Optogenetyczna aktywacja szlaków aferentnych w wycinkach mózgu i modulacja odpowiedzi za pomocą lotnych środków znieczulających

Summary

Wycinki mózgu ex vivo mogą być używane do badania wpływu lotnych środków znieczulających na wywołane reakcje na bodźce aferentne. Optogenetyka jest wykorzystywana do niezależnej aktywacji aferentów wzgórzowo-korowych i korowo-korowych do niepierwotnej kory nowej, a odpowiedzi synaptyczne i sieciowe są modulowane izofluranem.

Abstract

Środki znieczulające wpływają częściowo na świadomość poprzez swoje działania na obwody wzgórzowo-korowe. Jednak stopień, w jakim lotne środki znieczulające wpływają na różne komórkowe i sieciowe składniki tych obwodów, pozostaje niejasny. Wycinki mózgu ex vivo dostarczają środków, za pomocą których badacze mogą badać dyskretne składniki złożonych sieci i rozplątywać potencjalne mechanizmy leżące u podstaw wpływu lotnych środków znieczulających na wywołane reakcje. Aby wyizolować potencjalne efekty leków specyficzne dla typu komórki i szlaku w wycinkach mózgu, badacze muszą być w stanie niezależnie aktywować szlaki włókien doprowadzających, zidentyfikować nienakładające się populacje komórek i zastosować lotne środki znieczulające do tkanki w roztworze wodnym. W tym protokole opisano metody pomiaru optogenetycznie wywołanych odpowiedzi na dwie niezależne szlaki aferentne do kory nowej w wycinkach mózgu ex vivo. Odpowiedzi zewnątrzkomórkowe są rejestrowane w celu oznaczenia aktywności sieciowej, a ukierunkowane zapisy klamry łatkowej całej komórki są przeprowadzane w interneuronach dodatnich pod względem somatostatyny i parwalbuminy. Opisano dostarczanie fizjologicznie istotnych stężeń izofluranu przez sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy w celu modulowania odpowiedzi komórkowych i sieciowych.

Introduction

Lotne środki znieczulające są powszechnie stosowane w różnych warunkach klinicznych i akademickich od ponad stu lat. Różne klasy środków znieczulających mają unikalne, często nienakładające się na siebie cele molekularne^1,2,3, ale prawie wszystkie z nich powodują utratę przytomności. Podczas gdy ich efekty behawioralne są dość przewidywalne, mechanizmy, za pomocą których środki znieczulające wywołują utratę przytomności, są w dużej mierze nieznane. Środki znieczulające mogą ostatecznie wpływać zarówno na poziom, jak i zawartość świadomości poprzez działania na obwody korowo-wzgórzowe, zakłócając integrację informacji w całej hierarchii korowej^4,5^,6,7,8,9. W szerszym ujęciu, modulacja obwodów korowo-wzgórzowych może odgrywać rolę w eksperymentalnie¹⁰ lub farmakologicznie¹¹ odmiennych stanach świadomości, a także może być związana z sleep¹² oraz w patofizjologicznych zaburzeniach świadomości^13,14.

Nieuchwytność mechanizmów leżących u podstaw utraty i powrotu do świadomości podczas znieczulenia może być częściowo przypisana nieliniowemu, synergicznemu działaniu środków znieczulających na poziomie komórkowym, sieciowym i systemowym¹⁵. Izofluran, na przykład, hamuje aktywność w wybranych obszarach mózgu^16,17,18, upośledza łączność między odległymi regionami mózgu^{19,20,21,22,23} i zmniejsza reakcje synaptyczne w sposób specyficzny dla szlaku manner^24,25. Nie jest jasne, jakie efekty działania środków znieczulających, od poziomu molekularnego do systemowego, są konieczne lub wystarczające do spowodowania utraty przytomności. Oprócz merytorycznych badań klinicznych świadomości przy użyciu technik nieinwazyjnych^19,20,26, ważne jest, aby eksperymentatorzy starali się rozwikłać odrębne interakcje komórkowe i sieciowe, które służą świadomemu doświadczeniu.

Upraszczając złożone interakcje występujące w nienaruszonym mózgu, wycinki mózgu ex vivo pozwalają na badanie izolowanych komponentów dynamicznych systemów mózgu⁹. Preparat o zmniejszonej ilości plastrów łączy w sobie korzyści płynące ze stosunkowo nienaruszonych struktur anatomicznych lokalnych obwodów nerwowych z wszechstronnością manipulacji in vitro. Jednak do niedawna ograniczenia metodologiczne uniemożliwiały badanie właściwości synaptycznych i obwodowych sygnałów wejściowych dalekiego zasięgu w wycinkach mózgu^27,28; Kręta ścieżka dróg włókien korowo-wzgórzowych sprawiła, że aktywacja niezależnych szlaków aferentnych była prawie niemożliwa przez stymulację elektryczną.

Badanie wpływu środków znieczulających na preparaty do wycinania mózgu stanowi dodatkowe wyzwanie. W przypadku braku nienaruszonego układu oddechowego i krążenia, środki znieczulające muszą być stosowane w kąpieli, a stężenia starannie dopasowane do szacowanych stężeń w miejscu działania. W przypadku wielu dożylnych środków znieczulających powolne tempo równoważenia w tkance sprawia, że tradycyjne badania farmakologiczne są pracochłonne^29,30. Badanie wpływu środków znieczulających gazami lotnymi w preparatach ex vivo jest łatwiejsze do opanowania, ale wiąże się również z wyzwaniami. Obejmują one konwersję wdychanych dawek ciśnienia parcjalnego na stężenia wodne oraz potrzebę zmodyfikowanego systemu dostarczania leku do tkanki za pośrednictwem sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego³¹.

Tutaj opisane są metody, za pomocą których badacze mogą wykorzystać dobrze udokumentowane właściwości fizykochemiczne lotnego znieczulającego izofluranu do dostarczania leków do wycinków mózgu ex vivo, aktywować specyficzne dla szlaku i warstwy wejścia do obszaru zainteresowania kory mózgowej o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej, oraz przeprowadzać jednoczesne zapisy laminarne i ukierunkowane zapisy patch clamp z wybranych populacji neuronów. W połączeniu procedury te pozwalają badaczom mierzyć lotne zmiany wywołane znieczuleniem w kilku obserwowalnych właściwościach reakcji elektrofizjologicznej, od poziomu synaptycznego do poziomu sieci lokalnej.

Protocol

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Szkoły Medycznej Uniwersytetu Wisconsin-Madison oraz Zdrowia Publicznego.

1. Hodowla myszy w celu ekspresji fluorescencyjnego białka reporterowego w subpopulacjach interneuronów

1. Połącz homozyogiczną, zależną od Cre samca myszy tdTomato z homozygotyczną samicą SOM-Cre lub homozygotyczną samicą myszy PV-Cre.
   UWAGA: Inne specyficzne populacje neuronów mogą być celem za pomocą odpowiednich linii Cre.
2. Pozwól heterozygotycznemu potomstwu dojrzeć do co najmniej 3 tygodnia życia przed kontynuowaniem. W przypadku opisanych tutaj eksperymentów genotypowanie nie jest konieczne, ponieważ homozygotyczni rodzice produkują potomstwo, które jest heterozygotyczne zarówno pod względem rekombinazy Cre specyficznej dla typu komórki, jak i alleli reporterowych zależnych od Cre.

2. Wykonywanie jednostronnego stereotaktycznego wstrzykiwania konstruktu wirusowego

1. Dostosuj ustawienia ściągacza do mikropipet do pipet iniekcyjnych zgodnie ze wskazówkami w instrukcji obsługi przyrządu (zalecane ustawienia znajdują się w Tabeli 1). Wyciągnij szklaną mikropipetę.
2. Złamać końcówkę ostrego końca pipety tak, aby średnica końcówki wynosiła około 30 μm przy minimalnym zwężeniu na kilku milimetrach.
3. Korzystając z wcześniej udokumentowanych procedur, zdecyduj o odpowiednim mianie i objętości wirusa do wstrzyknięcia. W opisanych tutaj eksperymentach 1,0 μl (miano: 3,1-5,7 TU/ml) wstrzyknięte jednostronnie dało dobre wyniki.
4. Napełnij całą objętość pipety olejem mineralnym. Załaduj pipetę do mikrostrzykawki i przelej niewielką ilość oleju mineralnego przez końcówkę, aby upewnić się, że końcówka nie jest zatkana.
5. Wypełnij przed nim co najmniej 1,0 μl konstruktu wirusowego. Rekombinowanym wektorem wirusowym związanym z adenowirusem użytym w tych eksperymentach był AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP.
6. Ułóż sterylną serwetę w obszarze operacyjnym. Wysterylizuj narzędzia do procedury stereotaktycznej i umieść je na serwety.
7. Znieczulenie heterozygotycznego zwierzęcia SOM-tdPomidor lub PV-tdPomidor za pomocą izofluranu (3% do indukcji, 1,5-2% do konserwacji) i mieszaniny tlenu. Okresowo potwierdzaj chirurgiczny poziom znieczulenia za pomocą szczypania palca u nogi przez cały czas trwania operacji. Upewnij się, że zwierzę nie wykracza poza chirurgiczny plan znieczulenia, monitorując oddechy co 10-15 minut.
8. Ogol czubek głowy zwierzęcia. Nałóż obficie 70% alkohol izopropylowy i roztwór na bazie jodu na obszar operacyjny i maść okulistyczną do oczodołów, aby zapobiec wysuszeniu błony. Bupiwakainę/lidokainę (w stosunku 1:1, 1,0 mg/kg) podawać podskórnie w miejsce operowane w celu znieczulenia miejscowego.
9. Dopasuj zwierzę do ramy stereotaktycznej.
10. Użyj skalpela, aby wykonać nacięcie wzdłuż strzałkowej osi skóry pokrywającej grzbietową powierzchnię czaszki. Cofnij skórę za pomocą kleszczy. W razie potrzeby nawodnij czaszkę 0,9% solą fizjologiczną.
11. Na powierzchni czaszki delikatnie zaznacz krzyżykiem krzyżyk na powierzchni czaszki przecięcie współrzędnych przednich i bocznych. Wywierć otwór o odpowiednich współrzędnych w płaszczyźnie poprzecznej (w mm względem Bregmy, dla wstrzyknięcia kory obręczy (Cg): przednia 0,2, boczna 0,3; dla tylnego wzgórza (Po): tylna 2,25, boczna 3,4).
    UWAGA: Oznaczenia powinny wykraczać poza granice otworu na żarna, aby zapewnić wskazówki dotyczące dokładnego umieszczenia pipety.
12. Włącz i zrównoważ stół powietrzny.
13. Zmienić położenie elektrody ramy stereotaktycznej pod kątem 0° w przypadku wstrzyknięć do Cg lub 45° w płaszczyźnie koronalnej w przypadku wstrzyknięć do Po.
14. Podłączyć pompę strzykawkową do manipulatora elektrod. Podłączyć sterownik pompy mikrostrzykawkowej do pompy strzykawkowej.
15. Poruszać się po końcówce pipety w pobliżu (ale nie dotykając) powierzchni mózgu, na przecięciu znaczników utworzonych w kroku 2.11. Wprowadzić pipetę z prędkością około 1 mm/s wzdłuż jej osi podłużnej do mózgu, 0,9 mm (wstrzyknięcie w Cg) lub 3,1 mm (wstrzyknięcie w Po). Odczekaj 10 minut, zanim przejdziesz dalej.
16. Wstrzyknąć 1,0 μl konstruktu wirusowego przez okres 10 minut (100 nL/min). W przypadku zaobserwowania wycieku wirusa z miejsca wprowadzenia pipety, należy zmniejszyć szybkość wstrzykiwania do 50 nL/min.
17. Po wstrzyknięciu należy odczekać 10 minut, a następnie powoli wyjmować pipetę do wstrzykiwań.
18. Założyć szew zamykający nacięcie skóry głowy i podać podskórnie 2-5 mg/kg meloksykamu.
19. Należy przerwać stosowanie izofluranu i monitorować stan zwierzęcia podczas wychodzenia ze znieczulenia. Pozostawić do rekonwalescencji zgodnie z procedurami opisanymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Instytucji, w tym dalsze podawanie leków przeciwbólowych.

3. Przygotowanie ostrych wycinków mózgu

1. Odczekaj co najmniej 3 tygodnie na ekspresję konstruktu wirusowego przed pobraniem tkanki.
2. Przygotuj 1 l sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego do zabiegu krojenia (krojenie sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego, sACSF). Składniki znajdują się w tabeli 2.
3. Przez cały czas trwania procedury krojenia należy dostarczyć sACSF rozpuszczoną mieszaninę 95% O₂/5% CO_{2 ,} dostarczaną przez rurkę dyspersyjną gazu.
4. Przygotuj lodowatą kąpiel dla mikrotomu z wibrującymi ostrzami. Zamontuj lodowaty stolik na próbkę na mikrotomie i zamocuj szafirowe ostrze na miejscu w celu cięcia tkanek.
5. Znieczulaj mysz 3% izofluranem i tlenem, aż do utraty odruchu prostowania.
6. Odetnij głowę myszy za pomocą gilotyny i natychmiast zanurz głowę w sACSF o temperaturze 4°C. Aby zachować zdrowie tkanki, wykonaj następujące kroki tak szybko, jak to możliwe.
7. Otwórz jamę czaszki, wykonując małe nacięcie u podstawy czaszki i delikatnie usuwając każdą płytkę czaszki. Delikatnie usuń leżącą pod spodem oponę twardą.
8. Gdy mózg nadal znajduje się w jamie czaszki, użyj żyletki, aby usunąć móżdżek. Wykonaj drugie pionowe cięcie wzdłuż płaszczyzny strzałkowej w lewej półkuli, tuż obok linii środkowej.
9. Przygotuj blok tkankowy do cięcia.
   1. Delikatnie unieś mózg z jamy czaszki. Umieść mózg na bibule filtracyjnej płaską, strzałkową płaszczyzną w dół. Poprowadź bibułę filtracyjną po szablonie blokującym i wyrównaj mózg do leżącego pod spodem konturu szablonu (rysunek uzupełniający 1).
   2. Wykonaj dwa równoległe cięcia w płaszczyźnie koronalnej, jak wskazują linie na szablonie. Dodaj niewielką kroplę sACSF, aby bibuła filtracyjna była mokra, jeśli to konieczne.
   3. Umieścić blok tkankowy w sACSF o temperaturze 4°C na krótko, podczas gdy krok 3.8.4 jest przeprowadzany.
   4. Nałóż niewielką ilość super kleju na lodowaty etap próbki.
   5. Podnieś blok tkankowy z zimnego sACSF. Użyj rogu chłonnego ręcznika, aby usunąć nadmiar sACSF. Przyklej tylną płaszczyznę czołową bloku tkankowego do etapu próbki, tak aby grzbietowa powierzchnia mózgu była skierowana w stronę szafirowego ostrza.
10. Zbierz wycinki mózgu koronalnego o grubości 500 μm. Umieść interesujące je plastry na siatce nylonowej (rysunek uzupełniający 2) w temperaturze 34 °C sACSF i pozwól pojemnikowi osiągnąć temperaturę pokojową.
    UWAGA: W opisanych tutaj eksperymentach pobrano zapisy elektrofizjologiczne z odcinka koronalnego wyśrodkowanego około 2,25 mm z tyłu do bregmy w celu zbadania niepierwszorzędowego obszaru czuciowego, przyśrodkowej drugorzędowej kory wzrokowej (V2MM).

4. Przygotowanie eksperymentalnych worków ze sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (eACSF) zawierających rozpuszczony lotny izofluran znieczulający

1. Przygotować 300 ml podstawowej mieszaniny 3,0% izofluranu.
   1. W szczelnie zamkniętym worku z gazem politetrafluoroetylenowym dodać ~100 ml mieszaniny 95% O₂/5% CO_{2 do} 20-30 ml ciekłego izofluranu i niewielką ilość 0,9% soli fizjologicznej. Odczekać co najmniej 30 minut, aby umożliwić zrównoważenie izofluranu między fazą ciekłą i gazową.
   2. Określić ilość nasyconego izofluranu gazowego, V_sat, którą należy dodać do worka zapasowego, korzystając z następującego równania:
      
      gdzie P%_stock to docelowy skład gazu podstawowego (w tym przypadku 3%),_{V stock} to końcowa objętość worka z gazem podstawowym,_{P isofluran} to ciśnienie parcjalne izofluranu w temperaturze pokojowej (~240 mmHg), a_{P total} to ciśnienie atmosferyczne (~760 mmHg).
   3. Dodaj obliczoną ilość nasyconego gazu do pustego worka gazowego i napełnij worek objętością 95% mieszaniny gazów O₂/5% CO_{2 ,} aby uzyskać całkowitą objętość worka do 300 ml.
2. Przygotuj 2 l sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego do perfuzji plastra podczas eksperymentu (eksperymentalne ACSF, eACSF). Składniki znajdują się w tabeli 2. Rozpuścić 95% mieszaniny gazów O₂/5% CO_{2 w} roztworze.
3. Przygotować dwie oddzielne torebki z roztworami kontrolnymi i izofluranowymi.
   1. Do pustego worka z politetrafluoroetylenem dodać 600 ml eACSF i 600 ml mieszaniny 95% O₂/5% CO_{2 .} Oznacz tę torbę jako Kontrola.
   2. Do innego pustego worka z politetrafluoroetylenem dodać 300 ml eACSF. Oznacz tę torbę jako Isoflurane.
   3. Wybrać fizjologicznie istotne zrównoważone stężenie izofluranu w fazie gazowej. Eksperymenty prowadzono przy użyciu stężeń gazów odpowiadających 1,3% izofluranowi. Myszy tracą odruch prostowania i przypuszczalnie przytomność po 0,9% wdychaniu izofluranu.
   4. Użyj poniższego równania, aby obliczyć równoważne stężenie fazy gazowej w temperaturze pokojowej, P%(_{T room})³¹:
      
      gdzie P%(ciało T) jest fizjologicznie istotnym stężeniem fazy gazowej wybranym w kroku 4.3.3,_{pomieszczenie} T wynosi 25 °C, a_ciało T wynosi 37 °C.
   5. Użyj poniższego równania, aby określić objętość gazu z podstawowego worka gazowego,_{V stock}, aby dodać go do roztworu izofluranu.
      
      gdzie_roztwór V jest objętością eACSF w worku izofluranu (300 ml), P%(_{T pomieszczenie}) wprowadza się z równania (2), λ jest współczynnikiem podziału soli fizjologicznej/gazu Ostwalda izofluranu (λ = 1,2³²), a P%_stock jest stężeniem fazy gazowej w podstawowym worku gazowym (P%_stock = 3,0%).
   6. Do worka z roztworem izofluranu dodać objętość gazu z podstawowego worka gazowego, V_zapasu, obliczoną w kroku 4.3.5.
   7. Do worka z roztworem izofluranu dodać objętość mieszaniny 95% O₂/5% CO_{2 ,} aby całkowita objętość gazu w worku z roztworem izofluranu wynosiła 300 ml.
4. Wstrząsać workami kontrolnymi i izofluranem na wytrząsarce przez co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić zrównoważenie faz izofluranu.
5. Po zebraniu wszystkich danych prawidłowe stężenie można zweryfikować za pomocą monitora gazów znieczulających w celu zmierzenia zrównoważonego stężenia izofluranu w stosunku do pozostałego roztworu w worku.
6. Należy podać eksperymentalne stężenia gazów lotnych w jednostkach wodnych, ponieważ stężenia milimolowe są bardziej odporne na zmiany temperatury. Użyj poniższego równania, aby przeliczyć stężenie w fazie gazowej w temperaturze pokojowej, P%(_{T pomieszczenie}), na równoważne stężenie wodne (C_wodne, w mM)³¹:
   
   gdzie α jest współczynnikiem podziału soli i gazu Bunsena dla izofluranu w temperaturze 25°C³².

5. Przygotowanie sprzętu i oprogramowania do nagrań wielokanałowych

1. Skonfiguruj 16-kanałowy system akwizycji danych zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Do zbierania nagrań wielokanałowych można wykorzystać kilka dostępnych na rynku wzmacniaczy i systemów akwizycji danych. W opisanych tu eksperymentach sygnały analogowe są dostarczane przez panel referencyjny elektrod do dwóch wzmacniaczy, gdzie są wzmacniane (2000x) i filtrowane (0,1-10kHz). Wejścia analogowe do systemu akwizycji danych są digitalizowane z częstotliwością 40kHz.
2. Przymocuj odpowiedni 16-kanałowy adapter headstage do mikromanipulatora mikroskopu. Ustaw adapter tak, aby porty złącza żeńskiego były skierowane w dół.
3. Wyreguluj kąt działania tego mikromanipulatora tak, aby był skierowany w dół w kierunku komory nagrywającej, pod kątem około 70° w stosunku do poziomu.
4. Podłącz wejście sceny czołowej do sondy 16 x 1 do elektrofizjologii in vitro za pomocą adaptera headstage zakotwiczonego w mikromanipulatorze.
5. Podłącz złącze wyjściowe headstage do systemu akwizycji danych.
6. Zainstaluj odpowiednie oprogramowanie do pozyskiwania danych. Skonfiguruj 15 kanałów wejściowych tak, aby odpowiadały sygnałom wejściowym z pierwszych 15 wielokanałowych styków sondy. Skonfiguruj pozostały kanał, aby odbierał dane wejściowe z elektrody wewnątrzkomórkowej.
   UWAGA: Należy pamiętać, aby podczas zbierania i analizowania danych brać pod uwagę mapy elektrod i adapterów, aby upewnić się, że odpowiedni sygnał odpowiada stykowi elektrody, z którego został zebrany.

6. Konfiguracja protokołów stymulacji światłem

1. Skonfiguruj system dostarczania światła i zainstaluj dołączone oprogramowanie.
2. Otwórz oprogramowanie. Wybierz konfigurację okablowania sprzętowego, w której źródło wyzwalania (wyjście cyfrowe/TTL) dostarcza sygnał Trigger In do systemu dostarczania światła, a system dostarczania światła dostarcza sygnał Trigger Out do diody LED 470 nm.
3. Zamontuj soczewkę obiektywu o dużej mocy. Korzystając z aparatu cyfrowego, skalibruj obiektyw o dużej mocy do użytku z systemem dostarczania światła.
4. Utwórz nową sekwencję profili stymulacji świetlnej.
   1. Utwórz wybrany wzór. W opisanych tutaj eksperymentach zastosowano okrąg o średnicy 150 μm, aby umożliwić specyficzną dla warstwy aktywację końcówek aksonów.
   2. Aby utworzyć sekwencję profili, skopiuj i wklej ten profil dla każdej z dowolnej liczby prób.
   3. Utwórz listę przebiegów, która zawiera przebiegi o dowolnym natężeniu światła, czasie trwania impulsu lub liczbie impulsu.
   4. Losowo przypisz przebiegi do każdego profilu. Każdy profil z przypisanym mu kształtem fali odpowiada jednemu impulsowi wyzwalającemu z cyfrowego wejścia TTL lub jednej próbie.
   5. Zapisz sekwencję profili.
5. W oprogramowaniu do akwizycji danych utwórz nowy protokół.
   1. Ustaw liczbę prób tak, aby była równa liczbie profilów w właśnie utworzonej sekwencji profili.
   2. Wybierz wejścia sygnału zgodne z tymi skonfigurowanymi w kroku 5.6. Skonfiguruj protokół, który zapewnia pojedyncze cyfrowe wyjście TTL, nagrywając z tych 16 kanałów wejściowych przez odpowiedni czas przed i po wyzwalaczu cyfrowym.

7. Umieszczanie sondy wielokanałowej w wycinku tkanki mózgowej ex vivo

1. Perfuse bąbelkowy eACSF (nie w szczelnie zamkniętych workach) w ilości 3-6 ml / min.
2. Przenieś wycinek mózgu zawierający obszar zainteresowania na siatkę w komorze perfuzyjnej mikroskopu. Zakotwicz harfą platynową (patrz rysunek uzupełniający 3).
3. Obrócić siatkę siatki tak, aby linia styków elektrod na dystalnym końcu sondy wielokanałowej była w przybliżeniu prostopadła do powierzchni siatki.
4. W szerokim oświetleniu i pod precyzyjną kontrolą mikromanipulatora opuść sondę wielokanałową w kierunku powierzchni warstwy.
5. Obróć wieżyczkę kostki filtracyjnej, aby włączyć odpowiednią kostkę filtrującą do wizualizacji fluorescencyjnego białka reporterowego wyrażonego w zakończeniach aksonów aferentów korowych. W razie potrzeby obróć plasterek, aby dokładniej wyrównać sondę z powierzchnią pial.
6. Umieść sondę tuż nad płaszczyzną wycinka, ~200 μm przed ostateczną pozycją docelową wzdłuż osi x, pozostawiając co najmniej jeden kanał poza granicą rejestrowanego obszaru tkanki
7. Powoli włóż sondę do plastra, przesuwając manipulator wzdłuż jego osi podłużnej. Aby zminimalizować uszkodzenia tkanki, przesuwaj sondę tylko do tego stopnia, aby ostre końcówki były widoczne tylko pod powierzchnią tkanki. Zminimalizuje to uszkodzenia tkanki, jednocześnie zapewniając, że styki elektrod stykają się z tkanką.

8. Łatka zaciskająca wybrane neurony i uzyskująca konfigurację całej komórki

1. Przełącz źródło eACSF na workowane rozwiązanie sterujące.
2. Zidentyfikuj fluorescencyjnie znakowaną komórkę w celu ukierunkowanego nagrywania patch clamp.
   1. Ogranicz przysłonę przysłony przysłony do najmniejszej średnicy. Włącz soczewkę obiektywową o małej mocy i ustaw ostrość na tkance.
   2. Wyśrodkuj światło na obszarze tkanki przylegającym do sondy wielokanałowej (ale nie nakładającym się
   na nią).
   3. Włącz obiektyw zanurzeniowy o dużej mocy (40x lub 60x), zachowując ostrożność, aby uniknąć kontaktu między sondą wielokanałową a soczewką obiektywu.
   4. Obróć wieżyczkę kostki filtracyjnej, aby włączyć odpowiedni zestaw filtrów, aby umożliwić obrazowanie komórek wyrażających marker fluorescencyjny zależny od Cre.
   5. Zidentyfikuj fluorescencyjnie znakowaną komórkę jako cel do nagrywania patch clamp. Podnieś soczewkę obiektywu, aby uzyskać wystarczająco dużo miejsca na opuszczenie pipety z plastrem.
3. Załadować pipetę z plastrem (patrz Tabela 1) roztworem wewnętrznym (Tabela 2) i zamontować pipetę w uchwycie elektrody. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml zastosuj nadciśnienie odpowiadające ~0,1 ml powietrza.
4. Włóż pipetę z plastrem do roztworu. Ustaw ostrość końcówki pipety zgodnie ze wskazówkami wizualnymi.
5. Uzyskaj zapis całej komórki z komórki docelowej, wykonując czynności opisane wcześniej³³.
6. Jeśli planujesz ocenić zmiany wewnętrznych właściwości ogniwa (np. rezystancji wejściowej, szybkości wyzwalania potencjału czynnościowego w odpowiedzi na bieżące kroki), przeprowadź te zapisy. W przeciwnym razie przejdź do protokołu stymulacji aksonów poniżej.

9. Specyficzna dla warstwy optogenetyczna aktywacja zakończeń aksonów

1. Manipuluj polem widzenia w płaszczyźnie x-y, aby wyrównać profil stymulacji świetlnej z żądanym miejscem na przekroju.
2. Załaduj protokół bodźca świetlnego i przygotuj system dostarczania światła do odbioru cyfrowego impulsu TTL.
3. Optogenetycznie aktywuj zakończenia aksonów, jednocześnie rejestrując potencjały pola zewnątrzkomórkowego i fluktuacje błony wewnątrzkomórkowej.
4. Przełączyć źródło eACSF na roztwór izofluranu i myć lek przez 15 minut. W razie potrzeby zbierz spontaniczne nagrania podczas zmywania.
5. Powtórz kroki 9.2-9.3.
6. Przełącz źródło eACSF na roztwór kontrolny i wypłucz lek przez 20 minut. W razie potrzeby zbierz spontaniczne nagrania podczas wypłukiwania.
7. Powtórz kroki 9.2-9.3.

Results

Oś czasu kroków opisanych w protokole jest pokazana w Rysunek 1. Dane wejściowe kory mózgowej przychodzące z obszarów korowych wyższego rzędu lub z niepierwszorzędowych jąder wzgórza mają częściowo nakładające się pola końcowe w warstwie 1 niepierwszorzędowej kory wzrokowej²⁴. Aby wyizolować niezależne szlaki aferentne wzgórzowo-korowe lub korowo-korowe, wstrzyknięto wektor wirusowy zawierający ChR2 i fluorescencyjny reporter eYFP do Po lub Cg. Komórki w promieniu wst...

Discussion

W tym artykule opisano protokół oceny wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych odpowiedzi na selektywnie aktywowane szlaki aferentne w wycinkach mózgu ex vivo.

Wykorzystanie narzędzi optogenetycznych i równoległych schematów zapisu pozwala badaczom badać reakcje lokalnych populacji na aferentne dane wejściowe z odległych regionów mózgu, jednocześnie rejestrując z docelowych populacji interneuronów. Zastosowanie technologii optogenetycznej pozwala na zachowanie i aktywację zakończeń aksonów projekcji af...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Obiektyw szerokokątny 2,5x	Olympus	MPLFLN2,5X
40-krotna soczewka do zanurzenia w wodzie	Olympus	LUMPLFLN40XW
mieszanina 95% O2/5% CO2	Airgas	Z02OX95R2003045
A16	NeuroNexus	A16x1-2mm-100-177-A16	16-kanałowa sonda
AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP	Karl Deisseroth Lab, UNC Monitor
(POET II)	Criticare	602-3A
ATP, Sól magnezowa	Sigma Aldrich	A9187	roztwór wewnątrzkomórkowy
B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	The Jackson Laboratory	007914	Zależna od Cre mysz tdTomato
B6; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J	Jackson Laboratory	008069	Mysz PV-Cre
Wytrząsarka do brzucha	Thomas Scientific	1210H86-TS	do równoważenia szczelnych worków z gazem
Roztwór betadyny	Marka ogólna Bleach
	Ogólna marka		elektrody zaciskowej do chlorowania srebra
Bupivicaine
Chlorek wapnia (CaCl2)	Dot Scientific	DSC20010	ACSF
Szkło kapilarne (nagrania z zaciskiem krosowym)	King Precision Glass, Inc.	KG-33	borokrzemian, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Długość: 90.0mm
Szkło kapilarne (zastrzyki wirusowe)	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	3.5"
Sterowanie mikromanipulatorem junior	Luigs i Neumann	SM8	do sterowania mikromanipulatorem junior
Sterowanie manipulatorami i stołem przesuwnym	Luigs and Neumann	SM7	do sterowania elektrodą wielokanałową i Stół przesuwny
Digidata 1440A + Clampex 10	Molecular Devices	1440A	Digitizer i oprogramowanie
E-3603 rurki	Fisher Scientific	14171208	do dostarczania mieszaniny 95% O2/5% CO2 do komory inkubacyjnej + zastosowanie ciśnienia podczas zaciskania łaty
EGTA	Dot Scientific	DSE57060	wewnątrzkomórkowe
ERP-27 EEG Panel	referencyjny/krosowy EEGNeuralynx	Wycofana igła
do napełniania	World Precision Instruments	50821912	do napełniania pipet z zaciskiem krosowym
Kostka filtracyjna do obrazowania EYFP	Olympus	U-MRFPHQ
Bibuła filtracyjna	Fisher Scientific	09801E	kładzie się na szablonie plastra podczas przygotowywania bloku tkanki
Ściągacz do mikropipet płonących/brązowych	Instrument	SutterP-1000	2,5x2,5 Pudełko
filament Rurka dyspersyjna	gazu Sigma Aldrich	CLS3953312C
Szklana strzykawka (100 mL)	Sigma Aldrich	Z314390	do napełniania worków z uszczelnieniem gazowym
Kwas glukonowy, Sól potasowa (K-glukonian)	Dot Scientific	DSG37020	roztwór wewnątrzkomórkowy
Glucose	Dot Scientific	DSG32040	ACSF
GTP, Sól sodowa	Roztwór wewnątrzkomórkowy	Sigma Aldrich	G8877
Adapter sondy czołowej	Adapter NeuroNexus	A16-OM16	do podłączenia 16-kanałowej sondy do wejścia sceny głównej
Kleszcze hemostatyczne	VWR International	76192-096
HEPES	Dot Scientific	DSH75030	ACSF, roztwór wewnątrzkomórkowy
HS-16 Headstage	Neuralynx	Emerytowany
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Alkohol izopropylowy (70%)	VWR International	101223-746
Młodszy mikromanipulator	Luigs and Neumann	210-100 000 0090-R	do manipulacji elektrodą zaciskową
Moduł sterowania źródłem światła LED Mightex		BLS-PL02_US	optogenetyczne sterowanie źródłem światła
Wzmacniacz Lidocaine
Lynx-8	Neuralynx	wycofany
zasilacz Lynx-8	Neuralynx	wycofany
siarczan magnezu (MgSO4)	Dot Scientific	DSM24300	ACSF
mCherry, Texas Czerwona kostka	filtracyjna Chroma	49008	do obrazowania tdReporter fluorescencyjny
pomidorów Meloksykam
Uchwyt do mikropipet	Fisher Scientific	NC9044962
Pompa mikrostrzykawkowa	World Precision Instruments	UMP3-4
Olej mineralny	Marka
generyczna MultiClamp 700A	Urządzenia molekularne/Axon Instruments	700A	Wzmacniacz
Azot (do stołu powietrznego)	Airgas	NI200
Nylonowa siatka	Fisher Scientific	501460083	rozciągnięta na podkowę ze spłaszczonego drutu platynowego, na tym opiera się plasterek podczas nagrań
Nylon, wycięty z rajstop	Mały kawałek marki		do tworzenia platformy plastrów w komorze inkubacyjnej, pojedyncze włókna do tworzenia harfy platynowej
Maść okulistyczna	Fisher Scientific	NC1697520
Pipeta	Dot Scientific	307	Do przenoszenia tkanki na zestaw
Drut platynowy	VWR International	BT124000	2 cm, spłaszczony, do wykonania harfy platynowej
Polygon400	Mightex	DSI-E-0470-0617-000,	dostarczany z oprogramowaniem PolyScan2
Chlorek potasu (KCl)	Dot Scientific	DSP41000	ACSF
Fosforan potasu (KH2PO4)	Dot Scientific	DSP41200	ACSF
Żyletka	Fisher Scientific	12-640
Szafirowe ostrze (do wibratomu)	VWR International	100492-502
Ostrze skalpela	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-361445
Szczelny worek gazowy	Fisher Scientific	109236
Stół przesuwny do mikroskopu	Luigs and Neumann	380FMU
Wodorowęglan sodu (HCO3-)	Dot Scientific	DSS22060	ACSF
Chlorek sodu (NaCl)	Dot Scientific	DSS23020	ACSF, roztwór wewnątrzkomórkowy
Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre)	Mysz Jackson Laboratory	013044	SOM-Cre
Przyrząd stereotaktyczny	Kopf	Model 902	Podwójny klej Super Animal
	Super Staples	886833	do mocowania bloku tkanki do etapu próbki podczas przygotowywania plastrów
Wiertarka chirurgiczna	RAM Products Inc.	DIGITALMICROTORQUE	Microtorque II
(1 ml) z końcówką LuerLock	Fisher Scientific	309628	do wywierania nacisku podczas zaciskania łaty
Strzykawka (1 mL) z końcówką ślizgową	WW Grainger, Inc.	19G384	do napełniania pipet z zaciskiem krosowym
Filtry strzykawkowe VWR	International	66064-414
Mikroskop pionowy	Olympus	BX51
Mikrotom wibracyjny	Leica Biosystems	VT1000S
ręczniki Wypall	Fisher Scientific	19-042-427