tygodni.

4. Przygotowanie ustawień ekspozycji

UWAGA: Sekcje 5-7 opisują przygotowania do ekspozycji na cząstki przy użyciu automatycznej stacji naświetlania (AES, patrz Tabela Materiałów). Konfiguracja do nebulizacji i charakterystyki cząstek jest również kompatybilna z innymi systemami naświetlania ALI innych producentów. Jako przykład narażenie na cząstki jest opisane poniżej. Takie systemy mogą być również używane do innych ekspozycji, takich jak czynniki uczulające, dym papierosowy i spaliny z silników Diesla. Rysunek 1 pokazuje AES i moduł ekspozycji. Rysunek 2 przedstawia schematyczne przedstawienie ustawień ekspozycji, w tym wszystkich innych instrumentów.

  1. Przed rozpoczęciem naświetlania za pomocą AES należy podłączyć system do kilku przyrządów w celu zmierzenia charakterystyki aerozolu; są one mierzone w strumieniu bocznym tuż przed wejściem aerozoli do szafy.
    UWAGA: Rozdzielacz przepływu służy do podłączenia strumienia bocznego do sprzętu do charakteryzacji ekspozycji. Ogólnie rzecz biorąc, stosuje się następujące urządzenia: skaner do pomiaru cząstek z ruchomością (SMPS), optyczny wymiarownik cząstek (OPS), licznik cząstek kondensacji (CPC), mikrowaga oscylacyjna z elementem stożkowym (TEOM). Pomiary SMPS i OPS są wykonywane 1x na godzinę i wykorzystują te same rurki z rozdzielacza przepływu. CPC i TEOM wykonują ciągłe pomiary, a dane z obu są rejestrowane w rejestratorze danych Squirrel model 2020. Ponadto grawimetryczne stężenie masowe określa się za pomocą mikrowagi w warunkach kontrolowanej wilgotności względnej (40–70%) i temperatury (21–23 °C). Filtry teflonowe są ważone przed i po każdej ekspozycji w celu potwierdzenia stężenia ekspozycji. Do wychwytywania spalin używany jest filtr HEPA. Konfiguracja, w tym zawiesiny z nanomateriałów (ENM) i nebulizator, jest umieszczona w komorze przepływowej, aby zapobiec narażeniu ludzi. AES może być używany do testowania wielu różnych typów ENM, w tym metali i tlenków metali.
  2. Przygotować zawiesinę nanomateriału na krótko przed ekspozycją. Zwykle 1% zawiesinę przygotowuje się jako roztwór podstawowy. Na przykład zawiesić 100 mg nanomateriału w 10 ml czystej wody.
    UWAGA: W przypadku ekspozycji na DQ12 stosuje się 300 mg, aby osiągnąć około 2 μg/cm2. Ilość ta może być stosowana w pojedynczej ekspozycji lub podzielona na powtarzające się ekspozycje (np. 300 mg jest zawieszone w 30 ml na pojedynczą ekspozycję lub 21,5 mg jest zawieszone w 2,15 ml świeżej dawki każdego dnia przez 3 tygodnie powtarzanej ekspozycji). Zawiesina jest świeżo przygotowywana w każdym dniu ekspozycji. Zawiesina cząstek jest sonikowana przez 16 minut za pomocą sonizacji sondy. Objętość 1% roztworu podstawowego dostosowuje się do całkowitej objętości 100 ml poprzez dodanie czystej wody.
  3. Zawiesinę ENM umieścić w małej butelce z nakrętką i mieszadłem magnetycznym, aby zapobiec osadzaniu się cząstek. Podłącz butelkę do pompy perystaltycznej za pomocą małej rurki i dostosuj przepływ do 25 ml/h.
  4. Podłącz pompę perystaltyczną do dyszy rozpylającej i dostosuj ustawienia, aby umożliwić ciągłą aerozolację.
  5. Dysza natryskowa jest zamontowana na aluminiowej rurze o długości 60 cm (komora mieszania o średnicy 15 cm, podgrzana do 60 °C). Zestaw jest podłączony do AES za pomocą miedzianej rurki o długości 1,5 metra (średnica 15 cm). Na szczycie AES impaktor usuwa wszystkie aerozole większe niż 2,5 μm.
  6. Podłączyć dyszę natryskową do sprężonego powietrza o ciśnieniu 3 barów za pomocą dwóch regulatorów przepływu masowego (MFC), aby umożliwić nebulizację zawiesin. Jeden przepływ 14 l/min jest używany do dyszy natryskowej, drugi MFC do mieszania powietrza w rurze.
  7. Dzień przed rozpoczęciem ekspozycji włącz AES, aby komora osiągnęła temperaturę 37 °C.
  8. Włącz przepływ powietrza i wilgotność w szafie na 2 godziny przed rozpoczęciem ekspozycji, aby osiągnąć 85% wilgotności. Włącz ogrzewanie komór ekspozycyjnych, w których zostaną umieszczone wkładki z komórkami.
  9. Włącz mikrowagę kwarcową (QCM) i ustaw wartość początkową na 0 za pomocą oprogramowania. Rozpocznij rejestrowanie. Co 10 s masa jest mierzona i wyrażana jako ng/cm2.
  10. Podgrzać pożywkę do hodowli komórkowych do temperatury 37 °C w łaźni wodnej (~20–30 min).

5. Przygotowanie komórek Calu-3 do ekspozycji

UWAGA: Do typowej ekspozycji ALI przy użyciu AES potrzeba 15–20 insertów z warstwą komórek konfluentnych. Składają się one z 3 kontrolnych oczyszczania powietrza, 3 elementów sterujących inkubatora, które będą obsługiwane podobnie jak inne wkładki bez ekspozycji w AES, 6–8 wkładek do ekspozycji aerozolowej (w zależności od zastosowania 0, 1 lub 2 mikrowag), 1–3 wkładek do pomiarów kontrolnych (takich jak maksymalne uwalnianie LDH) oraz 3 zapasowych wkładek na wypadek, gdyby TEER niektórych wkładów był niewystarczający. Komórki powinny mieć TEER >1,000 Ω xcm2, aby kontynuować.

  1. W pierwszym dniu ekspozycji umyj komórki 1x CCM, sprawdź morfologię komórek i zmierz TEER modelu komórkowego za pomocą woltoomomierza. Komórki powinny tworzyć szczelną monowarstwę bez przerw.
  2. Umieścić 2 ml/1 ml buforowanego HEPES CCM bez FCS na podstawno-bocznej stronie płytek 6-dołkowych/12-dołkowych i przenieść wkładki hodowlane z komórkami na nowe płytki.
    UWAGA: Podczas ekspozycji w AES nie ma CO2 . Dlatego podczas transportu i ekspozycji stosuje się buforowaną pożywkę hodowlaną HEPES (25 mM HEPES). Pożywka ta jest stosowana zarówno do naświetlonych komórek w AES, jak i do komórek kontrolnych inkubatora.
  3. W przypadku, gdy czas transportu kultur komórkowych do AES jest dłuższy niż 5 minut, na czas transportu umieścić komórki w przenośnym inkubatorze o temperaturze 37 °C.

6. Obsługa AES podczas ekspozycji

  1. W AES należy wypełnić moduły ekspozycji CCM buforowanym przez HEPES bez płodowej surowicy cielęcej (FCS). Ilość CCM zależy od użytej jednostki i rodzaju wkładu do hodowli komórkowej. Należy pamiętać, że aby utrzymać komórki w ALI, podłoże powinno dotrzeć do dna membrany, ale nie powinno przeciekać na wierzch membrany. W przypadku korzystania z wkładek z 6 studzienkami dodaj 6 ml CCM buforowanego przez HEPES do modułów ekspozycyjnych.
  2. Przenieś wkładki z komórkami z płytek do modułów naświetlających za pomocą sterylnej pęsety. Sprawdzić, czy po stronie podstawno-bocznej komórek nie ma pęcherzyków powietrza i usunąć wszelkie CCM po wierzchołkowej stronie wkładek. W przypadku, gdy po stronie podstawno-bocznej znajdują się pęcherzyki powietrza, delikatnie obróć wkładki za pomocą sterylnej pęsety, aż zostaną usunięte. Płytki zawierające CCM należy przechowywać w inkubatorze w celu przeniesienia po narażeniu.
  3. Użyj wyświetlacza dotykowego, aby wybrać czas ekspozycji, natężenie przepływu powietrza i wzmocnienie osadzania elektrostatycznego. Wyświetlacz może być również używany do sprawdzania wilgotności i temperatury. Zazwyczaj wybiera się czas ekspozycji 4 godziny, przy natężeniu przepływu 50 ml/min na wkładkach w temperaturze 37 °C i wilgotności 85%.
    UWAGA: Moduły pierwszego poziomu (Rysunek 1) służą do ekspozycji na czyste powietrze; Wkładki na tym poziomie służą jako regulatory ekspozycji na czyste powietrze. Pozostałe moduły na drugim i trzecim poziomie mogą być używane do ekspozycji na aerozole, w tym dwa moduły do mikrowag kwarcowych (QCM) do pomiaru osadzania w trybie online.
  4. Test szczelności należy przeprowadzić przed rozpoczęciem ekspozycji. Wyciek musi być mniejszy niż 5 ml/min. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na wyświetlaczu AES. Po zakończeniu testu szczelności można rozpocząć ekspozycję. W przypadku nieszczelności należy sprawdzić przewody.
  5. Pod koniec ekspozycji otwórz drzwiczki modułu AES, otwórz moduły ekspozycji, umieść wkładki do hodowli komórkowych z powrotem na płytkach do hodowli komórkowych i przenieś płytki do przenośnego inkubatora.
  6. Zebrać pożywkę z modułów (tj. odsłoniętych próbek) i z płytek (tj. kontrolnych inkubatorów) do późniejszej analizy, takiej jak pomiar dehydrogenazy mleczanowej (LDH).
  7. Po powrocie do laboratorium hodowli komórkowych przenieś wkładki do hodowli komórkowych na płytki wypełnione świeżym standardowym CCM. Umieścić płytki z kulturami komórkowymi w inkubatorze do czasu następnej ekspozycji lub do analizy.
  8. Po ostatnim dniu ekspozycji umieścić wkłady w inkubatorze do następnego dnia.
  9. Nazajutrz po ostatniej ekspozycji dodać CCM po stronie wierzchołkowej, aby zmierzyć TEER za pomocą woltoomomierza. Pobrać oddzielnie zarówno wierzchołkowy, jak i podstawno-boczny CCM w celu analizy cytokin.
  10. Usunąć cały CCM i przeprowadzić test żywotności komórek, dodając, na przykład, odczynnik proliferacyjny po stronie wierzchołkowej.

7. Czyszczenie AES

  1. Napełnij moduły ekspozycyjne wodą, odczekaj 1 minutę i usuń wodę. Następnie napełnij moduły 70% etanolem, pozostaw na 10 minut i usuń etanol. Trąbki ekspozycyjne należy również oczyścić 70% etanolem.
  2. Zatrzymaj kontrolę wilgotności na poziomie 85%, ale pozostaw temperaturę w komorze na poziomie 37 °C do następnego eksperymentu.

Wyniki

Niniejszy artykuł przedstawia metodę hodowli i eksponowania ludzkich komórek nabłonka oskrzeli w warunkach ALI, która naśladuje realistyczne warunki powtarzalnej ekspozycji wziewnej i może być wykorzystana w badaniach toksyczności. Charakterystyka zarówno modelu komórkowego, jak i systemu ekspozycji jest niezbędna do uzyskania realistycznego modelu ekspozycji wziewnej, który może być stosowany w przypadku wielokrotnych ekspozycji. Wyniki dotyczące tych parametrów przedstawiono poniżej.

Wymagania i wybór modelu komórkowego

Przy wyborze odpowiedniego modelu komórkowego należy wziąć pod uwagę następujące cechy:

  1. Model komórkowy powinien być zdolny do tworzenia konfluentnej monowarstwy z funkcjonującymi połączeniami ścisłymi, aby naśladować barierę płucną.
  2. Model komórkowy powinien wykazywać optymalne parametry podczas wielokrotnej ekspozycji na powietrze kondycjonowane (pod kątem temperatury i wilgotności).
  3. Model komórkowy powinien reagować na ekspozycję.

Badanie rozpoczęto od zastosowania czterech różnych linii ludzkich komórek nabłonka oskrzeli: 16HBE, Calu-3, H292 oraz BEAS-2B. Wszystkie one są powszechnie wykorzystywane do badań toksyczności nanomateriałów i substancji chemicznych. Z czterech linii komórkowych tylko komórki Calu-3 spełniły wszystkie powyższe wymagania. Komórki te utworzyły monowarstwę z połączeniami ścisłymi (Rysunek 3), która w pomiarach TEER pozostawała stabilną barierą w czasie, podczas gdy pozostałe linie komórkowe albo nie utworzyły bariery, albo wykazały spadek funkcji barierowej podczas hodowli w warunkach ALI (Rysunek 4). Ponadto linie H292 i BEAS-2B miały tendencję do przerastania w wiele warstw komórkowych przy dłuższym okresie hodowli. Tradycyjna hodowla komórek w zanurzeniu oraz hodowla ALI znacznie się od siebie różniły, ponieważ w warunkach ALI składniki odżywcze były dostępne jedynie od strony bazolateralnej, a komórki były narażone na suche warunki od strony apikalnej. Warunki te mogą powodować stres w modelach komórkowych, co można było zaobserwować poprzez pomiar żywotności komórek w czasie. Linie komórkowe 16HBE, H292 oraz BEAS-2B wykazały zwiększone uwalnianie LDH podczas hodowli w warunkach ALI, podczas gdy komórki Calu-3 wykazały jedynie niewielkie uwalnianie LDH (Rysunek 5).

Następnie przetestowano odpowiedź modelu Calu-3 na substancje. Jako substancję kontrolną dodatnią, drogą nebulizacji na stronę apikalną modelu, podano LPS. Dawka osadzona wyniosła 0,25 µg/cm2. Komórki Calu-3 wykazały reakcję na lipopolisacharyd (LPS) poprzez zwiększenie uwalniania LDH oraz czynnika martwicy nowotworów alfa (TNF-α) (Rycina 6).

Na koniec monowarstwa Calu-3 została poddana działaniu nanomateriałów z krzemionki kwarcowej (DQ12) (IOM, Edynburg). Krzemionka krystaliczna może indukować pylicę krzemową, a także powodować nowotwory płuc. W związku z tym Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem (IARC) zaklasyfikowała krzemionkę krystaliczną jako karcynogen grupy I dla ludzi20. Uważa się, że mechanizm działania krzemionki krystalicznej opiera się na indukcji uporczywego stanu zapalnego wywołanego przez jej reaktywną powierzchnię21,22,23. Kilka badań in vivo przeprowadzonych zarówno na szczurach, jak i myszach, donosi o indukcji stanu zapalnego oraz zmian histopatologicznych, w tym nowotworów i włóknienia, po ekspozycji inhalacyjnej na krzemionkę krystaliczną24,25,26,27,28,29. Wszystkie te efekty obserwuje się po powtarzanej ekspozycji i/lub długoterminowej obserwacji. Model Calu-3 został wykorzystany do zbadania, czy obserwacje z badań in vivo można odtworzyć w modelu in vitro, który mógłby być poddawany powtarzalnej ekspozycji na poziomie ALI.

Komórki Calu-3 eksponowano na DQ12 przez 3 kolejne tygodnie, 5 dni w tygodniu, przez 4 h dziennie. Dawkę osadzoną zmierzono przy użyciu QCM. Średnia dawka osadzona wynosiła 120 ng/cm2 na dobę, przy dawce skumulowanej wynoszącej 1,6 µg/cm2, co jest zbliżone do dawek wywołujących efekt in vivo. Pozostałe charakterystyki cząstek przedstawiono w Tabeli 1. Po 3 tygodniach ekspozycji DQ12 nie wywołało istotnych efektów w zakresie TEER, żywotności komórek oraz uwalniania białka chemooktorakcyjnego monocytów 1 (MCP-1) w porównaniu z kontrolą w czystym powietrzu (Rysunek 7). Ponieważ na podstawie danych in vivo spodziewano się większej toksyczności DQ12, reaktywność cząstek sprawdzono za pomocą testu bezkomórkowego zgodnie z protokołem zoptymalizowanym w ramach projektu UE GRACIOUS (dokument 5.3). Reaktywność partii DQ12 była niższa od oczekiwanej (Rysunek 8), o rzędy wielkości niższa w porównaniu z cząstkami kontroli pozytywnej — sadzą techniczną (CB). Ten brak reaktywności może wyjaśniać brak odpowiedzi toksycznej w modelu Calu-3.

System ekstrakcji do fazy stałej; układ chromatograficzny; schemat; chemia analityczna.
Rycina 1: Zautomatyzowana stacja ekspozycji (AES).
Rysunek po lewej przedstawia obudowę urządzenia z panelem dotykowym. AES posiada trzy poziomy z modułami ekspozycyjnymi: poziom górny do ekspozycji na czyste powietrze oraz poziomy środkowy i dolny do ekspozycji na aerozole. Rysunek po prawej przedstawia moduł ekspozycyjny, w którym umieszcza się wkłady z komórkami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat systemu Vitrocell do interfejsu powietrze-ciecz z pompą perystaltyczną, generowaniem aerozolu i filtracją HEPA.
Rysunek 2: Schematyczna reprezentacja układu ekspozycyjnego.
Od lewej do prawej: 1) zawiesina ENM połączona z dyszą rozpylającą za pomocą pompy perystaltycznej; 2) przy użyciu sprężonego powietrza dysza rozpylająca nebulizuje zawiesinę ENM, a poprzez komorę mieszania aerozole są kierowane do AES; 3) bezpośrednio przed wejściem do AES podłączone są instrumenty do charakteryzacji aerozolu: SMPS, OPS, CPC oraz TEOM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej hodowli komórkowej, przedstawiający błony komórkowe w kolorze zielonym do badań naukowych.
Rysunek 3: Reprezentatywny obraz komórek Calu-3 po 10 dniach hodowli na granicy powietrze-ciecz (ALI).
Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej komórek Calu-3 po 10 dniach hodowli na ALI. Białko połączeń ścisłych ZO-1 jest zabarwione na zielono, a jądra komórkowe na niebiesko. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres pomiaru TEER ludzkich komórek nabłonkowych oskrzeli, przedstawiający oporność w ciągu 25 dni w warunkach ALI.
Rycina 4: Transepithelialna oporność elektryczna (TEER) czterech różnych linii komórkowych podczas 21-dniowego okresu hodowli.
Wartości TEER dla linii 16HBE, Calu-3, H292 i BEAS-2B hodowanych przez 21 dni: pierwsze 7 dni w zanurzeniu, a następnie 14 dni w warunkach ALI. Wartości TEER zostały skorygowane o oporność tła insertu i pomnożone przez powierzchnię insertu. Symbole i słupki błędów przedstawiają wartość średnią oraz odchylenie standardowe dla sześciu insertów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy względnego uwalniania LDH (% całkowitego) w liniach komórkowych w czasie po wysianiu (7-21 dni).
Rysunek 5: Uwalnianie LDH przez cztery różne linie komórkowe podczas 21-dniowego okresu hodowli.
Uwalnianie LDH przez linie 16HBE, Calu-3, H292 oraz BEAS-2B hodowane przez 21 dni: 7 dni w warunkach zanurzenia, a następnie 14 dni w warunkach ALI. Przedstawione wartości LDH są określone względem maksymalnego uwalniania LDH dla każdego typu komórek. Symbole i słupki błędów reprezentują wartość średnią oraz odchylenie standardowe dla pięciu insertów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy słupkowe konwersji WST-1, LDH i uwalniania TNF-α po ekspozycji na LPS w wynikach badania komórkowego.
Rycina 6: Efekty komórkowe w komórkach Calu-3 poddanych działaniu LPS.
Komórki Calu-3 zostały poddane działaniu 0,25 µg/cm2 LPS za pomocą nebulizacji w chmurze. (A) Konwersja WST-1. (B) Uwalnianie LDH. (C) Uwalnianie TNF-α po ekspozycji na LPS. Symbole i słupki błędów reprezentują wartości średnie oraz odchylenia standardowe z trzech insertów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykresy słupkowe uwalniania TEER, LDH i MCP-1 po ekspozycji na DQ12; wyniki analizy toksyczności komórkowej.
Rysunek 7: Efekty komórkowe w komórkach Calu-3 eksponowanych na nanomateriały DQ12.
Komórki Calu-3 były eksponowane przez 3 tygodnie (4 h dziennie, 5 dni w tygodniu) na nanomateriały DQ12, w dawce około 120 ng/cm2 na dobę, przy skumulowanej dawce 1,6 µg/cm2. (A) Wartości TEER. (B) Uwalnianie LDH. (C) Uwalnianie MCP-1 po ekspozycji na DQ12. Wszystkie symbole i słupki błędu reprezentują wartości średnie i odchylenia standardowe dla trzech insertów w grupie kontrolnej oraz sześciu insertów w grupie eksponowanej na DQ12. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres reaktywności w funkcji stężenia; porównuje intensywności reaktywności DQ12 i sadzy.
Rycina 8: Reaktywność DQ12 w układzie bezkomórkowym.
DQ12 inkubowano z sondą 2ʹ,7ʹ-dichlorofluoresceiny diacetatem (DCFH-DA) w celu wykrycia reaktywności powierzchniowej. Jako kontrolę pozytywną zastosowano cząsteczki sadzy (CB). W porównaniu z CB, DQ12 wykazuje bardzo niską reaktywność powierzchniową. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Masa cząsteczek (µg/m3)Liczba cząstek (#/cm³)3)Mobilna wielkość cząstek (nm)Geometryczne odchylenie standardoweOptyczny rozmiar cząstek (µm)
2969 (418)83983 (10215)66.62.51.1 (1.3)

Tabela 1: Charakterystyka ekspozycji na DQ12. Wartości przedstawiono jako średnią z odchyleniem standardowym w nawiasach.

Dyskusja

W artykule opisano metodę hodowli ludzkich komórek nabłonka oskrzeli pod ALI i wystawienia tego modelu oskrzelowego na działanie aerozoli lub gazów. Zaletą stosowania komórek Calu-3 jest to, że tworzą one ścisłe połączenia, pozostają monowarstwą, są w stanie wytrzymać przepływ powietrza i mogą być hodowane przez tygodnie w ALI, w przeciwieństwie do wielu innych typów komórek (np. 16HBE, H292 i BEAS-2B). Zastosowanie zautomatyzowanej stacji naświetlania (AES) VITROCELL® ma tę zaletę, że ogniwa mogą być naświetlane w realistycznych i odpowiednich warunkach, ponieważ niskie stężenia mogą być stosowane przy ciągłym przepływie powietrza.

Systemy ciągłego przepływu, takie jak AES, mają zalety w porównaniu z systemami chmurowymi 3,32, które wykorzystują pojedynczą nebulizację zawiesiny. Ciągły przepływ jest bardziej realistyczny, a wiele zmiennych, takich jak natężenie przepływu, wilgotność i temperatura, jest kontrolowanych. Ponadto osadzanie można usprawnić za pomocą pola elektrycznego. Na koniec cechy aerozolu, takie jak rozmiar, liczba, stężenie i masa, są monitorowane online. Wadą jest to, że systemy ciągłego przepływu są bardziej złożone w porównaniu z systemami w chmurze. Dlatego ważne jest, aby przeprowadzić eksperymenty przygotowawcze, które koncentrują się na charakterystyce cząstek aerozolu i dostarczonej dawce na wkładce. Początkowe stężenie początkowe cząstek i ustawienia AES można następnie dostosować, aby osiągnąć pożądaną dawkę na komórkach33. W zależności od rodzaju badanych cząstek, metoda wytwarzania aerozoli może się różnić. Zastosowanie osadzania elektrostatycznego zależy od rodzaju cząstek i najlepiej sprawdza się w przypadku cząstek metalicznych. W przypadku cząstek o dodatnim ładunku powierzchniowym należy zastosować ujemne pole elektrostatyczne i odwrotnie.

Wybór stężeń narażenia może być trudny w przypadku każdego eksperymentu z ekspozycją na powietrze-ciecz. W przypadku ekspozycji na DQ12 celem było osiągnięcie całkowitej skumulowanej dawki 1 μg/cm2 po 3 tygodniach ekspozycji, 5 dni w tygodniu, 4 godziny na dobę. Dawka ta jest podobna do dawek, które wywołały efekt in vivo 21,25,27,32,33. Podczas wykonywania ekspozycji wystąpiły pewne różnice między różnymi dniami ekspozycji. Chociaż rzeczywista zdeponowana dawka wynosząca 1,6 μg/cm2 jest wyższa niż 1 μg/cm2, do której dążono, dawka mogła być zbyt niska, aby zaobserwować efekty w modelu Calu-3. Zaobserwowano jedynie niewielkie różnice w TEER, żywotności i odpowiedzi na cytokiny między ekspozycją na czyste powietrze a ekspozycją na DQ12 i różnice te nie były statystycznie istotne. Wyjaśnieniem obserwacji, że ekspozycja na DQ12 przez 3 tygodnie nie wywołała znaczących efektów w komórkach Calu-3, jest to, że w modelu Calu-3 brakowało makrofagów. Możliwe, że po wychwycie DQ12 makrofagi wytwarzają cytokiny prozapalne, które mogą wpływać na komórki Calu-3. Innym wyjaśnieniem jest to, że partia DQ12, która została użyta do eksperymentów, nie była tak reaktywna, jak oczekiwano. W przypadku stosowania LPS jako substancji kontroli pozytywnej, Calu-3 wykazuje odpowiedź, mierzoną wzrostem uwalniania LDH i wzrostem uwalniania TNF-α. Oznacza to, że model może wykryć toksyczność.

Model komórkowy Calu-3 ma wiele zalet, które omówiono w sekcji wyników. Co więcej, przy hodowli przez dłuższy czas w ALI, komórki Calu-3 mogą hodować rzęski/struktury podobne do rzęsek13 i wytwarzać śluz 11,12,13. Pomimo tych zalet model ma ograniczenia w odniesieniu do jego fizjologicznego znaczenia. Linie komórkowe Calu-3 pochodzą z gruczolakoraka, podczas gdy 16HBE i BEAS-2B pochodzą ze zdrowej tkanki. Niestety, te dwie ostatnie nie nadają się do wielokrotnej ekspozycji ALI, ponieważ nie pozostają stabilną monowarstwą w czasie. Innym ograniczeniem modelu Calu-3 jest to, że reprezentuje on tylko pojedynczy typ komórki. W ludzkim płucu występuje wiele typów komórek, które oddziałują na siebie i różnie reagują na ekspozycję. Wdychane cząstki osadzają się w różnych obszarach płuc w zależności od ich wielkości aerodynamicznej. W tym miejscu cząsteczki stykają się z barierą komórkową nabłonka, jak to jest naśladowane przez model Calu-3. W ludzkim płucu makrofagi pęcherzykowe są przyciągane do cząstek, pochłaniają je i usuwają z płuc. Makrofagi odgrywają również istotną rolę w odpowiedzi zapalnej na ekspozycję na cząstki. W związku z tym podejmowane są wysiłki w celu rozszerzenia modelu Calu-3 poprzez dodanie pierwotnych makrofagów, aby dokładniej naśladować barierę płucną. Wadą makrofagów jest to, że pozostają żywotne tylko przez około 7 dni, gdy są hodowane na komórkach Calu-3 w ALI. W związku z tym makrofagi powinny być dodawane co tydzień, aby przekształcić obecny model Calu-3 w model kokultury. Obecnie trwa optymalizacja protokołu coculture.

Biorąc pod uwagę powyższe, model oskrzelowy Calu-3 jest odpowiednim modelem do wielokrotnego narażenia na aerozole substancji częściowo rozpuszczalnych, takich jak substancje chemiczne z dymu papierosowego i LPS. Te rozpuszczalne substancje indukują znaczny wzrost odpowiedzi cytokin w komórkach Calu-3. Do badania nierozpuszczalnych cząstek, takich jak spaliny z silników Diesla i DQ12, potrzebny jest model kokultury, ponieważ makrofagi odgrywają kluczową rolę w wywoływaniu efektów przez ekspozycję na cząstki.

Do opisanych ekspozycji zastosowano membrany wtykowe z porami 3,0 μm. Głównym powodem wyboru tego typu wkładki jest możliwość przetestowania translokacji nanomateriałów. W przypadku stosowania porów o mniejszym rozmiarze 0,4 μm aglomeraty cząstek nie będą w stanie przejść przez membranę wkładu. Wadą stosowania dużego rozmiaru porów jest to, że komórki potrzebują więcej czasu, aby się zlewać i że trudniej jest zobrazować morfologię komórek za pomocą mikroskopii świetlnej. Aby sprawdzić, czy komórki tworzą zlewającą się monowarstwę, TEER powinien wynosić >1,000 Ω xcm2 przed rozpoczęciem ekspozycji.

Podsumowując, przedstawiony tutaj model oskrzelowy Calu-3 nadaje się do stosowania w przypadku powtarzającej się ekspozycji na aerozole, co najmniej do 3 tygodni. Model jest odporny na hodowlę i ekspozycję poprzez ciągły przepływ powietrza i jest w stanie wykryć toksyczność dla nabłonka oskrzeli.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest finansowana przez EU-projekt PATROLS (Physiologically Anchored Tools for Realistic nanomaterial hazard aSsessment) oraz holenderskie Ministerstwo Zdrowia, Opieki Społecznej i Sportu (projekt V/050012). Chcielibyśmy podziękować dr Yvonne Staal i dr Janowi van Benthemowi za krytyczną recenzję manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,01 M NaOHSigma AldrichS5881
0,1 M (x10) PBSGibco14200-059
Dioctan 2',7'-dichlorodihydrofluorezyny (DCFH2-DA)Sigma AldrichD6883
Chlorowodorek 3-morfolinosydnoniminy (chlorowodorek SIN-1)Abcamab141525
Amfoterycyna BThermo Fisher Scientific Inc.15290
Zautomatyzowana stacja naświetlaniaVitrocell
Odczynnik do proliferacji komórek WST-1Wirówka Roche
Eppendorf
CPCTSI inc., St Paul MN, USA3022
Zestaw do wykrywania cytotoksyczności LDHRoche11644793001
DQ12IOMnanomateriały
ELISA Ready-SET-GoFischer Scientific88-8086-86, 88-7399-88
EVOM2World Precision Instruments Inc., FL, Stany ZjednoczoneEVOM2-STX2
FBSGreiner bio-one758093
Rozdzielacz przepływuTSI inc., St Paul MN, USAmodel 3708
Dioctan fluoresceiny (F-DA)Sigma AldrichF7378
HBSSThermo Fisher Scientific Inc.14175
Mikroskop świetlnyOlympusCKX41
Kontrolery przepływu masowegoMFC, Bronkhorst, Holandia
Metanol (klasa analityczna)Sigma Aldrich34860
MikrowagaSartorius, Getynga, NiemcyME-5
Minimalna niezbędna pożywka (MEM) + GlutaMAXThermo Fisher Scientific Inc. 41090
NEAAThermo Fisher Scientific Inc.11140
OPSTSI inc., St Paul MN, Stany Zjednoczone3339
Pen/StrepThermo Fisher Scientific Inc.15140
czerwieni fenolowej MEMGibco10500-064
Czysta wodaMerckMilliQ
SMPSTSI inc., St Paul MN, USA3936
Dysza natryskowaSchlick, Coburg, Niemcy
Filtry teflonowePallR2PJ46
TEOMRupprecht & Patashnick NY, USAseria 1400
Kolba do hodowli tkankowychThermo Fisher Scientific Inc.690175, 658175, 660175
Wkładki TranswellCorning3460, 3462
Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific Inc.25300
Tryptan NiebieskiSigma AldrichT8154
11644807001 Bez

Bibliografia

  1. Geiser, M., Jeannet, N., Fierz, M., Burtscher, H. Evaluating Adverse Effects of Inhaled Nanoparticles by Realistic In Vitro Technology. Nanomaterials (Basel). 7 (2), 49(2017).
  2. Herzog, F., et al. Mimicking exposures to acute and lifetime concentrations of inhaled silver nanoparticles by two different in vitro approaches. The Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1357-1370 (2014).
  3. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32(2009).
  4. Paur, H. R., et al. In-vitro cell exposure studies for the assessment of nanoparticle toxicity in the lung-A dialog between aerosol science and biology. Journal of Aerosol Science. 42 (10), 668-692 (2011).
  5. Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In Vitro Models for Respiratory Toxicology Research: Consensus Workshop and Recommendations. Applied in vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).
  6. Loret, T., et al. Air-liquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions. Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 58(2016).
  7. Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses. Critical Care Research and Practice. 2010, (2010).
  8. Braakhuis, H. M., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives in Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
  9. Ren, H., Birch, N. P., Suresh, V. An Optimised Human Cell Culture Model for Alveolar Epithelial Transport. PLoS One. 11 (10), 0165225(2016).
  10. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  11. Papazian, D., Wurtzen, P. A., Hansen, S. W. Polarized Airway Epithelial Models for Immunological Co-Culture Studies. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (1), 1-21 (2016).
  12. Jeong, M. H., et al. In vitro model for predicting acute inhalation toxicity by using a Calu-3 epithelium cytotoxicity assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 98, 106576(2019).
  13. Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmacology Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).
  14. Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection. Journal of Virological Methods. 174 (1-2), 144-149 (2011).
  15. Vitrocell. Vitrocell® Automated Exposure Station. , Available from: https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/automated-exposure-station1 (2019).
  16. Mülhopt, S., et al. Toxicity testing of combustion aerosols at the air-liquid interface with a self-contained and easy-to-use exposure system. Journal of Aerosol Science. 96, 38-55 (2016).
  17. Vitrocell. VITROCELL® Cloud for the exposure to liquid aerosols. , Available from: https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/vitrocell-cloud-system (2019).
  18. Endes, C., et al. An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), 40(2014).
  19. Lenz, A. G., et al. Efficient bioactive delivery of aerosolized drugs to human pulmonary epithelial cells cultured in air-liquid interface conditions. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (4), 526-535 (2014).
  20. Borm, P. J., Tran, L., Donaldson, K. The carcinogenic action of crystalline silica: a review of the evidence supporting secondary inflammation-driven genotoxicity as a principal mechanism. Critical Reviews in Toxicology. 41 (9), 756-770 (2011).
  21. Borm, P. J. A., Fowler, P., Kirkland, D. An updated review of the genotoxicity of respirable crystalline silica. Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 23(2018).
  22. Kawasaki, H. A mechanistic review of silica-induced inhalation toxicity. Inhalation Toxicology. 27 (8), 363-377 (2015).
  23. Sayes, C. M., et al. Changing the dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles. Inhalation Toxicology. 22 (4), 348-354 (2010).
  24. Driscoll, K. E., et al. Pulmonary response to inhaled silica or titanium dioxide. Toxicology and Applied Pharmacology. 111 (2), 201-210 (1991).
  25. Muhle, H., Kittel, B., Ernst, H., Mohr, U., Mermelstein, R. Neoplastic lung lesions in rat after chronic exposure to crystalline silica. Scandinavian Journal of Work, Environment and Health. 21, Suppl 2 27-29 (1995).
  26. Peeters, P. M., et al. Silica-induced NLRP3 inflammasome activation in vitro and in rat lungs. Particle and Fibre Toxicology. 11, 58(2014).
  27. Reuzel, P. G., Bruijntjes, J. P., Feron, V. J., Woutersen, R. A. Subchronic inhalation toxicity of amorphous silicas and quartz dust in rats. Food and Chemical Toxicology. 29 (5), 341-354 (1991).
  28. Arts, J. H., Muijser, H., Duistermaat, E., Junker, K., Kuper, C. F. Five-day inhalation toxicity study of three types of synthetic amorphous silicas in Wistar rats and post-exposure evaluations for up to 3 months. Food and Chemical Toxicology. 45 (10), 1856-1867 (2007).
  29. Cho, W. S., et al. Inflammatory mediators induced by intratracheal instillation of ultrafine amorphous silica particles. Toxicology Letters. 175 (1-3), 24-33 (2007).
  30. Herzog, F., et al. Exposure of silver-nanoparticles and silver-ions to lung cells in vitro at the air-liquid interface. Particle and Fibre Toxicology. 10 (1), 11(2013).
  31. Mülhopt, S., Diabate, S., Krebs, T., Weiss, C., Paur, H. R. Lung toxicity determination by in vitro exposure at the air liquid interface with an integrated online dose measurement. Journal of Physics: Conference Series. 170, 012008(2009).
  32. van Ravenzwaay, B., et al. Comparing fate and effects of three particles of different surface properties: nano-TiO(2), pigmentary TiO(2) and quartz. Toxicology Letters. 186 (2), 152-159 (2009).
  33. Henderson, R. F., et al. A comparison of the inflammatory response of the lung to inhaled versus instilled particles in F344 rats. Fundamental and Applied Toxicology. 24 (2), 183-197 (1995).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspozycja na cz stki przenoszone powietrzemhodowla kom rek Calu 3transepithelialna rezystancja elektrycznasystem przep ywu ci g egozawiesina nanocz stekpompa perystaltycznazautomatyzowana stacja ekspozycyjnatworzenie po cze cis ych
Model nabłonka oskrzeli na granicy faz powietrze-ciecz do realistycznego, powtarzającego się narażenia inhalacyjnego na cząstki unoszące się w powietrzu do testów toksyczności
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.