Opisana to oszczędzająca czas i miejsce metoda liczenia jaj i określania szybkości wylęgu poszczególnych komarów za pomocą 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych, co może znacznie zwiększyć skalę i szybkość testów płodności i płodności.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ulepszony test płodności i płodności dla Aedes aegypti przy użyciu 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych (płytki EAgaL)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komary stanowią poważny problem zdrowia publicznego jako wektory różnych patogenów. W przypadku tych badań, które wymagają oceny parametrów przystosowania komarów, w szczególności produkcji jaj i wskaźników wylęgu na poziomie indywidualnym, konwencjonalne metody stanowią znaczne obciążenie dla badaczy ze względu na wysoką pracochłonność i wymagania dotyczące przestrzeni laboratoryjnej. Opisana jest prosta metoda wykorzystująca 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej z agarozą w każdym dołku i cyfrowym obrazowaniem każdej studzienki w celu określenia liczby jaj i wskaźników wylęgu na indywidualnym poziomie przy znacznie zmniejszonych wymaganiach czasowych i przestrzennych.
Wprowadzenie
Kontrola komarów w celu ochrony ludzi przed patogenami przenoszonymi przez wektory jest ważnym celem zdrowia publicznego, głównie ze względu na brak skutecznych szczepionek dla większości patogenów przenoszonych przez komary. Wiele badań ma na celu zmniejszenie sprawności komarów w połączeniu ze strategią redukcji populacji stosowaną w terenie1,2,3. Obejmuje to szeroko zakrojone badania mające na celu stworzenie transgenicznych komarów i/lub linii nokautujących CRISPR/Cas9. Takie podejścia do modyfikacji populacji wymagają szczegółowej oceny indywidualnych parametrów sprawności4. Konwencjonalne techniki laboratoryjne do oceny przydatności samic komarów obejmują indywidualne przechowywanie pokrytych, karmionych krwią samic komarów w pojemnikach o pojemności 100 ml5, zmodyfikowane probówki stożkowe o pojemności 50 ml lub probówki do hodowli Drosophila zmodyfikowane przez zapewnienie wilgotnych powierzchni przy użyciu wilgotnej bawełny i krążków z bibuły filtracyjnej do składania jaj (tj. bibułki jaj)1,2,6,7. Takie metody wymagają stosunkowo dużej przestrzeni (np. 30 cm x 30 cm x 10 cm: szer. x dł. x wys. dla maksymalnie 100 probówek Drosophila) (Rysunek 1), oraz manipulowania pojedynczymi bibułkami jaj do liczenia jaj i larw wylęgowych, co może być pracochłonne. W tym manuskrypcie przedstawiono metodę liczenia jaj komarów i określania szybkości wylęgu przy użyciu 24-dołkowych płytek i agarozy jako powierzchni do składania jaj w celu obejścia tych problemów8.
Równocześnie, Ioshino et al.9 opisali szczegółową metodę wykorzystującą płytki 12- i 24-dołkowe do liczenia jaj uzyskanych od poszczególnych samic. Ich protokół stanowił znaczną poprawę w stosunku do konwencjonalnych metod w zakresie oszczędności czasu i miejsca9. Jednak opisany przez nich protokół nadal wykorzystuje mokrą bibułę filtracyjną jako powierzchnię do składania jaj, co wymaga rozłożenia każdego pojedynczego papieru w celu uzyskania liczby, ponieważ jaja często znajdują się pod spodem lub w fałdach. Ich protokół nie obejmował również wykorzystania technologii obrazowania ani metody liczenia larw.
Prezentowana jest ulepszona metoda przeprowadzania testów dopasowania do liczby jaj (tj. płodności) i szybkości wylęgu (tj. płodności) przy użyciu agarozy jako powierzchni do składania jaj w formacie 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej dla Ae. aegypti, które składają jaja na wilgotnych powierzchniach. Tabliczki te nazywano płytkami "EAgaL", od Egg, Agarose, oraz Larva. Te 24-dołkowe płytki zapewniają poszczególnym komarom minimalną powierzchnię do składania jaj, upraszczając w ten sposób i drastycznie skracając czas i wysiłek potrzebny do liczenia i utrzymywania jaj i wyklutych larw przez kilka dni. Płytka EAgaL wykorzystuje półprzezroczystą agarozę do powierzchni składania jaj, co eliminuje potrzebę obchodzenia się z papierami jajowymi oraz znajdowania jaj i larw po wykluciu; Fotografowanie każdego dołka pozwala na długoterminową archiwizację wyników i oddziela proces liczenia zarówno pod względem czasu, jak i przestrzeni od procesu hodowli/obróbki, w którym czas jest często ograniczony.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie talerza
- Wywierć otwory w 24-dołkowych pokrywach płytek do hodowli tkankowych (4−6 otworów na studzienkę) za pomocą wiertarki domowej z wiertłem ~1,6 mm (1/16 cala) (Rysunek 2).
UWAGA: Otwory te zapobiegają gromadzeniu się kondensacji wody z agarozy na pokrywie, gdzie komary mogą składać jaja. Standardowy rozmiar samicy Ae. aegypti (szczep "Liverpool") wynosi ~3,11 mm rozpiętości skrzydeł. Zmniejszenie rozmiaru otworów jest zalecane w przypadku stosowania mniejszych komarów, aby uniknąć ucieczki z płytki. - W dniu poprzedzającym eksperyment z składaniem jaj umyj i dokładnie opłucz płytki, a następnie namocz je w 1−5% wybielaczu przez 30−60 min w temperaturze pokojowej. Dokładnie spłucz je pod bieżącą wodą dejonizowaną i wysusz.
UWAGA: Proces ten zmniejsza ryzyko rozwoju grzybów i bakterii na agarozie. - Rozpuść agarozę w stężeniu 2% w wodzie dejonizowanej i natychmiast dodaj 500 μl stopionej agarozy do każdej studzienki z 24 dołków za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl (Rysunek 3A,B). Gdy agaroza zacznie się ochładzać i zatykać końcówkę pipety, podgrzej ją ponownie i użyj nowej końcówki do pipety.
UWAGA: Unikaj dotykania ścianek studzienki końcówką pipety, ponieważ może to pozostawić kawałek agarozy na ścianie, w której samica może złożyć jaja, komplikując proces obrazowania i liczenia. - Przed użyciem należy wysuszyć kondensację pary wodnej na ściankach studzienki przez noc na stole laboratoryjnym ( Rysunek 3C, D).
UWAGA: Oś czasu testu EAgaL od podania krwi do obrazowania larw jest przedstawiona na Rycina 4, która dotyczy komarów kolonijnych (Ae. aegypti "Liverpool" hodowanych w świetle 14 godzin: 10 godzin ciemnego cyklu światła, 27 °C, 80% wilgotności względnej, 500 larw w tacy o wymiarach 49,5 cm x 29,2 cm x 9,5 cm z 2 litrami wody), w warunkach owadobójczych. Zaleca się, aby każde laboratorium przeprowadziło test na płytce EAgaL z używanymi komarami, zwłaszcza w przypadku stosowania różnych szczepów, różnych gatunków komarów, a także różnych protokołów hodowli.
2. Karmienie komarów
UWAGA: Niezwykle ważne jest używanie komarów hodowanych w jednolitych warunkach dla wszystkich grup badanych i kontrolnych, ponieważ odżywianie larw ma wpływ na parametry kondycjonalizacji komarów10,11. Larwy z tyłu w warunkach niezatłoczonych z wystarczającą ilością pokarmu. Pozwól samicom komarów zbliżyć się w obecności samców, aby zapewnić krycie i dojrzewać przez co najmniej 3 dni.
- Usuń wszelkie źródło wody i/lub cukru z samic komarów co najmniej 16 godzin przed karmieniem krwią, aby zwiększyć odżywianie krwią.
- Podgrzej cyrkulator wody do sztucznego karmienia w temperaturze 37 °C i karm samice komarów krwią kręgowców umieszczoną w sztucznych karmnikach przez 15−30 minut (Rysunek 5A).
- Znieczulij komary CO2 lub na lodzie, przenieś je do szklanego naczynia na lodzie i wybierz te, które są nabrzmiałe krwią (Ryc. 5B) do pojemnika zaopatrzonego w 30% sacharozę na ponad 72 godziny, kiedy samice zakończą wydalanie i rozwój jaj.
UWAGA: Jeśli samice są zaopatrzone w wodę z sacharozą o niższym stężeniu, po 48 godzinach usuń wodę z sacharozy i wszelkie mokre powierzchnie, aby zapobiec składaniu jaj przez samice.
3. Składanie jaj
- Około 1 godzinę przed przeniesieniem komarów na płytki dodaj 2-3 krople (~80-120 μL) wody do każdej płytki za pomocą pipety transferowej.
- Co najmniej 72 godziny po karmieniu krwią powal komary CO2 lub na lodzie, przenieś je do szklanego naczynia na lodzie i indywidualnie umieść każdego komara na odwróconej pokrywie 24-dołkowej płytki na lodzie (Rysunek 6A).
UWAGA: Ta procedura została zastosowana przez Ioshino et al.9. - Po umieszczeniu wszystkich 24 komarów przykryj pokrywę odwróconym dnem płytki (Rysunek 6B), zabezpiecz pokrywę i płytkę nową, nową gumką i umieść w komorze środowiskowej (lub pomieszczeniu hodowlanym) (Rysunek 6C), aż komary wyzdrowieją (~10−15 min) i obróć płytkę prawą stroną do góry (Rysunek 6D).
- Pozwól samicom komarów złożyć jaja przez 24−48 godzin i usuń samice, uwalniając je z płytek do dużej klatki.
UWAGA: Jeśli ważne jest, aby śledzić poszczególne samice, znieczul je, schładzając płytki i usuwaj je pojedynczo na lodzie. Opóźnione składanie jaj i ciemne wydzieliny, które zakłócają liczenie jaj, zaobserwowano, gdy samice zostały przeniesione na płytki przed 72 godzinami po posiłku z krwi (PBM) (Ryc. 7D).
4. Liczenie jaj
- Należy sprawdzić każdą studzienkę na płytce 24-dołkowej, ponieważ czasami komary składają jaja na ścianach studzienek i na brzegu powierzchni agarozy/tworzywa sztucznego, gdzie są trudne do rozpoznania na zdjęciach. Za pomocą mokrego pędzla przesuń jaja ułożone na ścianie i krawędzi agarozy na płaską powierzchnię agarozy tak, aby wszystkie jaja znajdowały się w jednolitej płaszczyźnie i nie zachodziły na siebie.
UWAGA: Krawędź agarozy zwykle znajduje się poza płaszczyzną ogniskowej aparatu ze względu na napięcie powierzchniowe roztworu agarozy. - Za pomocą kleszczy usuń wszelkie złamane nogi, skrzydła i inne cząstki w studzienkach, które mogą zakłócać obrazowanie jaj (Rysunek 7C).
- Włóż biały papier pod płytkę, aby zwiększyć kontrast z ciemnymi jajami komarów przed obrazowaniem za pomocą oświetlacza stereomikroskopowego (Ryc. 7A).
- Wykonaj zdjęcie każdej studzienki za pomocą kompaktowej kamery cyfrowej w trybie mikroskopu, który pozwala użytkownikowi ustawić ostrość na obiektach znajdujących się w odległości do 1 cm. Ta funkcja pozwala na umieszczenie kamery bezpośrednio na płycie w celu obrazowania jaj bez statywu lub stojaka (Rysunek 7A). Aby rozróżnić pojedyncze jaja złożone w kępach, użyj trybu drobnego lub bardzo drobnego, aby uchwycić obrazy w wysokiej rozdzielczości, aby można było zobaczyć szczegóły z bliska.
UWAGA: Przed użyciem wyczyść kartę pamięci aparatu, aby zapobiec pomyleniu nowych i starych obrazów. - Po sfotografowaniu każdego dołka płytki, zrób zdjęcie całej płytki z etykietą kolejności obrazowania, aby później odróżnić każdą płytkę (Rysunek 7E).
- Dodaj cienką warstwę ~5 kropli wody (~200 μL) za pomocą pipety transferowej do każdej studzienki, aby zapobiec wysuszeniu czopu agarozowego i jaj oraz wywołać rozwój i wykluwanie się zarodka. Zwracaj uwagę na poziom wody przez pierwsze kilka godzin i sprawdzaj codziennie, ponieważ może dojść do utraty wody w wyniku wchłaniania przez agarozę lub parowania. Dodać wodę, gdy jej poziom jest zbyt niski, aby larwy mogły się wykluć.
UWAGA: Parowanie wody zachodzi nierównomiernie zarówno w obrębie płytki, jak i w stosie płytek. Zaobserwowano, że suszenie odbywa się w następującej kolejności: 1) studnie narożne (A1, A6, D1, D6) schną najszybciej; po którym następują 2) studzienki na zewnętrznej krawędzi płytki (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); i ostatnie 3) studnie w środku. Gdy talerze są układane w stosy, górna płyta wysycha najszybciej. - Przenieś obrazy do komputera za pomocą ImageJ (Fidżi) i zmień nazwy plików w celu łatwiejszej organizacji, na przykład "[identyfikator płyty]_[identyfikator studni].jpg" (Rysunek 8A,B).
- Utwórz plik arkusza kalkulacyjnego, aby zapisać liczbę jaj (tj. płodność) i liczbę larw oraz obliczyć wskaźnik wylęgu (tj. płodność) (Rysunek 9E).
- Otwórz obrazy za pomocą ImageJ (Fiji)12 i użyj narzędzia "multi-point", aby oznaczyć każde jajko (Rysunek 9A−C); powiększ lub pomniejsz za pomocą "+" lub "–", aby policzyć jaja w kępy. Po zaznaczeniu wszystkich jaj kliknij dwukrotnie ikonę wielopunktową, aby wyświetlić liczbę znaków (Rysunek 9D). Zapisz wyniki w arkuszu kalkulacyjnym.
5. Ocena płodności
UWAGA: Za 2 dni, pierwsze larwy w stadium rozwojowym mogą zacząć zamykać się w studzienkach. Odczekaj jeszcze 3-5 dni przed obrazowaniem/liczeniem, aby upewnić się, że wykluwają się wszystkie zdolne do życia jaja.
- Przygotuj pokarm dla larw, mieszając 1/16 łyżki stołowej (~168 mg) zmielonego pokarmu dla ryb (tj. normalnej diety larw komarów) w 20 ml wody i czekając, aż duże cząstki stałe osiądą (Rysunek 10A−D). Zacznij dodawać pokarm (supernatant) do studzienek, w których wykluły się larwy, gdy tylko się pojawią, ponieważ nie przetrwają one długo bez jedzenia.
UWAGA: Nadmierne dodanie cząstek pokarmu może zakłócać obrazowanie i liczenie wyklutych larw. - Około 5–8 dni po dodaniu wody do studzienek schłodzić płytkę, przykrywając pokruszonym lodem przez 15-20 minut w celu znieczulenia larw.
- Zrób zdjęcia każdej studzienki, trzymając talerze na lodzie, tak jak to miało miejsce w przypadku jaj. W przypadku obrazów larwalnych należy zapewnić ciemne tło, umieszczając materiał pod płytką, aby zwiększyć kontrast. Po sfotografowaniu każdej studzienki na płytce zrób zdjęcie całej płytki z etykietą kolejności obrazowania, aby później odróżnić każdą płytkę.
UWAGA: Obrazy są wykonywane, gdy płytki znajdują się na lodzie, ponieważ ruch larw może zagrozić liczeniu. Talerze są wielokrotnego użytku; Zamroź i usuń komary i agarozę, aby oczyścić je do następnego użycia. Płytka EAgaL nie nadaje się do hodowli larw do zaawansowanych stadiów. - Otwórz obrazy za pomocą ImageJ (Fidżi) i użyj narzędzia "wielopunktowego", aby policzyć, klikając każdą larwę. W okresie 3-5 dni niektóre larwy mogły się wylinić, zwłaszcza w studniach o małej liczbie larw. Dlatego przy liczeniu należy wykluczyć zrzucone skórki (tj. wysięki), które wyglądają jak larwy tylko na głowie z odrobiną ciała, lub skurczone larwy (Ryc. 10E). Zapisz wyniki w arkuszu kalkulacyjnym.
6. Wykonaj analizę
- Po zebraniu wszystkich niezbędnych danych do analizy płodności i płodności wykonaj odpowiednią analizę statystyczną i stwórz wykresy za pomocą preferowanego oprogramowania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Komary wstrzyknięto dsRNA ukierunkowanym na kandydata na transporter żelaza (FeT) lub gen kontrolny (EGFP), podano im krew, a następnie zmierzono płodność i liczbę potomstwa z wykorzystaniem metody płytek EAgaL, zgodnie z opisaną powyżej procedurą.
Komary, u których wyciszono ekspresję FeT po wstrzyknięciu dsRNA, wykazały znaczną redukcję zarówno liczby jaj, jak i wskaźnika wylęgu (Rycina 11A−C). Wszystkie komary z grupy kontrolnej i badawczej umi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Płytka EAgaL drastycznie zmniejsza nakład pracy, czas i miejsce do przeprowadzania indywidualnych testów płodności i płodności w Aedes aegypti w porównaniu z metodą FT. Wstępne porównanie metody FT z płytką EAgaL zaowocowało skróceniem czasu dla wszystkich etapów (do metody FT zastosowano technikę obrazowania) (tab. 1). Jako odniesienie, szacunkowe koszty uruchomienia i testu (jedna 24-dołkowa płytka EAgaL w porównaniu z 24 FT) przedstawiono w tabeli 2.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów w tym badaniu.
Podziękowania
Dziękujemy Texas A&M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program za dofinansowanie. Dziękujemy również członkom laboratorium Adelmana za pomoc w opracowaniu tej metody i sugestiom podczas redagowania manuskryptu, a także członkom laboratorium Kevina Mylesa. Dziękujemy również recenzentom i redaktorom za pomoc w ulepszaniu tego manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,6 mm Φ | alternatywnie można stosować podgrzewane gwoździe | ||
| 1000 μ L końcówki do pipet (długie) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-dołkowa płytka do hodowli tkanek | Thermo Scientific | 930186 | przezroczysta, płaska z płytkimi z pierścieniem |
| Agaroza | VWR | 0710-500G | |
| Kompaktowy aparat cyfrowy | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Komputer (Windows, Mac lub Linux) | |||
| Woda dejonizowana | |||
| Pobieranie oprogramowania | z: https://fiji.sc/ | ||
| Kleszcze | Dumont | mogą złamać ciało komara | |
| Szklane szalki Petriego | |||
| Oświetlacz do wiertarek | |||
| mikroskop stereoskopowy (gęsia szyja) | |||
| Pipeta P-1000 | malarskie | ||
| Gumki | |||
| Karta | do nagrywania obrazów z aparatu cyfrowego (DSHC, SDXC powinny być lepsze) | ||
| Oprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych (Microsoft Excel) | Microsoft | Każde oprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych działa | |
| TetraMin pokarm dla ryb | Tetra | mielony z młynkiem do kawy, blenderem lub tłuczkiem | |
| Pipety transferowe | VWR | 16011-188 |
Bibliografia
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520(2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity. Chemosphere. 221, 464-470 (2019).
- Inocente, E. A., et al. Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes. Insects. 10 (11), 373(2019).
- Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. Mosquito transgenesis: what is the fitness cost. Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).
- da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. , 217(2019).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938(2015).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 11023(2018).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380(2018).
- Ioshino, R. S., et al. Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti. Insects. 9 (3), 103(2018).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasites & Vectors. 8, 252(2015).
- Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Malaria Journal. 15 (1), 262(2016).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
