Artykuł metodologiczny

Przygotowanie przestrajalnych mikrośrodowisk macierzy zewnątrzkomórkowej w celu oceny specyfikacji fenotypu komórek Schwanna

DOI:

10.3791/61496

⸱

2 czerwca 2020

 ,  , 
1Department of Chemical and Environmental Engineering, University of Cincinnati, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Neuroscience Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metodologia ma na celu zilustrowanie mechanizmów, za pomocą których sygnały macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak sztywność substratu, skład białka i morfologia komórki, regulują fenotyp komórek Schwanna (SC).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Urazowe urazy obwodowego układu nerwowego (PNS) obecnie nie mają odpowiednich metod leczenia, aby odzyskać pełną sprawność. Komórki Schwanna (SC), jako główne komórki glejowe PNS, odgrywają istotną rolę w promowaniu regeneracji PNS poprzez dedyferencjację do fenotypu komórki regeneracyjnej po urazie. Jednak stan odróżnicowania SC jest trudny do utrzymania przez okres potrzebny do regeneracji i ma na niego wpływ zmiany w otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). W związku z tym niezbędne jest określenie złożonej zależności między SC a różnymi ECM w celu uzyskania wskazówek dotyczących potencjału regeneracyjnego SC. Aby rozwiązać ten problem, stworzono strategię, w ramach której różne białka ECM zostały zaadsorbowane na przestrajalnym podłożu z polidimetylosiloksanu (PDMS), który zapewnił platformę, na której można modulować sztywność i skład białka. SC wysiewano na przestrajalnych podłożach i mierzono krytyczne funkcje komórkowe reprezentujące dynamikę fenotypu SC. Aby zilustrować wzajemne oddziaływanie między ekspresją białka SC a morfologią komórkową, wykorzystano różne gęstości wysiewu SC oprócz indywidualnych drukowanych wzorów komórkowych w mikrokontakcie i scharakteryzowano je za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i western blot. Wyniki pokazały, że komórki o mniejszym obszarze rozprzestrzeniania się i większym stopniu wydłużenia komórkowego promowały wyższe poziomy regeneracyjnych markerów fenotypowych SC. Metodologia ta nie tylko zaczyna odkrywać istotny związek między ECM a funkcją komórkową SC, ale także dostarcza wskazówek dla przyszłej optymalizacji biomateriałów w naprawie nerwów obwodowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Urazy obwodowego układu nerwowego (PNS) pozostają głównym wyzwaniem klinicznym w opiece zdrowotnej, pogarszając jakość życia pacjentów i wywierając znaczący wpływ poprzez mnogość czynników społeczno-ekonomicznych1,2. Komórki Schwanna (SC), jako główne komórki glejowe w PNS, dostarczają niezbędnych wskazówek molekularnych i fizycznych do indukowania regeneracji PNS i pomagają w powrocie do sprawności funkcjonalnej w urazach z krótkimi przerwami. Wynika to z niezwykłej zdolności SC do dedyferencjacji do fenotypu komórki "naprawczej" z fenotypu mielinizacyjnego lub Remak3. Naprawczy SC jes....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie i charakterystyka substratu do hodowli komórkowych

  1. Przygotowanie podłoża
    1. Energicznie wymieszać elastomer bazowy PDMS i utwardzacze za pomocą końcówki pipety w stosunku od 10:1 do 60:1, aż pęcherzyki zostaną jednorodnie rozproszone w mieszaninie. Usuń bąbelki za pomocą suszenia próżniowego, aż bąbelki się rozproszą.
      UWAGA: Podczas polimeryzacji PDMS utwardzacz sieciuje się z elastomerem bazowym, aby zapewnić końcowe właściwości mechaniczne polimeru. Współczynniki usieciowania można dostosować, aby zmienić sztywność PDMS.
    2. Umieść kroplę (~0,2 ml) wysuszonej mieszaniny PDMS na kwadratowym lub okrąg....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby przeanalizować i określić ilościowo zależność między sztywnością substratu a składem białka na fenotypie SC, opracowano przestrajalny substrat do hodowli komórkowych PDMS (Rysunek 1A). Próba ściskania polimeru na różnych proporcjach podstawy: utwardzacza została wykorzystana do ilościowego określenia modułu Younga (E) podłoża (Rysunek 1B). Uzyskany w ten sposób zakres wartości modułu odzwierciedla fizjologicznie istotne warunki podłoża. Po przygotowaniu substratów, SC poddano h.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SC mogą wspomagać regenerację nerwów ze względu na ich transformację fenotypową i potencjał regeneracyjny po uszkodzeniu nerwu. Jednak sposób, w jaki sygnały ECM regulują tę zdolność regeneracyjną, pozostaje w większości niejasny, co może utrudniać nie tylko rozwój biomateriałów, które mają na celu promowanie regeneracji nerwów, ale także zrozumienie mechanizmów związanych z regeneracją nerwów. Aby rozpocząć badanie tej wzajemnej zależności, stworzono substraty do hodowli komórkowych, w których można kontrolować sygnały .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłosili potencjalnego konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Uniwersytetu w Cincinnati. Autorzy dziękują również Ronowi Flennikenowi z laboratorium Advanced Materials Characterization Uniwersytetu w Cincinnati za wsparcie.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Albumina z surowicy bydlęcej (BSA), koniugat Texas RedThermo Fisher ScientificA23017Barwienie BSA w celu pokazania mikrowzorów
Przeciwciało IgG przeciw myszy, technologiasygnalizacji komórkowejPrzeciwciało 7076Sużywane do analizy western blot
Przeciwciało anty-królicze IgG, technologia sygnalizacji komórkowej przeciwciał sprzężonych z HRPPrzeciwciało 7074Sużywane do analizy
western blotBrdUThermo Fisher ScientificB23151Odczynnik stosowany do pomiaru proliferacji komórek
Przeciwciało pierwotne BrdU sprzężone z Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificB35130Służy do wizualizacji BrdU w testach proliferacji komórek
Kolagen IThermo Fisher ScientificA10483-01Białko używane do powlekania szkiełek nakrywkowych
Maszyna do badania siły ściskającejTestResourcesPrzyrząd do ilościowego określania właściwości mechanicznych polimerów
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy DulbeccoThermo Fisher Scientific11965092Pożywka do hodowli komórkowych
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific16000044Pożywka do hodowli komórkowych uzupełniająca
FibronektynaThermo Fisher Scientific33010-018Białko używane do powlekania szkiełek nakrywkowych
Fluorescencja mikroskopNikonEclipse Ti2Mikroskop fluorescencyjny
Halt Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy (100X)Thermo Fisher Scientific78440Inhibitor proteazy i fosfatazy
LamininThermo Fisher Scientific23017015Białko używane do powlekania szkiełek nakrywkowych
Podłoże montażowe z DAPIThermo Fisher ScientificP36971Mocowanie szkiełek nakrywkowych i barwienie jąder
Mysz C-Jun pierwotne przeciwciało ThermoFisher Scientific711202Pierwszorzędowe przeciwciało do wizualizacji białka c-Jun
Mysz &beta-aktyna pierwotne przeciwciałoTechnologia sygnalizacji komórkowej3700SKontrola ładowania dla eksperymentów western blot
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Scientific15140122Pożywka do hodowli komórkowych uzupełniająca
Photoresist SU 2010KAYAKUSU8-2010Photoresist
Pluronic F-127Sigma AldrichP-2443Blokuj niespecyficzne wiązanie białek
Pierwotne przeciwciało królika c-JunTechnologia sygnalizacji komórkowej9165S Przeciwciałopierwszorzędowe do wizualizacji białka c-Jun
Podstawowe przeciwciało podstawowe białka mieliny królikaAbcamab40390Przeciwciało pierwszorzędowe do wizualizacji MBP
Królik p75NTRprzeciwciało pierwotne Technologia sygnalizacji komórkowej8238S Przeciwciałopierwotne do wizualizacji p75NTR
Falloidyna rodaminowaThermo Fisher ScientificR415Wizualizacja cytoszkieletu komórkowego
Bufor RIPAAbcamab156034Bufor do lizy komórek
RT4-D6P2T Linia komórkowa SchwannaATCCCRL-2768Linia komórkowa stosowana w
eksperymenty SYLGARD 184 PDMS baza i utwardzaczSigma Aldrich761036Przestrajalny polimer stosowany do powlekania szkiełek nakrywkowych
TrypsynaThermo Fisher Scientific15090-046Odczynnik do dysocjacji komórek
UV-Środek czyszczący do ozonuNovascanZwiększ hydrofilność PDMS
Versene (1x)Thermo Fisher Scientific15040066Dysocjacja komórek Odczynnik
przeciwciał sprzężona z HRP

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The Incidence of Peripheral Nerve Injury in Extremity Trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87, 381-385 (2008).
  2. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Schwann Cell PhenotypeExtracellular Matrix MicroenvironmentsTunable PDMS SubstrateMicrocontact Printing TechniqueCellular Spreading AreaCellular Elongation AnalysisImmunofluorescent StainingWestern Blot AnalysisLaminin Coated Substratesc Jun Expression

Powiązane artykuły