Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie przestrajalnych mikrośrodowisk macierzy zewnątrzkomórkowej w celu oceny specyfikacji fenotypu komórek Schwanna

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61496

⸱

2 czerwca 2020

 ,  , 
1Department of Chemical and Environmental Engineering, University of Cincinnati, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Neuroscience Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ta metodologia ma na celu zilustrowanie mechanizmów, za pomocą których sygnały macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak sztywność substratu, skład białka i morfologia komórki, regulują fenotyp komórek Schwanna (SC).

Streszczenie

Urazowe urazy obwodowego układu nerwowego (PNS) obecnie nie mają odpowiednich metod leczenia, aby odzyskać pełną sprawność. Komórki Schwanna (SC), jako główne komórki glejowe PNS, odgrywają istotną rolę w promowaniu regeneracji PNS poprzez dedyferencjację do fenotypu komórki regeneracyjnej po urazie. Jednak stan odróżnicowania SC jest trudny do utrzymania przez okres potrzebny do regeneracji i ma na niego wpływ zmiany w otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). W związku z tym niezbędne jest określenie złożonej zależności między SC a różnymi ECM w celu uzyskania wskazówek dotyczących potencjału regeneracyjnego SC. Aby rozwiązać ten problem, stworzono strategię, w ramach której różne białka ECM zostały zaadsorbowane na przestrajalnym podłożu z polidimetylosiloksanu (PDMS), który zapewnił platformę, na której można modulować sztywność i skład białka. SC wysiewano na przestrajalnych podłożach i mierzono krytyczne funkcje komórkowe reprezentujące dynamikę fenotypu SC. Aby zilustrować wzajemne oddziaływanie między ekspresją białka SC a morfologią komórkową, wykorzystano różne gęstości wysiewu SC oprócz indywidualnych drukowanych wzorów komórkowych w mikrokontakcie i scharakteryzowano je za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i western blot. Wyniki pokazały, że komórki o mniejszym obszarze rozprzestrzeniania się i większym stopniu wydłużenia komórkowego promowały wyższe poziomy regeneracyjnych markerów fenotypowych SC. Metodologia ta nie tylko zaczyna odkrywać istotny związek między ECM a funkcją komórkową SC, ale także dostarcza wskazówek dla przyszłej optymalizacji biomateriałów w naprawie nerwów obwodowych.

Wprowadzenie

Urazy obwodowego układu nerwowego (PNS) pozostają głównym wyzwaniem klinicznym w opiece zdrowotnej, pogarszając jakość życia pacjentów i wywierając znaczący wpływ poprzez mnogość czynników społeczno-ekonomicznych1,2. Komórki Schwanna (SC), jako główne komórki glejowe w PNS, dostarczają niezbędnych wskazówek molekularnych i fizycznych do indukowania regeneracji PNS i pomagają w powrocie do sprawności funkcjonalnej w urazach z krótkimi przerwami. Wynika to z niezwykłej zdolności SC do dedyferencjacji do fenotypu komórki "naprawczej" z fenotypu mielinizacyjnego lub Remak3. Naprawczy SC jest charakterystycznym fenotypem komórkowym pod kilkoma względami. Po urazie SC zwiększają tempo proliferacji, ponownie wchodząc w cykl komórkowy i rozpoczynając ekspresję kilku czynników transkrypcyjnych, aby ułatwić ponowne unerwienie. Czynniki te, takie jak c-Jun i p75 NTR, są regulowane w górę, podczas gdy mielinizujące markery SC, takie jak zasadowe białko mieliny (MBP), są regulowane w dół4,5. Ponadto SC zmieniają morfologię, wydłużając się i ustawiając się względem siebie, tworząc pasma Büngnera w poprzek miejsca urazu6. Zapewnia to fizyczny mechanizm naprowadzania aksonów na rozciąganie się do właściwego dystalnego celu7. Jednak pomimo zdolności SC do wspomagania regeneracji nerwów w urazach z krótkimi przerwami, wyniki powrotu do sprawności pozostają słabe w przypadku poważnych urazów. Jest to częściowo spowodowane utratą wskazówek naprowadzających macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), a także niezdolnością SC do utrzymania fenotypu regeneracyjnego przez długi czas8.

Proces regeneracji i regeneracji nerwów jest ściśle związany ze stanem blaszki podstawy po urazie. Blaszka podstawna to warstwa ECM wokół nerwu, która ułatwia prowadzenie i zapewnia wskazówki związane z ECM dla aksonów i SC w przypadkach, gdy pozostaje nienaruszona po urazie9. Stan ECM i jego zdolność do dostarczania sygnałów związanych z matrycą do komórek jest niezwykle ważny i był wcześniej badany w wielu różnych kontekstach10,11,12,13,14. Na przykład wykazano, że sztywność ECM może kierować funkcjami komórki, takimi jak proliferacja i różnicowanie11,15,16. Skład ECM może również prowadzić do wyraźnej odpowiedzi komórkowej i regulować zachowania komórek, takie jak migracja i różnicowanie poprzez wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe17,18. Co więcej, morfologia komórek, w tym obszar rozprzestrzeniania się i wydłużanie komórek, odgrywają główną rolę w regulacji funkcji i mogą być regulowane przez wskazówki związane z ECM19,20. Wiele wcześniejszych badań koncentrowało się na komórkach macierzystych różnicujących się w określone linie, jednak SC mają podobną zdolność do zmiany fenotypu z homeostatycznego, dorosłego SC w zdrowym nerwie, na naprawczy SC zdolny do wydzielania białek i czynników wzrostu podczas przebudowy ECM po uszkodzeniu nerwu5,21. Dlatego szczególnie ważne jest zidentyfikowanie mechanizmów leżących u podstaw związku między wrodzoną zdolnością regeneracyjną SC a sygnałami związanymi z ECM, aby wgląd ostatecznie wykorzystał tę zdolność do regeneracji nerwów.

Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy szczegółową metodologię produkcji substratu do hodowli komórkowych, gdzie sztywność mechaniczna i typ liganda mogą być łatwo dostrojone w fizjologicznie odpowiednich zakresach. Polidimetylosiloksan (PDMS) został wybrany jako substrat ze względu na jego wysoce przestrajalną mechanikę w porównaniu z żelem poliakrylamidowym, gdzie maksymalny moduł Younga wynosi około 12 kPa, w przeciwieństwie do PDMS na poziomie około 1000 kPa22,23,24. Jest to korzystne dla wykonywanej pracy, ponieważ ostatnie badania wykazały, że moduł Younga nerwu kulszowego królika może przekraczać 50 kPa podczas rozwoju, co sugeruje, że zakres sztywności nerwów w PNS jest szerszy niż wcześniej badano. Różne białka są zdolne do adsorpcji na podłożach PDMS w celu analizy kombinatorycznej regulacji mechaniki i ligandów na zachowanie SC. Pozwala to na badanie wielu sygnałów mikrośrodowiskowych obecnych w procesie regeneracji PNS i porównanie wysokiego stopnia przestrajania z pracą, skupiając się wyłącznie na sztywności podłoża25. Co więcej, te zmodyfikowane substraty do hodowli komórkowych są kompatybilne z wieloma metodami analizy ilościowej, takimi jak immunohistochemia, western blot i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (q-PCR).

Ta platforma hodowli komórkowych jest wysoce odpowiednia do analizy ścieżek mechanistycznych, ze względu na wysoki poziom indywidualnej przestrajania każdego sygnału związanego z ECM. Ponadto, popularne metody mikrowzorcowania komórek, w tym druk mikrokontaktowy, mogą być osiągnięte na podłożach, aby umożliwić kontrolowaną adhezję komórkową w celu analizy kształtu komórki w odniesieniu do innych wskazówek związanych z ECM24. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ substraty o wzorze liniowym, które sprzyjają wydłużaniu się populacji komórek, dostarczają narzędzia do naśladowania i badania wydłużonych i regeneracyjnych SC w pasmach Büngnera podczas regeneracji nerwów. Co więcej, morfologia komórkowa jest silnym regulatorem wielu funkcji komórek i może potencjalnie wprowadzać mylące wyniki eksperymentalne, jeśli nie jest kontrolowana26,27. Obecnie wiele uwagi poświęca się mechanizmom rządzącym fenotypem regeneracyjnym SC regulowanym przez ECM cues28,29,30. Jest to niezbędne, aby zapewnić wgląd w projektowanie biomateriałów, które mogą być stosowane jako kanały prowadzenia nerwów w celu pomocy w regeneracji nerwów PNS. Te szczegółowe protokoły mogą ostatecznie zostać wykorzystane jako potencjalne narzędzie do rozszyfrowania mechanizmów funkcji SC i innych typów komórek, regulowanych przez sygnały związane z ECM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie i charakterystyka regulowanego podłoża do hodowli komórkowych

  1. Przygotowanie podłoża
    1. Wymieszać energicznie elastomer bazowy PDMS i środki utwardzające za pomocą końcówki pipety w stosunku od 10:1 do 60:1, aż pęcherzyki powietrza zostaną homogenicznie rozproszone w mieszaninie. Usunąć pęcherzyki powietrza poprzez desykację próżniową, aż znikną.
      UWAGA: Podczas polimeryzacji PDMS środek utwardzający sieciuje z elastomerem bazowym, aby zapewnić pożądane właściwości mechaniczne końcowego polimeru. Stosunki sieciowania można dostosować w celu zmiany sztywności PDMS.
    2. Nanieść kroplę (~0,2 mL) odgazowanej mieszaniny PDMS na kwadratowe lub okrągłe szkiełko podstawowe (np. 22 mm x 22 mm) i wirować szkiełko w wirówce do nanoszenia warstw (spin coater) z prędkością 2500 rpm przez 30 s.
    3. Inkubować szkiełko w piekarniku w temperaturze 60 °C przez 1-2 h lub w temperaturze pokojowej przez noc, aby PDMS stężał.
    4. Potraktować szkiełko w oczyszczaczu UV-Ozone przez 7 min (długość fali UV: 185 nm i 254 nm), aby zwiększyć hydrofilowość powierzchni. Umieścić je w wysterylizowanej płytce 6-dołkowej.
    5. Przed użyciem do hodowli komórkowej inkubować podłoża w 70% etanolu przez co najmniej 30 min.
      OSTRZEŻENIE: Oczyszczacz UV-Ozone może generować ozon, który jest szkodliwy dla ludzi. Pracować w dygestorium chemicznym lub w pomieszczeniu z odpowiednią wentylacją.
    6. Zanurzyć szkiełka w roztworze białek (10 µg/mL kolagenu I, fibronektyny lub lamininy) na 60 min w sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Po traktowaniu UV-Ozone powierzchnia PDMS może nadal być hydrofobowa. Obracać płytkę wielodołkową, aby upewnić się, że każde szkiełko jest pokryte roztworem białek.
    7. Odssać roztwór białek i przemyć szkiełko roztworem PBS 3x.
    8. Resuspendować linię komórek Schwanna RT4-D6P2T (SCs) z naczynia do pasażowania, używając dostępnego komercyjnie roztworu EDTA (1x) z 2,5% trypsyną, a następnie policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Wysiać SCs na regulowaną powierzchnię PDMS z pożądaną gęstością komórek. Gęstości wysiewu SC mogą się różnić w zależności od zastosowania.
    9. Utrzymywać komórki w pożądanych parametrach hodowli (wilgotność 90%, 5% CO2, 37 °C itp.) przez cały czas trwania eksperymentu. Jako medium hodowlane stosować DMEM uzupełnione o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny.
  2. Przygotowanie podłoża mikrowzorowanego
    1. Narysować pożądaną geometrię i obszary adhezyjne dla komórek (900 µm2, 1 600 µm2 i 2 500 µm2) przy użyciu oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Zamówić u komercyjnego dostawcy chromową fotomaskę na podstawie tych wzorów.
    2. W clean roomie lub środowisku wolnym od kurzu, zastosować standardowe techniki fotolitografii do wykonania wafli krzemowych (protokoły opisano szczegółowo w innym miejscu31). Krytyczne parametry dla tego konkretnego zastosowania są następujące: Fotorezyst: SU-8 2010; Profil wirowania w celu rozproszenia fotorezystu: 500 rpm przez 10 s z przyspieszeniem 100 rpm/s, następnie 3500 rpm przez 30 s z przyspieszeniem 300 rpm/s; Energia naświetlania światłem UV: 130 mJ/cm2.
      UWAGA: Wysokość wzorów na waflach krzemowych po zastosowaniu tych parametrów wynosi około 10 µm. Potencjalne pęknięcia wokół krawędzi poza prostokątnymi lub trójkątnymi wzorami mogą być widoczne pod mikroskopem świetlnym po kroku 1.2.2. Wygrzewanie wafla krzemowego w temperaturze 190 °C przez 30 min pomaga wyeliminować pęknięcia.
    3. Umieścić wzorowany wafel krzemowy w okrągłej płytce Petriego o średnicy 150 mm i wysokości 15 mm i wlać na wafel odgazowany PDMS (stosunek mieszania 10:1) przygotowany zgodnie z krokiem 1.1.1.
      UWAGA: Upewnić się, że grubość PDMS wynosi co najmniej 5 mm, aby ułatwić manipulację podczas etapów mikro drukowania kontaktowego.
    4. Stężać PDMS na waflu krzemowym w piekarniku w temperaturze 60 °C przez noc. Pozostawić PDMS do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Precyzyjnie wyciąć skalpelem chirurgicznym stemplami w kształcie kwadratów 30 mm x 30 mm zawierających właściwe wzory z wafla krzemowego. Nie uszkodzić wafla krzemowego.
      UWAGA: Wafla krzemowe mogą być wielokrotnie wykorzystywane w tym punkcie do produkcji kolejnych stempli po oczyszczeniu izopropanolem.
    5. Sterylizować stemple PDMS oraz regulowane szkiełka podstawowe (przygotowane w krokach 1.1.1 do 1.1.3) poprzez zanurzenie ich w 70% etanolu na 30 min.
    6. Aby potwierdzić skuteczność mikrowzorowania za pomocą stempli PDMS po mikro drukowaniu kontaktowym, osuszyć powierzchnię stempli PDMS strumieniem filtrowanego powietrza i nanieść pipetą roztwór BSA (sprzężony z Texas Red) w stężeniu 50 µg/mL, aby pokryć całą wzorowaną stronę stempla PDMS.
    7. Inkubować stemple PDMS z roztworem BSA przez 1 h w temperaturze pokojowej, aby umożliwić adsorpcję białka.
    8. Osuszyć powierzchnię regulowanych szkiełek podstawowych strumieniem filtrowanego powietrza, zwiększyć hydrofilowość powierzchni zgodnie z opisem w kroku 1.1.5.
    9. Osuszyć stemple PDMS na powietrzu, aby usunąć pozostały roztwór BSA.
      UWAGA: Należy zadbać o całkowite usunięcie roztworu BSA ze stempla, ponieważ jakikolwiek pozostały roztwór spowoduje ślizganie się stempli po szkiełku podczas mikro drukowania kontaktowego.
    10. Dociśnąć wzorowaną stronę stempla do regulowanego szkiełka podstawowego, aby umożliwić adsorpcję BSA na powierzchni szkiełka. Delikatnie docisnąć stempel do szkiełka przez 5 min.
      UWAGA: Nie stosować nadmiernej siły nacisku na stempel, ponieważ ugnie się on, co spowoduje nieswoisty kontakt między stemplem a szkiełkiem. Odpowiednia siła nacisku na stempel jest niezbędna do pomyślnego mikro drukowania kontaktowego.
    11. Zbadać mikrowzór za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem FITC (izotiocyjanian fluoresceiny).
    12. Aby wydrukować obszary adhezyjne dla komórek zamiast wzorów fluorescencyjnych, zastąpić białko BSA lamininą i powtórzyć kroki od 1.2.5 do 1.2.10.
    13. Zdjąć stemple ze szkiełek, przenieść szkiełka do wysterylizowanej płytki 6-dołkowej. Dodać 2 mL 0,2% (w/v) roztworu Pluronic F-127 do każdego dołka, aby pokryć powierzchnię szkiełka, i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Pluronic F-127 może adsorbować się na powierzchni PDMS, zwiększając jej hydrofobowość, co blokuje adhezję komórek.
    14. Odssać roztwór Pluronic F-127 i przemyć 5x PBS oraz 1x medium do hodowli komórek przed wysianiem komórek. Typowa gęstość wysiewu dla SCs wynosi 1 000 komórek/cm2.
    15. 45 min po wysianiu komórek usunąć medium hodowlane i przemyć szkiełka PBS 2x, aby zapobiec adhezji wielu komórek SC do tego samego wzoru. Utrzymywać komórki w pożądanych warunkach hodowli przez 48 h przed kwantyfikacją.
    16. Aby stworzyć podłoża do hodowli komórkowej z wzorem liniowym w celu zbadania wyrównanych komórek, postępować zgodnie z krokami od 1.2.1 do 1.2.4 w celu wykonania stempli do mikro drukowania kontaktowego.
      UWAGA: Wymiary rowka/grzbietu wzorów liniowych na stemplu dla opisanych komórek wynoszą 50 μm x 50 μm. Całkowite wymiary stempla to 10 mm x 10 mm.
    17. Wyciąć stemple do wymiarów zawierających tylko pożądane wzory liniowe.
      UWAGA: Podczas tworzenia stempli w CAD obszar niewzorowany stempla wokół wzorów liniowych będzie odpowiadał obszarowi adhezyjnemu dla komórek po mikro drukowaniu kontaktowym. Dlatego konieczne jest wyeliminowanie obszarów niewzorowanych podczas wycinania stempla, aby upewnić się, że każda komórka SC wysiana na powierzchni podąża za wzorami.
    18. Postępować zgodnie z krokami od 1.1.1 do 1.1.3, aby przygotować regulowaną powierzchnię PDMS pokrywającą dwie płytki Petriego.
      UWAGA: W tym przypadku PDMS będzie pokrywał samą powierzchnię płytki Petriego, a nie szkiełko podstawowe.
    19. Postępować zgodnie z krokami od 1.2.5 do 1.2.10, aby przeprowadzić mikro drukowanie kontaktowe w celu naniesienia obszarów adhezyjnych z wzorem liniowym na jedną z płytek Petriego pokrytych PDMS.
      UWAGA: Powierzchnia płytki Petriego 60 mm x 15 mm może pomieścić obszary z wzorem liniowym z 6 stempli PDMS.
    20. Zdjąć stemple i wypełnić płytkę Petriego 4 mL 0,2% (w/v) roztworu Pluronic F-127 i inkubować przez 1 h.
    21. Po mikro drukowaniu kontaktowym przepłukać każdą stronę stempli PDMS 70% etanolem 3x i osuszyć powietrzem. Obrócić stemple PDMS i postępować zgodnie z krokami od 1.2.5 do 1.2.10, aby wydrukować niewzorowany obszar adhezyjny dla komórek, używając niewzorowanej strony stempla na drugiej płytce Petriego. Powtórzyć krok 1.2.13.
    22. Odssać roztwór F-127 z płytek, przemyć 3x PBS, a następnie 1x świeżym medium do hodowli komórek. Wysiać SCs na płytki.
      UWAGA: Gęstość wysiewu dla płytki z wzorem liniowym wynosi 5 000 komórek/cm2, a dla płytki niewzorowanej 10 000 komórek/cm2.
    23. Utrzymywać SCs w pożądanych warunkach przez 48 h i postępować zgodnie z protokołami przygotowania lizatów SC32.
      UWAGA: Gęstość wysiewu komórek dla płytek niewzorowanych jest 2x wyższa niż dla płytek z wzorem liniowym, ponieważ płytka z wzorem liniowym ma tylko połowę obszaru adhezyjnego komórek co płytka niewzorowana.
      1. Aby przygotować lizaty, przenieść odpowiednią ilość buforu do radioimmunoprecypitacji (RIPA) do stożkowej probówki wirówkowej 10 mL. Rozcieńczyć inhibitor proteazy i fosfatazy (100x) w stosunku 1:100 w buforze RIPA, wymieszać dobrze za pomocą pipety.
      2. Przemyć komórki lodowatym PBS (1x) przez 2 min, dodać 80 µL roztworu przygotowanego w kroku 1.2.23.1 na każdy obszar adhezyjny komórek (obszar, który miał kontakt ze stemplami PDMS i zaabsorbował białko) w płytkach Petriego. Inkubować komórki z roztworem na bloku z lodem przez 15 min.
        NOTE: Roztwór pozostanie tylko na obszarze adhezyjnym komórek ze względu na hydrofobowość adsorpcji Pluronic F-127 w pozostałych miejscach. Cecha ta umożliwia skuteczną i wystarczającą ekstrakcję białek dla SC z wzorem liniowym.
      3. Zeskrobać SCs skrobaczką do komórek przez 5 min. Zebrać lizat do oznakowanej probówki mikrocentryfugi 1,5 mL.
      4. Wirować lizat w mikrocentryfudze przy 12 000 x g przez 15 min w 4°C. Zebrać nadsącz pipetą 1 000 µL i przenieść do czystej probówki mikrocentryfugi. Przechowywać lizat komórkowy w temperaturze -20 °C.
  3. Charakterystyka podłoża
    UWAGA: Aby scharakteryzować mechanikę polimeru na szkiełku podstawowym, zazwyczaj stosuje się kilka metod, w tym testy ściskania objętościowego11,33 lub testy za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM)34. Niniejszy protokół opisuje testy ściskania objętościowego.
    1. Wlać prekursor PDMS o pożądanym stosunku mieszania (krok 1.1) do płytki Petriego 30 mm, upewniając się, że grubość warstwy PDMS w płytce wynosi co najmniej 20 mm.
    2. Wyjąć płytkę Petriego ze stężonym PDMS z piekarnika 60 °C po 1 h i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej. Wyciąć polimer w kwadraty 10 mm x 10 mm. Zmierzyć grubość PDMS za pomocą suwmiarki.
    3. Umieścić PDMS na stole maszyny do pomiaru siły ściskania. Podłączyć czujnik siły ściskania (model: 112C) do portu czujnika i przymocować czujnik do osi maszyny testowej.
    4. Dostosować wysokość czujnika do około 0,5 cm nad stempel PDMS, używając sterowania „jog” na przednim panelu urządzenia.
    5. Otworzyć powiązane oprogramowanie za pomocą okna „Test Setup”, wybrać „Servo profile” i otworzyć okno „Segment”. W oknie „Segment” wprowadzić pożądaną wartość „Control Rate” i „End Amount” dla testu.
      UWAGA: Control rate określa prędkość, z jaką czujnik przemieszcza się w dół w stronę PDMS. End amount określa całkowitą odległość, jaką przebywa czujnik.
    6. Użyć przycisku „Z” znajdującego się na panelu sterowania oprogramowania, aby zresetować wszystkie pomiary w tym punkcie.
    7. Przesunąć czujnik w dół, aby lekko dotknął PDMS, aż zostanie obciążony siłą 1-2 niutonów (N). Obciążenie i odległość, jaką przebył czujnik, zostaną wyświetlone w oprogramowaniu.
    8. Po użyciu przycisku „Z” uruchomić pomiar za pomocą funkcji „Play” i zapisać plik rejestrujący siłę i odległość.
    9. Powtórzyć kroki od 1.3.3 do 1.3.8 dla każdego warunku eksperymentalnego PDMS.
    10. Otworzyć plik i użyć poniższego wzoru do obliczenia modułu Younga (E) PDMS dla każdego stosunku. (F = siła ściskania, A = powierzchnia stempla PDMS, ∆L = odległość przebyta przez czujnik, a L0 = pierwotna grubość stempla PDMS).
      Równanie modułu sprężystości E=F/A/ΔL/L₀, wzór na zależność naprężenia i odkształcenia materiału.

2. Ilościowa ocena właściwości komórkowych na substratach o regulowanych parametrach

  1. Test proliferacji
    1. Wysiać komórki SC na podłożach przygotowanych w kroku 1.1.9 z gęstością 5 000 komórek/cm2 w płytce 6-dołkowej. Inkubować komórki SC przez 48 h w standardowych warunkach hodowli komórkowej (37 °C i 5% CO2).
    2. Rozcieńczyć 12 µL roztworu zapasowego Bromodeoksyurydyny (BrdU) o stężeniu 10 mM w 12 mL pożywki do hodowli komórkowej o temperaturze 37 °C, wymieszać dokładnie pipetą, aby przygotować 10 µM roztwór znakujący BrdU.
    3. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowej i przemyć komórki SC 2x roztworem PBS.
    4. Dodać 2 mL roztworu znakującego BrdU do każdego dołka i inkubować komórki SC przez 2 h.
      UWAGA: Czas inkubacji z roztworem znakującym BrdU zależy od specyficznego tempa proliferacji komórek. Linia komórkowa RT4-D6P2T SC charakteryzuje się wysokim tempem proliferacji, dlatego zastosowano 2 h inkubacji.
    5. Usunąć roztwór znakujący BrdU i przemyć komórki SC 3x roztworem PBS. Do każdego dołka dodać 1 mL 3,7% formaldehydu w PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min w celu utrwalenia komórek.
      OSTROŻNIE: Formaldehyd jest rakotwórczy dla ludzi; dlatego wszystkie prace należy prowadzić w dygestorium chemicznym przy zastosowaniu odpowiedniej ochrony.
      UWAGA: Podczas płukania roztworem PBS w dołku nie ma pożywki do hodowli komórkowej, w związku z czym powierzchnia PDMS może być hydrofobowa. Należy zachować ostrożność, aby nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia powierzchni podłoża, co zapobiegnie uszkodzeniu komórek.
    6. Odssać roztwór formaldehydu i przemyć 3x roztworem PBS (po 3 min każdorazowo). Usunąć PBS i dodać 1 mL 0,2% Triton X-100 w PBS do każdego dołka w celu permeabilizacji błony komórkowej. Inkubować komórki SC z roztworem Triton X-100 przez 20 min w temperaturze pokojowej.
    7. Usunąć roztwór Triton X-100 i przemyć komórki SC 3x roztworem PBS (po 3 min każdorazowo).
    8. Dodać 1 mL 1 N HCl do każdego dołka i inkubować na lodzie przez 10 min. Usunąć 1 N HCl i dodać 1 mL 2 N HCl do każdego dołka, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min. Obróbka HCl służy do hydrolizy DNA.
    9. Wymieszać 182 mL 0,2 mM Na2HPO4 i 18 mL 0,1 mM kwasu cytrynowego, aby przygotować bufor fosforanowo-cytrynowy do odsłaniania antygenów. Usunąć 2 N HCl i dodać 1 mL buforu fosforanowo-cytrynowego do każdego dołka, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    10. Przemyć komórki SC 3x roztworem 0,2% Triton X-100 w PBS. Do każdego dołka dodać 2 mL 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej, aby zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał.
    11. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe przeciw BrdU sprzężone z Alexa Fluor 488 w roztworze 3% BSA w stosunku 1:300, tworząc roztwór barwiący BrdU. Inkubować komórki SC z roztworem barwiącym przez noc w temperaturze pokojowej, przykrywając płytkę folią aluminiową.
    12. Aby ilościowo określić proliferację, obrazować komórki SC przy użyciu kanałów FITC i DAPI mikroskopu fluorescencyjnego w celu wykrycia odpowiednio BrdU i jąder komórkowych. Zapisać obrazy jako pliki „nd.2”.
    13. Otworzyć pliki „nd.2” dla każdego obrazu wykonanego w identycznych pozycjach przestrzennych.
    14. Uruchomić oprogramowanie do analizy obrazu. Kliknąć prawym przyciskiem myszy w tło, aby otworzyć okna „Automated Measurement Results” (Automatyczne wyniki pomiarów) oraz „Automated Measurement” (Automatyczny pomiar) w sekcji „Analysis Control” (Kontrola analizy).
    15. W menu „Count & Taxonomy” (Liczenie i taksonomia) wybrać „Count” (Licz). Na obrazie FITC kliknąć każde jądro wykazujące zieloną fluorescencję (dodatnie pod kątem BrdU), a następnie kliknąć prawym przyciskiem myszy na obrazie.
      UWAGA: Liczba komórek dodatnich pod kątem BrdU jest wyświetlana w oknie „Automations and Measurements” (Automatyzacje i pomiary).
    16. W przypadku obrazów DAPI powtórzyć krok 2.1.14, aby policzyć całkowitą liczbę jąder. Obliczyć procent komórek dodatnich pod kątem BrdU dla tego obrazu.
    17. Powtórzyć kroki od 2.1.13 do 2.1.16 dla pozostałych obrazów w celu analizy statystycznej i obliczyć średni procent komórek dodatnich pod kątem BrdU dla każdego rodzaju podłoża.
  2. Ilościowe oznaczenie ekspresji c-Jun poprzez analizę obrazów immunofluorescencyjnych
    1. Komórki przygotowane w płytkach 6-dołkowych zgodnie z krokami 1.1.9 i 1.2.23 utrwalić i permeabilizować zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami (kroki 2.1.5-2.1.7).
      UWAGA: Aby przeprowadzić dokładne porównanie intensywności fluorescencji między komórkami w różnych warunkach ECM, zastosować identyczne ustawienia kamery dla wszystkich próbek, tak aby każda z nich posiadała te same parametry.
    2. Zapisać obrazy jako pliki „.nd2”.
    3. Uruchomić oprogramowanie do analizy obrazu. Kliknąć prawym przyciskiem myszy w tło, aby otworzyć okna „Automated Measurement Results” (Automatyczne wyniki pomiarów) oraz „Automated Measurement” (Automatyczny pomiar) w sekcji „Analysis Control” (Kontrola analizy).
    4. W oknie „Automated Measurement Results” wybrać „Object Data” (Dane obiektów). Aktywować przycisk „Keep updating measurement” (Aktualizuj pomiary na bieżąco).
    5. W górnym panelu oprogramowania wybrać „Measure” (Pomiar), a następnie „Object features” (Cechy obiektu). Dodać „Mean Intensity” (Średnia intensywność) do sekcji „Selected for Measurement” (Wybrane do pomiaru).
    6. Otworzyć i połączyć dwa pliki obrazów „.nd2” zawierające obrazy c-Jun oraz jąder komórkowych.
    7. W górnym panelu wybrać „ROI” i zaznaczyć „Draw Rectangular ROI” (Rysuj prostokątny obszar ROI). Wyrysować prostokątny obszar obejmujący jądro pojedynczej komórki.
      UWAGA: Ekspresja c-Jun jest skoncentrowana w obrębie jąder komórkowych35.
    8. W górnym panelu oprogramowania wybrać „Binary” (Binarna) oraz „Define Threshold” (Zdefiniuj próg); pojawi się nowe okno służące do precyzyjnego zdefiniowania obszaru fluorescencji c-Jun.
    9. W nowym oknie kliknąć „Full Image/Use ROI” (Pełny obraz/Użyj ROI), aby przełączyć program z modelu pełnego obrazu na model ROI. Użyć opcji „Intensity” (Intensywność), aby dostosować tabelę wyszukiwania znajdującą się po lewej stronie okna w celu korekty rozmiaru/kształtu zaznaczonego obszaru wewnątrz prostokątnego ROI.
      UWAGA: Należy zadbać o to, aby rozmiar i kształt zaznaczonego obszaru były identyczne z jądrem komórkowym.
    10. Kliknąć przycisk „OK”, aby uzyskać średnią intensywność FITC w oknie „Automated Measurement Results”, a następnie kliknąć „Store Data” (Zapisz dane).
    11. W oknie „Automated Measurement” wybrać „Delete Object” (Usuń obiekt), aby usunąć czerwony zaznaczony obszar. W panelu bocznym po lewej stronie użyć „Pointing Tool” (Narzędzie wskazywania), aby zaznaczyć i usunąć prostokątny ROI.
    12. Powtórzyć kroki od 2.2.6 do 2.2.11, aby zmierzyć średnią intensywność FITC dla każdej kolejnej komórki.
    13. W obszarze okna „Automated Measurement Results” wybrać „Stored” (Zapisane), aby wyświetlić wszystkie zapisane dane. Użyć funkcji „Export” (Eksportuj) i wybrać „Data to Excel” (Dane do Excela), aby zapisać wyeksportowaną arkusz i przeprowadzić dodatkowe obliczenia.
  3. Ilościowe oznaczenie wydłużenia jąder
    1. Utrwalić i permeabilizować komórki SC przygotowane zgodnie z krokiem 1.2.22, stosując kroki 2.1.5-2.1.7. Przeprowadzić barwienie jąder przy użyciu medium montującego z DAPI.
    2. Przy użyciu kanału DAPI i obiektywu 40x wykonać obrazy próbki i zapisać je jako pliki „.nd2”.
    3. Postępować zgodnie z krokami 2.2.3 i 2.2.4, aby otworzyć okna „Automated Measurement Results” i „Automated Measurement” w oprogramowaniu do analizy obrazu.
    4. W oknie „Automated Measurement Results” użyć funkcji „Option” (Opcje), a następnie „Select Object Feature” (Wybierz cechę obiektu). W kolumnie „Feature” (Cecha) wybrać „Elongation” (Wydłużenie) i dodać do kolumny „Selected for Measurements” (Wybrane do pomiarów). Użyć opcji „Keep Updating Measurement” (Aktualizuj pomiary na bieżąco), aby aktywować tę funkcję.
    5. Otworzyć plik obrazu „nd.2” zawierający obrazy jąder. W oknie „Automated Measurement” wybrać funkcję „Auto Detect” (Autowykrywanie) i zaznaczyć jądro. Kliknąć prawym przyciskiem myszy na obrazie; zmierzony współczynnik kształtu jądra zostanie wyświetlony w oknie „Automated Measurement Results”.
    6. Powtórzyć krok 2.3.5, aby ilościowo określić współczynniki kształtu innych jąder na obrazie. Wybrać „Store Data” (Zapisz dane) w oknie „Automated Measurement Results”.
    7. Powtórzyć kroki 2.3.5-2.3.6 dla kolejnych obrazów. Wyeksportować dane do pliku arkusza kalkulacyjnego w sposób opisany wcześniej w kroku 2.2.13 w celu analizy.
  4. Western blot w celu ilościowego oznaczenia ekspresji białek
    1. Postępować zgodnie ze standardowymi protokołami analizy western blot opisanymi w innej literaturze32. Rozcieńczenia przeciwciał użytych w badaniu przedstawiono poniżej: przeciw c-Jun (królicze) 1:2 000; przeciw β-aktynie (mysie) 1:1 000; przeciw p75NTR (królicze) 1:1 000; przeciw podstawowemu białku mieliny (królicze) 1:1 000; przeciw mysim/króliczym IgG, przeciwciało sprzężone z HRP 1:10 000.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby przeanalizować i ilościowo określić wpływ sztywności podłoża oraz składu białkowego na fenotyp SC, opracowano regulowane podłoże do hodowli komórkowej z PDMS (Rycina 1A). W celu wyznaczenia modułu Younga (E) podłoża przeprowadzono testy ściskania polimeru przy różnych stosunkach bazy do czynnika sieciującego (Rycina 1B). Uzyskany zakres wartości modułu odpowiada fizjologicznie istotnym warunkom podłoża. Po przygotowaniu podłoży hodowano komórki SC i analizow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

SC mogą wspomagać regenerację nerwów ze względu na ich transformację fenotypową i potencjał regeneracyjny po uszkodzeniu nerwu. Jednak sposób, w jaki sygnały ECM regulują tę zdolność regeneracyjną, pozostaje w większości niejasny, co może utrudniać nie tylko rozwój biomateriałów, które mają na celu promowanie regeneracji nerwów, ale także zrozumienie mechanizmów związanych z regeneracją nerwów. Aby rozpocząć badanie tej wzajemnej zależności, stworzono substraty do hodowli komórkowych, w których można kontrolować sygnały ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłosili potencjalnego konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Uniwersytetu w Cincinnati. Autorzy dziękują również Ronowi Flennikenowi z laboratorium Advanced Materials Characterization Uniwersytetu w Cincinnati za wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Albumina z surowicy bydlęcej (BSA), koniugat Texas RedThermo Fisher ScientificA23017Barwienie BSA w celu pokazania mikrowzorów
Przeciwciało IgG przeciw myszy, technologiasygnalizacji komórkowejPrzeciwciało 7076Sużywane do analizy western blot
Przeciwciało anty-królicze IgG, technologia sygnalizacji komórkowej przeciwciał sprzężonych z HRPPrzeciwciało 7074Sużywane do analizy
western blotBrdUThermo Fisher ScientificB23151Odczynnik stosowany do pomiaru proliferacji komórek
Przeciwciało pierwotne BrdU sprzężone z Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificB35130Służy do wizualizacji BrdU w testach proliferacji komórek
Kolagen IThermo Fisher ScientificA10483-01Białko używane do powlekania szkiełek nakrywkowych
Maszyna do badania siły ściskającejTestResourcesPrzyrząd do ilościowego określania właściwości mechanicznych polimerów
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy DulbeccoThermo Fisher Scientific11965092Pożywka do hodowli komórkowych
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific16000044Pożywka do hodowli komórkowych uzupełniająca
FibronektynaThermo Fisher Scientific33010-018Białko używane do powlekania szkiełek nakrywkowych
Fluorescencja mikroskopNikonEclipse Ti2Mikroskop fluorescencyjny
Halt Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy (100X)Thermo Fisher Scientific78440Inhibitor proteazy i fosfatazy
LamininThermo Fisher Scientific23017015Białko używane do powlekania szkiełek nakrywkowych
Podłoże montażowe z DAPIThermo Fisher ScientificP36971Mocowanie szkiełek nakrywkowych i barwienie jąder
Mysz C-Jun pierwotne przeciwciało ThermoFisher Scientific711202Pierwszorzędowe przeciwciało do wizualizacji białka c-Jun
Mysz &beta-aktyna pierwotne przeciwciałoTechnologia sygnalizacji komórkowej3700SKontrola ładowania dla eksperymentów western blot
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Scientific15140122Pożywka do hodowli komórkowych uzupełniająca
Photoresist SU 2010KAYAKUSU8-2010Photoresist
Pluronic F-127Sigma AldrichP-2443Blokuj niespecyficzne wiązanie białek
Pierwotne przeciwciało królika c-JunTechnologia sygnalizacji komórkowej9165S Przeciwciałopierwszorzędowe do wizualizacji białka c-Jun
Podstawowe przeciwciało podstawowe białka mieliny królikaAbcamab40390Przeciwciało pierwszorzędowe do wizualizacji MBP
Królik p75NTRprzeciwciało pierwotne Technologia sygnalizacji komórkowej8238S Przeciwciałopierwotne do wizualizacji p75NTR
Falloidyna rodaminowaThermo Fisher ScientificR415Wizualizacja cytoszkieletu komórkowego
Bufor RIPAAbcamab156034Bufor do lizy komórek
RT4-D6P2T Linia komórkowa SchwannaATCCCRL-2768Linia komórkowa stosowana w
eksperymenty SYLGARD 184 PDMS baza i utwardzaczSigma Aldrich761036Przestrajalny polimer stosowany do powlekania szkiełek nakrywkowych
TrypsynaThermo Fisher Scientific15090-046Odczynnik do dysocjacji komórek
UV-Środek czyszczący do ozonuNovascanZwiększ hydrofilność PDMS
Versene (1x)Thermo Fisher Scientific15040066Dysocjacja komórek Odczynnik
przeciwciał sprzężona z HRP

Bibliografia

  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The Incidence of Peripheral Nerve Injury in Extremity Trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87, 381-385 (2008).
  2. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of Upper and Lower Extremity Peripheral Nerve Injuries in a Population of Patients with Multiple Injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45, 116-122 (1998).
  3. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594, 3521-3531 (2016).
  4. Arthur-Farraj, P. J., et al. c-Jun Reprograms Schwann Cells of Injured Nerves to Generate a Repair Cell Essential for Regeneration. Neuron. 75, 633-647 (2012).
  5. Jessen, K. R., Mirsky, R. The Success and Failure of the Schwann Cell Response to Nerve Injury. Frontiers in Cell Neurosciences. 13, 33(2019).
  6. Gomez-Sanchez, J. A., et al. After Nerve Injury, Lineage Tracing Shows That Myelin and Remak Schwann Cells Elongate Extensively and Branch to Form Repair Schwann Cells, Which Shorten Radically on Remyelination. Journal of Neuroscience. 37 (37), 9086-9099 (2017).
  7. Deumens, R., et al. Repairing injured peripheral nerves: Bridging the gap. Progress in Neurobiology. 92, 245-276 (2010).
  8. Höke, A., Gordon, T., Zochodne, D. W., Sulaiman, O. A. R. A decline in glial cell-line-derived neurotrophic factor expression is associated with impaired regeneration after long-term Schwann cell denervation. Experimental Neurology. 173, 77-85 (2002).
  9. Jones, S., Eisenberg, H. M., Jia, X. Advances and future applications of augmented peripheral nerve regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17, 1-17 (2016).
  10. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. 60-61, 176-189 (2017).
  11. Harris, G. M., Piroli, M. E., Jabbarzadeh, E. Deconstructing the Effects of Matrix Elasticity and Geometry in Mesenchymal Stem Cell Lineage Commitment. Advanced Function Mater. 24 (16), 2396-2403 (2014).
  12. Pryzhkova, M. V., Harris, G. M., Ma, S., Jabbarzadeh, E. Patterning pluripotent stem cells at a single cell level. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering. 3 (4), 461-471 (2013).
  13. Engler, A. J., Sweeney, H. L., Discher, D. E., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeleton and Neuronal Interaction. 7 (4), 335(2007).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  16. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Reports. 15, 1243-1253 (2014).
  17. Chernousov, M. A., Carey, D. J. Schwann cell extracellular matrix molecules and their receptors. Histology and Histopathology. 15, 593-601 (2000).
  18. Shibata, S., et al. Selective Laminin-Directed Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Distinct Ocular Lineages. Cell Reports. 25 (6), 1668-1679 (2018).
  19. Mcbeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell Shape, Cytoskeletal tenstion and RhoA regulate stem cell lineage committment. Developmental Cell. 6, 483-495 (2004).
  20. Halder, G., Dupont, S., Piccolo, S. Transduction of mechanical and cytoskeletal cues by YAP and TAZ. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 591-600 (2012).
  21. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594 (13), 3521-3531 (2016).
  22. Lopez-Fagundo, C., Bar-Kochba, E., Livi, L. L., Hoffman-Kim, D., Franck, C. Three-dimensional traction forces of Schwann cells on compliant substrates. Journal of The Royal Society Interface. 11, 20140247(2014).
  23. Gu, Y., et al. The influence of substrate stiffness on the behavior and functions of Schwann cells in culture. Biomaterials. 33, 6672-6681 (2012).
  24. Xu, Z. Y., Orkwis, J. A., DeVine, B. M., Harris, G. M. Extracellular matrix cues modulate Schwann cell morphology, proliferation, and protein expression. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. , (2019).
  25. Urbanski, M. M., et al. Myelinating glia differentiation is regulated by extracellular matrix elasticity. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  26. Sun, Y., et al. Tunable stiffness of graphene oxide/polyacrylamide composite scaffolds regulates cytoskeleton assembly. Chemical Sciences. 9 (31), 6516-6522 (2018).
  27. Hwang, J. H., et al. Extracellular matrix stiffness regulates osteogenic differentiation through MAPK activation. PLoS One. 10, 1-16 (2015).
  28. Ryan, A. J., et al. A Physicochemically Optimized and Neuroconductive Biphasic Nerve Guidance Conduit for Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 6, 1-13 (2017).
  29. Du, J., et al. Prompt peripheral nerve regeneration induced by a hierarchically aligned fibrin nanofiber hydrogel. Acta Biomaterialia. 55, 296-309 (2017).
  30. Huang, L., et al. A compound scaffold with uniform longitudinally oriented guidance cues and a porous sheath promotes peripheral nerve regeneration in vivo. Acta Biomaterialia. 68, 223-236 (2018).
  31. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. Jouranl of Visualized Experiments. (119), e55276(2017).
  32. Gupta, R., et al. Shear stress alters the expression of myelin-associated glycoprotein (MAG) and myelin basic protein (MBP) in Schwann cells. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 23, 1232-1239 (2005).
  33. Harris, G. M., Shazly, T., Jabbarzadeh, E. Deciphering the combinatorial roles of geometric, mechanical, and adhesion cues in regulation of cell spreading. PLoS One. 8 (11), (2013).
  34. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  35. Schreck, I., et al. C-Jun localizes to the nucleus independent of its phosphorylation by and interaction with JNK and vice versa promotes nuclear accumulation of JNK. Biochemical and Biophysical Research Communications. 407, 735-740 (2011).
  36. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal Visualized Experiments. (22), e1065(2008).
  37. Treter, J., et al. Washing-resistant surfactant coated surface is able to inhibit pathogenic bacteria adhesion. Applied Surface Science. 303, 147-154 (2014).
  38. Lutz, J. F. Polymerization of oligo(ethylene glycol) (meth)acrylates: Toward new generations of smart biocompatible materials. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 46 (11), 3459-3470 (2008).
  39. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (2017).
  40. Pu, J. Golgi polarization in a strong electric field. Journal of Cell Science. 118, 1117-1128 (2005).
  41. Blaker, J. J., et al. Bioactive Silk-Based Nerve Guidance Conduits for Augmenting Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 7, 1800308(2018).
  42. Daly, W., Yao, L., Zeugolis, D., Windebank, A., Pandit, A. A biomaterials approach to peripheral nerve regeneration : bridging the peripheral nerve gap and enhancing functional recovery. Journal of the Royal Society of Interface. 9 (67), 202-221 (2012).
  43. Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
  44. Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., McCarthy, C. W., Gilbert, R. J. Varying the diameter of aligned electrospun fibers alters neurite outgrowth and Schwann cell migration. Acta Biomaterialia. 6, 2970-2978 (2010).
  45. Carvalho, C. R., Oliveira, J. M., Reis, R. L. Modern Trends for Peripheral Nerve Repair and Regeneration: Beyond the Hollow Nerve Guidance Conduit. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 337(2019).
  46. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical Regulation of Cell Behavior - Cross Talk between Substrate Stiffness and Nanotopography. Engineering. 3, 36-54 (2017).
  47. Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple Approach to Micropattern Cells on Common Culture Substrates by Tuning Substrate Wettability. Tissue Engineering. 10, 865-872 (2004).
  48. Grove, M., et al. YAP/TAZ initiate and maintain schwann cell myelination. Elife. 6, 1-27 (2017).
  49. Poitelon, Y., et al. YAP and TAZ control peripheral myelination and the expression of laminin receptors in Schwann cells. Nature Neuroscience. 19, 879-887 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Substrat z PDMS o regulowanej sztywnościtechnika mikrodośladupowierzchnia rozprzestrzeniania się komórekanaliza elongacji komórekbarwienie immunofluorescencyjneanaliza Western blotsubstraty powlekane lamininąekspresja c-Jun
Przygotowanie przestrajalnych mikrośrodowisk macierzy zewnątrzkomórkowej w celu oceny specyfikacji fenotypu komórek Schwanna
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.