Wycinki mózgu ex vivo mogą być używane do badania wpływu lotnych środków znieczulających na wywołane reakcje na bodźce aferentne. Optogenetyka jest wykorzystywana do niezależnej aktywacji aferentów wzgórzowo-korowych i korowo-korowych do niepierwotnej kory nowej, a odpowiedzi synaptyczne i sieciowe są modulowane izofluranem.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Optogenetyczna aktywacja szlaków aferentnych w wycinkach mózgu i modulacja odpowiedzi za pomocą lotnych środków znieczulających
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Środki znieczulające wpływają częściowo na świadomość poprzez swoje działania na obwody wzgórzowo-korowe. Jednak stopień, w jakim lotne środki znieczulające wpływają na różne komórkowe i sieciowe składniki tych obwodów, pozostaje niejasny. Wycinki mózgu ex vivo dostarczają środków, za pomocą których badacze mogą badać dyskretne składniki złożonych sieci i rozplątywać potencjalne mechanizmy leżące u podstaw wpływu lotnych środków znieczulających na wywołane reakcje. Aby wyizolować potencjalne efekty leków specyficzne dla typu komórki i szlaku w wycinkach mózgu, badacze muszą być w stanie niezależnie aktywować szlaki włókien doprowadzających, zidentyfikować nienakładające się populacje komórek i zastosować lotne środki znieczulające do tkanki w roztworze wodnym. W tym protokole opisano metody pomiaru optogenetycznie wywołanych odpowiedzi na dwie niezależne szlaki aferentne do kory nowej w wycinkach mózgu ex vivo. Odpowiedzi zewnątrzkomórkowe są rejestrowane w celu oznaczenia aktywności sieciowej, a ukierunkowane zapisy klamry łatkowej całej komórki są przeprowadzane w interneuronach dodatnich pod względem somatostatyny i parwalbuminy. Opisano dostarczanie fizjologicznie istotnych stężeń izofluranu przez sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy w celu modulowania odpowiedzi komórkowych i sieciowych.
Wprowadzenie
Lotne środki znieczulające są powszechnie stosowane w różnych warunkach klinicznych i akademickich od ponad stu lat. Różne klasy środków znieczulających mają unikalne, często nienakładające się na siebie cele molekularne1,2,3, ale prawie wszystkie z nich powodują utratę przytomności. Podczas gdy ich efekty behawioralne są dość przewidywalne, mechanizmy, za pomocą których środki znieczulające wywołują utratę przytomności, są w dużej mierze nieznane. Środki znieczulające mogą ostatecznie wpływać zarówno na poziom, jak i zawartość świadomości poprzez działania na obwody korowo-wzgórzowe, zakłócając integrację informacji w całej hierarchii korowej4,5,6,7,8,9. W szerszym ujęciu, modulacja obwodów korowo-wzgórzowych może odgrywać rolę w eksperymentalnie10 lub farmakologicznie11 odmiennych stanach świadomości, a także może być związana z sleep12 oraz w patofizjologicznych zaburzeniach świadomości13,14.
Nieuchwytność mechanizmów leżących u podstaw utraty i powrotu do świadomości podczas znieczulenia może być częściowo przypisana nieliniowemu, synergicznemu działaniu środków znieczulających na poziomie komórkowym, sieciowym i systemowym15. Izofluran, na przykład, hamuje aktywność w wybranych obszarach mózgu16,17,18, upośledza łączność między odległymi regionami mózgu19,20,21,22,23 i zmniejsza reakcje synaptyczne w sposób specyficzny dla szlaku manner24,25. Nie jest jasne, jakie efekty działania środków znieczulających, od poziomu molekularnego do systemowego, są konieczne lub wystarczające do spowodowania utraty przytomności. Oprócz merytorycznych badań klinicznych świadomości przy użyciu technik nieinwazyjnych19,20,26, ważne jest, aby eksperymentatorzy starali się rozwikłać odrębne interakcje komórkowe i sieciowe, które służą świadomemu doświadczeniu.
Upraszczając złożone interakcje występujące w nienaruszonym mózgu, wycinki mózgu ex vivo pozwalają na badanie izolowanych komponentów dynamicznych systemów mózgu9. Preparat o zmniejszonej ilości plastrów łączy w sobie korzyści płynące ze stosunkowo nienaruszonych struktur anatomicznych lokalnych obwodów nerwowych z wszechstronnością manipulacji in vitro. Jednak do niedawna ograniczenia metodologiczne uniemożliwiały badanie właściwości synaptycznych i obwodowych sygnałów wejściowych dalekiego zasięgu w wycinkach mózgu27,28; Kręta ścieżka dróg włókien korowo-wzgórzowych sprawiła, że aktywacja niezależnych szlaków aferentnych była prawie niemożliwa przez stymulację elektryczną.
Badanie wpływu środków znieczulających na preparaty do wycinania mózgu stanowi dodatkowe wyzwanie. W przypadku braku nienaruszonego układu oddechowego i krążenia, środki znieczulające muszą być stosowane w kąpieli, a stężenia starannie dopasowane do szacowanych stężeń w miejscu działania. W przypadku wielu dożylnych środków znieczulających powolne tempo równoważenia w tkance sprawia, że tradycyjne badania farmakologiczne są pracochłonne29,30. Badanie wpływu środków znieczulających gazami lotnymi w preparatach ex vivo jest łatwiejsze do opanowania, ale wiąże się również z wyzwaniami. Obejmują one konwersję wdychanych dawek ciśnienia parcjalnego na stężenia wodne oraz potrzebę zmodyfikowanego systemu dostarczania leku do tkanki za pośrednictwem sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego31.
Tutaj opisane są metody, za pomocą których badacze mogą wykorzystać dobrze udokumentowane właściwości fizykochemiczne lotnego znieczulającego izofluranu do dostarczania leków do wycinków mózgu ex vivo, aktywować specyficzne dla szlaku i warstwy wejścia do obszaru zainteresowania kory mózgowej o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej, oraz przeprowadzać jednoczesne zapisy laminarne i ukierunkowane zapisy patch clamp z wybranych populacji neuronów. W połączeniu procedury te pozwalają badaczom mierzyć lotne zmiany wywołane znieczuleniem w kilku obserwowalnych właściwościach reakcji elektrofizjologicznej, od poziomu synaptycznego do poziomu sieci lokalnej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury z udziałem zwierząt opisane w niniejszym protokole zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Animal Care and Use Committee) przy School of Medicine and Public Health Uniwersytetu w Wisconsin-Madison.
1. Hodowla myszy w celu ekspresji fluorescencyjnego białka reporterowego w subpopulacjach interneuronów
- Krzyżuj samca myszy homozygotycznej tdTomato zależnej od Cre z samicą myszy homozygotycznej SOM-Cre lub samicą myszy homozygotycznej PV-Cre.
UWAGA: Inne specyficzne populacje neuronów można wycelować, stosując odpowiednie linie Cre. - Pozostaw heterozygotyczne potomstwo do osiągnięcia wieku co najmniej 3 tygodni przed przystąpieniem do dalszych etapów. W przypadku opisanych tutaj eksperymentów genotypowanie nie jest konieczne, ponieważ homozygotyczni rodzice dają potomstwo, które w całości jest heterozygotyczne zarówno w odniesieniu do specyficznej dla typu komórek rekombinazy Cre, jak i alleli reportera zależnego od Cre.
2. Wykonywanie jednostronnej iniekcji stereotaktycznej konstruktu wirusowego
- Dostosuj ustawienia wyciągarki do mikropipet przeznaczonej do pipet do iniekcji zgodnie z instrukcją obsługi urządzenia (zalecane ustawienia znajdują się w Tabeli 1). Wyciągnij szklaną mikropipetę.
- Odłam końcówkę ostrego końca pipety w taki sposób, aby średnica wierzchołka wynosiła około 30 µm przy minimalnym zwężeniu na odcinku kilku milimetrów.
- Korzystając z wcześniej udokumentowanych procedur, określ odpowiedni miano i objętość wirusa do iniekcji. W opisanych tutaj eksperymentach dobre wyniki uzyskano przy jednostronnej iniekcji 1,0 μL (miano: 3,1-5,7 TU/mL).
- Wypełnij całą objętość pipety od tyłu olejem mineralnym. Zamocuj pipetę w mikrosyringe i przepuść niewielką ilość oleju mineralnego przez końcówkę, aby upewnić się, że nie jest ona zapchana.
- Wypełnij przód pipety co najmniej 1,0 μL konstruktu wirusowego. Rekombinowany wektor wirusa towarzyszącego adenowirusom zastosowany w tych eksperymentach to AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP.
- Rozłóż sterylną obłożenie w obszarze chirurgicznym. Sterylizuj narzędzia do procedury stereotaktycznej i umieść je na obłożeniu.
- Zanieś anestezyję zwierzęciu heterozygotycznemu SOM-tdTomato lub PV-tdTomato, stosując izofluran (3% do indukcji, 1,5-2% do podtrzymania) i mieszankę z tlenem. Przez cały czas trwania operacji okresowo potwierdzaj chirurgiczny poziom znieczulenia za pomocą ucisku palca u nogi. Monitoruj oddech co 10-15 min, aby upewnić się, że stan zwierzęcia nie odbiega od planu znieczulenia.
- Wygol górną część głowy zwierzęcia. Obficie zastosuj 70% alkohol izopropylowy oraz roztwór na bazie jodu w obszarze chirurgicznym, a do oczodołów maść oftalmiczną, aby zapobiec wysychaniu błony. Podaj bupiwakainę/lidokainę (stosunek 1:1, 1,0 mg/kg) podskórnie w miejscu operacyjnym jako znieczulenie miejscowe.
- Umieść zwierzę w ramie stereotaktycznej.
- Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie wzdłuż osi strzałkowej skóry pokrywającej grzbietową powierzchnię czaszki. Odsunięcie skóry pęsetą. W razie potrzeby nawilżaj czaszkę 0,9% solą fizjologiczną.
- Na powierzchni czaszki lekko zaznacz ołówkiem krzyżykiem przecięcie współrzędnych przednio-bocznych. Wywierć otwór we właściwych współrzędnych w płaszczyźnie poprzecznej (w mm względem Bregmy, dla iniekcji do kory obręczy (Cg): przednio 0,2, bocznie 0,3; dla iniekcji do tylnego wzgórza (Po): tylno 2,25, bocznie 3,4).
UWAGA: Oznaczenia powinny wykraczać poza granice otworu trepanacyjnego, aby zapewnić precyzyjne umieszczenie pipety. - Włącz i wypoziomuj stół pneumatyczny.
- Ustaw manipulator elektrody ramy stereotaktycznej pod kątem 0° dla iniekcji do Cg lub 45° w płaszczyźnie czołowej dla iniekcji do Po.
- Zamocuj pompę strzykawkową do manipulatora elektrody. Podłącz kontroler pompy mikrosyringe do pompy strzykawkowej.
- Przesuń końcówkę pipety w pobliże (ale bez dotykania) powierzchni mózgu, w punkcie przecięcia oznaczeń wykonanych w kroku 2.11. Wprowadź pipetę z prędkością około 1 mm/s wzdłuż jej osi podłużnej do mózgu na głębokość 0,9 mm (iniekcja w Cg) lub 3,1 mm (iniekcja w Po). Odczekaj 10 min przed kontynuacją.
- Wstrzyknij 1,0 µL konstruktu wirusowego w czasie 10 min (100 nL/min). Jeśli zaobserwowany zostanie wyciek wirusa z miejsca wprowadzenia pipety, zmniejsz prędkość iniekcji do 50 nL/min.
- Po iniekcji odczekaj 10 min przed powolnym wycofaniem pipety do iniekcji.
- Zaszyj nacięcie skóry głowy i podaj 2-5 mg/kg meloksykamu podskórnie.
- Przerwij podawanie izofluranu i monitoruj zwierzę podczas wybudzania z narkozy. Pozwól na rekonwalescencję zgodnie z procedurami opisanymi przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt danej instytucji, w tym dalsze podawanie leków przeciwbólowych.
3. Przygotowanie ostrych skrawków mózgu
- Odczekać co najmniej 3 tygodnie na ekspresję konstruktu wirusowego przed pobraniem tkanki.
- Przygotować 1 L sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego do procedury krojenia (sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy do krojenia, sACSF). Składniki znajdują się w Tabeli 2.
- Przez cały czas trwania procedury krojenia nasycać sACSF rozpuszczoną mieszaniną 95% O2/5% CO2, dostarczaną za pomocą rurki do dyspersji gazu.
- Przygotować kąpiel lodową dla mikrotomu z wibrującym ostrzem. Zamontować schłodzony stolik do preparatów w mikrotomie i zamocować ostrze szafirowe do sekcjonowania tkanki.
- Zanestetyzować mysz 3% izofluranem i tlenem aż do utraty odruchu prostowania.
- Dozatować mysz za pomocą gilotyny i natychmiast zanurzyć głowę w sACSF o temperaturze 4°C. Aby zachować żywotność tkanki, należy wykonać następujące kroki jak najszybciej.
- Otworzyć jamę czaszki, wykonując niewielkie nacięcie u podstawy czaszki i ostrożnie usuwając każdą z płytek kostnych. Delikatnie usunąć leżącą pod nimi oponę twardą.
- Gdy mózg znajduje się jeszcze w jamie czaszki, użyć żyletki do usunięcia móżdżku. Wykonać drugie cięcie pionowe wzdłuż płaszczyzny strzałkowej w lewej półkuli, tuż bocznie od linii środkowej.
- Przygotować blok tkanki do sekcjonowania.
- Ostrożnie wyjąć mózg z jamy czaszki. Położyć mózg na papierze filtracyjnym płaską płaszczyzną strzałkową do dołu. Przesunąć papier filtracyjny nad szablon blokujący i wyrównać mózg do obrysu szablonu znajdującego się poniżej (Supplementary Figure 1).
- Wykonać dwa równoległe cięcia w płaszczyźnie czołowej, zgodnie z liniami na szablonie. W razie potrzeby dodać małą kroplę sACSF, aby papier filtracyjny pozostał wilgotny.
- Krótko umieścić blok tkanki w sACSF o temperaturze 4°C podczas wykonywania kroku 3.8.4.
- Nanieść niewielką ilość superkleju na schłodzony stolik do preparatów.
- Wyjąć blok tkanki z zimnego sACSF. Użyć rogu chłonnego ręcznika, aby odsączyć nadmiar sACSF. Przykleić tylną płaszczyznę czołową bloku tkanki do stolika do preparatów, tak aby powierzchnia grzbietowa mózgu była skierowana w stronę ostrza szafirowego.
- Pobrać coronalne skrawki mózgu o grubości 500 µm. Umieścić interesujące skrawki na nylonowej siatce (Supplementary Figure 2) w sACSF o temperaturze 34 °C i pozwolić naczyniu osiągnąć temperaturę pokojową.
UWAGA: W przypadku opisanych tutaj eksperymentów, rejestracje elektrofizjologiczne pobrano z przekroju czołowego wycentrowanego około 2,25 mm za bregma, aby zbadać niepodstawowy obszar sensoryczny, przyśrodkową wtórną korę wzrokową (V2MM).
4. Przygotowanie eksperymentalnych worków z płynem mózgowo-rdzeniowym (eACSF) zawierających rozpuszczony lotny anestetyk izofluran
- Przygotować 300 mL roztworu zapasowego mieszaniny 3,0% izofluranu.
- Do szczelnego worka gazowego z politetrafluoroetylenu dodać ~100 mL mieszaniny gazowej 95% O2/5% CO2 do 20-30 mL ciekłego izofluranu i niewielkiej ilości 0,9% soli fizjologicznej. Odczekać co najmniej 30 min, aby umożliwić wyrównanie stężeń izofluranu między fazą ciekłą a gazową.
- Obliczyć objętość nasyconego gazu izofluranowego, Vsat, którą należy dodać do worka zapasowego, korzystając z następującego równania:
gdzie P%stock to docelowy skład gazu zapasowego (w tym przypadku 3%), Vstock to końcowa objętość worka z gazem zapasowym, Pisoflurane to ciśnienie parcjalne izofluranu w temperaturze pokojowej (~240 mmHg), a Ptotal to ciśnienie atmosferyczne (~760 mmHg). - Dodać obliczoną ilość nasyconego gazu do pustego worka gazowego i wypełnić worek objętością mieszaniny gazowej 95% O2/5% CO2 tak, aby całkowita objętość worka zapasowego wyniosła 300 mL.
- Przygotować 2 L sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego do perfuzji skrawka podczas eksperymentu (eksperymentalny ACSF, eACSF). Składniki przedstawiono w Tabeli 2. Rozpuścić mieszaninę gazową 95% O2/5% CO2 w roztworze.
- Przygotować dwa osobne worki z roztworami kontrolnymi i izofluranem.
- Do pustego worka gazowego z politetrafluoroetylenu dodać 600 mL eACSF i 600 mL mieszaniny gazowej 95% O2/5% CO2. Oznaczyć ten worek jako Control.
- Do innego pustego worka gazowego z politetrafluoroetylenu dodać 300 mL eACSF. Oznaczyć ten worek jako Isoflurane.
- Wybrać fizjologicznie istotne, wyrównane stężenie izofluranu w fazie gazowej. Eksperymenty prowadzono przy stężeniach gazu odpowiadających 1,3% izofluranu. Myszy tracą odruch prostowania ciała, a prawdopodobnie i przytomność, przy 0,9% wziewnego izofluranu.
- Użyć następującego równania do obliczenia równoważnego stężenia w fazie gazowej w temperaturze pokojowej, P%(Troom)31:
gdzie P%(Tbody) to fizjologicznie istotne stężenie w fazie gazowej wybrane w kroku 4.3.3, Troom to 25 °C, a Tbody to 37 °C. - Użyć następującego równania, aby określić objętość gazu z zapasowego worka gazowego, Vstock, którą należy dodać do roztworu izofluranu.
gdzie Vsolution to objętość eACSF w worku ISOFLURANE (300 mL), P%(Troom) jest wartością z równania (2), λ to współczynnik podziału Ostwalda izofluranu między solą fizjologiczną a gazem (λ = 1,232), a P%stock to stężenie w fazie gazowej worka zapasowego (P%stock = 3,0%). - Do worka z roztworem izofluranu dodać objętość gazu z zapasowego worka gazowego, Vstock, obliczoną w kroku 4.3.5.
- Do worka z roztworem izofluranu dodać objętość mieszaniny gazowej 95% O2/5% CO2 tak, aby całkowita objętość gazu w worku z roztworem izofluranu wyniosła 300 mL.
- Wstrząsać oba worki (kontrolny i z izofluranem) na wytrząsarce przez co najmniej 1 h, aby umożliwić wyrównanie faz izofluranu.
- Po zebraniu wszystkich danych prawidłowe stężenie można zweryfikować, używając monitora gazów anestetycznych do pomiaru wyrównanego stężenia izofluranu w fazie gazowej nad pozostałym w worku roztworem.
- Stężenia eksperymentalne gazów lotnych podawać w jednostkach wodnych, ponieważ stężenia milimolarne są bardziej odporne na zmiany temperatury. Użyć następującego równania, aby przeliczyć stężenie w fazie gazowej w temperaturze pokojowej, P%(Troom), na równoważne stężenie w roztworze wodnym (Caqueous, w mM)31:
gdzie α to współczynnik podziału Bunsena dla izofluranu między solą fizjologiczną a gazem w 25°C32.
5. Przygotowanie sprzętu i oprogramowania do rejestracji wielokanałowej
- Skonfigurować 16-kanałowy system akwizycji danych zgodnie z instrukcjami producenta.
UWAGA: Do rejestracji wielokanałowej można wykorzystać wiele dostępnych w handlu wzmacniaczy i systemów akwizycji danych. W opisanych tutaj eksperymentach sygnały analogowe są przesyłane za pomocą panelu referencyjnego elektrod do dwóch wzmacniaczy, gdzie są wzmacniane (2000x) i filtrowane (0.1-10kHz). Wejścia analogowe do systemu akwizycji danych są digitalizowane z częstotliwością 40kHz. - Przymocować odpowiedni adapter przedwzmacniacza 16-kanałowego do mikromanipulatora mikroskopowego. Zorientować adapter tak, aby gniazda żeńskie były skierowane w dół.
- Ustawić kąt pracy mikromanipulatora tak, aby był on skierowany w dół w stronę komory rejestracyjnej, pod kątem około 70° względem poziomu.
- Podłączyć wejście przedwzmacniacza do sondy 16 x 1 do elektrofizjologii in vitro za pomocą adaptera przedwzmacniacza zamocowanego do mikromanipulatora.
- Podłączyć złącze wyjściowe przedwzmacniacza do systemu akwizycji danych.
- Zainstalować odpowiednie oprogramowanie do akwizycji danych. Skonfigurować 15 kanałów wejściowych tak, aby odpowiadały sygnałom wejściowym z pierwszych 15 kontaktów sondy wielokanałowej. Skonfigurować pozostały kanał do odbierania sygnału z elektrody wewnątrzkomórkowej.
UWAGA: Należy zwrócić uwagę na mapy elektrod i adapterów podczas gromadzenia i analizy danych, aby upewnić się, że odpowiedni sygnał odpowiada kontaktowi elektrody, z którego został pobrany.
6. Konfiguracja protokołów stymulacji światłem
- Skonfigurować system dostarczania światła i zainstalować dołączone oprogramowanie.
- Otworzyć oprogramowanie. Wybrać konfigurację okablowania sprzętowego, w której źródło wyzwalania (Digital/TTL Out) dostarcza sygnał Trigger In do systemu dostarczania światła, a system dostarczania światła dostarcza sygnał Trigger Out do diody LED 470 nm.
- Zamontować obiektyw o dużej powiększeniu. Za pomocą kamery cyfrowej skalibrować obiektyw o dużej powiększeniu do pracy z systemem dostarczania światła.
- Utworzyć nową sekwencję profili stymulacji świetlnej.
- Utworzyć wybrany wzór. W opisanych tutaj eksperymentach wykorzystuje się okrąg o średnicy 150 µm, aby umożliwić warstwową aktywację zakończeń aksonalnych.
- Aby skonstruować sekwencję profili, skopiować i wkleić ten profil dla dowolnej liczby prób.
- Utworzyć listę przebiegów zawierającą przebiegi o dowolnej intensywności światła, czasie trwania impulsu lub liczbie impulsów.
- Losowo przypisać przebiegi do każdego profilu. Każdy profil z przypisanym przebiegiem odpowiada jednemu impulsowi wyzwalającemu z wejścia Digital TTL lub jednej próbie.
- Zapisać sekwencję profili.
- W oprogramowaniu do akwizycji danych utworzyć nowy protokół.
- Ustawić liczbę prób równą liczbie profili w nowo utworzonej sekwencji profili.
- Wybrać wejścia sygnałowe zgodne z konfiguracją z kroku 5.6. Skonfigurować protokół generujący pojedyncze wyjście cyfrowe TTL, rejestrujący dane z tych 16 kanałów wejściowych przez odpowiedni czas przed i po cyfrowym wyzwalaniu.
7. Umieszczanie sondy wielokanałowej w preparacie ex vivo z cienkiego skrawka tkanki mózgowej
- Przeprowadź perfuzję napowietrzonym eACSF (nie w szczelnych workach) z prędkością 3-6 mL/min.
- Przenieś skrawek mózgu zawierający obszar zainteresowania na siatkę w komorze perfuzyjnej mikroskopu. Przymocuj go za pomocą platynowej harfy (patrz Rycina uzupełniająca 3).
- Obróć siatkę tak, aby linia kontaktów elektrod na dystalnym końcu sondy wielokanałowej była mniej więcej prostopadła do powierzchni opon miękkich.
- Przy oświetleniu szerokopolowym i precyzyjnej kontroli mikromanipulatora opuść sondę wielokanałową w kierunku powierzchni skrawka.
- Obróć wieżyczkę z kostkami filtrów, aby wybrać odpowiednią kostkę do wizualizacji fluorescencyjnego białka reporterowego ekspresjonowanego w zakończeniach aksonów aferentnych kory. W razie potrzeby obróć skrawek, aby dokładniej wyrównać sondę z powierzchnią opon miękkich.
- Ustaw sondę tuż nad płaszczyzną skrawka, ok. 200 µm przed końcową pozycją docelową wzdłuż osi x, pozostawiając przynajmniej jeden kanał poza granicą rejestrowanego obszaru tkanki.
- Powoli wprowadź sondę do skrawka, przesuwając manipulator wzdłuż jego osi podłużnej. Aby zminimalizować uszkodzenia tkanki, posuwaj sondę tylko do momentu, aż ostre końcówki staną się ledwo widoczne pod powierzchnią tkanki. Pozwoli to zminimalizować uszkodzenia tkanki, zapewniając jednocześnie kontakt elektrod z tkanką.
8. Patch clamping docelowych neuronów i uzyskanie konfiguracji whole-cell
- Przełącz źródło eACSF na worek z roztworem kontrolnym.
- Zidentyfikuj komórkę znakowaną fluorescencyjnie do ukierunkowanej rejestracji metodą patch clamp.
- Zmniejsz otwór przysłony do najmniejszej średnicy. Użyj obiektywu o małym powiększeniu i ustaw ostrość na tkance.
- Wycentruj wiązkę światła nad obszarem tkanki sąsiadującym z sondą wielokanałową (ale nie nakładającym się na nią).
- Użyj obiektywu imersyjnego (wodnego) o dużym powiększeniu (40x lub 60x), zachowując ostrożność, aby uniknąć kontaktu między sondą wielokanałową a soczewką obiektywu.
- Obróć rewolwer z kostkami filtrów, aby wybrać odpowiedni zestaw filtrów umożliwiający obrazowanie komórek wykazujących ekspresję fluorescencyjnego markera zależnego od Cre.
- Wybierz komórkę znakowaną fluorescencyjnie jako cel rejestracji metodą patch clamp. Podnieś obiektyw, aby stworzyć wystarczająco dużo miejsca do wprowadzenia pipety do patch clampu.
- Napełnij pipetę do patch clampu (patrz Tabela 1) roztworem wewnętrznym (Tabela 2) i zamocuj pipetę w uchwycie elektrody. Za pomocą strzykawki 1 mL przyłóż dodatnie ciśnienie odpowiadające ok. 0,1mL powietrza.
- Obniż pipetę do patch clampu do roztworu. Pod kontrolą wizualną ustaw ostrość na koniuszku pipety.
- Wykonaj rejestrację z całej komórki (whole-cell) z wybranej komórki, stosując kroki zaprezentowane wcześniej33.
- Jeśli planujesz ocenić zmiany w parametrach wewnętrznych komórki (np. rezystancję wejściową, częstotliwość generowania potencjałów czynnościowych w odpowiedzi na skoki prądu), przeprowadź te pomiary. W przeciwnym razie przejdź do protokołu stymulacji aksonu opisanego poniżej.
9. Warstwowa optogenetyczna aktywacja zakończeń aksonalnych
- Przesuń pole widzenia w płaszczyźnie x-y, aby dopasować profil stymulacji świetlnej do pożądanej lokalizacji na skrawku.
- Wczytaj protokół stymulacji świetlnej i przygotuj system dostarczania światła do odbioru cyfrowego impulsu TTL.
- Aktywuj optogenetycznie zakończenia aksonów, jednocześnie rejestrując potencjały polowe zewnątrzkomórkowe oraz wewnątrzkomórkowe fluktuacje błonowe.
- Przełącz źródło eACSF na roztwór izofluranu i przeprowadzaj płukanie w celu wprowadzenia leku przez 15 min. W razie potrzeby wykonaj rejestracje spontaniczne podczas wprowadzania leku.
- Powtórz kroki 9.2-9.3.
- Przełącz źródło eACSF na roztwór kontrolny i przeprowadzaj płukanie w celu wypłukania leku przez 20 min. W razie potrzeby wykonaj rejestracje spontaniczne podczas wypłukiwania.
- Powtórz kroki 9.2-9.3.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Harmonogram kroków opisanych w protokole przedstawiono na Rysunku 1. Wejścia korowe pochodzące z korowych obszarów wyższego rzędu lub z niepierwotnych jąder wzgórza mają częściowo nakładające się pola zakończeń w warstwie 1 niepierwotnej kory wzrokowej24. Aby wyizolować niezależne drogi doprowadzające wzgórzowo-korowe lub koro-korowe, wykonano iniekcję wektora wirusowego zawierającego ChR2 oraz fluorescencyjny reporter eYFP do Po lub Cg. Komórki w promieniu iniekcji p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym artykule opisano protokół oceny wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych odpowiedzi na selektywnie aktywowane szlaki aferentne w wycinkach mózgu ex vivo.
Wykorzystanie narzędzi optogenetycznych i równoległych schematów zapisu pozwala badaczom badać reakcje lokalnych populacji na aferentne dane wejściowe z odległych regionów mózgu, jednocześnie rejestrując z docelowych populacji interneuronów. Zastosowanie technologii optogenetycznej pozwala na zachowanie i aktywację zakończeń aksonów projekcji af...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Bryanowi Krause za wsparcie techniczne i wskazówki dotyczące tego projektu.
Ta praca była wspierana przez Międzynarodowe Towarzystwo Badań Anestezjologicznych (IMRA do AR), Narodowe Instytuty Zdrowia (R01 GM109086 do MIB) oraz Wydział Anestezjologii, Szkoła Medycyny i Zdrowia Publicznego, University of Wisconsin, Madison, WI, USA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Obiektyw szerokokątny 2,5x | Olympus | MPLFLN2,5X | |
| 40-krotna soczewka do zanurzenia w wodzie | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| mieszanina 95% O2/5% CO2 | Airgas | Z02OX95R2003045 | |
| A16 | NeuroNexus | A16x1-2mm-100-177-A16 | 16-kanałowa sonda |
| AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP | Karl Deisseroth Lab, UNC Monitor | ||
| (POET II) | Criticare | 602-3A | |
| ATP, Sól magnezowa | Sigma Aldrich | A9187 | roztwór wewnątrzkomórkowy |
| B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Laboratory | 007914 | Zależna od Cre mysz tdTomato |
| B6; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | Jackson Laboratory | 008069 | Mysz PV-Cre |
| Wytrząsarka do brzucha | Thomas Scientific | 1210H86-TS | do równoważenia szczelnych worków z gazem |
| Roztwór betadyny | Marka ogólna Bleach | ||
| Ogólna marka | elektrody zaciskowej do chlorowania srebra | ||
| Bupivicaine | |||
| Chlorek wapnia (CaCl2) | Dot Scientific | DSC20010 | ACSF |
| Szkło kapilarne (nagrania z zaciskiem krosowym) | King Precision Glass, Inc. | KG-33 | borokrzemian, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Długość: 90.0mm |
| Szkło kapilarne (zastrzyki wirusowe) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | 3.5" |
| Sterowanie mikromanipulatorem junior | Luigs i Neumann | SM8 | do sterowania mikromanipulatorem junior |
| Sterowanie manipulatorami i stołem przesuwnym | Luigs and Neumann | SM7 | do sterowania elektrodą wielokanałową i Stół przesuwny |
| Digidata 1440A + Clampex 10 | Molecular Devices | 1440A | Digitizer i oprogramowanie |
| E-3603 rurki | Fisher Scientific | 14171208 | do dostarczania mieszaniny 95% O2/5% CO2 do komory inkubacyjnej + zastosowanie ciśnienia podczas zaciskania łaty |
| EGTA | Dot Scientific | DSE57060 | wewnątrzkomórkowe |
| ERP-27 EEG Panel | referencyjny/krosowy EEGNeuralynx | Wycofana igła | |
| do napełniania | World Precision Instruments | 50821912 | do napełniania pipet z zaciskiem krosowym |
| Kostka filtracyjna do obrazowania EYFP | Olympus | U-MRFPHQ | |
| Bibuła filtracyjna | Fisher Scientific | 09801E | kładzie się na szablonie plastra podczas przygotowywania bloku tkanki |
| Ściągacz do mikropipet płonących/brązowych | Instrument | SutterP-1000 | 2,5x2,5 Pudełko |
| filament Rurka dyspersyjna | gazu Sigma Aldrich | CLS3953312C | |
| Szklana strzykawka (100 mL) | Sigma Aldrich | Z314390 | do napełniania worków z uszczelnieniem gazowym |
| Kwas glukonowy, Sól potasowa (K-glukonian) | Dot Scientific | DSG37020 | roztwór wewnątrzkomórkowy |
| Glucose | Dot Scientific | DSG32040 | ACSF |
| GTP, Sól sodowa | Roztwór wewnątrzkomórkowy | Sigma Aldrich | G8877 |
| Adapter sondy czołowej | Adapter NeuroNexus | A16-OM16 | do podłączenia 16-kanałowej sondy do wejścia sceny głównej |
| Kleszcze hemostatyczne | VWR International | 76192-096 | |
| HEPES | Dot Scientific | DSH75030 | ACSF, roztwór wewnątrzkomórkowy |
| HS-16 Headstage | Neuralynx | Emerytowany | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Alkohol izopropylowy (70%) | VWR International | 101223-746 | |
| Młodszy mikromanipulator | Luigs and Neumann | 210-100 000 0090-R | do manipulacji elektrodą zaciskową |
| Moduł sterowania źródłem światła LED Mightex | BLS-PL02_US | optogenetyczne sterowanie źródłem światła | |
| Wzmacniacz Lidocaine | |||
| Lynx-8 | Neuralynx | wycofany | |
| zasilacz Lynx-8 | Neuralynx | wycofany | |
| siarczan magnezu (MgSO4) | Dot Scientific | DSM24300 | ACSF |
| mCherry, Texas Czerwona kostka | filtracyjna Chroma | 49008 | do obrazowania tdReporter fluorescencyjny |
| pomidorów Meloksykam | |||
| Uchwyt do mikropipet | Fisher Scientific | NC9044962 | |
| Pompa mikrostrzykawkowa | World Precision Instruments | UMP3-4 | |
| Olej mineralny | Marka | ||
| generyczna MultiClamp 700A | Urządzenia molekularne/Axon Instruments | 700A | Wzmacniacz |
| Azot (do stołu powietrznego) | Airgas | NI200 | |
| Nylonowa siatka | Fisher Scientific | 501460083 | rozciągnięta na podkowę ze spłaszczonego drutu platynowego, na tym opiera się plasterek podczas nagrań |
| Nylon, wycięty z rajstop | Mały kawałek marki | do tworzenia platformy plastrów w komorze inkubacyjnej, pojedyncze włókna do tworzenia harfy platynowej | |
| Maść okulistyczna | Fisher Scientific | NC1697520 | |
| Pipeta | Dot Scientific | 307 | Do przenoszenia tkanki na zestaw |
| Drut platynowy | VWR International | BT124000 | 2 cm, spłaszczony, do wykonania harfy platynowej |
| Polygon400 | Mightex | DSI-E-0470-0617-000, | dostarczany z oprogramowaniem PolyScan2 |
| Chlorek potasu (KCl) | Dot Scientific | DSP41000 | ACSF |
| Fosforan potasu (KH2PO4) | Dot Scientific | DSP41200 | ACSF |
| Żyletka | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Szafirowe ostrze (do wibratomu) | VWR International | 100492-502 | |
| Ostrze skalpela | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-361445 | |
| Szczelny worek gazowy | Fisher Scientific | 109236 | |
| Stół przesuwny do mikroskopu | Luigs and Neumann | 380FMU | |
| Wodorowęglan sodu (HCO3-) | Dot Scientific | DSS22060 | ACSF |
| Chlorek sodu (NaCl) | Dot Scientific | DSS23020 | ACSF, roztwór wewnątrzkomórkowy |
| Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) | Mysz Jackson Laboratory | 013044 | SOM-Cre |
| Przyrząd stereotaktyczny | Kopf | Model 902 | Podwójny klej Super Animal |
| Super Staples | 886833 | do mocowania bloku tkanki do etapu próbki podczas przygotowywania plastrów | |
| Wiertarka chirurgiczna | RAM Products Inc. | DIGITALMICROTORQUE | Microtorque II |
| (1 ml) z końcówką LuerLock | Fisher Scientific | 309628 | do wywierania nacisku podczas zaciskania łaty |
| Strzykawka (1 mL) z końcówką ślizgową | WW Grainger, Inc. | 19G384 | do napełniania pipet z zaciskiem krosowym |
| Filtry strzykawkowe VWR | International | 66064-414 | |
| Mikroskop pionowy | Olympus | BX51 | |
| Mikrotom wibracyjny | Leica Biosystems | VT1000S | |
| ręczniki Wypall | Fisher Scientific | 19-042-427 |
Bibliografia
- Baumgart, J. P., et al. Isoflurane inhibits synaptic vesicle exocytosis through reduced Ca2+ influx, not Ca2+-exocytosis coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 112 (38), 11959-11964 (2015).
- Herring, B. E., Xie, Z., Marks, J., Fox, A. P. Isoflurane inhibits the neurotransmitter release machinery. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 1265-1273 (2009).
- Xie, Z., et al. Interaction of anesthetics with neurotransmitter release machinery proteins. Journal of Neurophysiology. 109 (3), 758-767 (2013).
- Crick, F., Koch, C. A framework for consciousness. Nature Neurosciences. 6 (2), 119-126 (2003).
- Koch, C., Massimini, M., Boly, M., Tononi, G. Neural correlates of consciousness: progress and problems. Nature Reviews Neurosciences. 17 (5), 307-321 (2016).
- Dehaene, S., Changeux, J. P. Experimental and theoretical approaches to conscious processing. Neuron. 70 (2), 200-227 (2011).
- Friston, K. A theory of cortical responses. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 360 (1456), 815-836 (2005).
- Mashour, G. A., Hudetz, A. G. Bottom-Up and Top-Down Mechanisms of General Anesthetics Modulate Different Dimensions of Consciousness. Frontiers in Neural Circuits. 11, 44(2017).
- Voss, L. J., Garcia, P. S., Hentschke, H., Banks, M. I. Understanding the Effects of General Anesthetics on Cortical Network Activity Using Ex Vivo Preparations. Anesthesiology. 130 (6), 1049-1063 (2019).
- Redinbaugh, M. J., et al. Thalamus Modulates Consciousness Via Layer-Specific Control of Cortex. Neuron. 105 (4), 0896(2020).
- Carhart-Harris, R. L., Friston, K. J. REBUS and the Anarchic Brain: Toward a Unified Model of the Brain Action of Psychedelics. Pharmacological Reviews. 71 (3), 316-344 (2019).
- Mak-McCully, R. A., et al. Coordination of cortical and thalamic activity during non-REM sleep in humans. Nature communications. 8 (1), 15499(2017).
- Alkire, M. T., Hudetz, A. G., Tononi, G. Consciousness and anesthesia. Science. 322 (5903), 876-880 (2008).
- Sanders, R. D., Maze, M. Noradrenergic trespass in anesthetic and sedative states. Anesthesiology. 117 (5), 945-947 (2012).
- Hemmings, H. C., et al. Towards a Comprehensive Understanding of Anesthetic Mechanisms of Action: A Decade of Discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 40 (7), 464-481 (2019).
- Nourski, K. V., et al. Auditory Predictive Coding across Awareness States under Anesthesia: An Intracranial Electrophysiology Study. Journal of Neurosciences. 38 (39), 8441-8452 (2018).
- Liu, X., et al. Propofol disrupts functional interactions between sensory and high-order processing of auditory verbal memory. Human Brain Mapping. 33 (10), 2487-2498 (2012).
- Hentschke, H., Raz, A., Krause, B. M., Murphy, C. A., Banks, M. I. Disruption of cortical network activity by the general anesthetic isoflurane. British Journal of Anaesthesiology. 119 (4), 685-696 (2017).
- Lee, U., et al. Disruption of frontal-parietal communication by ketamine, propofol, and sevoflurane. Anesthesiology. 118 (6), 1264-1275 (2013).
- Ferrarelli, F., et al. Breakdown in cortical effective connectivity during midazolam-induced loss of consciousness. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 107 (6), 2681-2686 (2010).
- Ku, S. W., Lee, U., Noh, G. J., Jun, I. G., Mashour, G. A. Preferential inhibition of frontal-to-parietal feedback connectivity is a neurophysiologic correlate of general anesthesia in surgical patients. PLoS.One. 6 (10), 25155(2011).
- Lee, M., et al. Network Properties in Transitions of Consciousness during Propofol-induced Sedation. Scientific Reports. 7 (1), 16791(2017).
- Murphy, M., et al. Propofol anesthesia and sleep: a high-density EEG study. Sleep. 34 (3), 283-291 (2011).
- Murphy, C., Krause, B., Banks, M. Selective effects of isoflurane on cortico-cortical feedback afferent responses in murine non-primary neocortex. British Journal of Anaesthesiology. 123 (4), 488-496 (2019).
- Raz, A., et al. Preferential effect of isoflurane on top-down versus bottom-up pathways in sensory cortex. Frontiers in System Neurosciences. 8, 191(2014).
- Schrouff, J., et al. Brain functional integration decreases during propofol-induced loss of consciousness. Neuroimage. 57 (1), 198-205 (2011).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-Specific Feedforward Circuits between Thalamus and Neocortex Revealed by Selective Optical Stimulation of Axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gredell, J. A., Turnquist, P. A., MacIver, M. B., Pearce, R. A. Determination of diffusion and partition coefficients of propofol in rat brain tissue: implications for studies of drug action in vitro. BJA: British Journal of Anaesthesia. 93 (6), 810-817 (2004).
- Benkwitz, C., et al. Determination of the EC50 amnesic concentration of etomidate and its diffusion profile in brain tissue: implications for in vitro studies. Anesthesiology. 106 (1), 114-123 (2007).
- Franks, N. P., Lieb, W. R. Selective actions of volatile general anaesthetics at molecular and cellular levels. British Journal of Anaesthesia. 71 (1), 65-76 (1993).
- Honemann, C. W., Washington, J., Honemann, M. C., Nietgen, G. W., Durieux, M. E. Partition coefficients of volatile anesthetics in aqueous electrolyte solutions at various temperatures. Anesthesiology. 89 (4), 1032-1035 (1998).
- Au - Segev, A., Au - Garcia-Oscos, F., Au - Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024(2016).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Experimental Physiology. 96 (1), 19-25 (2011).
- Banks, M. I., Pearce, R. A. Dual actions of volatile anesthetics on GABAA IPSCs: dissociation of blocking and prolonging effects. Anesthesiology. 90 (1), 120-134 (1999).
- Hagan, C. E., Pearce, R. A., Trudell, J. R., MacIver, M. B. Concentration measures of volatile anesthetics in the aqueous phase using calcium sensitive electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 81, 177-184 (1998).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
