Ten protokół opisuje budowę taniego systemu mikroiniekcji, jego stereotaktyczne wszczepianie w głębokie struktury mózgu oraz procedurę czasowych mikroiniekcji tetrodotoksyny u szczurów przytomnych i nieskrępowanych. Celem jest ujawnienie udziału struktur podwzgórza w regulacji owulacji poprzez hamowanie ich aktywności neuronalnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Odkrywanie roli dyskretnych obszarów mózgu szczura w regulacji owulacji poprzez odwracalną inaktywację za pomocą mikroiniekcji tetrodotoksyny
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wiele eksperymentalnych podejść zostało wykorzystanych do badania roli mózgu w regulacji owulacji. Przykładem może być uszkodzenie i deaferentacja grup neuronów, które są metodami inwazyjnymi, które trwale naruszają integralność obszaru docelowego. Metodom tym towarzyszą skutki uboczne, które mogą wpływać na analizę ostrych i czasowych mechanizmów regulacyjnych. Stereotaktyczne wszczepienie kaniul prowadzących skierowanych do określonych obszarów mózgu, po którym następuje okres rekonwalescencji, pozwala naukowcom na mikrowstrzykiwanie różnych leków po ustąpieniu niepożądanych skutków operacji. Tetrodotoksyna została wykorzystana do określenia ról kilku obszarów mózgu w różnych procesach fizjologicznych, ponieważ przejściowo hamuje potencjały czynnościowe zależne od sodu, blokując w ten sposób całą aktywność neuronalną w regionie docelowym. Protokół ten łączy tę metodę ze strategiami oceny cyklu rujowego i owulacji, aby ujawnić rolę dyskretnych regionów mózgu w regulacji owulacji w określonych momentach dowolnego etapu cyklu rujowego. Przytomne i niepohamowane szczury (Rattus norvegicus) stosowano w celu uniknięcia blokującego działania, jakie środki znieczulające i hormony stresu wywierają na owulację. Protokół ten można łatwo dostosować do innych gatunków, celów mózgowych i czynników farmakologicznych w celu badania różnych procesów fizjologicznych. Przyszłe ulepszenia tej metody obejmują zaprojektowanie systemu mikroiniekcji wykorzystującego szklane kapilary o małej średnicy zamiast kaniul prowadzących. Zmniejszy to ilość tkanki uszkodzonej podczas implantacji i zmniejszy rozprzestrzenianie się podawanych leków poza obszar docelowy.
Wprowadzenie
Owulacja to proces, w którym jeden lub więcej dojrzałych oocytów jest uwalnianych z jajników raz na cykl estralny/menstruacyjny. Ponieważ rozmnażanie wszystkich gatunków ssaków zależy od produkcji gamet, zrozumienie mechanizmów regulujących owulację ma ogromny wpływ w różnych dziedzinach, od biomedycyny, przemysłu hodowlanego i utrzymania zagrożonych gatunków. Owulacja jest regulowana przez oś podwzgórze-przysadka-jajnik, która obejmuje kilka obszarów podwzgórza i pozapodwzgórza, gonadotropy w przedniej przysadce mózgowej oraz komórki osłonki i ziarnistości, które wraz z oocytami tworzą pęcherzyki jajnikowe wewnątrz jajników1.
Pęcherzyki jajnikowe rosną, rozwijają się i w końcu owulują w odpowiedzi na toniczne i fazowe wydzielanie hormonu folikulotropowego i hormonu luteinizującego, dwóch gonadotropin wydzielanych przez gonadotropy. Wzorzec wydzielania gonadotropin ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego rozwoju pęcherzyków jajnikowych i owulacji i jest regulowany przez hormon uwalniający gonadotropiny (GnRH)1,2. Ten neuropeptyd jest syntetyzowany przez neurony rozsiane po całym śródmózgowiu, a następnie wydzielany do wrotnego naczynia krwionośnego, które łączy podwzgórze i przedni płat przysadki. Aktywność wydzielnicza neuronów GnRH jest z kolei modulowana przez sygnał synaptyczny pochodzący z różnych struktur mózgu. Struktury te przekazują informacje o stanie środowiska zewnętrznego i wewnętrznego organizmu, w tym o dostępności pokarmu, długości fotoperiodu i stężeniu hormonów we krwi. W tym sensie kształtują one wzorzec rozrodczy każdego gatunku i należy określić konkretne role tych struktur, aby właściwie zrozumieć mechanizmy rządzące owulacją. Jako przykład wykazano, że wahania poziomu estradiolu podczas cyklu rujowego regulują wydzielanie GnRH; jednak neurony GnRH nie wyrażają izoformy receptora estradiolu potrzebnej do wykrycia takich zmian. Dwie populacje neuronów wyrażających te receptory znajdują się odpowiednio w rostralnym regionie okołokomorowym trzeciej komory i w jądrze łukowatym oraz stabilizują synapsy z neuronami GnRH. Istnieją dowody sugerujące, że neurony te interpretują stężenie estradiolu, a następnie stymulują aktywność neuronów GnRH poprzez uwalnianie kisspeptyny, silnego induktora wydzielania GnRH3.
Eksperymenty obejmujące termiczne lub chemiczne zmiany, a także mechaniczną deaferencję, pozwoliły badaczom określić udział kilku struktur mózgu w regulacji owulacji4,5,6,7,8,9,10, 11,12. Eksperymenty te mają jednak tę wadę, że są inwazyjne i traumatyczne, wymagają kilku dni rekonwalescencji przed oceną efektów leczenia, co utrudnia analizę ostrych skutków leczenia. Ponadto trwale wpływają na docelowe obszary i w dłuższej perspektywie zakłócają inne procesy fizjologiczne. Ze względu na te problemy, wyniki tych eksperymentów są zwykle zaciemnione przez homeostatyczne mechanizmy kompensacyjne w ciele zwierzęcia, a wydobycie dokładnych informacji na temat czasowej dynamiki regulacyjnej, w którą zaangażowany jest obszar, jest raczej trudne.
Mikroiniekcja leków, które przejściowo zakłócają aktywność neuronów za pomocą kaniul prowadzących, jest odpowiednią alternatywą, która przewyższa wady wymienione powyżej. Kaniule można umieścić w dowolnym obszarze mózgu za pomocą operacji stereotaktycznej, co pozwala badaczowi rozpocząć leczenie farmakologiczne po zniknięciu zakłócających skutków operacji. Czasowa mikroiniekcja leków pozwala naukowcom przetestować hipotezy dotyczące udziału regionu w określonym etapie procesu i może być wykonywana u zwierząt przytomnych, skrępowanych lub poruszających się swobodnie. Różne leki, w tym środki znieczulające miejscowo, agoniści, antagoniści, przeciwstawni agoniści i toksyny biologiczne, takie jak tetrodotoksyna (TTX), mogą być mikrowstrzykiwane do obszaru zainteresowania w określonym czasie.
TTX to biologiczna toksyna syntetyzowana przez bakterie żyjące w ciele rozdymki, a także innych kręgowców i bezkręgowców. TTX wycisza aktywność neuronalną poprzez selektywną i przejściową blokadę kanałów sodowych, co powoduje zahamowanie potencjałów czynnościowych zależnych od sodu. W obecności TTX komórki doświadczają zmiany w fazie depolaryzacji, a zatem nie są pobudliwe, ale pozostają żywe. Blokujący efekt TTX tłumaczy się jego składem molekularnym: grupa guanidynowa jest w stanie przejść przez zewnątrzkomórkowy aspekt kanału sodowego, ale reszta cząsteczki nie może przejść ze względu na swój rozmiar, więc jest zablokowana i blokuje kanał13,14,15,16,17. Mechanizm działania TTX pozwolił na wykorzystanie go jako narzędzia do badania układu nerwowego zarówno in vitro, jak i in vivo. Domózgowe wstrzyknięcie tej toksyny zostało wykorzystane do zbadania roli dyskretnych obszarów mózgu w kilku procesach, takich jak zachowywanie pamięci18, sen i pobudzenie19, rozpoznawanie miejsca20, nawigacja przestrzenna21, nadużywanie narkotyków22, termoregulacja23, rozwój schizofrenii24, zachowania seksualne25 oraz regulacja owulacji26. W tym protokole opisujemy wpływ na owulację przejściowej inaktywacji jąder podwzgórza przez mikroiniekcję TTX u przytomnych i nieskrępowanych szczurów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM. Instytucja ta działa ściśle zgodnie z meksykańskimi przepisami dotyczącymi obchodzenia się ze zwierzętami, oficjalną normą: NOM-062-ZOO-1999, która jest zgodna z międzynarodowymi wytycznymi.
1. Budowa obustronnych kaniul
- Wyjmij trzonek ze stali nierdzewnej z piasty dwóch igieł podskórnych 23 G za pomocą pęsety ciśnieniowej, a następnie usuń pozostały klej za pomocą ostrza skalpela.
- Narysuj linię w odległości 15 mm od końca trzonów za pomocą drobnego markera permanentnego. Użyj pęsety tnącej, aby usunąć ścięte końce.
- Chwyć segmenty 15 mm drobnymi hemostatami i dociśnij je prostopadle tarczą tnącą przymocowaną do narzędzia obrotowego, aż do uzyskania 14 mm odcinków rurki. Ten krok jest wykonywany w celu wyeliminowania przesłoniętej części trzonów, tworząc otwarte i końce. Na koniec wbij igłę 30 G przez segmenty, aby wyeliminować wszelkie wewnętrzne przeszkody.
- Określ odległość między interesującymi strukturami w lewej i prawej półkuli mózgu za pomocą atlasu mózgu27. Użyj gliny do formowania, aby przymocować dwa segmenty 14 mm do szkiełka mikroskopowego i upewnij się, że oba znajdują się na tym samym poziomie poziomym. Obserwuj przez mikrometr okularowy (10x) i dopasuj segmenty drobną pęsetą, aż do uzyskania żądanej odległości.
- Wymieszaj pastę lutowniczą z 10% kwasem solnym w proporcji 2:1 i dodaj kroplę mieszaniny 2 mm poniżej końca segmentów. oba segmenty jednym punktem za pomocą lutownicy i drutu lutowniczego o średnicy 0,5 mm. Upewnij się, że lut nie zasłania światła segmentów.
- Stwórz podporę, aby przymocować kaniulę do uchwytu stereotaktycznego, przecinając 10-milimetrowy odcinek sprężystego drutu ze stali nierdzewnej o średnicy 0,3 mm. Użyj pleśni gliny, aby umieścić 2 mm drutu w kontakcie z poprzednim punktem lutowniczym, a resztę leżeć nad końcem kaniul. drut do kaniul.
- Oczyść powierzchnię kaniul 70% etanolem, aby usunąć nadmiar pasty lutowniczej. Przepłucz wnętrze kaniul sterylną wodą, aby usunąć cząstki metaliczne. Powtarzaj ten proces, aż pod mikroskopem nie będzie można wykryć żadnych cząstek w 10-krotnym powiększeniu.
2. Budowa obturatorów i czapek
- Do budowy obturatorów należy wyciąć dwa 16 mm segmenty okrągłego miękkiego drutu ze stali nierdzewnej (o średnicy 0,35 mm). Przytrzymaj obustronną kaniulę z hemostatykami, prostopadle do stołu laboratoryjnego i włóż jeden z tych segmentów do każdej kaniuli, aż dotrą do stołu. Zegnij resztkę pod kątem 90°.
- Na nasadki wytnij dwa 2 mm segmenty silikonowej rurki (średnica wewnętrzna = 0,76 mm) i nałóż kroplę kleju silikonowego na jeden z końców każdego segmentu. Nie pozwól, aby klej dostał się do rurki. Pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 24 godziny.
3. Budowa mikrowtryskiwaczy
- Powtórz krok 1.1, używając zamiast tego igieł podskórnych o sile 30 G, aby utworzyć trzony.
- Narysuj linię w odległości 18,5 mm od końca wałów i usuń resztki ściętych końców za pomocą pęsety tnącej.
- Powtórz krok 1.1 z pojedynczą igłą 23 G, aby zbudować adaptery, przecinając dwa segmenty o długości 6 mm, zaczynając od końca.
- Usunąć zasłonięte części segmentów 6 mm, dociskając je prostopadle do tarczy tnącej, aż do uzyskania dwóch adapterów 4 mm. Wyeliminuj wszelkie przeszkody wewnętrzne.
- Włóż ścięty koniec segmentów 30 G do adapterów. Spójrz przez mikroskop stereoskopowy, aby upewnić się, że koniec obu, segmentów i adapterów, znajduje się na tym samym poziomie. Nałóż klej cyjanoakrylowy na dystalny staw za pomocą bawełnianego wacika i pozostaw do wyschnięcia na 15 minut.
- Namocz dwa teflonowe łączniki rurek w 70% etanolu na 5 minut, a następnie przymocuj je do mikrowtryskiwaczy za pomocą adapterów. Poczekaj, aż średnica złączy zmniejszy się przez co najmniej 24 godziny, a następnie wysterylizuj mikrowtryskiwacz metodą niskotemperaturową, aby uniknąć uszkodzenia złączy (zalecana jest sterylizacja tlenkiem etylenu).
4. Pielęgnacja zwierząt i wymazy z pochwy
- Używaj cyklicznych dorosłych samic szczurów kapturowych (Rattus norvegicus, szczep CIIZ-V) o wadze od 230 do 260 gramów. Szczury trzymane są w grupach po cztery w standardowych klatkach polipropylenowych w pomieszczeniu o fotoperiodzie 14:10 od jasnego do ciemnego. Ustaw temperaturę i wilgotność odpowiednio na 22 ± 2 °C i na 40%. Zapewnij jedzenie i wodę ad libitum.
- Wymaz z pochwy należy wykonywać codziennie między godziną 10:00 a 12:00.
- Zmodyfikowaną pętlę bakteriologiczną o średnicy wewnętrznej 1 mm wysterylizować za pomocą lampy alkoholowej i schłodzić sterylną wodą. Trzymaj szczura pewnym uchwytem i wprowadź 5 mm pętli bakteriologicznej do pochwy, dotykając jej wewnętrznych ścianek. Usuń pętlę bakteriologiczną. Jeśli się powiedzie, na czubku pojawi się mętna kropla. Umieść tę kroplę na szkiełku mikroskopowym.
- Powtórz ten proces dla każdego szczura, sterylizując i schładzając pętlę między każdym zwierzęciem.
- Po wyschnięciu kropli wybarwić hematoksyliną-eozyną i obserwować próbki pod mikroskopem pod 10x.
- Określ proporcję leukocytów, komórek jądrzastych nabłonka i komórek zrogowaciałych w każdym rozmazie i sklasyfikuj go zgodnie z kryteriami etapów cyklu rujowego opisanych w Rysunek 1, który zgadza się z poprzednią literaturą28,29.
5. Stereotaktyczne wszczepienie kaniul
UWAGA: Wykonaj implantację kaniul po regularnym aseptycznym zabiegu stereotaktycznym i przestrzegając norm instytucjonalnych.
- Przed zabiegiem
- Sterylizuj narzędzia chirurgiczne, kaniule, chirurgiczne, zasłony, gazę i drewniane waciki bawełniane 24 godziny przed zabiegiem za pomocą autoklawu parowego. Sterylizuj końcówki metalowych narzędzi między kolejnymi operacjami, czyszcząc je 10% nadtlenkiem wodoru, a następnie wodą, a następnie umieść je w sterylizatorze z gorącymi kulkami.
- Przygotuj obszary robocze i instrument stereotaktyczny przed usunięciem zwierzęcia z sali domowej. Przygotuj zwierzę do operacji w obszarze, który znajduje się jak najdalej od stołu operacyjnego, aby uniknąć zanieczyszczenia podczas zabiegu.
- Oczyść miejsca przygotowania i zabiegu 70% etanolem, a następnie nałóż 10% roztwór chlorku na dziesięć minut. Oczyść podstawę, ramę i manipulatory instrumentu stereotaktycznego 70% etanolem i wysterylizuj końcówki nauszników za pomocą gorącego sterylizatora kulek i schłodzić je powietrzem przed zabiegiem.
- Operację należy wykonać w dedykowanym fartuchu laboratoryjnym, masce na twarz, nakryciu głowy, rękawach chirurgicznych, ochraniaczach na buty i rękawicach chirurgicznych. Poproś asystenta o przygotowanie zwierząt do operacji i sprawdzenie ich ogólnego stanu podczas zabiegu.
- Przymocuj kaniulę do uchwytu stereotaktycznego. Poproś asystenta, aby przyniósł do pokoju pierwsze zwierzę, które ma być operowane. Wybierz szczury w diestrus do operacji, ponieważ obserwacje z naszego laboratorium wskazują, że zwierzęta te szybciej odzyskują prawidłowe cykle rujowe niż szczury operowane w innych etapach, prawdopodobnie dlatego, że reakcja na stres zmienia się wraz z cyklem rujowym.
- Zważ zwierzę i wywołaj znieczulenie 4% izofluranem w 100% tlenu w komorze indukcyjnej dla szczurów podłączonej do parownika izofluranu. Aby uniknąć stresowania zwierząt, nie napełniaj komory przed wstępnym napełnieniem. Potwierdź chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, sprawdzając rozszerzenie źrenicy i utratę bólu mierzoną testami szczypania ogona i uszu po zaobserwowaniu utraty odruchu prostowania.
- Znieczulić szczura przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg), jeśli parownik izofluranu nie jest dostępny.
- Wyjmij szczura z komory indukcyjnej i użyj stożka nosowego w tabeli przygotowawczej, aby utrzymać efekty znieczulenia 2,5% izofluranem w 100% tlenie. Przytnij włosy na skórze głowy maszynką do strzyżenia i usuń luźne włosy za pomocą wałka do kłaczków. Przedoperacyjną dawkę podskórną 2 mg/kg meloksykamu i 5 mg/kg enrofloksacyny należy wstrzyknąć podskórnie odpowiednio jako niesteroidowy lek przeciwzapalny/przeciwbólowy i antybiotyk.
- Nałóż sztuczne łzy hypromelozy na każde oko, aby uniknąć wysuszenia podczas zabiegu.
- Zamontuj zwierzę w instrumencie stereotaktycznym nad podkładką rozgrzewającą za pomocą niepękających pasków dousznych i maski anestezjologicznej. Wyreguluj nos clamp, aby upewnić się, że głowa zwierzęcia jest płaska. Wykonaj peeling chirurgiczny w ogolonym obszarze, naprzemiennie z powidonem-jodem z mydłem i 70% etanolem jeden raz, a następnie dwa razy używając powidonu-jodu i 70% etanolu. Włóż termometr doodbytniczy, aby zarejestrować temperaturę zwierzęcia podczas zabiegu, a następnie przykryj go sterylnym polem operacyjnym.
- Podczas zabiegu
- Za pomocą skalpela wykonaj 2-centymetrowe nacięcie w skórze i mięśniu pośrodku ogolonego obszaru. Usuń okostną z czaszki za pomocą bawełnianego wacika pokrytego 2% nadtlenkiem wodoru, aby odsłonić bregmę lub lambdę, punkty orientacyjne, które zostaną użyte do obliczenia współrzędnych docelowych. Osusz czaszkę powietrzem, aby uzyskać lepszą wizualizację punktu orientacyjnego.
- Użyj manipulatorów instrumentu stereotaktycznego, aby przesunąć kaniulę do pozycji bezpośrednio nad wybranym punktem orientacyjnym. Zarejestruj współrzędne przednio-tylne i przyśrodkowo-boczne z instrumentu stereotaktycznego i użyj ich do obliczenia współrzędnych obszaru docelowego zgodnie z atlasem mózgu27.
- Ustaw obliczone współrzędne w przyrządzie stereotaktycznym i umieść końcówkę kaniuli na powierzchni czaszki. Zarejestruj współrzędną grzbietowo-brzuszną i użyj jej do obliczenia głębokości do obszaru docelowego.
- Zdejmij ramię manipulatora, odkręcając je od ramy. Użyj wiertła dentystycznego przymocowanego do narzędzia obrotowego z prędkością 15 000 obr./min, aby zaznaczyć miejsce, w którym zostanie wykonana kraniotomia. Następnie użyj zadziorów, aby zrobić trzy otwory, tworząc trójkąt równoboczny wokół znaku. Otwory te nie mogą przebijać czaszki. Włóż chirurgiczne do otworów, upewniając się, że są dobrze osadzone.
- Spraw, aby kraniotomia była wystarczająco szeroka, aby dostosować się do odległości między obszarami docelowymi w każdej półkuli. Powinien mieć jak najmniejszą średnicę, ale wystarczająco dużą, aby umożliwić obniżenie kaniuli bez dotykania granic czaszki, ponieważ zmieni to trajektorię. Kraniotomię należy wykonywać stopniowo, stosując możliwie najmniejszy nacisk. Czaszka gryzonia ma zaledwie kilka milimetrów grubości i ma kluczowe znaczenie dla zachowania integralności tkanek znajdujących się poniżej.
- Gdy opona twarda jest widoczna, użyj sterylnej igły 21 G z końcówką zakrzywioną pod kątem 90°, aby usunąć drzazgi kości i wykonać przednio-tylne cięcie w oponach mózgowych. Użyj techniki Wirtshafter and associate30, aby uniknąć uszkodzenia zatoki strzałkowej górnej, jeśli obszar docelowy znajduje się blisko linii środkowej.
- Umieść uchwyt z kaniulą w ramie i użyj manipulatora grzbietowo-brzusznego, aby dotrzeć do współrzędnej brzusznej. Sprawdź, czy igła nie dotyka granic podczas schodzenia i w razie potrzeby zwiększ średnicę kraniotomii.
UWAGA: Ważne jest, aby końcówka kaniul prowadzących była skierowana na obszar w zakresie od 0.5 do 2.0 mm powyżej obszaru zainteresowania. Wynika to z reakcji zapalnej mózgu w odpowiedzi na wprowadzenie ciał obcych i zniszczenie tkanki. Jest to szczególnie ważne, jeśli obszar zainteresowania jest mały, a odległość robocza musi być wcześniej obliczona empirycznie.
- Umieść uchwyt z kaniulą w ramie i użyj manipulatora grzbietowo-brzusznego, aby dotrzeć do współrzędnej brzusznej. Sprawdź, czy igła nie dotyka granic podczas schodzenia i w razie potrzeby zwiększ średnicę kraniotomii.
- Nałóż cement dentystyczny, aby przymocować kaniulę do czaszki i pozostaw do wyschnięcia. Upewnij się, że cement dentystyczny nie zakrywa końca kaniuli, ponieważ spowoduje to jej nieodwracalne zablokowanie. Poczekaj, aż cement całkowicie się zestali.
- Włożyć zasłony, aby uniknąć dalszych przeszkód i zapewnić drożność podczas badania. Załóż silikonową nasadkę, aby uniknąć zanieczyszczenia.
- Po zabiegu chirurgicznym
- Utracone płyny należy zastąpić wstrzyknięciem dootrzewnowym 1,0 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej o temperaturze fizjologicznej. Umieść zwierzę w klatce rekonwalescencji ze wsparciem termicznym do czasu, aż dojdzie do siebie po znieczuleniu. Okresowo sprawdzaj temperaturę i tętno paleniska/częstość oddechów zwierzęcia. Efekty działania izofluranu utrzymują się przez kilka minut po przerwaniu strumienia gazu, podczas gdy działanie ketaminy/ksylazyny utrzymuje się przez 40-50 minut.
- Zapewnij pooperacyjne zastrzyki z antybiotykami, lekami przeciwbólowymi i przeciwzapalnymi (w tych samych dawkach i drogach, które zostały podane wcześniej) przez 48-72 godziny i dokładnie sprawdzaj zwierzęta codziennie przez resztę eksperymentu. Wszelkie oznaki bólu, stresu lub utraty wagi należy zgłaszać do weterynarza lub przeszkolonego pracownika laboratorium. W tym okresie nie wykonuj żadnych innych manipulacji na szczurach.
- Rozpocznij pobieranie wymazów z pochwy po leczeniu pooperacyjnym i kontynuuj je, aż zwierzę wykaże trzy kolejne cykle rujowe trwające cztery dni.
UWAGA: Przewlekłe cewniki szyjne mogą być wszczepiane chirurgicznie, co pozwala badaczowi na pobranie seryjnych próbek krwi w celu analizy wydzielania hormonów, takich jak estradiol, progesteron, testosteron, hormon luteinizujący, hormon folikulotropowy i kortykosteron. Zalecamy założenie takiego cewnika, gdy zwierzę dojdzie do siebie po operacji mózgu, ponieważ poprawi to przeżywalność, a jednocześnie pozwoli uniknąć zatkania cewnika, które może wynikać z wydłużonego czasu rekonwalescencji.
6. Obchodzenie się z tetrodotoksyną i przygotowanie roztworów
UWAGA: TTX jest jedną z najbardziej toksycznych znanych substancji. Działa na mięśnie szkieletowe i tkankę nerwową. Zatrucie przez kontakt jest mało prawdopodobne, ale każda otwarta rana jest potencjalną drogą do zaszczepienia do organizmu. Głównymi problemami podczas pracy z TTX są nakłucie skóry ostrymi narzędziami, które miały kontakt z toksyną oraz wytwarzanie aerozoli, które mogą dostać się do ust, oczu i błon śluzowych. W zależności od dawki, TTX może być śmiertelny w przypadku wdychania, połknięcia lub zaszczepienia przez skórę. Spowoduje to silne podrażnienie oczu. LD50 został przetestowany na myszach po podaniu doustnym i dożylnym i wynosi odpowiednio 334 μg/kg i 7,3 μg/kg. W tej chwili nie ma dostępnej antytoksyny.
UWAGA: Substancją inaktywującą jest 1,0% NaOCl z 0,25 N NaOH lub bez niego, lub 10% roztwór wybielacza. Całkowita inaktywacja następuje po 30 minutach ekspozycji. TTX nie może być całkowicie inaktywowany przez żadną pochodną chlorku o stężeniu poniżej 10%, przez autoklawowanie ani przez sterylizację na sucho w temperaturze niższej niż 500 °F. Wszystkie procedury związane z TTX muszą być wykonywane przez dwie kompetentne osoby ubrane w wewnętrzną i zewnętrzną parę rękawic nitrylowych, dedykowany fartuch laboratoryjny, okulary ochronne, jednorazową maskę na twarz, zamknięte buty i długie spodnie.
- Przygotowanie roztworu podstawowego
- Umieść podkładkę nasączoną substancją dezaktywującą w dygestorium, aby zapobiec zanieczyszczeniu w przypadku rozlania. Przed rozpoczęciem upewnij się, że wyciąg działa prawidłowo. Przygotować pojemnik z roztworem inaktywującym, aby wyrzucić końcówki do pipet.
- Zawiesić sterylny liofilizowany proszek cytrynianu TTX zgodnie z instrukcjami producenta, bardzo ostrożnie i powoli miareczkując sterylnym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, spłukując przy tym ścianki fiolki. Unikaj tworzenia się piany i aerozolu. Należy postępować zgodnie z techniką aseptyczną, aby uniknąć zanieczyszczenia roztworu TTX, ponieważ zostanie on wstrzyknięty do mózgu żywych zwierząt. Użyj strzykawki z igłą zamiast mikropipety, jeśli fiolki TTX mają zewnętrzną membranę zapobiegającą tworzeniu się aerozolu.
- Podwielokrotność roztworu podstawowego rozlać do sterylnych mikroprobówek. Podwielokrotności powinny być jak najmniejsze, ponieważ cykle zamrażania/rozmrażania mogą zmienić stabilność cząsteczek. Nie napełniaj więcej niż połowę probówek, ponieważ woda zwiększa swoją objętość po zamrożeniu, co może prowadzić do otwarcia pokrywy i zanieczyszczenia probówki i innych próbek przechowywanych w pojemniku.
- Odkazić zewnętrzną stronę rurek i powierzchnie, na których zastosowano TTX, za pomocą substancji dezaktywującej. Przechowywać probówki w temperaturze -20 °C w pudełku na fiolki w pojemniku wtórnym.
- Rozcieńczanie roztworu podstawowego do stężenia roboczego
- Świeżo rozcieńczone roztwory należy przygotować w dniu, w którym będą używane, ponieważ rozcieńczone roztwory są mniej stabilne. Umieść podkładkę nasączoną substancją dezaktywującą w dygestoriach, a na niej mikrorurkę. Przygotować pojemnik z roztworem inaktywującym, aby wyrzucić końcówki do pipet.
- Odpipetować roztwór podstawowy na dnie sterylnej mikroprobówki, a następnie dodać obliczoną ilość sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego, aby osiągnąć stężenie 10 ng/μl. Zgodnie z opisem dotyczącym ponownego zawieszania proszku TTX, należy przeprowadzić bardzo ostrożne i powolne miareczkowanie, spłukując ścianki fiolki i unikając tworzenia się piany i aerozolu.
- Jeżeli próbki, które znajdowały się w zamrażarce, zostaną użyte do mikroiniekcji, należy pozostawić je do zrównoważenia w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę przed eksperymentem.
7. Mikroiniekcja roztworów TTX lub pojazdów dla swobodnie poruszających się szczurów
- Skonfigurować pompę do mikroiniekcji z szybkością infuzji i całkowitym czasem wstrzyknięcia zgodnie z eksperymentem. Obliczyć te parametry z wyprzedzeniem, biorąc pod uwagę objętość zajmowaną przez strukturę docelową i ilość roztworu do wstrzyknięcia. W tym eksperymencie należy wstrzyknąć 200 nl roztworu z szybkością 50 nl na minutę, aby uzyskać całkowity czas infuzji wynoszący 4 minuty.
- Napełnij dwie strzykawki Hamiltona o pojemności 10 μl sterylną wodą destylowaną, włóż kawałek sterylnej rurki teflonowej do złącza rurki każdego mikrowtryskiwacza, upewniając się, że długość rurki nie krępuje ruchu szczura (rurkę można sterylizować za pomocą tlenku etylenu).
- Umieść na niej podkładkę nasączoną substancją dezaktywującą, a nad nią kwadrat folii parafinowej o wymiarach 2 cm x 2 cm. Odpipetować odpowiednią ilość TTX, aby napełnić igłę iniektora i 1 cm rurki powyżej folii. Zamortyzować upuszczenie TTX, delikatnie cofając tłok. Zamontuj strzykawki w pompie do mikroiniekcji i za pomocą jej elementów sterujących manipuluj tłokiem, aż na końcu każdego mikrowstrzykiwacza będzie widoczna kropla TTX. Wyrzuć krople do podkładki nasączonej substancją dezaktywującą.
- Wybierz szczury, które zostaną poddane mikroiniekcji. Używaj tylko szczurów, które wykazały co najmniej trzy kolejne cykle po operacji. Weź pod uwagę ich etap cyklu i porę dnia. Zarówno czas, jak i etap zależą od konkretnej hipotezy, którą będziesz testować, w tym eksperymencie 14:00 godzin rui wybrano, ponieważ w tym momencie występują nerwowe sygnały przedowulacyjne rządzące fazowym wydzielaniem GnRH. Przetransportować je do pomieszczenia, w którym odbędzie się wstrzyknięcie, w ich własnych klatkach, aby uniknąć stresu.
- Chwyć szczura mocnym uściskiem, zdejmij nasadkę i obturatory z kaniul, włóż mikrowstrzykiwacze do kaniul prowadzących i włóż zwierzę z powrotem do klatki.
- Włączyć pompę i poczekać, aż zakończy się mikroiniekcja. W tym okresie należy obserwować zwierzę, aby wykryć ewentualne odłączenie się mikrowstrzykiwaczy i uniknąć skręcenia rurek teflonowych.
- Pozostawić mikrowstrzykiwacze na miejscu przez dodatkowe dwie minuty, aby uniknąć refluksu roztworu. Usuń je, oczyść powierzchnię implantu roztworem antyseptycznym jodopowidonu, unikając jego przepływu wewnątrz kaniul prowadzących. Włóż sterylne zasłony, załóż czapkę i odłóż zwierzę do pomieszczenia kolonijnego. Obserwuj zwierzę okresowo, aby wykryć wszelkie możliwe skutki uboczne leku.
- Włączyć pompę o takich samych parametrach jak podczas mikroiniekcji i sprawdzić prawidłowy przepływ, aby upewnić się, że drożność układu została zachowana podczas zabiegu.
- Nacisnąć tłok, aby wypchnąć TTX/pojazd z mikrowtryskiwacza, aż pęcherzyk powietrza dotrze do końcówki igły. Przypomnij sobie TTX w jego mikroprobówce. Napełnić strzykawkę wodą destylowaną i użyć jej do oczyszczenia wnętrza rurek. Wylać wodę do substancji dezaktywującej i powtórzyć ten proces co najmniej trzy razy. Strzykawki, rurki i mikrowstrzykiwacze należy oczyścić z zewnątrz szmatką nasączoną substancją dezaktywującą.
8. Eutanazja i przetwarzanie tkanek
- W dniu przewidywanej lub potwierdzonej pochwy rui należy wstrzyknąć szczurowi dootrzewnowe przedawkowanie pentobarbitalu sodu (75 mg/kg). Sprawdzić, czy nie doszło do utraty przytomności i wstrzyknąć 200 nl 0,5% roztworu błękitu metylenowego przez kaniule prowadzące, jak opisano w krokach od 7.1 do 7.9. Sprawdź, czy nie ma objawów bólu za pomocą testu szczypania palca u nogi lub ogona, a jeśli nie zostaną wykryte, odetnij głowę szczura za pomocą gilotyny dla gryzoni .
- Użyj nożyczek, aby otworzyć jamę brzuszną i znaleźć jajniki. Użyj cienkich nożyczek do tęczówki, aby wypreparować każdy jajnik, przecinając na styku macicy i jajowodu za pomocą szkła powiększającego. Unikaj uszkodzenia jajowodu, ponieważ spowoduje to utratę oocytów.
- Umieść jajniki pod mikroskopem stereoskopowym i użyj żyletki, aby usunąć całą tkankę tłuszczową bez uszkadzania narządu. Usuń jajowód z każdego jajnika, przecinając żyletką jak najdalej od obszaru bańki. Zamontuj każdy jajowód na innym zjeżdżalni i zalej kroplą wody. Jajniki należy przechowywać w fiolce zawierającej roztwór Bouina.
- Delikatnie osusz jajowody chłonnym ręcznikiem papierowym i poszukaj bańki pod mikroskopem stereoskopowym. Ręką niedominującą przytrzymaj jajowód na miejscu, ściskając daleko od bańki igłą 23 G, a następnie użyj kolejnej igły 23 G w ręce dominującej, aby wykonać nacięcie 1 mm w środkowej części bańki. Kompleksy wzgórek-oocyty będą wystawać z nacięcia jako kropla lepkiego płynu (Rysunek 2D). Użyj igły w dominującej ręce, aby delikatnie i powoli odciągnąć kroplę daleko od jajowodu. Naciśnij resztkę bańki, aby upewnić się, że w środku nie pozostały żadne oocyty. Usuń oocyty z jajowodów tak szybko, jak to możliwe, ponieważ wysuszenie jajowodu nieodwracalnie uwięzi oocyty w środku.
- Wyjmij jajowód ze szkiełka i poczekaj, aż kropla płynu zawierającego oocyty wyschnie. Wybarwić próbkę hematoksyliną-eozyną. Użyj podłoża montażowego do szkiełka nakrywkowego. Obserwuj pod mikroskopem (10x), aby określić liczbę oocytów wydalanych przez każdy jajnik.
UWAGA: Uśmiercanie przez perfuzję serca nie jest wykonywane w tym protokole, ponieważ oocyty zostałyby uwięzione w jajowodach, a zatem do oceny owulacji konieczne byłyby metody histologiczne. Jeśli użytkownik musi wykonać perfuzję w celu analizy innych tkanek, jajniki można najpierw usunąć, a tętnice zstępujące zacisnąć grubymi hemostatykami poniżej wątroby, aby uniknąć wycieku utrwalacza .
- Usuń skórę głowy i zanurz czaszkę w szklanym pojemniku z 10% roztworem formaliny. Pozwól na unieruchomienie głowy przez co najmniej dziesięć dni przed usunięciem kaniuli, aby uniknąć zniekształcenia tkanki. Aby usunąć kaniulę, użyj nożyczek, aby odłączyć wszystkie mięśnie w okolicy czaszki, która ją otacza. Przeciąć między kością nosową a czołową za pomocą trymerów do kości, a następnie usunąć kość potyliczną. Włóż końcówkę trymerów do otworu wielkiego i zacznij przecinać grzebienie strzałkowe, docierając do pozostałości kości nosowej.
- Izolowany obszar górnej części czaszki musi zawierać kości czołowe i ciemieniowe. Usuń wszczepioną kaniulę przymocowaną do górnej części czaszki, powoli pociągając ją prostopadle do głowy. Wytnij dowolną przyczepioną część opon mózgowych cienkimi nożyczkami do tęczówki, aby uniknąć deformacji mózgu.
- Wykonaj przednio-tylne nacięcie na oponach mózgowych i odłóż je na bok, aby usunąć mózg z podstawy czaszki. Włóż pęsetę poniżej opuszki węchowej i delikatnie pociągnij mózg do góry, aż nerwy wzrokowe będą widoczne. Przetnij nerwy cienkimi nożyczkami do tęczówki i wyciągnij mózg. Zachowaj mózg w roztworze utrwalającym.
- Uzyskaj skrawki mózgu o grubości 50 μm za pomocą wibratomu, zamontuj je w szkiełkach pokrytych poli-L-lizyną (0,1% w wodzie destylowanej) i wybarwij techniką Nissl. Obserwuj szkiełka pod mikroskopem (10x), aby określić ostateczną pozycję kaniul (Rysunek 2A-2C) i rozprzestrzenianie się barwnika za pomocą atlasu mózgu szczura 27.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisany powyżej protokół przetestowano poprzez ocenę efektów pojedynczej mikroiniekcji TTX lub nośnika (sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy; ACSF) do jednego z dwóch różnych jąder znanych z udziału w regulacji owulacji u szczura: jądra nadskrzyżowaniowego oraz jądra łukowatego. Wybrano jądro nadskrzyżowaniowe, ponieważ zawiera ono centralny rozrusznik okołodobowy u ssaków i uczestniczy w regulacji zdarzeń cyklicznych, takich jak wydzielanie gonadotropin. Wybrano jądro łukowate, ponieważ zawiera ono populację neuronów wykazuj...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ten artykuł opisuje metodę przejściowej dezaktywacji, w dowolnym momencie, dyskretnego regionu w mózgu przytomnych i nieskrępowanych szczurów. Dostępna jest również prosta metoda śledzenia ich cyklu rujowego i oceny owulacji. Protokół ten pozwala na prostą analizę udziału określonych regionów mózgu w mechanizmach napędzających owulację poprzez porównanie wyników owulacji u zwierząt leczonych TTX z tymi leczonymi podłożem. Z wyjątkiem instrumentu stereotaktycznego i pompy mikroiniekcyjnej, które są powszechne w laboratori...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia w związku z tym artykułem.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni Raymondowi Sanchezowi z Uniwersytetu Waszyngtońskiego za jego cenną pomoc w redagowaniu manuskryptów oraz M.Sc. Georginie Cortés i M.Sc. Cintii Javier za ich wsparcie techniczne w standaryzacji tej techniki. Jesteśmy również wdzięczni członkom służb weterynaryjnych w Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández i MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán za doskonałe utrzymanie i opiekę nad zwierzętami doświadczalnymi. Eksperymenty opisane w tym protokole były wspierane przez grant DGAPA-PAPIIT o numerze: IN216015 oraz przez grant CONACyT o numerze: 236908 dla Roberto Domíngueza. Carlos-Camilo Silva jest doktorantem w Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) i jest wspierany przez Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (numer grantu: 294555).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10 μ L Strzykawki Hamilton | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" igła hipodermiczna ze stali nierdzewnej | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" igła hipodermiczna ze stali nierdzewnej | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" igła hipodermiczna ze stali nierdzewnej | BD | 305106 | |
| Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy | BASi | MD-2400 | |
| Trymer kości | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Frez do mikrowiertarki | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Maszynka do strzyżenia | Wahl | ||
| Tarcza tnąca | Dremel | SM5010 | |
| Pęseta | tnąca Truper | 17367 | |
| Klej cyjanokrylanowy | Kola loka | K-1 | |
| Cement dentystyczny | Nic Tone | ||
| Enrofloksazyna | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoskop | Zeiss | ||
| Bardzo drobne nożyczki Bonn | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Maska na twarz | Lanceta HG | 60036 | |
| Kleszcze Graefe | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoksylina | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Sterylizator gorących kulek | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Kwas solny | Sigma | 320331 | |
| Hypromeloza Sztuczne łzy | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Pompka do mikroiniekcji | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Rękawice nitrylowe | Lanceta HG | 69028 | |
| Listwy nauszne bez pękania | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lizyna | Sigma | P4707 | |
| Powidon-jod | Dermo Dine | ||
| Powidon-jod z mydłem | Germisin espuma | ||
| Pęseta ciśnieniowa | Truper | 17371 | |
| Maska anestezjologiczna dla szczurów | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Roztwór soli | fizjologicznej PISA | ||
| Skalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Ostrze skalpela | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Pentobarbital sodu | Pisa Agropecuaria | ||
| Standardowy uchwyt elektrody | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Drut ze stali nierdzewnej | American Orthodontic | 856-612 | |
| Aparat | stereotaktycznyDavid Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Sissarki chirurgiczne | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Złącza teflonowe | Basi | MD-1510 | |
| Rurka teflonowa | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoksyna | Alomone labs | T-500 | |
| Waporyzator | Kent scientific | VetFlo |
Bibliografia
- Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
- Fink, G. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. Conn, M., Freeman, E. , Springer Science Business Media. New York. 107-133 (2000).
- Herbison, A. E. The Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator. Endocrinology. 159 (11), 3723-3736 (2018).
- Morello, H., Taleisnik, S. Changes of the release of luteinizing hormone (LH) on the day of proestrus after lesions or stimulation of the raphe nuclei in rats. Brain Research. 360 (1-2), 311-317 (1985).
- Slusher, M. A., Critchlow, V. Effect of Midbrain Lesions on Ovulation and Adrenal Response to Stress in Female Rats. Experimental Biology and Medicine. 101 (3), 497-499 (1959).
- Sawyer, C. H., Haun, C. K., Hilliard, J., Radford, H. M., Kanematsu, S. Further Evidence for the Identity of Hypothalamic Areas Controlling Ovulation and Lactation in the Rabbit. Endocrinology. 73 (3), 338-344 (1963).
- Schiavi, R., Jutisz, M., Sakiz, E., Guillemin, R. Stimulation of Ovulation by Purified LH-Releasing Factor (LRF) in Animals Rendered Anovulatory by Hypothalamic Lesion. Experimental Biology and Medicine. 114 (2), 426-429 (1963).
- Bagga, N., Chhina, G. S., Mohan Kumar, V., Singh, B. Cholinergic activation of medial preoptic area by amygdala for ovulation in rat. Physiology & Behavior. 32 (1), 45-48 (1984).
- Barraclough, C. A., Yrarrazaval, S., Hatton, R. A Possible Hypothalamic Site of Action of Progesterone in the Facilitation of Ovulation in the Rat. Endocrinology. 75 (6), 838-845 (1964).
- Critchlow, V. Blockade of ovulation in the rat by mesencephalic lesions 1, 2. Endocrinology. 63 (5), 596-610 (1958).
- Terasawa, E., Wiegand, S. J. Effects of Hypothalamic Deafferentation on Ovulation and Estrous Cyclicity in the Female Guinea Pig. Neuroendocrinology. 26 (4), 229-248 (1978).
- Halász, B., Köves, K., Molnár, J. Neural control of ovulation. Human Reproduction. 3 (1), 33-37 (1988).
- Narahashi, T. Pharmacology of tetrodotoxin. Journal of Toxicology: Toxin Reviews. 20 (1), 67-84 (2001).
- Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. Tetrodotoxin blockage of sodium conductance increase in lobster giant axons. The Journal of General Physiology. 47 (5), 965-974 (1964).
- Narahashi, T., Deguchi, T., Urakawa, N., Ohkubo, Y. Stabilization and rectification of muscle fiber membrane by tetrodotoxin. American Journal of Physiology-Legacy Content. 198 (5), 934-938 (1960).
- Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiological Reviews. 54 (4), 813-889 (1974).
- Ritchie, J. M., Rogart, R. B. The binding of saxitoxin and tetrodotoxin to excitable tissue. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 79 (1), 1-50 (1977).
- Bermudez-Rattoni, F., Introini-Collison, I. B., McGaugh, J. L. Reversible inactivation of the insular cortex by tetrodotoxin produces retrograde and anterograde amnesia for inhibitory avoidance and spatial learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5379-5382 (1991).
- Tang, X., Yang, L., Liu, X., Sanford, L. D. Influence of Tetrodotoxin Inactivation of the Central Nucleus of the Amygdala on Sleep and Arousal. Sleep. 28 (8), 923-930 (2005).
- Klement, D., Pašt’alková, E., Fenton, A. A. Tetrodotoxin infusions into the dorsal hippocampus block non-locomotor place recognition. Hippocampus. 15 (4), 460-471 (2005).
- Conejo, N. M., Cimadevilla, J. M., González-Pardo, H., Méndez-Couz, M., Arias, J. L. Hippocampal Inactivation with TTX Impairs Long-Term Spatial Memory Retrieval and Modifies Brain Metabolic Activity. PLoS ONE. 8 (5), 64749(2013).
- Grimm, J., Ronald, E. Dissociation of Primary and Secondary Reward-Relevant Limbic Nuclei in an Animal Model of Relapse. Neuropsychopharmacology. 22 (5), 473-479 (2000).
- Hasegawa, H., et al. Inhibition of the preoptic area and anterior hypothalamus by tetrodotoxin alters thermoregulatory functions in exercising rats. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1458-1462 (2005).
- Meyer, F., Louilot, A. Early Prefrontal Functional Blockade in Rats Results in Schizophrenia-Related Anomalies in Behavior and Dopamine. Neuropsychopharmacology. 37 (10), 2233-2243 (2012).
- Rothfeld, J. M., Harlan, R. E., Shivers, B. D. Reversible disruption of lordosis via midbrain infusions of procaine and tetrodotoxin. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 25 (4), 857-863 (1986).
- Silva, C., Cortés, G. D., Javier, C. Y., Flores, A., Domínguez, R. A neural circadian signal essential for ovulation is generated in the suprachiasmatic nucleus during each stage of the estrous cycle. Experimental Physiology. , (2019).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (7th Ed). , Academic Press. California. (2014).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS ONE. 7 (4), 35538(2012).
- Wirtshafter, D., Asin, K., Kent, E. W. Simple technique for midline stereotaxic surgery in the rat. Physiology & Behavior. 23 (1), 409-410 (1979).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
- Kazim, S. F., Enam, S. A., Shamim, M. S. Possible detrimental effects of neurosurgical irrigation fluids on neural tissue: An evidence based analysis of various irrigants used in contemporary neurosurgical practice. International Journal of Surgery. 8 (8), 586-590 (2010).
- Miyajima, M., et al. Role of cerebrospinal fluid as perfusate in neuroendoscopic surgery: A basic investigation. Acta Neurochirurgica. 113, 103-107 (2012).
- Mori, K., et al. Potential risk of artificial cerebrospinal fluid solution without magnesium ion for cerebral irrigation and perfusion in neurosurgical practice. Neurologia Medico-Chirurgica. 53 (9), 596-600 (2013).
- Oka, K., Yamamoto, M., Nonaka, T., Tomonaga, M. The significance of artificial cerebrospinal fluid as perfusate and endoneurosurgery. Neurosurgery. 38 (4), (1996).
- James, T. A., Starr, M. S. Effects of the rate and volume of injection on the pharmacological response elicited by intraingral microapplication of drugs in the rat. Journal of Pharmacological Methods. 1 (3), 197-202 (1978).
- Freund, N., Manns, M., Rose, J. A method for the evaluation of intracranial tetrodotoxin injections. Journal of Neuroscience Methods. 186 (1), 25-28 (2010).
- Zhuravin, I. A., Bures, J. Extent of the tetrodotoxin induced blockade examined by pupillary paralysis elicited by intracerebral injection of the drug. Experimental Brain Research. 83 (3), 687-690 (1991).
- Myers, R. Injection of solutions into cerebral tissue: relation between volume and diffusion. Physiology and Behavior. 1 (2), 171-174 (1966).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal of Visualized Experiments. (46), e2082(2010).
- McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. J Neuroimmunol. 194 (1-2), 27-33 (2008).
- Cunningham, M. G., O'Connor, R. P., Wong, S. E. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of VisualizedExperiments. (13), e716(2008).
- Akinori, A., Masamichi, S., Hiroshi, T. A new device for microinjection of drugs into the lower brain stem of conscious rats: Studies on site of action of morphine. Journal of Pharmacological Methods. 2 (4), 371-378 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- de Sousa, A. F., et al. Optogenetic reactivation of memory ensembles in the retrosplenial cortex induces systems consolidation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences. 116 (17), 8576-8581 (2019).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
