Przygotowanie fałdu głosowego szczura do analiz nerwowo-mięśniowych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metody używane do przygotowania fałdów głosowych szczurów do histochemicznego badania nerwowo-mięśniowego.

Streszczenie

Celem tego samouczka jest opisanie przygotowania fałdu głosowego szczura do histochemicznego badania nerwowo-mięśniowego. Protokół ten określa procedury rozwarstwiania krtani u szczurów, błyskawicznego zamrażania i kriosekcji fałdów głosowych. W pracy opisano sposób kriosekcji fałdów głosowych zarówno w płaszczyźnie podłużnej, jak i przekroju poprzecznego. Nowością tego protokołu jest śledzenie krtani podczas kriosekcji, które zapewnia dokładną identyfikację wewnętrznych mięśni krtani i zmniejsza ryzyko utraty tkanki. Rysunki pokazują postępującą kriosekcję w obu płaszczyznach. Dwadzieścia dziewięć półkrtani szczurów poddano kriosekcji i śledzono od pojawienia się chrząstki tarczycy do pojawienia się pierwszej sekcji, która obejmowała pełny fałd głosowy. Pełny fałd głosowy został zobrazowany dla wszystkich zwierząt w obu płaszczyznach. Stwierdzono dużą zmienność odległości od pojawienia się chrząstki tarczycy do pojawienia się pełnego fałdu głosowego w obu płaszczyznach. Waga nie była skorelowana z głębokością punktów orientacyjnych krtani, co sugeruje, że indywidualna zmienność i inne czynniki związane z przygotowaniem tkanek mogą być odpowiedzialne za dużą zmienność w wyglądzie punktów orientacyjnych podczas sekcji. W badaniu tym szczegółowo opisano metodologię i przedstawiono dane morfologiczne dotyczące przygotowania fałdu głosowego szczura do histochemicznego badania nerwowo-mięśniowego. Ze względu na dużą zmienność osobniczą, punkty orientacyjne krtani powinny być ściśle śledzone podczas kriosekcji, aby zapobiec nadmiernemu cięciu tkanki i utracie tkanek. Zastosowanie spójnej metodologii, w tym odpowiednie przygotowanie tkanek i świadomość punktów orientacyjnych w krtani szczura, pomoże w uzyskaniu spójnych wyników we wszystkich badaniach i pomoże nowym badaczom zainteresowanym wykorzystaniem fałdu głosowego szczura jako modelu do badania mechanizmów nerwowo-mięśniowych krtani.

Wprowadzenie

Krtań szczura jest dobrze znanym modelem do badania strukturalnych i funkcjonalnych adaptacji nerwowo-mięśniowej krtani do rozwoju, starzenia się, chorób i czynników farmakologicznych^1,2,3,4,5. Spójność metod histologicznych ma kluczowe znaczenie dla tej branży, ponieważ istnieje wiele zawiłości związanych z przygotowaniem i analizą mięśni, a także wyzwania związane z rozmiarem, kształtem i topografią krtani mięśni zamkniętych w chrząstkach krtaniowych^{1,6,7,8,9,10,11}. Ze względu na niewielki rozmiar wewnętrznych mięśni krtani szczura, systematyczne osadzanie, zamrażanie i kriosekcja mają kluczowe znaczenie dla osiągnięcia spójnych i dokładnych wyników. Na przykład, podczas cięcia fałdu głosowego szczura w płaszczyźnie koronalnej, połączenia nerwowo-mięśniowe (NMJ) czterech wewnętrznych mięśni krtani znajdują się w odległości mniejszej niż 1,8 mm od głębokości tkanki¹¹. Dlatego precyzyjne monitorowanie anatomii mięśni krtani podczas kriosekcji jest niezbędne, aby dokładnie zidentyfikować interesujący fragment (sekcje) i zapobiec nadmiernemu cięciu tkanki. Przecięcie mięśnia docelowego może skutkować niedokładną identyfikacją liczby i topografii NMJs¹¹ lub może spowodować ogólne zmniejszenie wielkości próby, jeśli mięsień docelowy zostanie odrzucony z powodu zamieszania związanego z orientacją punktu orientacyjnego¹². W miarę opracowywania nowych modeli do badania mięśni krtani i ich odpowiednich adaptacji, standardowe procedury operacyjne są niezbędne, aby zapewnić precyzję, wiarygodność i powtarzalność wyników we wszystkich badaniach.

Celem tego artykułu jest szczegółowe przygotowanie fałdu głosowego szczura do optymalnej analizy podłużnej i przekrojowej. Opisano szczegółowe metody stosowane regularnie w naszym laboratorium w celu identyfikacji docelowych punktów orientacyjnych mięśni podczas kriosekcji. Chociaż podobne metody są stosowane w kilku laboratoriach, tutaj podano więcej szczegółów niż w literaturze, aby zapewnić wiarygodną i dokładną replikację, gdy są wdrażane przez początkujących badaczy. Celem tego samouczka jest przedstawienie standardowej metodologii oceny immunohistochemicznej (IHC) fałdu głosowego szczura w celu poprawy spójności między laboratoriami i badaniami.

Protokół

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szkoły Medycznej Uniwersytetu Nowojorskiego.

1. Wypreparuj krtań szczura

1. Poddaj szczura eutanazji zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonym protokołem. Ogolić brzuszną szyję od żuchwy do manubrii i przetrzeć alkoholem, aby zapobiec zanieczyszczeniu futra w próbkach tkanek.
2. Pod lunetą sekcyjną z 10-krotnym powiększeniem wyciąć całą krtań, tworząc skalpelem nacięcie szyi w linii środkowej, aż do odsłonięcia tchawicy.
3. Oddziel brzuszne zewnętrzne mięśnie krtani w linii środkowej, aby odsłonić krtań za pomocą kleszczy i nożyczek preparacyjnych lub skalpela.
4. Odetnij tchawicę ogonową do trzeciego pierścienia tchawicy i wykonaj nacięcie rostralne do kości gnykowej, aby wyciąć całą krtań za pomocą nożyczek preparacyjnych.
5. Usuń zewnętrzne tkanki krtani (przełyk, tarczyca i zewnętrzne mięśnie krtani) z krtani za pomocą narzędzi do mikrodysekcji (pęsety, szpilek i mikronożyczek) w powiększeniu.
6. Za pomocą mikronożyczek przetnij krtań grzbietowo między arytenoidami, używając linii środkowej między tylnymi mięśniami pierściennymi jako punktu orientacyjnego. Przygnij boczne ściany krtani, aby odsłonić fałdy głosowe, a następnie przeciąć brzusznie przez linię środkową chrząstki tarczycy między przednim spoidłem fałdów głosowych za pomocą mikronożyczek (Rycina 1).
   UWAGA: Ten krok może być opcjonalny; Można go pominąć, aby utrzymać krtań w całości. Bisekcja krtani umożliwia wiele technik barwienia immunologicznego poprzez oddzielne użycie prawej i lewej strony tej samej krtani.
7. Opłucz każdą półkrtań w roztworze buforowym fosforanowym (PBS) przez ~10 s i delikatnie osusz wycieraczką zadaniową, aby ograniczyć tworzenie się kryształków lodu podczas zamrażania.

2. Naprawa i/lub błyskawiczne zamrażanie tkanki krtaniowej

UWAGA: Fiksacja może nie być idealna dla wszystkich protokołów barwienia immunologicznego. Często tkanki krtani są błyskawicznie zamrażane na świeżo bezpośrednio po sekcji. Pomiń krok 2.1, aby błyskawicznie zamrozić tkankę krtani bez fiksacji.

1. Aby utrwalić półkrtań, umieść tkanki w probówce wirówkowej wypełnionej 4% formaldehydem w PBS na 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 70 obr./min. Przenieś chusteczki do czystej probówki wirówkowej i płucz 3x przez 20 minut w PBS. Następnie przenieść do czystej probówki wirówkowej i zanurzyć w 20% roztworze sacharozy/5% glicerolu (~18 godzin lub do momentu, gdy tkanka opadnie) w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Formaldehyd jest niebezpieczny i powinien być stosowany w dygestorium wraz z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.
2. Umieść wszystkie półkrzmieni w jednolitej pozycji w krioformie wypełnionej związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). W przypadku półkrtani należy umieścić tkankę tak, aby przyśrodkowa powierzchnia fałdu głosowego była skierowana w stronę dolnej części kriomoldu, a podłużna część fałdu głosowego była równoległa do dolnej krawędzi otworu kriomoldu. W przypadku całych krtani należy umieścić tkankę tak, aby tylne cricoarytenoidy były skierowane do dna kriofordu, a podłużna część fałdu głosowego równolegle do dolnej krawędzi otworu kriomaldu.
   UWAGA: Spójna orientacja krtani w obrębie związku OCT ma kluczowe znaczenie dla kriosekcji fałdu głosowego szczura. Po osadzeniu i zamrożeniu półkrtani należy ją rozmrozić, aby zmienić jej orientację, co stwarza ryzyko uszkodzenia tkanek w wyniku wielu cykli rozmrażania-zamrażania.
3. Błyskawiczne zamrażanie tkanek przy użyciu izopentanu (2-metylobutanu) schłodzonego w stalowej zlewce otoczonej ciekłym azotem.
   UWAGA: Izopentan osiąga optymalną temperaturę do zamrażania tkanek, gdy białe osady zaczynają tworzyć się po bokach i na dnie zlewki¹³. Izopentan jest stosowany, ponieważ ma wyższą przewodność cieplną niż ciekły azot, co pomaga zapobiegać pękaniu bloku tkankowego podczas szybkiego zamrażania. Bardziej szczegółowy opis zamrażania tkanek w OTC można znaleźć w Kumar et al.¹³.
4. Zawiń każdą formę we wstępnie oznaczoną folię i umieść w indywidualnej torbie do zamrażania, aby zapobiec odwodnieniu, i natychmiast przechowuj na suchym lodzie do momentu przekazania do przechowywania w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

3. Kriosekcja hemilarynx w płaszczyźnie przekroju poprzecznego

1. Ustaw temperaturę komory w kriostacie na -20 °C, czyli w środku zakresu temperatur (15−25 °C) zalecanego do cięcia tkanki mięśniowej przez instrukcję producenta.
2. Ustaw grubość przekroju kriostatu na odcinek o grubości 10 μm.
   UWAGA: W przypadku analizy przekroju poprzecznego włókien mięśniowych optymalne są odcinki o grubości 10 μm, aby umożliwić całkowite barwienie i solidną intensywność obrazowania znakowanych włókien mięśniowych do analizy typowania włókien^14,15,16. Niektóre protokoły mogą wymagać różnej grubości przekroju w zależności od celów nerwowo-mięśniowych.
3. Przenieś tkanki do komory kriostatu, dodaj jednolitą warstwę związku OCT na krążku próbki kriostatu (uchwyt) i umieść osadzony blok tkanki na wierzchu związku OCT na dysku próbki. Aby uzyskać przekroje poprzeczne fałdu głosowego do analizy włókien mięśniowych tarczycy (TA), należy przymocować próbkę do uchwytu tak, aby brzuszna chrząstka tarczycy była skierowana w stronę ostrza kriostatu, a chrząstka arytenoidalna była skierowana w stronę dysku próbki.
   UWAGA: Należy zauważyć, że te punkty orientacyjne nie są widoczne na tym etapie, ze względu na to, że związek OCT staje się biały i nieprzezroczysty po zamrożeniu. Ten brak widoczności jest powodem, dla którego tak ważne jest, aby zwrócić uwagę na orientację półkrtani podczas fazy błyskawicznego zamarzania.
4. Przyciąć związek OCT, przesuwając głowę próbki o 100 μm, aż pojawi się brzuszna część chrząstki tarczycy.
5. Następnie przyciąć i śledzić odcinki 30 μm od początku chrząstki tarczycy do odsłonięcia blaszki właściwej, przyśrodkowych mięśni TA i bocznych mięśni TA.
   UWAGA: Punkty orientacyjne krtani należy śledzić i notować od początku chrząstki tarczycy co 100 μm, aby upewnić się, że kąt przekroju nie jest ukośny. Rysunek 2 przedstawia dwa zestawy punktów orientacyjnych krtani w płaszczyźnie przekroju poprzecznego w powiększeniu 10x.
6. Po osiągnięciu docelowego mięśnia TA należy zebrać skrawki na dodatnio naładowanych szkiełkach o wielkości 10 μm.
7. Przechowywać skrawki w PBS w temperaturze 4 °C, aby zatrzymać wilgoć do czasu, gdy będą gotowe do barwienia.
   UWAGA: Utrwalona tkanka może być przechowywana w PBS do jednego tygodnia, w zależności od celu IHC, podczas gdy nieutrwalona tkanka powinna być natychmiast przetworzona.

4. Kriosekcja hemilarynx w płaszczyźnie podłużnej

1. Gdy komora kriostatu jest ponownie ustawiona na -20 °C, zmień grubość przekroju na 30 μm.
   UWAGA: Do analizy NMJ można użyć grubości tkanki w zakresie 30-60 μm do uchwycenia kilku kompletnych NMJ w mięśniach krtani bez fragmentacji zakończenia nerwowego lub płytki końcowej motorycznej^11,12,17.
2. Aby uzyskać podłużne odcinki fałdów głosowych do analizy NMJ mięśnia TA, należy przymocować próbki do uchwytu tak, aby nagłośnia była skierowana w stronę ostrza kriostatu, a światło tchawicy skierowane w dół w kierunku krążka próbki.
3. Przyciąć związek OCT, przesuwając główkę próbki o 100 μm, aż pojawi się chrząstka tarczycy.
4. Przycinaj i śledź odcinki o wielkości 30 μm od początku tarczycy do odsłonięcia blaszki właściwej oraz przyśrodkowych i bocznych podziałów mięśnia TA.
   UWAGA: Zaleca się pięć zestawów punktów orientacyjnych krtani w płaszczyźnie podłużnej, aby śledzić postęp głębokości tkanki w kierunku docelowego mięśnia TA. Rysunek 3 przedstawia punkty orientacyjne krtani w płaszczyźnie podłużnej w powiększeniu 10x.
5. Po osiągnięciu docelowego mięśnia TA należy zebrać skrawki na dodatnio naładowanych szkiełkach pod prędkością 30 μm.
6. Przechowywać skrawki w PBS w temperaturze 4 °C, aby zatrzymać wilgoć do czasu, gdy będą gotowe do barwienia.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki były częścią trwającego badania nad wpływem ćwiczeń głosowych na krtaniowy układ nerwowo-mięśniowy. Dwadzieścia dziewięć samców szczurów Fischer 344/brown Norway (12 w wieku 9 miesięcy, 17 w wieku 24 miesięcy) zważono i poddano eutanazji poprzez inhalację CO₂, a następnie wykonano obustronną torakotomię.

Procedury przeprowadzono zgodnie z opisanym protokołem w celu znakowania NMJ oraz pomiaru wielkości włókien bocznego i przyśrodkowego mięśnia TA. Odległość mi...

Dyskusja

Przygotowanie fałdów głosowych szczurów do analizy nerwowo-mięśniowej może wiązać się z różnymi wyzwaniami. Mięśnie krtani są nie tylko małe i otoczone chrząstką, co utrudnia bezpośrednią ekstrakcję mięśnia docelowego, ale stwierdzono również dużą zmienność między zwierzętami w głębokości anatomicznych punktów orientacyjnych krtani. W przypadku mięśni protokół płaszczyzny przekroju poprzecznego, pełne odcinki fałdów głosowych pojawiły się między 21−85 sekcjami (10 μm na sekcję) po początkowym pojawieniu się brzusznej chr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Certyfikowana 2-metylobutanowa	Fisher Chemical	35514
	Fisherbrand	1213101
Szczypce kriogeniczne SS	Thermo Scientific	11679123
Kriostat	Leica Biosystems	CM3050
Ostrza kriostatu	CL Sturkey D554X50	22-210-045
Jednorazowe formy bazowe 15mm x 15mm	Thermo Scientific	41-741
Jednorazowe podkładki	Medline	23-666-062
Zestaw preparacyjny	Thermo Scientific	9996969
DPBS - Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco	Gibco	14190136
sekcja mrożona Medium	Fisher Healthcare	23-730-571
Wiadro na lód	Bel-Art
Komora wilgotnościowa Immunostain	Ted Pella Inc	NC9425474
Uchwyty na igły	Assi	ASSI. B148
Gąbki włókninowe, 4-warstwowe	Quick Medical	9023
Wytrząsarka orbitalna	Troemner	02-217-987
Długopis
paraformaldehydowy, 16% w/v aq. soln., bez metanolu	Alfa Aesar	50-00-0
Premium	Fisherbrand	5408129
Przechowywanie próbek Worki	Fisherbrand	19240093
Miara z podziałką ze stali nierdzewnej 32 uncje/100 ml	Polar Ware	114231B
Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus	Fisherbrand	12-550-15
Wycieraczka zadaniowa	Kimberly-Clark Professional™ 34155	06666A
Timer	Fisherbrand	2261840
Vannas Wzór Nożyczki	Assi	ASSI.
SAS15RV UWAGA: W przypadku wszystkich materiałów eksploatacyjnych są to przykłady wyposażenia do zakupu. Dokładny model nie jest konieczny do ukończenia naszych metod.

folia aluminiowa 11999054 Probówki do mikrowirówek