Artykuł metodologiczny

Przygotowanie przestrajalnych mikrośrodowisk macierzy zewnątrzkomórkowej w celu oceny specyfikacji fenotypu komórek Schwanna

DOI:

10.3791/61496

⸱

2 czerwca 2020

 ,  , 
1Department of Chemical and Environmental Engineering, University of Cincinnati, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Neuroscience Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metodologia ma na celu zilustrowanie mechanizmów, za pomocą których sygnały macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak sztywność substratu, skład białka i morfologia komórki, regulują fenotyp komórek Schwanna (SC).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Urazowe urazy obwodowego układu nerwowego (PNS) obecnie nie mają odpowiednich metod leczenia, aby odzyskać pełną sprawność. Komórki Schwanna (SC), jako główne komórki glejowe PNS, odgrywają istotną rolę w promowaniu regeneracji PNS poprzez dedyferencjację do fenotypu komórki regeneracyjnej po urazie. Jednak stan odróżnicowania SC jest trudny do utrzymania przez okres potrzebny do regeneracji i ma na niego wpływ zmiany w otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). W związku z tym niezbędne jest określenie złożonej zależności między SC a różnymi ECM w celu uzyskania wskazówek dotyczących potencjału regeneracyjnego SC. Aby rozwiązać ten problem, stworzono strategię, w ramach której różne białka ECM zostały zaadsorbowane na przestrajalnym podłożu z polidimetylosiloksanu (PDMS), który zapewnił platformę, na której można modulować sztywność i skład białka. SC wysiewano na przestrajalnych podłożach i mierzono krytyczne funkcje komórkowe reprezentujące dynamikę fenotypu SC. Aby zilustrować wzajemne oddziaływanie między ekspresją białka SC a morfologią komórkową, wykorzystano różne gęstości wysiewu SC oprócz indywidualnych drukowanych wzorów komórkowych w mikrokontakcie i scharakteryzowano je za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i western blot. Wyniki pokazały, że komórki o mniejszym obszarze rozprzestrzeniania się i większym stopniu wydłużenia komórkowego promowały wyższe poziomy regeneracyjnych markerów fenotypowych SC. Metodologia ta nie tylko zaczyna odkrywać istotny związek między ECM a funkcją komórkową SC, ale także dostarcza wskazówek dla przyszłej optymalizacji biomateriałów w naprawie nerwów obwodowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Urazy obwodowego układu nerwowego (PNS) pozostają głównym wyzwaniem klinicznym w opiece zdrowotnej, pogarszając jakość życia pacjentów i wywierając znaczący wpływ poprzez mnogość czynników społeczno-ekonomicznych1,2. Komórki Schwanna (SC), jako główne komórki glejowe w PNS, dostarczają niezbędnych wskazówek molekularnych i fizycznych do indukowania regeneracji PNS i pomagają w powrocie do sprawności funkcjonalnej w urazach z krótkimi przerwami. Wynika to z niezwykłej zdolności SC do dedyferencjacji do fenotypu komórki "naprawczej" z fenotypu mielinizacyjnego lub Remak3. Naprawczy SC jest charakterystycznym fenotypem komórkowym pod kilkoma względami. Po urazie SC zwiększają tempo proliferacji, ponownie wchodząc w cykl komórkowy i rozpoczynając ekspresję kilku czynników transkrypcyjnych, aby ułatwić ponowne unerwienie. Czynniki te, takie jak c-Jun i p75 NTR, są regulowane w górę, podczas gdy mielinizujące markery SC, takie jak zasadowe białko mieliny (MBP), są regulowane w dół4,5. Ponadto SC zmieniają morfologię, wydłużając się i ustawiając się względem siebie, tworząc pasma Büngnera w poprzek miejsca urazu6. Zapewnia to fizyczny mechanizm naprowadzania aksonów na rozciąganie się do właściwego dystalnego celu7. Jednak pomimo zdolności SC do wspomagania regeneracji nerwów w urazach z krótkimi przerwami, wyniki powrotu do sprawności pozostają słabe w przypadku poważnych urazów. Jest to częściowo spowodowane utratą wskazówek naprowadzających macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), a także niezdolnością SC do utrzymania fenotypu regeneracyjnego przez długi czas8.

Proces regeneracji i regeneracji nerwów jest ściśle związany ze stanem blaszki podstawy po urazie. Blaszka podstawna to warstwa ECM wokół nerwu, która ułatwia prowadzenie i zapewnia wskazówki związane z ECM dla aksonów i SC w przypadkach, gdy pozostaje nienaruszona po urazie9. Stan ECM i jego zdolność do dostarczania sygnałów związanych z matrycą do komórek jest niezwykle ważny i był wcześniej badany w wielu różnych kontekstach10,11,12,13,14. Na przykład wykazano, że sztywność ECM może kierować funkcjami komórki, takimi jak proliferacja i różnicowanie11,15,16. Skład ECM może również prowadzić do wyraźnej odpowiedzi komórkowej i regulować zachowania komórek, takie jak migracja i różnicowanie poprzez wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe17,18. Co więcej, morfologia komórek, w tym obszar rozprzestrzeniania się i wydłużanie komórek, odgrywają główną rolę w regulacji funkcji i mogą być regulowane przez wskazówki związane z ECM19,20. Wiele wcześniejszych badań koncentrowało się na komórkach macierzystych różnicujących się w określone linie, jednak SC mają podobną zdolność do zmiany fenotypu z homeostatycznego, dorosłego SC w zdrowym nerwie, na naprawczy SC zdolny do wydzielania białek i czynników wzrostu podczas przebudowy ECM po uszkodzeniu nerwu5,21. Dlatego szczególnie ważne jest zidentyfikowanie mechanizmów leżących u podstaw związku między wrodzoną zdolnością regeneracyjną SC a sygnałami związanymi z ECM, aby wgląd ostatecznie wykorzystał tę zdolność do regeneracji nerwów.

Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy szczegółową metodologię produkcji substratu do hodowli komórkowych, gdzie sztywność mechaniczna i typ liganda mogą być łatwo dostrojone w fizjologicznie odpowiednich zakresach. Polidimetylosiloksan (PDMS) został wybrany jako substrat ze względu na jego wysoce przestrajalną mechanikę w porównaniu z żelem poliakrylamidowym, gdzie maksymalny moduł Younga wynosi około 12 kPa, w przeciwieństwie do PDMS na poziomie około 1000 kPa22,23,24. Jest to korzystne dla wykonywanej pracy, ponieważ ostatnie badania wykazały, że moduł Younga nerwu kulszowego królika może przekraczać 50 kPa podczas rozwoju, co sugeruje, że zakres sztywności nerwów w PNS jest szerszy niż wcześniej badano. Różne białka są zdolne do adsorpcji na podłożach PDMS w celu analizy kombinatorycznej regulacji mechaniki i ligandów na zachowanie SC. Pozwala to na badanie wielu sygnałów mikrośrodowiskowych obecnych w procesie regeneracji PNS i porównanie wysokiego stopnia przestrajania z pracą, skupiając się wyłącznie na sztywności podłoża25. Co więcej, te zmodyfikowane substraty do hodowli komórkowych są kompatybilne z wieloma metodami analizy ilościowej, takimi jak immunohistochemia, western blot i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (q-PCR).

Ta platforma hodowli komórkowych jest wysoce odpowiednia do analizy ścieżek mechanistycznych, ze względu na wysoki poziom indywidualnej przestrajania każdego sygnału związanego z ECM. Ponadto, popularne metody mikrowzorcowania komórek, w tym druk mikrokontaktowy, mogą być osiągnięte na podłożach, aby umożliwić kontrolowaną adhezję komórkową w celu analizy kształtu komórki w odniesieniu do innych wskazówek związanych z ECM24. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ substraty o wzorze liniowym, które sprzyjają wydłużaniu się populacji komórek, dostarczają narzędzia do naśladowania i badania wydłużonych i regeneracyjnych SC w pasmach Büngnera podczas regeneracji nerwów. Co więcej, morfologia komórkowa jest silnym regulatorem wielu funkcji komórek i może potencjalnie wprowadzać mylące wyniki eksperymentalne, jeśli nie jest kontrolowana26,27. Obecnie wiele uwagi poświęca się mechanizmom rządzącym fenotypem regeneracyjnym SC regulowanym przez ECM cues28,29,30. Jest to niezbędne, aby zapewnić wgląd w projektowanie biomateriałów, które mogą być stosowane jako kanały prowadzenia nerwów w celu pomocy w regeneracji nerwów PNS. Te szczegółowe protokoły mogą ostatecznie zostać wykorzystane jako potencjalne narzędzie do rozszyfrowania mechanizmów funkcji SC i innych typów komórek, regulowanych przez sygnały związane z ECM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie i charakterystyka substratu do hodowli komórkowych

  1. Przygotowanie podłoża
    1. Energicznie wymieszać elastomer bazowy PDMS i utwardzacze za pomocą końcówki pipety w stosunku od 10:1 do 60:1, aż pęcherzyki zostaną jednorodnie rozproszone w mieszaninie. Usuń bąbelki za pomocą suszenia próżniowego, aż bąbelki się rozproszą.
      UWAGA: Podczas polimeryzacji PDMS utwardzacz sieciuje się z elastomerem bazowym, aby zapewnić końcowe właściwości mechaniczne polimeru. Współczynniki usieciowania można dostosować, aby zmienić sztywność PDMS.
    2. Umieść kroplę (~0,2 ml) wysuszonej mieszaniny PDMS na kwadratowym lub okrągłym szkiełku nakrywkowym (np. 22 mm x 22 mm) i obracaj szkiełko nakrywkowe na powlekarce wirowej z prędkością 2500 obr./min przez 30 s.
    3. Szkiełko nakrywkowe należy inkubować w piecu w temperaturze 60 °C przez 1-2 godziny lub w temperaturze pokojowej przez noc, aby PDMS stwardniał.
    4. Szkiełko nakrywkowe należy traktować środkiem czyszczącym UV-Ozone przez 7 minut (długość fali UV: 185 nm i 254 nm), aby zwiększyć hydrofilowość powierzchni. Umieść go w wysterylizowanej płytce 6-dołkowej.
    5. Przed użyciem do hodowli komórkowej należy inkubować substraty w 70% etanolu przez co najmniej 30 min.
      UWAGA: Środek czyszczący UV-Ozone może wytwarzać ozon, który jest szkodliwy dla ludzi. Pracuj w dygestoriach chemicznych lub z jakąś formą wentylacji.
    6. Zanurzyć szkiełka nakrywkowe w roztworze białkowym (10 μg/ml kolagenu I, fibronektyny lub lamininy) na 60 minut w sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Po obróbce UV-Ozone powierzchnia PDMS może być nadal hydrofobowa. Obrócić płytkę dołka, aby upewnić się, że każde szkiełko nakrywkowe jest pokryte roztworem białka.
    7. Odessać roztwór białka i przemyć szkiełko nakrywkowe solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) 3x.
    8. Ponownie zawiesić linię komórkową Schwanna RT4-D6P2T (SCs) z naczynia pasażowego za pomocą dostępnego na rynku roztworu EDTA (1x) z 2,5% trypsyną i zlicz komórki za pomocą hemocytometru. Wysiewaj SC na przestrajalnej powierzchni PDMS o żądanej gęstości komórek. Gęstość wysiewu SC może się różnić w zależności od zastosowania.
    9. Utrzymuj komórki w pożądanych parametrach hodowli komórkowej (90% wilgotności, 5%CO2, 37 °C itp.) przez czas trwania eksperymentu. Jako pożywkę do hodowli komórkowych należy użyć zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny.
  2. Przygotowanie podłoża z mikrowzorem
    1. Narysuj żądaną geometrię i obszary klejenia komórek (900 μm2, 1 600 μm2 i 2 500 μm2) za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Utwórz chromowaną fotomaskę na podstawie tych wzorów od komercyjnego dostawcy.
    2. W pomieszczeniu czystym lub środowisku wolnym od kurzu użyj standardowych technik fotolitografii do wytwarzania płytek krzemowych (protokoły są szczegółowo opisane w innym miejscu31). Parametry krytyczne dla tego konkretnego zastosowania są następujące: Fotorezystor: SU-8 2010; Profil wirowania w celu rozproszenia fotorezystu: 500 obr/min przez 10 s z przyspieszeniem 100 obr/min, następnie 3500 obr/min przez 30 s z przyspieszeniem 300 obr/s; Energia ekspozycji światła UV: 130 mJ/cm,2,
      UWAGA: Wysokość wzorów na płytkach krzemowych wynosi około 10 μm przy tych parametrach. Potencjalne pęknięcia wokół krawędzi poza prostokątnymi lub trójkątnymi wzorami można zobaczyć za pomocą mikroskopu świetlnego po kroku 1.2.2. Pieczenie wafla silikonowego w temperaturze 190 °C przez 30 minut pomaga wyeliminować pęknięcia.
    3. Umieścić wzorzystą płytkę krzemową w okrągłej szalce Petriego o średnicy 150 mm x wysokości 15 mm i wlać odgazowany PDMS (proporcje mieszania 10:1) przygotowane w kroku 1.1.1 na płytkę krzemową.
      UWAGA: Upewnij się, że grubość PDMS wynosi co najmniej 5 mm, aby ułatwić obsługę podczas etapów drukowania mikrokontaktowego.
    4. Zestalić PDMS na płytce krzemowej w piekarniku w temperaturze 60 °C przez noc. Poczekaj, aż PDMS ostygnie do temperatury pokojowej. Precyzyjnie wycięte stemple kwadratów o wymiarach 30 mm x 30 mm zawierające odpowiednie wzory z płytki krzemowej za pomocą skalpela chirurgicznego. Nie uszkadzaj wafla silikonowego.
      UWAGA: W tym momencie wafle krzemowe mogą być wielokrotnie wykorzystywane do produkcji większej liczby znaczków po oczyszczeniu izopropanolem.
    5. Wysterylizuj stemple PDMS i przestrajalne szkiełka nakrywkowe (przygotowane w krokach od 1.1.1 do 1.1.3), zanurzając je w 70% etanolu na 30 minut.
    6. Aby potwierdzić skuteczność mikrowzoru za pomocą stempli PDMS po wydrukowaniu mikrokontaktowym, należy osuszyć powierzchnię stempli PDMS za pomocą przefiltrowanego strumienia powietrza i odpipetować 50 μg/ml roztworu BSA (sprzężonego Texas Red), aby pokryć całą wzorzystą stronę stempla PDMS.
    7. Inkubować stemplowanie PDMS z roztworem BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić adsorpcję białek.
    8. Osuszyć powierzchnię przestrajalnych szkiełek nakrywkowych za pomocą przefiltrowanego strumienia powietrza, zwiększyć hydrofilowość powierzchni, jak opisano w kroku 1.1.5.
    9. Wysuszyć na powietrzu stemple PDMS, aby usunąć pozostały roztwór BSA.
      UWAGA: Należy upewnić się, że roztwór BSA został całkowicie usunięty ze stempla, ponieważ wszelkie pozostałe roztwory spowodują przesuwanie się stempli na szkiełku nakrywkowym podczas drukowania mikrokontaktowego.
    10. Doprowadzić wzorzystą stronę stempla do konforemnego kontaktu z przestrajalnym szkiełkiem nakrywkowym w celu adsorpcji BSA na powierzchni szkiełka nakrywkowego. Delikatnie dociśnij stempel do szkiełka nakrywkowego przez 5 minut
      UWAGA: Nie należy wywierać nadmiernej siły na stempel, ponieważ wygina się on i powoduje niespecyficzny kontakt między stemplem a szkiełkiem nakrywkowym. Odpowiednia siła przyłożona do stempla jest niezbędna do udanego druku mikrokontaktowego.
    11. Zbadaj mikrowzór za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem FITC (izotiocyjanian fluoresceiny).
    12. Aby wydrukować obszary adhezyjne komórek, a nie wzory fluorescencyjne, zastąp białko BSA lamininą i powtórz kroki od 1.2.5 do 1.2.10.
    13. Usuń stemple z szkiełek nakrywkowych, przenieś szkiełka nakrywkowe do wysterylizowanej płytki 6-dołkowej. Dodać 2 ml 0,2% w/v roztworu Pluronic F-127 do każdej studzienki, aby pokryć powierzchnię szkiełka nakrywkowego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Pluronic F-127 może być adsorbowany na powierzchni PDMS, zwiększając hydrofobowość powierzchni PDMS, aby zablokować adhezję komórek.
    14. Odessać roztwór Pluronic F-127 i przemyć 5x PBS i 1x pożywką do hodowli komórkowych przed wysiewem komórek. Typowa gęstość wysiewu dla SC wynosi 1 000 komórek/cm2.
    15. 45 minut po wysiewie komórek usunąć pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć szkiełka nakrywkowe PBS 2x, aby zapobiec przyleganiu wielu SC do tego samego wzoru. Utrzymuj komórki w pożądanym środowisku hodowli komórkowej przez 48 godzin przed kwantyfikacją.
    16. Aby utworzyć substraty do hodowli komórkowych z linim wzorem w celu zbadania wyrównanych komórek, wykonaj kroki od 1.2.1 do 1.2.4 w celu utworzenia stempli do drukowania mikrokontaktowego.
      UWAGA: Wymiary rowka/grzbietu wyłożonych wzorów na stemplu to 50 μm x 50 μm dla obrysowanych komórek. Całkowite wymiary stempla to 10 mm x 10 mm.
    17. Wytnij stemple na wymiary zawierające tylko żądane wzory linii.
      UWAGA: Podczas tworzenia stempli w CAD, niewzorzysty obszar stempla wokół wzorów linii będzie odpowiadał obszarowi kleju komórkowego po drukowaniu mikrokontaktowym. W związku z tym konieczne jest wyeliminowanie niewzorzystych obszarów podczas wycinania stempla, aby upewnić się, że każdy SC wysiany na powierzchni jest zgodny ze wzorami.
    18. Wykonaj kroki od 1.1.1 do 1.1.3, aby przygotować przestrajalną powłokę powierzchniową PDMS na dwie szalki Petriego.
      UWAGA: Będzie to PDMS pokrywający samą powierzchnię szalki Petriego, a nie na szkiełku nakrywkowym.
    19. Wykonaj kroki od 1.2.5 do 1.2.10, aby wykonać drukowanie mikrokontaktowe w celu wydrukowania obszarów kleju komórkowego z linim wzorem na jednej z płytek Petriego pokrytych PDMS.
      UWAGA: Powierzchnia szalki Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm może zawierać obszary z wzorem linii z 6 stempli PDMS.
    20. Usunąć ślady i napełnić szalkę Petriego 4 ml 0,2% m/v roztworu Pluronic F-127 i inkubować przez 1 godzinę.
    21. Po wydrukowaniu mikrokontaktowym opłucz każdą stronę stempli PDMS 70% etanolem 3x i osusz powietrzem. Obróć stemple PDMS i wykonaj kroki od 1.2.5 do 1.2.10, aby wydrukować niewzorzysty obszar kleju komórkowego przy użyciu niewzorzystej strony stempla na drugiej szalce Petriego. Powtórz krok 1.2.13.
    22. Odessać roztwór F-127 z naczyń, przemyć 3x PBS, a następnie 1x przemyć świeżym pożywką do hodowli komórkowych. Nasiona SC na talerzach.
      UWAGA: Gęstość wysiewu dla naczynia z wzorem linii wynosi 5,000 komórek/cm2, a dla naczynia bez wzoru wynosi 10,000 komórek/cm2.
    23. Utrzymuj SC w żądanych warunkach przez 48 godzin i postępuj zgodnie z protokołami, aby przygotować lizaty SC32.
      UWAGA: Gęstość wysiewu komórek dla naczyń bez wzoru jest 2 razy wyższa niż dla naczyń z wzorem liniowym, ponieważ naczynie z wzorem linii ma tylko połowę powierzchni kleju komórkowego naczynia bez wzoru.
      1. Aby przygotować lizaty, należy przenieść odpowiedni bufor do testu radioimmunoprecypitacji (RIPA) do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 10 ml. Rozcieńczyć proteazę i inhibitor fosfatazy (100x) w stosunku 1:100 w buforze RIPA, dobrze wymieszać pipetując.
      2. Przemyć komórki lodowatym PBS (1x) przez 2 minuty, dodać 80 μl roztworu przygotowanego z kroku 1.2.23.1 na każdy obszar kleju komórkowego (obszar, który miał kontakt ze stemplami PDMS i zaadsorbowanym białkiem) na szalkach Petriego. Inkubować komórki z roztworem na bloku lodu przez 15 min.
        UWAGA: Roztwór pozostanie tylko na obszarze kleju komórkowego ze względu na hydrofobowość adsorpcji Pluronic F-127 w innym miejscu. Ta cecha umożliwia udaną i wystarczającą ekstrakcję białka dla SC o wzorze liniowym.
      3. Zeskrobuj SC za pomocą skrobaka do komórek przez 5 minut. Zbierz lizat do oznakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      4. Lizat mikrowirówki przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4°C. Zebrać supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i przenieść do czystej probówki do mikrowirówki. Przechowywać lizat komórkowy w temperaturze -20 °C.
  3. Charakterystyka podłoża
    UWAGA: Aby scharakteryzować mechanikę polimeru na szkiełku nakrywkowym, zwykle stosuje się wiele metod, w tym testy ściskania masowego11,33 lub badania mikroskopii sił atomowych34. Ten protokół przedstawi podstawowe testy kompresji zbiorczej.
    1. Wlać prekursor PDMS o pożądanych proporcjach mieszania (krok 1.1) na płytkę Petriego o średnicy 30 mm, upewnić się, że grubość warstwy PDMS w szalce Petriego wynosi co najmniej 20 mm.
    2. Po 1 godzinie wyjąć szalkę Petriego z zestalonym PDMS z pieca o temperaturze 60 °C i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej. Pokrój polimer na kwadraty o wymiarach 10 mm x 10 mm. Zmierz grubość PDMS za pomocą suwmiarki.
    3. Umieść PDMS na stoliku maszyny do pomiaru siły ściskającej. Podłącz czujnik siły ściskania (model: 112C) do portu czujnika i przymocuj czujnik do osi maszyny testowej.
    4. Ustaw wysokość czujnika na około 0.5 cm powyżej stempla PDMS za pomocą przycisku "jog" na przednim panelu przyrządu.
    5. Otwórz powiązane oprogramowanie za pomocą okna "Test Setup", wybierz "Servo profile" i otwórz okno "Segment". W oknie "Segment" wprowadź żądane "Szybkość kontrolną" i "Kwotę końcową" dla testu.
      UWAGA: Szybkość kontroli określa szybkość, z jaką czujnik przemieszcza się w dół w kierunku PDMS. Ilość końcowa określa całkowitą odległość, jaką pokonuje czujnik.
    6. Użyj przycisku "Z" znajdującego się na panelu sterowania oprogramowania, aby zresetować wszystkie pomiary w tym momencie.
    7. Przesuń czujnik w dół, aby lekko zetknąć się z PDMS, aż zostaną załadowane 1-2 niutony (N). Obciążenie i odległość, jaką pokonuje czujnik, zostaną wyświetlone w oprogramowaniu.
    8. Po użyciu przycisku "Z" uruchom pomiar za pomocą "Play" i zapisz file siła nagrywania i odległość.
    9. Powtórzyć kroki od 1.3.3 do 1.3.8 dla każdego warunku doświadczalnego PDMS.
    10. Otwórz plik i użyj poniższego wzoru, aby obliczyć moduł Younga (E) PDMS dla każdego stosunku. (F = siła ściskająca, A = obszar stempla PDMS, ∆L = odległość przesuwu czujnika, a L0 = oryginalna grubość stempla PDMS).
      figure-protocol-1

2. Kwantyfikacja właściwości komórkowych na przestrajalnych podłożach

  1. Test proliferacji
    1. Wysiewaj SC na podłożach przygotowanych z kroku 1.1.9 o gęstości 5 000 komórek/cm2 na płytce 6-dołkowej. Pozostawić SC do inkubacji przez 48 godzin w standardowych warunkach hodowli komórkowej (37 °C i 5% CO2 ).
    2. Rozcieńczyć 12 μl 10 mM roztworu podstawowego bromodeoksyurydyny (BrdU) w 12 ml pożywki do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C, dobrze wymieszać pipetą, aby uzyskać 10 μM roztworu do znakowania BrdU.
    3. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć SC 2x PBS.
    4. Dodać 2 ml roztworu do znakowania BrdU do każdej studzienki i inkubować SC przez 2 godziny
      UWAGA: Czas inkubacji roztworu do znakowania BrdU zależy od konkretnego tempa proliferacji komórek. Linia RT4-D6P2T SC charakteryzuje się wysokim tempem proliferacji, dlatego zastosowano 2 godziny czasu inkubacji.
    5. Usuń roztwór do etykietowania BrdU i umyj SC 3x PBS. Dodaj 1 ml 3,7% formaldehydu z PBS do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut w celu utrwalenia komórek.
      UWAGA: Formaldehyd jest czynnikiem rakotwórczym dla ludzi; Dlatego wszystkie prace należy wykonywać wewnątrz dygestorium chemicznego z zachowaniem odpowiedniej ochrony.
      UWAGA: Podczas mycia PBS w studzience nie ma pożywki do hodowli komórkowych, a zatem powierzchnia PDMS może być hydrofobowa. Podejmij środki ostrożności, aby nie wysuszyć całkowicie powierzchni podłoża, aby zapobiec uszkodzeniu komórek.
    6. Odessać roztwór formaldehydu i przemyć 3x PBS (po 3 min). Usuń PBS i dodaj 1 ml 0,2% Triton X-100 w PBS do każdej studzienki, aby przeniknąć błonę komórkową. Inkubować SC z roztworem Triton X-100 przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Usunąć roztwór Triton X-100 i przemyć SC 3x PBS (po 3 minuty).
    8. Dodać 1 ml 1 N HCl do każdej studzienki i inkubować na lodzie przez 10 min. Usunąć 1 N HCl i dodać 1 ml 2 N HCl do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min. Leczenie HCl służy do hydrolizy DNA.
    9. Wymieszaj 182 ml 0,2 mM Na2HPO4 i 18 ml 0,1 mM kwasu cytrynowego, aby wytworzyć bufor fosforanowo-cytrynowy do pobierania antygenu. Usunąć 2 N HCl i dodać 1 ml buforu fosforanu/kwasu cytrynowego do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    10. Umyj SCs 3x 0,2% Triton X-100 w PBS. Dodać 2 ml 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS do każdej studzienki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby określić czas niespecyficznego wiązania przeciwciała.
    11. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało BrdU sprzężone z Alexa Fluor 488 w 3% roztworze BSA w stosunku 1:300 dla roztworu barwiącego BrdU. Inkubować SC z roztworem barwiącym przez noc w temperaturze pokojowej, podczas gdy płytka jest pokryta folią aluminiową.
    12. Aby określić ilościowo proliferację, należy zobrazować SC za pomocą kanału FITC i DAPI mikroskopu fluorescencyjnego do wykrywania odpowiednio BrdU i jąder. Zapisz obrazy jako pliki "nd.2".
    13. Otwórz pliki "nd.2" dla każdego zdjęcia wykonanego w identycznych pozycjach przestrzennych.
    14. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu. Kliknij prawym przyciskiem myszy tło, aby otworzyć okno "Wyniki pomiarów automatycznych" i "Pomiar automatyczny" w sekcji "Kontrola analizy".
    15. W menu "Liczebność i taksonomia" wybierz "Liczba". Na obrazie FITC kliknij każde jądro wykazujące zieloną fluorescencję (dodatni BrdU) i kliknij prawym przyciskiem myszy na obrazie.
      UWAGA: Liczba dodatnich komórek BrdU jest pokazana w oknie "Automatyzacje i pomiary".
    16. W przypadku obrazów DAPI powtórz krok 2.1.14, aby policzyć całkowitą liczbę jąder. Oblicz procent komórek dodatnich BrdU dla tego obrazu.
    17. Powtórzyć kroki od 2.1.13 do 2.1.16 dla innych obrazów do celów statystycznych i obliczyć średni odsetek komórek BrdU dodatnich dla każdego warunku substratu.
  2. Kwantyfikacja ekspresji c-Jun poprzez analizę obrazu immunofluorescencyjnego
    1. Komórki przygotowane wewnątrz płytek 6-dołkowych z kroku 1.1.9 i 1.2.23 są utrwalane i przepuszczalne zgodnie z procedurami opisanymi wcześniej (kroki 2.1.5-2.1.7).
      UWAGA: Aby przeprowadzić dokładne porównania intensywności fluorescencji w komórkach o różnych warunkach ECM, należy zastosować ustawienia kamery identycznie do wszystkich próbek, przy czym wszystkie próbki mają te same parametry.
    2. Zapisz obrazy jako pliki ".nd2".
    3. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu. Kliknij prawym przyciskiem myszy tło, aby otworzyć okno "Wyniki pomiarów automatycznych" i "Pomiar automatyczny" w sekcji "Kontrola analizy".
    4. W polu "Automated Measurement Results" (Wyniki pomiarów automatycznych) wybierz opcję "Object Data" (Dane obiektu). Aktywuj przycisk "Kontynuuj aktualizację pomiaru".
    5. W górnym panelu oprogramowania wybierz "Zmierz", a następnie "Cechy obiektu". Dodaj "Średnia intensywność" do sekcji "Wybrane do pomiaru".
    6. Otwórz i połącz dwa pliki obrazów ".nd2", które zawierają obrazy c-Jun i jąder.
    7. W górnym panelu wybierz "ROI" i wybierz "Narysuj prostokątny ROI". Narysuj prostokątny obszar zawierający obszar jądra pojedynczej komórki.
      UWAGA: Wyrażenie c-Jun jest skoncentrowane w nuclei35.
    8. W górnym panelu oprogramowania wybierz "Binarny" i "Zdefiniuj próg", pojawi się nowe okno do precyzyjnego zdefiniowania obszaru fluorescencyjnego c-Jun.
    9. W nowym oknie kliknij "Pełny obraz/Użyj ROI", aby przełączyć program z modelu pełnego obrazu na model ROI. Użyj opcji "Intensywność", aby dostosować tabelę przeglądową znajdującą się po lewej stronie okna w celu dostosowania rozmiaru/kształtu podświetlonego obszaru w prostokątnym ROI.
      UWAGA: Zwróć uwagę, aby rozmiar/kształt podświetlonego obszaru był identyczny z jądrem.
    10. Kliknij przycisk "OK", aby uzyskać średnią intensywność FITC w oknie "Wyniki pomiarów automatycznych", a następnie kliknij "Zapisz dane".
    11. W oknie "Pomiar automatyczny", "Usuń obiekt", aby usunąć podświetlony na czerwono obszar. Na lewym panelu bocznym użyj "Narzędzia wskazującego", aby wybrać prostokątny zwrot akcji i usunąć.
    12. Powtórzyć kroki od 2.2.6 do 2.2.11, aby zmierzyć średnią intensywność FITC dla każdej dodatkowej komórki.
    13. W obszarze okna "Automatyczne wyniki pomiarów" wybierz "Przechowywane", a wszystkie zapisane dane zostaną wyświetlone. Skorzystaj z funkcji "Eksportuj" i wybierz "Dane do Excela", aby zapisać wyeksportowany arkusz kalkulacyjny i wykonać dodatkowe obliczenia.
  3. Kwantyfikacja wydłużenia jądra
    1. Napraw i przepuszczalność SC przygotowanych z kroku 1.2.22, postępując zgodnie z krokami 2.1.5-2.1.7. Wykonaj barwienie jądrowe za pomocą podłoża montażowego z DAPI.
    2. Korzystając z kanału DAPI i obiektywu 40x, uzyskaj obrazy próbki i zapisz je jako pliki ".nd2".
    3. Wykonaj kroki 2.2.3 i 2.2.4, aby otworzyć okna "Wyniki pomiarów automatycznych" i "Pomiar automatyczny" w oprogramowaniu do analizy obrazu.
    4. W "Automatycznych wynikach pomiarów" użyj funkcji "Opcja", a następnie "Wybierz cechę obiektu". W kolumnie "Cecha" wybierz "Wydłużenie" i dodaj do kolumny "Wybrane do pomiarów". Użyj opcji "Aktualizuj pomiar", aby aktywować tę funkcję.
    5. Otwórz plik obrazu "nd.2", który zawiera obrazy jądrowe. W oknie "Pomiar automatyczny" wybierz funkcję "Automatyczne wykrywanie" i wybierz jądro. Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy, a zmierzony współczynnik proporcji jądrowych zostanie pokazany w "Automatycznych wynikach pomiarów".
    6. Powtórz krok 2.3.5, aby określić ilościowo proporcje jąder dla innych jąder na obrazie. Wybierz "Przechowuj dane" w oknie "Automatyczne wyniki pomiarów".
    7. Powtórz czynności od 2.3.5 do 2.3.6, aby uzyskać dodatkowe obrazy. Wyeksportuj dane do pliku arkusza kalkulacyjnego, tak jak poprzednio w wersji 2.2.13 w celu analizy.
  4. Western blot do ilościowego określenia ekspresji białka
    1. Postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami analizy western blot opisanymi gdzie indziej32. Rozcieńczenia przeciwciał użytych w badaniu przedstawiono poniżej: Królik anty c-Jun 1:2,000; Mysz anty β-aktyna 1:1,000; Królik anty p75NTR 1:1,000; Królicze białko podstawowe anty mielinowe 1:1,000; Przeciwciało anty-mysie/królicze IgG, związane z HRP 1:10 000.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby przeanalizować i określić ilościowo zależność między sztywnością substratu a składem białka na fenotypie SC, opracowano przestrajalny substrat do hodowli komórkowych PDMS (Rysunek 1A). Próba ściskania polimeru na różnych proporcjach podstawy: utwardzacza została wykorzystana do ilościowego określenia modułu Younga (E) podłoża (Rysunek 1B). Uzyskany w ten sposób zakres wartości modułu odzwierciedla fizjologicznie istotne warunki podłoża. Po przygotowaniu substratów, SC poddano h...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SC mogą wspomagać regenerację nerwów ze względu na ich transformację fenotypową i potencjał regeneracyjny po uszkodzeniu nerwu. Jednak sposób, w jaki sygnały ECM regulują tę zdolność regeneracyjną, pozostaje w większości niejasny, co może utrudniać nie tylko rozwój biomateriałów, które mają na celu promowanie regeneracji nerwów, ale także zrozumienie mechanizmów związanych z regeneracją nerwów. Aby rozpocząć badanie tej wzajemnej zależności, stworzono substraty do hodowli komórkowych, w których można kontrolować sygnały ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłosili potencjalnego konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Uniwersytetu w Cincinnati. Autorzy dziękują również Ronowi Flennikenowi z laboratorium Advanced Materials Characterization Uniwersytetu w Cincinnati za wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Albumina z surowicy bydlęcej (BSA), koniugat Texas RedThermo Fisher ScientificA23017Barwienie BSA w celu pokazania mikrowzorów
Przeciwciało IgG przeciw myszy, technologiasygnalizacji komórkowejPrzeciwciało 7076Sużywane do analizy western blot
Przeciwciało anty-królicze IgG, technologia sygnalizacji komórkowej przeciwciał sprzężonych z HRPPrzeciwciało 7074Sużywane do analizy
western blotBrdUThermo Fisher ScientificB23151Odczynnik stosowany do pomiaru proliferacji komórek
Przeciwciało pierwotne BrdU sprzężone z Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificB35130Służy do wizualizacji BrdU w testach proliferacji komórek
Kolagen IThermo Fisher ScientificA10483-01Białko używane do powlekania szkiełek nakrywkowych
Maszyna do badania siły ściskającejTestResourcesPrzyrząd do ilościowego określania właściwości mechanicznych polimerów
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy DulbeccoThermo Fisher Scientific11965092Pożywka do hodowli komórkowych
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific16000044Pożywka do hodowli komórkowych uzupełniająca
FibronektynaThermo Fisher Scientific33010-018Białko używane do powlekania szkiełek nakrywkowych
Fluorescencja mikroskopNikonEclipse Ti2Mikroskop fluorescencyjny
Halt Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy (100X)Thermo Fisher Scientific78440Inhibitor proteazy i fosfatazy
LamininThermo Fisher Scientific23017015Białko używane do powlekania szkiełek nakrywkowych
Podłoże montażowe z DAPIThermo Fisher ScientificP36971Mocowanie szkiełek nakrywkowych i barwienie jąder
Mysz C-Jun pierwotne przeciwciało ThermoFisher Scientific711202Pierwszorzędowe przeciwciało do wizualizacji białka c-Jun
Mysz &beta-aktyna pierwotne przeciwciałoTechnologia sygnalizacji komórkowej3700SKontrola ładowania dla eksperymentów western blot
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Scientific15140122Pożywka do hodowli komórkowych uzupełniająca
Photoresist SU 2010KAYAKUSU8-2010Photoresist
Pluronic F-127Sigma AldrichP-2443Blokuj niespecyficzne wiązanie białek
Pierwotne przeciwciało królika c-JunTechnologia sygnalizacji komórkowej9165S Przeciwciałopierwszorzędowe do wizualizacji białka c-Jun
Podstawowe przeciwciało podstawowe białka mieliny królikaAbcamab40390Przeciwciało pierwszorzędowe do wizualizacji MBP
Królik p75NTRprzeciwciało pierwotne Technologia sygnalizacji komórkowej8238S Przeciwciałopierwotne do wizualizacji p75NTR
Falloidyna rodaminowaThermo Fisher ScientificR415Wizualizacja cytoszkieletu komórkowego
Bufor RIPAAbcamab156034Bufor do lizy komórek
RT4-D6P2T Linia komórkowa SchwannaATCCCRL-2768Linia komórkowa stosowana w
eksperymenty SYLGARD 184 PDMS baza i utwardzaczSigma Aldrich761036Przestrajalny polimer stosowany do powlekania szkiełek nakrywkowych
TrypsynaThermo Fisher Scientific15090-046Odczynnik do dysocjacji komórek
UV-Środek czyszczący do ozonuNovascanZwiększ hydrofilność PDMS
Versene (1x)Thermo Fisher Scientific15040066Dysocjacja komórek Odczynnik
przeciwciał sprzężona z HRP

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The Incidence of Peripheral Nerve Injury in Extremity Trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87, 381-385 (2008).
  2. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of Upper and Lower Extremity Peripheral Nerve Injuries in a Population of Patients with Multiple Injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45, 116-122 (1998).
  3. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594, 3521-3531 (2016).
  4. Arthur-Farraj, P. J., et al. c-Jun Reprograms Schwann Cells of Injured Nerves to Generate a Repair Cell Essential for Regeneration. Neuron. 75, 633-647 (2012).
  5. Jessen, K. R., Mirsky, R. The Success and Failure of the Schwann Cell Response to Nerve Injury. Frontiers in Cell Neurosciences. 13, 33(2019).
  6. Gomez-Sanchez, J. A., et al. After Nerve Injury, Lineage Tracing Shows That Myelin and Remak Schwann Cells Elongate Extensively and Branch to Form Repair Schwann Cells, Which Shorten Radically on Remyelination. Journal of Neuroscience. 37 (37), 9086-9099 (2017).
  7. Deumens, R., et al. Repairing injured peripheral nerves: Bridging the gap. Progress in Neurobiology. 92, 245-276 (2010).
  8. Höke, A., Gordon, T., Zochodne, D. W., Sulaiman, O. A. R. A decline in glial cell-line-derived neurotrophic factor expression is associated with impaired regeneration after long-term Schwann cell denervation. Experimental Neurology. 173, 77-85 (2002).
  9. Jones, S., Eisenberg, H. M., Jia, X. Advances and future applications of augmented peripheral nerve regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17, 1-17 (2016).
  10. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. 60-61, 176-189 (2017).
  11. Harris, G. M., Piroli, M. E., Jabbarzadeh, E. Deconstructing the Effects of Matrix Elasticity and Geometry in Mesenchymal Stem Cell Lineage Commitment. Advanced Function Mater. 24 (16), 2396-2403 (2014).
  12. Pryzhkova, M. V., Harris, G. M., Ma, S., Jabbarzadeh, E. Patterning pluripotent stem cells at a single cell level. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering. 3 (4), 461-471 (2013).
  13. Engler, A. J., Sweeney, H. L., Discher, D. E., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeleton and Neuronal Interaction. 7 (4), 335(2007).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  16. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Reports. 15, 1243-1253 (2014).
  17. Chernousov, M. A., Carey, D. J. Schwann cell extracellular matrix molecules and their receptors. Histology and Histopathology. 15, 593-601 (2000).
  18. Shibata, S., et al. Selective Laminin-Directed Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Distinct Ocular Lineages. Cell Reports. 25 (6), 1668-1679 (2018).
  19. Mcbeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell Shape, Cytoskeletal tenstion and RhoA regulate stem cell lineage committment. Developmental Cell. 6, 483-495 (2004).
  20. Halder, G., Dupont, S., Piccolo, S. Transduction of mechanical and cytoskeletal cues by YAP and TAZ. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 591-600 (2012).
  21. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594 (13), 3521-3531 (2016).
  22. Lopez-Fagundo, C., Bar-Kochba, E., Livi, L. L., Hoffman-Kim, D., Franck, C. Three-dimensional traction forces of Schwann cells on compliant substrates. Journal of The Royal Society Interface. 11, 20140247(2014).
  23. Gu, Y., et al. The influence of substrate stiffness on the behavior and functions of Schwann cells in culture. Biomaterials. 33, 6672-6681 (2012).
  24. Xu, Z. Y., Orkwis, J. A., DeVine, B. M., Harris, G. M. Extracellular matrix cues modulate Schwann cell morphology, proliferation, and protein expression. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. , (2019).
  25. Urbanski, M. M., et al. Myelinating glia differentiation is regulated by extracellular matrix elasticity. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  26. Sun, Y., et al. Tunable stiffness of graphene oxide/polyacrylamide composite scaffolds regulates cytoskeleton assembly. Chemical Sciences. 9 (31), 6516-6522 (2018).
  27. Hwang, J. H., et al. Extracellular matrix stiffness regulates osteogenic differentiation through MAPK activation. PLoS One. 10, 1-16 (2015).
  28. Ryan, A. J., et al. A Physicochemically Optimized and Neuroconductive Biphasic Nerve Guidance Conduit for Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 6, 1-13 (2017).
  29. Du, J., et al. Prompt peripheral nerve regeneration induced by a hierarchically aligned fibrin nanofiber hydrogel. Acta Biomaterialia. 55, 296-309 (2017).
  30. Huang, L., et al. A compound scaffold with uniform longitudinally oriented guidance cues and a porous sheath promotes peripheral nerve regeneration in vivo. Acta Biomaterialia. 68, 223-236 (2018).
  31. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. Jouranl of Visualized Experiments. (119), e55276(2017).
  32. Gupta, R., et al. Shear stress alters the expression of myelin-associated glycoprotein (MAG) and myelin basic protein (MBP) in Schwann cells. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 23, 1232-1239 (2005).
  33. Harris, G. M., Shazly, T., Jabbarzadeh, E. Deciphering the combinatorial roles of geometric, mechanical, and adhesion cues in regulation of cell spreading. PLoS One. 8 (11), (2013).
  34. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  35. Schreck, I., et al. C-Jun localizes to the nucleus independent of its phosphorylation by and interaction with JNK and vice versa promotes nuclear accumulation of JNK. Biochemical and Biophysical Research Communications. 407, 735-740 (2011).
  36. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal Visualized Experiments. (22), e1065(2008).
  37. Treter, J., et al. Washing-resistant surfactant coated surface is able to inhibit pathogenic bacteria adhesion. Applied Surface Science. 303, 147-154 (2014).
  38. Lutz, J. F. Polymerization of oligo(ethylene glycol) (meth)acrylates: Toward new generations of smart biocompatible materials. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 46 (11), 3459-3470 (2008).
  39. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (2017).
  40. Pu, J. Golgi polarization in a strong electric field. Journal of Cell Science. 118, 1117-1128 (2005).
  41. Blaker, J. J., et al. Bioactive Silk-Based Nerve Guidance Conduits for Augmenting Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 7, 1800308(2018).
  42. Daly, W., Yao, L., Zeugolis, D., Windebank, A., Pandit, A. A biomaterials approach to peripheral nerve regeneration : bridging the peripheral nerve gap and enhancing functional recovery. Journal of the Royal Society of Interface. 9 (67), 202-221 (2012).
  43. Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
  44. Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., McCarthy, C. W., Gilbert, R. J. Varying the diameter of aligned electrospun fibers alters neurite outgrowth and Schwann cell migration. Acta Biomaterialia. 6, 2970-2978 (2010).
  45. Carvalho, C. R., Oliveira, J. M., Reis, R. L. Modern Trends for Peripheral Nerve Repair and Regeneration: Beyond the Hollow Nerve Guidance Conduit. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 337(2019).
  46. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical Regulation of Cell Behavior - Cross Talk between Substrate Stiffness and Nanotopography. Engineering. 3, 36-54 (2017).
  47. Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple Approach to Micropattern Cells on Common Culture Substrates by Tuning Substrate Wettability. Tissue Engineering. 10, 865-872 (2004).
  48. Grove, M., et al. YAP/TAZ initiate and maintain schwann cell myelination. Elife. 6, 1-27 (2017).
  49. Poitelon, Y., et al. YAP and TAZ control peripheral myelination and the expression of laminin receptors in Schwann cells. Nature Neuroscience. 19, 879-887 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Schwann Cell PhenotypeExtracellular Matrix MicroenvironmentsTunable PDMS SubstrateMicrocontact Printing TechniqueCellular Spreading AreaCellular Elongation AnalysisImmunofluorescent StainingWestern Blot AnalysisLaminin Coated Substratesc Jun Expression

Powiązane artykuły