Ten protokół opisuje zastosowanie hybrydyzacji in situ fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFISH) do pomiaru kinetyki in vivo syntezy i degradacji mRNA.
Artykuł metodologiczny
Sondowanie kinetyki mRNA w czasie i przestrzeni u Escherichia coli przy użyciu dwukolorowej hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (smFISH) pozwala na zliczenie bezwzględnej liczby mRNA w poszczególnych komórkach. W tym miejscu opisujemy zastosowanie smFISH do pomiaru szybkości transkrypcji i degradacji mRNA w Escherichia coli. Ponieważ smFISH opiera się na stałych komórkach, wykonujemy smFISH w wielu punktach czasowych podczas eksperymentu z przebiegiem czasu, tj. gdy komórki przechodzą zsynchronizowane zmiany po indukcji lub represji ekspresji genów. W każdym punkcie czasowym podregiony mRNA są spektralnie rozróżniane w celu zbadania wydłużenia transkrypcji i przedwczesnego zakończenia. Wynik tego protokołu pozwala również na analizę wewnątrzkomórkowej lokalizacji mRNA i niejednorodności w liczbie kopii mRNA między komórkami. Korzystając z tego protokołu, wiele próbek (~50) może być przetworzonych w ciągu 8 godzin, co odpowiada czasowi potrzebnemu na zaledwie kilka próbek. Omówiliśmy, jak zastosować ten protokół do badania kinetyki transkrypcji i degradacji różnych mRNA w komórkach bakteryjnych.
Wprowadzenie
Przepływ informacji genetycznej od DNA do mRNA i białka jest jednym z najbardziej podstawowych procesów komórkowych, którego regulacja jest ważna dla sprawności komórkowej1. Liczba mRNA w komórce jest określana przez dwa dynamiczne procesy, transkrypcję i degradację mRNA. Jednak sposób, w jaki transkrypcja i degradacja mRNA są regulowane w czasie i przestrzeni pojedynczej komórki, pozostaje nie do końca zrozumiały, głównie z powodu braku metod eksperymentalnych do ilościowego pomiaru ich kinetyki in vivo.
Metody oparte na całkowitej liczbie mRNA wyekstrahowanych z populacji komórek, takie jak Northern blot, RT-PCR, sekwencjonowanie RNA i mikromacierze ekspresji genów, mogą mierzyć względną różnicę w poziomach mRNA i były szeroko stosowane do analizy szybkości wydłużania transkrypcji2,3,4,5 lub szybkość degradacji mRNA6,7. Nie podają one jednak bezwzględnej liczby mRNA na komórkę, a zatem nie nadają się do badania szybkości inicjacji transkrypcji8. Ponadto, ponieważ mRNA są ekstrahowane z populacji komórek, nie można zmierzyć przestrzennego rozkładu mRNA w pojedynczej komórce i zmienności liczby kopii mRNA między komórkami.
Sekwencjonowanie RNA nowej generacji na pojedynczych komórkach (scRNAseq) może określić ilościowo liczbę mRNA na komórkę w skali genomowej9. Jednak nadal trudno jest zastosować tę technikę do pomiaru kinetyki transkrypcji ze względu na wyzwania związane z przygotowaniem próbki i wysokie koszty. W szczególności zastosowanie scRNAseq do bakterii było technicznie trudne ze względu na niską liczebność mRNA10,11.
Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (smFISH) opiera się na hybrydyzacji znakowanych fluorescencyjnie jednoniciowych sond, których sekwencje są komplementarne do docelowego mRNA będącego przedmiotem zainteresowania12,13. Koncepcja hybrydyzacji specyficznej dla sekwencji jest podobna do tej stosowanej w Northern blot lub RT-PCR, ale hybrydyzacja odbywa się in situ w utrwalonych komórkach, aby zachować natywną lokalizację mRNA. Sygnał pojedynczego mRNA jest wzmacniany za pomocą wielu sond o długości ~20 nukleotydów (nt), hybrydyzujących z różnymi częściami mRNA (Rysunek 1A)13. W tym podejściu "kafelkowym" liczba sond potrzebnych do wykrycia pojedynczego mRNA wyznacza dolną granicę długości mRNA, które można oznaczyć. Alternatywnie, interesujące mRNA może być transkrypcyjnie połączone z niekodującą matrycą tandemowych sekwencji operatorów Lac, tak że wiele kopii znakowanej fluorescencyjnie sondy lacO hybrydyzuje z pojedynczym mRNA (Figura 1B)14.
smFISH został użyty do ilościowego określenia liczby mRNA na komórkę w stanie ustalonym (tj. gdy synteza i rozpad są w równowadze) oraz do analizy średniej i zmienności mRNA wśród komórek bakteryjnych15,16,17. Ostatnio smFISH został zastosowany do ilościowego określania liczby mRNA w stanie niestacjonarnym, zaraz po indukcji lub represji ekspresji genów w E. coli18,19,20. Czasowe zmiany w bezwzględnej liczbie kopii mRNA wykorzystano następnie do obliczenia szybkości inicjacji, wydłużania i zakończenia transkrypcji, a także szybkości degradacji mRNA. W tym przypadku konwencjonalne procedury smFISH mogą być kłopotliwe, ponieważ istnieje wiele próbek, z których każda reprezentuje jeden punkt czasowy, które muszą przejść przez wiele etapów wymiany (tj. wirowania i mycia). W tym miejscu opisujemy protokół smFISH, w którym etapy postępowania z próbką są znacznie uproszczone dzięki przyklejeniu komórek do powierzchni szkiełka nakrywkowego i zasysaniu cieczy za pomocą systemu filtracji próżniowej14,19. Na przykładzie ekspresji lacZ w E. coli pokazano pełny przebieg pracy ( Rysunek 2), w tym analizę obrazu (Rysunek 3) uzyskując kinetykę in vivo transkrypcji (inicjacji, wydłużenia i zakończenia) oraz degradacji mRNA, zmienności ekspresji mRNA między komórkami i lokalizacji mRNA. Przewidujemy, że protokół będzie miał szerokie zastosowanie do badania kinetyki in vivo i lokalizacji innych mRNA w różnych gatunkach bakterii.
Protokół
1. Przygotowanie sond smFISH
UWAGA: Aby znakować sondy smFISH pojedynczym fluorophorem, należy postępować zgodnie ze standardowym protokołem znakowania oligonukleotydów kwasów nukleinowych opartym na chemii estrów NHS21.
- Zaprojektuj sondy smFISH. Zdecyduj, czy w przypadku interesującego genu zastosować sondy typu „tiling” (kafelkowe) czy „array” (macierzowe) (Rysunek 1). Sposób podjęcia tej decyzji opisano w sekcji Dyskusja.
- W przypadku sond typu „tiling” (Rysunek 1A) skorzystaj z internetowego narzędzia do projektowania sond (np. sprawdź Tabelę materiałów).
- W przypadku sond typu „array” (Rysunek 1B) przeprowadź wyszukiwanie sekwencji metodą BLAST, aby upewnić się, że sekwencja sondy nie jest komplementarna do żadnych innych sekwencji mRNA.
- Aby zbadać kinetykę transkrypcji i degradacji mRNA lacZ, użyj dwóch zestawów po 24 sond, z których każdy zestaw obejmuje pierwsze i ostatnie regiony o wielkości 1 kb genu lacZ (3 072 bp)19.
UWAGA: Zestawy sond te będą w dalszej części określane odpowiednio jako „sonda mRNA 5’” oraz „sonda mRNA 3’”. Sekwencje tych sond wymieniono w Tabeli materiałów.
- Zamów sekwencje sond jako oligonukleotydy DNA z łącznikiem aminowym C6 na końcu 5’. Rozpuść poszczególne sondy w wodzie do stężenia 1 mM.
- Połącz ekvimolarne ilości sond z zestawów „sonda mRNA 5’” i „sonda mRNA 3’”. Na przykład w przypadku zestawu sond mRNA 5’ dla lacZ, połącz 20 µL każdej sondy (łącznie 24 rodzaje sond w zestawie).
- Przeprowadź wytrącanie etanolem22 połączonych sond, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia aminami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi (takimi jak Tris, glicyna i sole amonu), które mogą hamować reakcję konjugacji. Na koniec rozpuść osad DNA w 100 µL wody (uzyskując stężenie DNA ok. 4,5 mM w zestawie sond).
UWAGA: Ten krok jest zalecany nawet jeśli sondy zostały poddane standardowemu oczyszczaniu przez odsolenie przez producenta. Zamiast wytrącania etanolem lub dodatkowo do niego można zastosować standardowe oczyszczanie na filtrze. - Wybierz dwa spektralnie odmienne fluorofory z monofunkcyjną grupą estru NHS, tak aby zestawy sond mRNA 5’ i 3’ można było znakować różnie. Na przykład przygotuj ester NHS Cy5 dla sond mRNA 5’ oraz ester NHS Cy3B dla sond mRNA 3’. Rozpuść każdy rodzaj fluoroforów w bezwodnym DMSO do końcowego stężenia 20 mg/mL (~25 mM).
- Przygotuj 0,1 M wodorowęglanu sodu (pH 8,5) bezpośrednio przed każdą reakcją znakowania. Długotrwała ekspozycja na powietrze obniży jego pH i zmniejszy wydajność znakowania.
- Do reakcji konjugacji połącz następujące składniki: 15 μL roztworu stokowego fluoroforu Cy5 (z kroku 1.5), 4 μL zestawu sond mRNA 5’ (z kroku 1.4), 75 μL wodorowęglanu sodu (z kroku 1.6) oraz 7 μL wody. Owiń probówkę folią aluminiową i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 3-6 h.
UWAGA: Dłuższa inkubacja nie musi skutkować większą wydajnością znakowania. Ponadto skalę reakcji można zwiększyć lub zmniejszyć, o ile zachowane zostaną stężenia składników. - Powtórz powyższy krok dla zestawu sond mRNA 3’ i odpowiadającego im fluoroforu (tj. estru NHS Cy3B).
- Przeprowadź wytrącanie etanolem22, aby usunąć niezwiązane cząsteczki barwnika. Rozpuść osad w ~50 μL buforu TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0 z 1 mM EDTA).
- Oszacuj stężenia DNA i fluoroforu za pomocą spektrometru UV-Vis.
- Zmierz absorbancję przy 260 nm oraz 559 nm (Cy3B) lub 649 nm (Cy5). Jeśli próbka jest zbyt skoncentrowana, aby uzyskać dokładny pomiar, rozcieńcz 1 µL próbki do 10 µL.
- Przelicz absorbancję na stężenie:
εDNA = 0,2 μM-1 (dla jednoniciowego DNA o długości 20 nt), εCy5 = 0,25 μM-1 oraz εCy3B = 0,13 μM-1
UWAGA: [DNA] to stężenie wszystkich sond w roztworze. Stężenie pojedynczych sond jest około 24-krotnie niższe. Stężenie wszystkich sond będzie od tego momentu określane jako „stężenie sond”. Jeśli stosunek [DNA] do [barwnika] wynosi 1, można pominąć następny krok HPLC23, a próbkę należy rozcieńczyć do końcowego stężenia 4-5 μM w buforze TE.
- (Zalecane) Oczyść znakowane sondy z nieznakowanych sond i wolnych barwników za pomocą HPLC.
UWAGA: Chociaż ten dodatkowy etap oczyszczania doprowadzi do utraty części próbki, jest on korzystny dla dalszych zastosowań. Usunięcie nieznakowanych sond DNA zwiększy sygnał fluorescencji z docelowych mRNA, a usunięcie niezwiązanych barwników zmniejszy fluorescencję tła.- Przygotuj układ HPLC ze standardową analityczną kolumną C18, 0,1 M octanem trietyloamoniowym (TEAA) jako buforem A i acetonitrylem jako buforem B.
- Dodaj 1 M TEAA do próbki (z kroku 1.9), aby uzyskać stężenie 0,1 M TEAA.
- Ustaw program gradientu w następujący sposób: 0-5 min z 0% B, 5-35 min z liniowym gradientem B 0-30%, 35-37 min z liniowym gradientem B 30-100% oraz 37-40 min z 0% B. Utrzymaj przepływ na poziomie 0,1 mL/min i rejestruj chromatogramy przy 260 i 649 nm (dla próbek znakowanych Cy5) lub przy 260 i 559 nm (dla próbek znakowanych Cy3B).
- Zbierz eluowaną próbkę w momencie, gdy absorbancja wzrośnie w obu kanałach (DNA i fluorofor).
- Skoncentruj eluowaną próbkę za pomocą koncentratora próżniowego i ponownie zawieś osad w 50-100 μL buforu TE.
- Sprawdź stężenie DNA i fluoroforu za pomocą spektrometru UV-Vis (patrz krok 1.10). Jeśli to konieczne, rozcieńcz próbkę, aby uzyskać końcowe stężenie około 4-5 µM. Przechowuj sondy w temperaturze -20 °C
2. Przygotowanie roztworów
- Przygotuj dużą objętość wody traktowanej DEPC oraz buforów (Tabela 1). Roztwory te mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej przez ponad rok.
- Przygotuj 4x roztwór utrwalający oraz roztwór do płukania (Tabela 1).
- Przygotuj roztwór do prehybrydyzacji oraz roztwór do hybrydyzacji sondy (Tabela 1). Roztwór do hybrydyzacji sondy przygotuj podczas inkubacji w kroku 5.1 lub 6.1, a następnie przechowuj go w wytrząsarce blatowej w temperaturze 37 °C przez 20-40 min pod przykryciem, aby zminimalizować ekspozycję na światło.
UWAGA: Stężenia formamidu, SSC oraz sondy zostały zoptymalizowane dla zestawów sond lacZ, aby zminimalizować fluorescencję tła przy jednoczesnej maksymalizacji sygnału rzeczywistego. Szczegółowe informacje na temat modyfikacji tych stężeń dla różnych zastosowań znajdują się w sekcji Dyskusja.
3. Przygotowanie szkiełek podstawowych i nakrywek
- Oczyszczanie szkiełek nakrywkowych i przedmiotowych.
- Za pomocą pęsety umieść poszczególne szkiełka nakrywkowe i przedmiotowe w naczyniu Coplin. Upewnij się, że szkiełka są oddzielone i nie stykają się ze sobą.
- Napełnij naczynie 100% etanolem i zamknij pokrywkę. Umieść naczynie w wodnej myjce ultradźwiękowej i poddaj sonikacji przez 15-20 min.
UWAGA: W przypadku sonikatora kąpielowego zaleca się wyłączenie funkcji grzania. - Wylej etanol i przemyj szkiełka wodą ultrapure 3-4x. Użyj wody płynącej bezpośrednio z urządzenia do oczyszczania wody.
- Wylej wodę z naczynia i napełnij je 70% etanolem. Zamknij pokrywkę, przeprowadź sonikację przez 15-20 min, a następnie przemyj wodą ultrapure.
- Napełnij naczynie wodą ultrapure i poddaj sonikacji przez 15-20 min.
UWAGA: Szkiełka nakrywkowe i przedmiotowe można przechowywać przez noc w naczyniu Coplin wypełnionym wodą ultrapure. - Wyjmij szkiełko przedmiotowe lub nakrywkę z naczynia Coplin za pomocą czystej pęsety i osusz je strumieniem gazu N2. Powtórz tę czynność dla pozostałych szkiełek i nakrywek.
- Umieść osuszone szkiełka przedmiotowe w czystym pudełku do przechowywania aż do momentu wykonania kroku 7.5. Umieść osuszone szkiełka nakrywkowe w pustym pudełku na końcówki do pipety o pojemności 1 000-μL, które będzie służyć jako „komora” w dalszej części procedury.
- Za pomocą markera hydrofobowego narysuj na szkiełkach nakrywkowych okręgi, wzorując się na okrągłych otworach w pudełku na końcówki. Okręgi te (o średnicy ~0,5 cm) będą pełnić funkcję „dołków”. Odczekaj co najmniej 5-10 min, aż marker całkowicie wyschnie.
UWAGA: Zawsze trzymaj pokrywkę pudełka z końcówkami zamkniętą. - Nanieś kroplę 20-μL 0,1% poli-L-lizyny do każdego dołka. Inkubuj przez 10-50 min w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Dostosuj tę objętość do wielkości dołka. Upewnij się, że roztwór całkowicie pokrywa obszar dołka. Przy dłuższej inkubacji należy uważać, aby uniknąć odparowania. - Po inkubacji odessij poli-L-lizynę, nie dotykając powierzchni, aby nie zeskrobać warstwy poli-L-lizyny. Następnie nanieś kroplę (~20 μL) wody DEPC do dołków traktowanych poli-L-lizyną. Zamknij pokrywkę „komory”, aby zapobiec odparowaniu do momentu wykonania kroku 5.1.
4. Eksperyment z przebiegiem czasowym i fiksacja próbek
- Hodować komórki E. coli w ok. 20 mL kultury płynnej w kolbie o pojemności 250 mL. Kolbę należy umieścić w inkubatorze z wytrząsarką (30 °C) i kontynuować wytrząsanie. Wytrząsarkę należy zatrzymywać wyłącznie podczas pobierania próbek.
UWAGA: Wyniki przedstawione w niniejszej pracy uzyskano z komórek MG1655 hodowanych w minimalnym medium M9 uzupełnionym o 0,2% glicerolu, 0,1% kwasów kasamino i 1 mg/L tiaminy do fazy wzrostu wykładniczego (OD600~0,2). - Do pustej probówki o pojemności 1,5 mL dodać 250 µL 4-krotnego roztworu utrwalającego. Powtórzyć czynność, przygotowując tyle probówek, ile punktów czasowych zostanie pobranych. Probówki należy opisać numerami punktów czasowych i przechowywać w temperaturze pokojowej.
- Przed rozpoczęciem eksperymentu kinetycznego pobrać 750 µL kultury komórkowej (OD600~0,2). Kulturę przenieść do probówki oznaczonej jako „czas zero” (z kroku 4.2). Delikatnie odwrócić probówkę, aby wymieszać komórki z roztworem utrwalającym.
UWAGA: Nie mieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół, nie używać wirówki typu vortex ani nie traktować komórek gwałtownie. Próbka ta reprezentuje stan represji i zostanie użyta jako kontrola do obliczenia intensywności fluorescencji pojedynczego mRNA (patrz krok 9.4). - Do kultury płynnej dodać 0,02-1 mM izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG), aby indukować ekspresję lacZ. W tym momencie uruchomić stoper (t = 0 min) i pobierać próbki w określonych odstępach czasu (np. co 1 min) od tego momentu. W celu pobrania próbek powtórzyć krok 4.3.
- W określonym czasie podczas eksperymentu kinetycznego (np. w t = 1,5 min) dodać 5 mM ortonitrofenylo-β-D-fukopiranozydu (ONPF) lub 500 mM glukozy24, aby zrepresować ekspresję lacZ. Po ponownej represji kontynuować pobieranie próbek z kultur (krok 4.3), aby śledzić degradację mRNA.
UWAGA: Represja może być również przeprowadzona z użyciem ok. 400 µg/mL rifampicyny, inhibitora inicjacji transkrypcji25. - W celu utrwalenia inkubować probówki zawierające pobrane komórki w temperaturze pokojowej przez 15 min, a następnie w lodzie przez 30 min.
- Aby usunąć utrwalacze, wirować probówki z prędkością 4 500 x g przez 4 min w temperaturze pokojowej. Nadmiar cieczy usunąć pipetą.
UWAGA: Należy pamiętać, aby utylizować formaldehyd w oddzielnym pojemniku na odpady, zgodnie z protokołem bezpieczeństwa. - Dodać 1 mL DEPC-PBS i resuspenderć komórki. Powtórzyć wirowanie i resuspensję jeszcze 2 razy.
UWAGA: Utrwalone komórki są delikatne i wymagają ostrożnego traktowania. Należy starannie resuspenderć osad i unikać powstawania pęcherzyków powietrza. - Po końcowym etapie płukania resuspenderć komórki w ok. 30 µL DEPC-PBS.
5. Permeabilizacja błon komórkowych
- Nanieś próbki z każdego punktu czasowego do oddzielnych studni na szkiełku nakrywkowym (~30 μL na studnię). Odczekaj 10-30 min w temperaturze pokojowej, aż komórki przywrą do powierzchni. Unikaj łączenia się kropel cieczy między studniami.
- Aby wypłukać niezwiązane komórki, odessij ciecz i nanieś ~20 μL DEPC PBS do każdej studni. Odessij DEPC PBS w ciągu kilku minut.
- Przeprowadź permeabilizację błon komórkowych, nakładając 15 µL 70% etanolu do każdej studni na 4 min. Po 4 min odessij etanol i upewnij się, że studnie są całkowicie suche.
UWAGA: Kluczowe jest ograniczenie czasu kontaktu z etanolem do 4 min. Dłuższa obróbka doprowadzi do nadmiernej permeabilizacji. - Nanieś 30 µL roztworu płuczącego do każdej studni.
6. Hybrydyzacja sond
- Odssać roztwór piorący z każdego dołka. Nanieść 30 µL roztworu do prehybrydyzacji do każdego dołka. Inkubować komorę w piecu w temperaturze 37 °C przez 30 min.
UWAGA: Dodać ~50 mL wody na dno komory w celu zapewnienia wilgotności. - Odssać roztwór do prehybrydyzacji z każdego dołka. Nanieść ~30 µL roztworu do hybrydyzacji sond do każdego dołka. Przykryć komorę folią aluminiową i inkubować w piecu w temperaturze 37 °C przez 2 h.
UWAGA: Przed tym krokiem upewnić się, że roztwór do hybrydyzacji sond znajduje się w wytrząsarce blatowej w temperaturze 37 °C. Unikać łączenia się cieczy między dołkami. W razie potrzeby nanieść do każdego dołka mniejszą objętość roztworu.
7. Płukanie po hybrydyzacji i przygotowanie do obrazowania
- Za pomocą pipety wielokanałowej nanieś jednocześnie ok. 30 µL roztworu płuczącego do każdej studni. Odessij płyn i powtórz proces płukania 3-5 razy. Inkubuj komorę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 15-30 min.
- Powtórz krok 7.1 jeszcze dwa razy.
- Przepłucz każdą studnię roztworem DEPC-PBS 5 razy. Postępuj zgodnie z metodą opisaną w kroku 7.1, pomijając etap inkubacji.
- Odsysaj płyn z szkiełka nakrywkowego. Nanieś 4 µL DEPC-PBS do każdej studni.
- Używając pęsety, podnieś i odwróć szkiełko nakrywkowe, a następnie delikatnie połóż je na szkiełku przedmiotowym (z kroku 3.2). Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza.
- Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego za pomocą silikonowej masy stomatologicznej.
- Odczekaj do utwardzenia się masy. Na tym etapie można przerwać pracę i przechowywać preparat przez noc w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Inne protokoły smFISH sugerują dodanie odczynników usuwających tlen (np. oksydazy glukozowej/katalazy) lub zastosowanie komercyjnego medium montażowego zapobiegającego blaknięciu14,26 w celu zwiększenia fotostabilności fluoroforów.
8. Obrazowanie
- Aby zlokalizować obszar zainteresowania, należy użyć trybu podglądu na żywo w obrazowaniu w kontraście fazowym. Pole widzenia wewnątrz studni zmienia się za pomocą joysticka stolika. Należy wybrać obszar o optymalnej gęstości komórek (tj. taki, w którym znajduje się wiele w większości odseparowanych od siebie komórek). Następnie należy dostosować ostrzenie w osi z, tak aby obrazy komórek w kontraście fazowym były ostre.
- Należy wykonać zdjęcia w następującej kolejności: Cy5 (czas ekspozycji 4 s), Cy3 (czas ekspozycji 2 s) oraz kontrast fazowy (czas ekspozycji 0,2 s).
UWAGA: Cząsteczki barwnika Cy3B są obrazowane w kanale Cy3, a uzyskane obrazy określa się mianem obrazów Cy3. - Należy powtórzyć kroki 8.1–8.2, aby pozyskać obrazy z około 10 różnych obszarów w obrębie jednej studni.
- Należy przenieść obiektyw do kolejnej studni i powtórzyć kroki 8.1–8.3.
- Obrazy należy wyeksportować jako pliki TIFF.
- (Opcjonalnie) Należy obrazować wielobarwne koraliki zaadsorbowane na powierzchni szkiełka cover-slip w kanałach Cy5 i Cy3, aby określić przesunięcie przestrzenne między tymi kanałami w celu rejestracji obrazów.
- Należy nanieść około 10 µL wielobarwnych koralików fluorescencyjnych (średnica 0,2 µm) na czystą powierzchnię szkiełka cover-slip i odczekać 10–30 min. Po przemyciu około 50 µL PBS, należy nanieść około 5 µL PBS i przykryć szkiełko cover-slip szkiełkiem przedmiotowym. Następnie całość należy uszczelnić i zamontować w mikroskopie.
- Należy obrazować koraliki w obu kanałach: Cy5 i Cy3.
9. Analiza obrazu
UWAGA: Kod Matlab wykorzystany w tym kroku jest dostępny w serwisie GitHub pod adresem: https://github.com/sjkimlab/Code_Publication/tree/master/JoVE_2020. Folder na GitHub zawiera wszystkie elementy niezbędne do analizy obrazu, w tym wartości parametrów dla segmentacji komórek i identyfikacji punktów (spotów). Procedura w tym kroku została szczegółowo opisana w skrypcie głównym o nazwie „FISHworkflow.m”.
- Otwórz narzędzie do segmentacji komórek, takie jak microbeTracker27 lub Oufti28, i wczytaj obrazy w kontraście fazowym. Wybierz opcję „Independent frames” i naciśnij przycisk „All frames”, aby rozpocząć proces segmentacji, w ramach którego identyfikowane są komórki i obliczane są ich kontury (Rysunek 3B,C).
UWAGA: Szczegółowe protokoły korzystania z tych pakietów oprogramowania są dostępne online (np. oufti.org). - Wczytaj obrazy fluorescencyjne Cy5 w funkcji spotFinder programu microbeTracker lub Oufti i naciśnij przycisk „Run”, aby rozpocząć identyfikację i kwantyfikację punktów na podstawie dopasowania Gaussa 2D (Rysunek 3B,C). Powtórz ten krok dla obrazów fluorescencyjnych Cy3, aby przeanalizować punkty w kanale Cy3. Krok ten generuje listę punktów w każdej komórce, wraz z ich intensywnościami i współrzędnymi.
- (Opcjonalnie) Odfiltruj słabe punkty (fałszywie dodatnie) za pomocą progu, zgodnie z opisem w pliku FISHworkflow.m.
UWAGA: Przeanalizuj fluorescencyjne punkty w kontroli negatywnej (np. MG1655 ΔlacZ) i określ próg służący do odfiltrowania wyników fałszywie dodatnich. - Aby uzyskać intensywność punktu pojedynczego mRNA, wykorzystaj listę intensywności punktów zmierzonych w czasie zero (przed dodaniem IPTG) i dopasuj rozkład intensywności punktów do modelu mieszanin Gaussa z dwiema składowymi. Przyjmij pozycję szczytu pierwszej populacji Gaussa (czarna linia na Rysunku 3D,E) jako intensywność punktu pojedynczego mRNA. Wykonaj tę operację oddzielnie dla punktów Cy5 i Cy3, aby uzyskać intensywność punktu pojedynczego mRNA lacZ na końcach 5’ i 3’.
UWAGA: Powtórz tę czynność w każdym eksperymencie z przebiegiem czasowym, ponieważ intensywność punktu pojedynczego mRNA może się nieznacznie różnić w zależności od eksperymentu. - Podziel intensywność fluorescencji punktu przez intensywność pojedynczego mRNA (z kroku 9.4), aby uzyskać liczbę cząsteczek mRNA w punkcie. Zsumuj znormalizowane intensywności punktów wewnątrz komórki, aby obliczyć całkowitą liczbę mRNA w komórce (Rysunek 3F). Wykonaj te obliczenia oddzielnie dla mRNA 5’ i 3’.
- Oblicz i przedstaw na wykresie średnią liczbę mRNA na komórkę w każdym punkcie czasowym (np. Rysunek 4B), a następnie przeanalizuj kinetykę transkrypcji i degradacji mRNA in vivo na podstawie zmian czasowych średnich poziomów mRNA (Rysunek 4B).
- Aby uzyskać szybkość elongacji transkrypcji, wykonaj dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów linii do początkowego wzrostu sygnałów mRNA 5’ i 3’ i wyznacz punkty przecięcia z poziomami bazowymi (Rysunek 4B). Różnica między tymi punktami przecięcia wskazuje średni czas przemieszczania się polimeraz RNA (RNAP) z regionu sondy 5’ do regionu sondy 3’. Podziel odległość między dwoma zestawami sond (2 kb) przez ten czas, aby uzyskać średnią szybkość elongacji transkrypcji.
- Aby uzyskać szybkość degradacji mRNA, dopasuj funkcję zaniku wykładniczego, y = A·exp(-t/τ), do końcowego regionu spadku sygnałów mRNA 5’ i 3’ (np. Rysunek 4B). Parametr dopasowania, τ, jest średnim czasem życia mRNA.
- (Opcjonalnie) Przeanalizuj zmienność ekspresji genów między komórkami (np. odpowiedź na poziomie komórkowym na indukcję pokazaną na Rysunku 4C), w oparciu o rozkład liczby mRNA w każdej komórce (obliczony w kroku 9.5).
- (Opcjonalnie) Wykorzystując informacje o lokalizacji punktów wzdłuż osi głównej i pomocniczej komórki (uzyskane w kroku 9.2), przeanalizuj lokalizację mRNA (Rysunek 4D,E).
- (Opcjonalnie) Przeanalizuj ko-lokalizację mRNA 5’ i 3’ (Rysunek 5), porównując lokalizację punktów wykrytych w kanałach Cy5 i Cy3.
- Wczytaj obrazy wielokolorowych kulek (Krok 8.6) w funkcji spotFinderF w programie microbeTracker i uzyskaj współrzędne centroidów kulek w kanałach Cy5 i Cy3. Użyj listy współrzędnych centroidów do obliczenia macierzy transformacji afinicznej, która określa, jak kanały Cy5 i Cy3 są przesunięte i obrócone względem siebie29.
- Zastosuj macierz transformacji afinicznej do obrazów FISH Cy5 i Cy3, aby przekonwertować obrazy Cy3 na układ współrzędnych Cy5. Określ, czy dany punkt jest ko-lokalizowany z innym punktem w innym kanale. Na przykład punkt w kanale Cy5 jest uznawany za ko-lokalizowany z innym punktem w kanale Cy3, jeśli odległość między ich centroidami jest mniejsza niż 150 nm (Rysunek 5).
- Przeanalizuj, ile punktów Cy5 zostało zakwalifikowanych jako „ko-lokalizowane” z punktami Cy3 w każdym punkcie czasowym. Przeanalizuj również intensywność punktów ko-lokalizowanych (Rysunek 5).
Wyniki
Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne obrazy uzyskane przy użyciu tego protokołu smFISH. Pełne pole widzenia (86,7 μm x 66,0 μm przy zastosowaniu naszego zestawu mikroskopowego opisanego w Tabeli materiałów) ukazuje ~500 komórek E. coli rozproszonych w całym polu (Rysunek 3A). Jeśli gęstość komórek jest znacznie wyższa niż na tym obrazie, automatyczna segmentacja komórek staje się trudna, ponieważ algorytmy segmentacji nie identyfikują wiarygodnie poszczególnych komórek, gdy te stykają się ze sobą. Należy dostosować stężenie komórek oraz czas inkubacji stosowany w celu adhezji do powierzchni (Krok 5.1), aby uzyskać optymalną gęstość komórek w polu widzenia.
Morfologia komórek na obrazach w kontraście fazowym powinna pozostać porównywalna z morfologią żywych komórek w celu przeprowadzenia segmentacji (Rysunek 3A-C). W przypadku nadmiernej permeabilizacji dochodzi do zmian morfologii komórek (tworzą one tzw. „duchy”; Rysunek uzupełniający 1). W takiej sytuacji można skrócić czas traktowania 70% etanolem w kroku 5.3.
Przed indukcją średni poziom ekspresji lacZ wynosił ~0,03 mRNA na komórkę, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami15,30. Ponadto rozkład intensywności plamek mRNA lacZ przed indukcją nie pasował dobrze do rozkładu normalnego ani rozkładu Poissona ze względu na obecność plamek o wysokich intensywnościach (Rycyna 3D,E). Sugeruje to, że większość plamek wykrytych w stanie represji reprezentuje pojedynczą cząsteczkę mRNA lacZ, ale niewielka populacja plamek zawiera więcej niż jedną cząsteczkę mRNA lacZ. Aby wyodrębnić populację z pojedynczym mRNA lacZ, zastosowano model mieszanin gaussowskich z dwiema składowymi (wstawki na Rycynie 3D,E). Następnie średnią pierwszej funkcji gaussowskiej przyjęto jako średnią intensywność pojedynczej plamki mRNA (np. szczyt czarnej krzywej na Rycynie 3D) i wykorzystano ją do przeliczenia intensywności plamek na liczbę mRNA dla wszystkich plamek wykrytych w eksperymencie w serii czasowej. Aby obliczyć całkowitą liczbę mRNA w komórce, zsumowano znormalizowane intensywności plamek w każdej komórce (Rycyna 3F)19.
Gdy poziom ekspresji mRNA lacZ jest niski, wewnątrz komórki znajdują się jedna lub dwie oddzielone przestrzennie plamki mRNA lacZ ograniczone dyfrakcyjnie. W związku z tym obrazy tych plamek mogą być analizowane za pomocą dopasowania do funkcji Gaussa 2D w celu określenia ich intensywności i lokalizacji.
W przypadku wysokiego poziomu ekspresji, gdy plamki w obrębie komórki nakładają się na siebie, dopasowanie gaussowskie 2D nie zapewnia wiarygodnej kwantyfikacji. W takiej sytuacji poziom mRNA należy obliczyć, dzieląc całkowity sygnał fluorescencji w komórce po odjęciu tła przez średnią intensywność pojedynczej cząsteczki mRNA19.
Po indukowaniu ekspresji lacZ, najpierw wzrasta sygnał 5’ mRNA lacZ, a następnie wzrasta sygnał 3’ mRNA lacZ (Rysunek 4B). W przypadku represji ekspresji lacZ, sygnały zarówno 5’ jak i 3’ mRNA lacZ maleją z pewnym odstępem czasu między sobą (Rysunek 4B). Aby wyznaczyć szybkość elongacji transkrypcji, wzrost sygnałów 5’ i 3’ dopasowuje się najpierw do linii prostych (Rysunek 4B), a różnicę w punktach przecięcia z osią x przyjmuje się za czas potrzebny polimerazom RNA (RNAPs) na przebycie odległości między dwoma regionami sond (2,000 nt). Szybkość elongacji transkrypcji można zmierzyć w każdym eksperymencie z przebiegiem czasowym, a odchylenia standardowe można obliczyć z duplikatów eksperymentalnych. Średnia szybkość elongacji transkrypcji w naszych warunkach eksperymentalnych wynosiła 15-30 nt/s19.
Dodatkowo, szybkość degradacji mRNA (odwrotność średniego czasu życia mRNA) została wyznaczona poprzez dopasowanie funkcji wykładniczej do obszaru spadku (Rycina 4B). Nasze dane z przebiegu czasowego obejmują degradację mRNA w trakcie i po transkrypcji31. Aby zbadać degradację uwolnionych cząsteczek mRNA, dopasowaliśmy punkty czasowe z momentu, w którym mRNA 3’ zaczęło ulegać degradacji (t > 6 min). Uzyskaliśmy wartość ~90 s jako średni czas życia mRNA lacZ 5’ lub 3’19.
Szybkość inicjacji transkrypcji można obliczyć na podstawie nachylenia wzrostu sygnału 5’ po indukcji (Ryc. 4B, niebieski) lub na podstawie średniej liczby mRNA w stanie stacjonarnym (która stanowi iloraz szybkości inicjacji i szybkości degradacji). Ponadto prawdopodobieństwo przedwczesnej terminacji transkrypcji można oszacować, przyjmując stosunek nachylenia wzrostu sygnału 3’ do nachylenia wzrostu sygnału 5’32 lub stosunek poziomów stacjonarnych regionów 3’ i 5’ mRNA19.
Ponieważ smFISH jest techniką jednokomórkową, możemy analizować zmienność transkrypcji między poszczególnymi komórkami. Na przykład można przeanalizować procent komórek wykazujących ekspresję mRNA lacZ po dodaniu IPTG (Rycyna 4C). Można również zbadać, czy lokalizacja mRNA zmienia się po indukcji. Zaobserwowaliśmy, że plamki mRNA lacZ na końcach 5’ i 3’ przemieszczają się nieco na zewnątrz, oddalając się od centrum komórki (Rycina 4D,E), co jest zgodne z wcześniejszym doniesieniem33.
Wreszcie, analiza kolokalizacji między punktami mRNA 5’ i 3’ może być informacyjna (Rysunek 5A). Na przykład, w stanie represji (czas zero), około 25% punktów mRNA 5’ kolokalizuje się z punktem mRNA 3’. W t = 1 min, gdy w tak wielu loci genowych zachodzi synteza mRNA 5’, ale nie jeszcze synteza mRNA 3’, większość punktów mRNA 5’ występuje samodzielnie, bez sygnału mRNA 3’ (tzn. niskie prawdopodobieństwo kolokalizacji). Jednak w momencie pojawienia się mRNA 3’ (tzn. t = 2 min), prawdopodobieństwo kolokalizacji wzrasta (fioletowa strzałka na Rysunku 5A,B). Ten punkt czasowy, w którym kolokalizacja staje się częsta, zależy od szybkości elongacji transkrypcji. Dwuwymiarowy wykres gęstości liczby cząsteczek mRNA 5’ i 3’ lacZ w obrębie każdego punktu kolokalizacji wykrytego w tym punkcie czasowym może służyć do wnioskowania o gęstości RNAP na genie lacZ (Rysunek 5C). Jak zgłoszono wcześniej19, liczby mRNA 5’ na tym wykresie wskazują, że w większości loci lacZ znajduje się mniej niż 10 RNAP na DNA, gdy ekspresja lacZ jest indukowana przez 1 mM IPTG. Dodatkowo, liczby mRNA 3’ na tym wykresie są związane z klastrowaniem RNAP34. Fakt, że liczba mRNA 3’ jest bliska jedności, oznacza, że w obszar sondy 3’ wchodzi w przybliżeniu tylko jedna RNAP. Sugeruje to, że RNAP na genie lacZ są rozdzielone przestrzennie, zamiast tworzyć klaster (lub „konwój”).
Rysunek 1: Projekt sond smFISH dla badanego mRNA. (A) Metoda kafelkowania (tiling). Sekwencje krótkich oligonukleotydów DNA (o długości ~20 bp) są dobierane tak, aby pokrywały badane mRNA. Sondy oligonukleotydowe są znakowane cząsteczką barwnika fluorescencyjnego. (B) Metoda macierzy. Niekodująca macierz sekwencji tandemowych (np. „macierz lacO”) jest fuzjonowana transkrypcyjnie z badanym mRNA. Do wzmocnienia sygnału mRNA stosuje się znakowaną fluorescencyjnie sondę komplementarną do jednostki powtarzalnej (np. sonda lacO o długości 17 bp). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Schemat procedury eksperymentalnej smFISH oraz czas trwania każdego etapu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Analiza obrazów smFISH. (A-C) Obraz mikroskopowy smFISH 5’ lacZ mRNA (czerwony) i 3’ lacZ mRNA (zielony) w szczepie dzikim E. coli (MG1655) hodowanym w minimalnym medium M9 uzupełnionym o 0,2% glicerolu, 0,1% kwasów kasamino i 1 mg/L tiaminy w temperaturze 30 °C. (A) Reprezentatywny obraz próbki z t = 3 min po indukcji 0,05 mM IPTG w t = 0 min i represji 500 mM glukozą w t = 1,5 min. Obraz w kontraście fazowym oraz dwa obrazy fluorescencyjne Cy5 (dla 5’ lacZ mRNA, czerwony) i Cy3 (dla 3’ lacZ mRNA, zielony) zostały nałożone na siebie z zastosowaniem pseudokolorowania. Obraz obejmuje pole o wymiarach 86,7 μm x 66,0 μm. Pasek skali, 5 μm. (B) Powiększenie niewielkiego obszaru (żółta ramka) z panelu (A). Kontury komórek przedstawiono kolorem białym, a plamki fluorescencyjne zidentyfikowane w analizie obrazu zaznaczono czerwonymi kropkami. Pasek skali, 1 μm. (C) Detekcja konturów komórek i plamek fluorescencyjnych w warunkach wysokiej ekspresji (t = 4 min po indukcji 1 mM IPTG). Pasek skali, 1 μm. (D-E) Rozkłady intensywności plamek 5’ i 3’ mRNA zmierzone przed dodaniem IPTG (stan represji). Histogramy przedstawiono wraz z dwiema funkcjami Gaussa (czarną i szarą), których wartości średnie pochodzą z modelu mieszanin gaussowskich. Wstawka przedstawia wykres kwantyl-kwantyl liczb losowych wygenerowanych z modeli mieszanin gaussowskich oraz eksperymentalnie zmierzonych intensywności plamek mRNA (n = 1040 dla 5’ mRNA i 680 dla 3’ mRNA). (F) Informacje uzyskane dla pojedynczej komórki wskazanej w panelu (B). Dla danej komórki (i) zidentyfikowano plamki w kanałach Cy5 i Cy3, a ich intensywność (I) oraz współrzędne wzdłuż krótkiej i długiej osi komórki (d, l) określono za pomocą dopasowania funkcji Gaussa 2D. Po normalizacji zsumowano intensywności plamek, aby uzyskać całkowitą liczbę 5’ lub 3’ mRNA w tej komórce. Można również analizować ko-lokalizację plamek z różnych kanałów, analogicznie do przykładu pokazanego na Rysunku 5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Analiza kinetyki transkrypcji i degradacji mRNA in vivo. (A) Schemat i reprezentatywne obrazy z eksperymentów smFISH dwukolorowych mierzących zmiany poziomu mRNA lacZ w czasie. Czerwone i zielone linie przerywane oznaczają odpowiednio sondy oligonukleotydowe znakowane Cy5 lub Cy3B, które hybrydyzują z 1-kb długimi regionami 5’ i 3’ mRNA lacZ w E. coli. Przedstawiono również nałożone obrazy dwóch kanałów fluorescencyjnych na obraz w kontraście fazowym w określonych punktach czasowych po indukcji 0,2 mM IPTG w t = 0 min. Transkrypcję zahamowano za pomocą 500 mM glukozy w t = 1,5 min. Pasek skali, 1 μm. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Kim i wsp.19. (B) Liczba cząsteczek mRNA lacZ 5’ i 3’ na komórkę w czasie, podczas eksperymentu opisanego w panelu (A). Słupki błędów przedstawiają wartości bootstrapped SEM. W każdym punkcie czasowym przeanalizowano co najmniej 1 200 komórek. Początkowy wzrost sygnałów mRNA 5’ i 3’ został dopasowany linią (niebieską). Różnica w punktach przecięcia z osią x wynosiła 1,93 min, co daje średnią szybkość elongacji transkrypcji wynoszącą 17,3 nt/s. Końcowy spadek sygnałów mRNA 5’ i 3’ został dopasowany funkcją zaniku wykładniczego (szara). Parametry dopasowania wskazują, że średni czas życia mRNA wynosi 1,52 min dla mRNA 5’ i 1,66 min dla mRNA 3’. (C) Procent komórek z jednym lub więcej punktami mRNA lacZ podczas eksperymentu opisanego w (A). Słupki błędów przedstawiają wartości bootstrapped SEM. (D) Lokalizacja punktu wzdłuż krótkiej osi komórki. Bliskość punktu do błony można określić, dzieląc położenie wzdłuż krótkiej osi (d) przez połowę szerokości komórki (w). (E) Zmiana lokalizacji punktów mRNA lacZ 5’ i 3’ wzdłuż krótkiej osi komórek podczas eksperymentu opisanego w (A). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 5: Analiza kolokalizacji plamek mRNA 5’ i 3’. (A) Schemat przedstawiający oczekiwaną kolokalizację plamek mRNA 5’ i 3’ po indukcji. W momencie powstania mRNA 3’, prawdopodobieństwo kolokalizacji plamki mRNA 5’ z plamką mRNA 3’ wzrasta (fioletowa strzałka). (B) Prawdopodobieństwo kolokalizacji po indukcji 1 mM IPTG. Fioletowa strzałka wskazuje punkt czasowy, w którym prawdopodobieństwo kolokalizacji po raz pierwszy staje się częste zgodnie ze schematem na panelu (A). (C) Liczba cząsteczek mRNA lacZ 5’ i 3’ w obrębie plamki kolokalizacji wykrytej w t = 2 min po indukcji 1 mM IPTG (łącznie 841 plamek). Szare kropki reprezentują poszczególne plamki kolokalizowane, natomiast czerwone kropki reprezentują średnią z danych pogrupowanych. Słupki błędów to SEM. Odcień szarości wskazuje gęstość punktów w danym obszarze wykresu. Linia przerywana oznacza nachylenie równe 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 6: Optymalizacja warunków hybrydyzacji sondy. Wykorzystano dwa rodzaje próbek: komórki MG1655 hodowane zgodnie z opisem w Rycina 3, które pozostały nieindukowane (kolor niebieski) lub zostały potraktowane 0,5 mM IPTG przez 20 min (kolor czerwony). Roztwór do hybrydyzacji sond przygotowano z różnymi stężeniami sond (łącznie 72 sond sprzężonych z Cy5, pokrywających cały region lacZ) oraz formamidu. Stężenia formamidu dostosowano odpowiednio w roztworze do prehybrydyzacji oraz w roztworze do przemywania. „No probe” (linia szara) oznacza poziom fluorescencji w komórkach z dodatkiem IPTG, których nie poddano działaniu sond w etapie hybrydyzacji. Średnią intensywność fluorescencji znormalizowaną przez powierzchnię komórki (AU) obliczono dla 300-800 komórek. Słupki błędów reprezentują SEM obliczone metodą bootstrapingu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina uzupełniająca 1: Zniekształcona morfologia komórek wynikająca z nadmiernej permeabilizacji. Nałożenie obrazów w kontraście fazowym (skala szarości), mRNA 5’ lacZ (Cy5, czerwony) oraz mRNA 3’ lacZ (Cy3, zielony) komórek MG1655 5 min po indukcji 1 mM IPTG. (A) Przykład pokazujący mieszankę prawidłowych komórek i komórek nadmiernie permeabilizowanych, pozbawionych prawidłowej morfologii (wskazane różowymi strzałkami). (B) Przykład pokazujący skupione razem komórki typu „ghost”. Pasek skali = 1 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
| Woda z DEPC | ||||
| Dodać 0,1% DEPC do wody ultrapure i inkubować butelkę (przykrytą) w 37°C suszyć w suszarce przez noc i autoklawować następnego dnia. | ||||
| PBS z DEPC (10X) | ||||
| Wymieszać następujące składniki: | ||||
| 80 g | NaCl (stężenie końcowe 1,37 M) | |||
| 2 g | KCl (stężenie końcowe 27 mM) | |||
| 14,2 g | Na2HPO (histopatologia)4 (stężenie końcowe 100 mM) | |||
| 2,7 g | KH2PO4 (stężenie końcowe 20 mM) | |||
| Woda ultrapure do 1 L | ||||
| Filtr (0.22 μm) do szklanej butelki. | ||||
| Dodać 0,1% DEPC i postępować zgodnie z instrukcją dotyczącą wody z DEPC. | ||||
| Aby przygotować roztwór 1X, należy go rozcieńczyć 10-krotnie wodą z DEPC. | ||||
| 1M bufor fosforan sodu z DEPC, pH 7,4 | ||||
| Wymieszać następujące składniki: | ||||
| 115 g | Na2HPO4 | |||
| 22,8 g | NaH2PO4 | |||
| Woda ultraczysta do objętości 1 l | ||||
| Filtr (0.22 μm) do szklanej butelki. | ||||
| Dodać 0,1% DEPC i postępować zgodnie z instrukcją przygotowania wody z DEPC. | ||||
| 4X roztwór utrwalający (16% formaldehyd) | ||||
| 5 ml | 20% formaldehyd | |||
| 500 µL | woda z DEPC | |||
| 750 µL | 1M bufor fosforanowy sodu z DEPC, pH 7,4 | |||
| Przechowywać w 4 °C przez okres do 2–4 tygodni. | ||||
| OSTRZEŻENIE: Formaldehyd jest toksyczny. Podczas przygotowywania tego roztworu należy używać rękawic oraz pracować pod wyciągiem (dygestorium). | ||||
| Roztwór do płukania | ||||
| Wymieszaj następujące składniki: | ||||
| 10 mL | Formamid (stężenie końcowe 25%) | |||
| 4 ml | 20X SSC (stężenie końcowe 2X) | |||
| Dopełnić wodę z DEPC do objętości 40 ml | ||||
| Filtr (0.22 μm) i przechowywać w temperaturze 4 °C | ||||
| OSTRZEŻENIE: Formamid jest toksyczny. Podczas przygotowywania tego roztworu należy używać rękawic oraz pracować pod dygestorium. | ||||
| Roztwór do prehybrydyzacji | ||||
| 200 µL | Formamid (stężenie końcowe 20%) | |||
| 100 µL | 20X SSC (stężenie końcowe 2X) | |||
| 10 µL | 100X VRC (stężenie końcowe 1X) | |||
| 25 µL | 4% (m/v) BSA (stężenie końcowe 0,1%) | |||
| 685 µL | woda z DEPC | |||
| UWAGA: Przed pobraniem należy wymieszać roztwór VRC w vorteksie. 10 µL na zewnątrz. | ||||
| UWAGA: Formamid jest toksyczny i znanym teratogenem. Należy używać rękawic i pracować z nim pod wyciągiem. | ||||
| Roztwór do hybrydyzacji sond | ||||
| 200 µL | Formamid (stężenie końcowe 20%) | |||
| 100 µL | 20X SSC (stężenie końcowe 2X) | |||
| 10 µL | 100X VRC (stężenie końcowe 1X) | |||
| 25 µL | 4% (m/v) BSA (stężenie końcowe 0,1%) | |||
| 10 µL | 40 mg/mL tRNA z E. coli (stężenie końcowe 0,4 mg/mL) | |||
| 200 µL | 50% siarczan dekstranu (stężenie końcowe 10%) | |||
| Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. µL | zestaw sond mRNA 5’ (z kroku 1.12) do stężenia końcowego 4 nM. | |||
| y µL | zestaw sond mRNA 3’ (z kroku 1.12) do stężenia końcowego 4 nM. | |||
| - | wodę z DEPC do uzyskania całkowitej objętości 1 ml | |||
| UWAGA: Siarczan dekstranu należy dodać na końcu. Ze względu na jego wysoką lepkość, należy odciąć końcówkę tipa do pipety przed pobraniem substancji. 200 μL z roztworu zapasu 50%. Po dodaniu siarczanu dekstranu pipetować w górę i w dół w celu homogenizacji roztworu. | ||||
Tabela 1: Składy użytych roztworów.
Dyskusja
W tym miejscu przedstawiliśmy protokół smFISH do pomiaru kinetyki mRNA u E. coli. We wcześniej opublikowanych protokołach smFISH dla bakterii23 komórki były trzymane w probówkach do samego końca protokołu, czyli do momentu, gdy będą gotowe do obrazowania. Chociaż ma to wiele zalet, takich jak minimalne niespecyficzne wiązanie sond fluorescencyjnych na powierzchni szkiełka nakrywkowego23, trudno jest przestrzegać tych protokołów, gdy istnieje wiele próbek z eksperymentu z przebiegiem czasu. Po pierwsze, należy pobrać stosunkowo dużą objętość komórek (>1 ml), a nawet pobrać je przed utrwaleniem. Po drugie, próbki komórek muszą być wielokrotnie odwirowywane w celu wymiany roztworów i umycia po etapie hybrydyzacji. W naszym protokole niewielka objętość (<1 ml) kultury jest bezpośrednio mieszana z roztworem utrwalającym w probówce o pojemności 1,5 ml, co pomaga szybko "zamrozić" stan komórki w momencie pobierania próbki. Ponadto komórki pozostają przyczepione do powierzchni przez cały czas trwania zabiegu, a różne roztwory można szybko wymieniać, zasysając ciecze za pomocą systemu filtracji próżniowej i nakładając krople roztworu za pomocą pipety wielokanałowej. Ta różnica sprawia, że nasz protokół jest bardzo korzystny, gdy trzeba przetworzyć dużą liczbę próbek jednocześnie. Korzystając z naszego protokołu, można jednocześnie obsługiwać od 12 do 48 próbek, a cała procedura FISH może zostać zakończona w ciągu ~8 godzin, czyli mniej więcej tyle czasu potrzebnego na kilka próbek (ryc. 2). Chociaż użyliśmy ekspresji lacZ w E. coli jako przykładu, protokół ma szerokie zastosowanie do różnych genów i gatunków bakterii, z rozważaniami omówionymi poniżej.
W przypadku różnych genów pierwszą rzeczą, którą należy wziąć pod uwagę, są sondy smFISH. Można zaprojektować sondy oligonukleotydowe, które kafelkują mRNA będące przedmiotem zainteresowania (Figura 1A)13. W tym podejściu "kafelkowym" każda sonda ma długość ~20 zasad i jest oznaczona fluoroforem na końcu 5' lub 3'. Ta strategia jest wygodna, ponieważ nie jest potrzebna żadna manipulacja genetyczna. Alternatywnie, powtórzenie tandemowe sekwencji ~ 20 pz, obcej sekwencji genomowej (np. Tablica sekwencji lacO w Caulobacter crescentus14), może zostać wstawiona do nieulegającego translacji regionu genu będącego przedmiotem zainteresowania, a pojedyncza sonda komplementarna do jednostki powtórzenia jest używana do znakowania mRNA (podejście "tablicowe"; Rysunek 1B). W obu przypadkach wiele fluoroforów zdobi mRNA, dając wzmocniony sygnał fluorescencyjny, który można łatwo odróżnić od pojedynczej sondy niespecyficznie związanej wewnątrz komórki.
To, czy wybrać podejście "kafelkowe" czy "macierzowe", zależy od kontroli negatywnej, próbki, w której testowane jest niespecyficzne wiązanie sond z powodu braku docelowego mRNA. W przypadku sond kafelkowych (ryc. 1A) zmutowany szczep bez interesującego genu lub stanu, w którym gen nie jest transkrybowany (np. Tłumienie lacZ) może służyć jako kontrola ujemna do testowania niespecyficznego wiązania sond. W przypadku smFISH opartego na macierzy (rysunek 1B) szczep typu dzikiego pozbawiony macierzy może służyć jako kontrola negatywna, ponieważ nie zawiera miejsc wiązania dla sond.
Optymalne warunki hybrydyzacji mogą zależeć od sekwencji sondy, a nawet wyboru barwników fluoroforowych. Zoptymalizowaliśmy warunki hybrydyzacji dla zestawów sond lacZ, utrzymując temperaturę hybrydyzacji na poziomie 37 °C i testując różne stężenia zestawów sond i formamidu w roztworze hybrydyzacyjnym. Wyższe stężenia formamidu mają tendencję do zmniejszania zarówno niespecyficznego, jak i swoistego wiązania26,35. Zalecamy systematyczną zmianę hybrydyzacji i warunków jej prania przy zachowaniu tego samego czasu i temperatury hybrydyzacji. W miarę jak warunek staje się bardziej rygorystyczny, zmniejsza się zarówno wiązanie niespecyficzne, jak i swoiste (ryc. 6). Ważne jest, aby znaleźć punkt, w którym niespecyficzne wiązanie zaczyna spadać poniżej akceptowalnego progu bez dalszego naruszania specyficznego wiązania. Na przykład jako próg użyliśmy poziomu sygnału uzyskanego bez żadnych sond ("brak sond") (rysunek 6).
Dwukolorowa metoda smFISH znakująca dwa oddzielne regiony mRNA jest ograniczona do długich genów. Aby zmierzyć tempo wydłużania transkrypcji, wykorzystaliśmy fakt, że lacZ jest długi (3075 pz), a jego ekspresja może być indukowana przez IPTG. Gdy gen jest krótki, trudno jest zaprojektować dwa zestawy sond kafelkowych (w pobliżu końców 5' i 3') i rozwiązać opóźnienie czasowe między pojawieniem się regionów mRNA 5' vs. 3'. W takim przypadku można policzyć powstające mRNA w stanie stacjonarnym za pomocą smFISH i przeanalizować ich rozkład za pomocą modelu analitycznego, w którym szybkość wydłużania transkrypcji jako odpowiedni parametrwynosi 20. Ponadto, gdy interesujący nas gen nie jest indukowalny, można leczyć komórki ryfampicyną w czasie zero i mierzyć zmianę czasową w podregionach mRNA 5' i 3'. Opóźnienie od spadku sygnału 5' mRNA do spadku sygnału 3' mRNA można następnie wykorzystać do obliczenia szybkości wydłużania transkrypcji, jak to miało miejsce wcześniej31.
Wreszcie, protokół smFISH jest wszechstronny i można go łączyć z innymi schematami etykietowania. Wcześniej locus DNA wizualizowano razem z mRNA poprzez połączenie mRNA FISH z DNA FISH14 lub fluorescencyjnym systemem reporter-operator20. Produkty białkowe można uwidocznić, wykonując immunofluorescencję razem z mRNA FISH 14,36. Można go również połączyć z trójwymiarową mikroskopią superrozdzielczą37 w celu wizualizacji mRNA we wszystkich trzech wymiarach 38,39.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ten protokół został opracowany przez S.K. podczas jej badań podoktoranckich w laboratorium dr Christine Jacobs-Wagner w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa i Instytucie Nauk Mikrobiologicznych na Uniwersytecie Yale. Dziękujemy dr Jacobs-Wagner i członkom jej laboratorium za różnorodny wkład podczas opracowywania metody oraz Laurze Troyer za krytyczną lekturę manuskryptu. SK dziękuje za wsparcie ze strony programu Searle Scholars; K.V. dziękuje za wsparcie przyznane przez Uniwersytet Illinois nagrodzie James Scholar Preble Research Award.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szczep bakteryjny | |||
| Escherichia coli MG1655 | |||
| Chemikalia, peptydy i inne | |||
| Acetonitryl | Sigma-Aldrich | 34851 | Bufor UPLC B |
| Chlorek amonu | Fisher Chemical | A661-500 | Aby zrobić podłoże M9 |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | B2518 | Hybrydyzacja sondy |
| Chlorek wapnia | Acros Organics | 349610250 | Do produkcji pożywki |
| M9 Casaminokwas | BD Difco | 223050 | Do produkcji M9 pożywka |
| Cy3B NHS | GE Healthcare Nauki przyrodnicze | PA63101 | Fluorofor do sond FISH |
| Cy5 NHS ester | GE Healthcare Life Nauki | PA15101 | Fluorofor do sond FISH |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Siarczan dekstranu | Millipore | S4030 | Hybrydyzacja sondy |
| Dekstroza | Fisher Chemical | D16 | Aby stłumić ekspresję lacZ |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Aby rozpuścić fluorofory |
| E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | R1753 | Hybrydyzacja sondy |
| Etanol | Decon Laboratories | 2701 | Stosowany w oczyszczaniu, lizie i czyszczeniu szkiełek nakrywkowych |
| DNA Sondy | FISH Technologie | Sekwencje są publikowane w ref#16 | |
| Formaldehyd | Ladd Research Industries | 20295 | Utrwalenie |
| Formamid | American Bio | AB00600 | Hybrydyzacja sondy, wstępna hybrydyzacja i mycie |
| Glycerol | Americanbio | AB00751-01000 | Aby uzyskać podłoże M9 |
| Izopropylotio-β-galaktozyd (IPTG) | Invitrogen | 15529019 | indukcji lacZ |
| Siarczan magnezu | Fisher Chemical | M65-500 | Aby zrobić podłoże |
| M9 2-nitrofenyl β-D-fukopirazyd (ONPF) | Santa Cruz Biotechnology | sc-216258 | Tłumienie lacZ |
| Picodent twinsil 22 | Picodent | 1300 1000 | Uszczelniacz |
| Poli-L-lizyna | Sigma-Aldrich | P8920 | Do obróbki powierzchni szkiełka nakrywkowego |
| Chlorek potasu | Fisher BioReagents | BP366-500 | Do produkcji PBS |
| Fosforan potasu jednozasadowy | Fisher BioReagents | BP362-500 | Do wytwarzania pożywki PBS i M9 |
| Ryfampicyna | Sigma-Aldrich | R3501 | Aby zatrzymać inicjację transkrypcji |
| Bufor solno-cytrynianu sodu (SSC) | Invitrogen | AM9763 | Hybrydyzacja sondy, wstępna hybrydyzacja i płukanie |
| wodorowęglanu sodu | Fisher BioReagents | BP328-500 | Koniugacja fluorofor-sonda |
| Chlorek sodu | Fisher BioReagents | BP358-1 | Do oczyszczania DNA, PBS i M9 pożywka |
| Fosforan sodu dwuzasadowy | Fisher BioReagents | BP332-500 | Do wytwarzania pożywki PBS i M9 |
| Monozasadowy fosforan sodu | Fisher BioReagents | BP329-500 | Do wytwarzania buforu fosforanu sodu |
| Super PAP Pen | Invitrogen | 8899 | Marker hydrofobowy do szkiełek nakrywkowych |
| TetraSpek mikrosfery | Invitrogen | T7280 | Kontrole dla rejestracja wielokanałowa |
| Tiamina | Sigma-Aldrich | T1270 | Aby uzyskać medium M9 |
| Octan trietyloamonu | Sigma-Aldrich | 90358 | Bufor UPLC Kompleks |
| rybonukleozydów wanadylu (VRC) | Sigma-Aldrich | 94742 | Hybrydyzacja sondy i wstępna hybrydyzacja |
| Sprzęt | |||
| C18 kolumna | Waters | Acquity BEH C18 kolumna | |
| Wirówka nablatowa | Eppendorf | 5425 | |
| Inkubator nablatowy | Eppendorf | Thermomixer F1.5 | |
| Inkubator (piekarnik) | Thermo Scientific | 51030514 | Konwekcja grawitacyjna |
| System oczyszczania wody | Millipore | Milli-Q Reference | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | |
| Azot gazowy | Budynek | Do suszenia nadmuchem szkiełek nakrywkowych i szkiełek szklanych | |
| UPLC | Waters | Acquity UPLC System | |
| Vacuum i aspirator | Budynek | Aspirator wykonany jest z kolby filtracyjnej z bocznym ramieniem. | |
| Koncentrator próżniowy | Labconco | 7810010 | Centrivap; do suszenia próbek pobranych z UPLC. |
| Vortexer | Scientific Industries | Genie-2 SI-0236 | |
| Wytrząsarka do kąpieli wodnej | New Brunswick | Innova 3100 | Krytyczne dla eksperymentów w czasie |
| Sonikator do kąpieli wodnej | VWR | 97043-960 | Do czyszczenia szkiełek nakrywkowych i szkiełek |
| Tools | |||
| 1,5 ml probówek | Eppendorf | 22431021 | Probówki do lamin DNA |
| 1000-uL Pudełko na końcówki do pipet | Denville Scientific | P1126 | Puste pudełko po użyciu wszystkich końcówek |
| Słoik Coplin | SPI | 01240-AB | Do czyszczenia szkiełek nakrywkowych i szkiełek Szkiełko |
| nakrywkowe | Fisher Scientific | 22-050-230 | 24x60 No1 |
| Filtrowane końcówki do pipet | Denville Scientific | P1121,P1122,P1126 | SHARP® Precyzyjne końcówki barierowe |
| Kleszcze | SPI | K35a | Do obsługi czystych szkiełek nakrywkowych i szkiełek szkiełkowych |
| Szkiełko | szklane Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Rękawice | Pipeter wielokanałowy Microflex | MK-296-M | |
| Eppendorf | 2231300045 | Do użycia na etapie mycia | |
| Pipeta | Gilson | P1000, P200, P20 | |
| Zbiornik odczynnika | MTC Bio | P8025-1S | Do użycia na etapie mycia |
| Filtr strzykawkowy (0,22 um) | Milipore | SLGS033SS | |
| Timer | VWR | 62344-641 | |
| Oprogramowanie i algorytmy | |||
| MATLAB | Mathworks | R2013 i nowsze | https://www.mathworks.com |
| MicrobeTracker lub Oufti | https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker | ||
| https://oufti.org/ | |||
| Stellaris Probe Designer | Biosearch Technologies | https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer | |
| Microscope | |||
| CCD | kamera Hamamatsu Zestaw filtrów Photonics | Orca-II-ER | |
| Cy3 | Chroma | 49004 | |
| Zestaw filtrów Cy5 | Chroma | 49006 | |
| Mikroskop epifluorescencyjny | Nikon | Eclipse Ti | Do kontrastu fazowego i epi fluorescencji |
| Źródło wzbudzenia fluorescencji | Lumencor | SOLA-E | |
| Nikon Elements oprogramowanie | Nikon | oprogramowanie sterujące konfiguracją mikroskopu | |
| Obiektyw z kontrastem fazowym 100x | Plan Apochromat Nikon (NA 1.45) | ||
| Sekwencja sondy | |||
| Biosearch Technologies Inc | |||
| lacZ1 | GTGAATCCGTAATCATGGTC | 5' mRNA | |
| lacZ2 | TCACGACGTTGTAAAACGAC | 5' mRNA | |
| lacZ3 | ATTAAGTTGGGTAACGCCAG | 5' mRNA | |
| lacZ4 | TATTACGCCAGAGCTGGCGAAA | 5' mRNA | |
| lacZ5 | ATTCAGGCTGCGCAACTGTT | 5' mRNA | |
| lacZ6 | AAACCAGGCAAAGCGCCATT | 5' mRNA | |
| lacZ7 | AGTATCGGCCTCAGGAAGAT | 5' mRNA | |
| lacZ8 | AACCGTGCATCTGCCAGTTT | 5' mRNA | |
| lacZ9 | TAGGTCACGTTGGTGTAGAT | 5' mRNA | |
| lacZ10 | AATGTGAGCGAGTAACAACC | 5' mRNA | |
| lacZ11 | GTAGCCAGCTTTCATCAACA | 5' mRNA | |
| lacZ12 | AATAATTCGCGTCTGGCCTT | 5' mRNA | |
| lacZ13 | AGATGAAACGCCGAGTTAAC | 5' mRNA | |
| lacZ14 | AATTCAGACGGCAAACGACT | 5' mRNA | |
| lacZ15 | TTTCTCCGGGGCGCGTAAAAAT | 5' mRNA | |
| lacZ16 | ATCTTCCAGATAACTGCCGT | 5' mRNA | |
| lacZ17 | AACGAGACGTCACGGAAAAT | 5' mRNA | |
| lacZ18 | GCTGATTTGTGTAGTCGGTT | 5' mRNA | |
| lacZ19 | TTAAAGCGAGTGGCAACATG | 5' mRNA | |
| lacZ20 | AACTGTTACCCGTAGGTAGT | 5' mRNA | |
| lacZ21 | ATAATTTCACCGCCGAAAGG | 5' mRNA | |
| lacZ22 | TTTCGACGTTCAGACGTAGT | 5' mRNA | |
| lacZ23 | ATAGAGATTCGGGATTTCGG | 5' mRNA | |
| lacZ24 | TTCTGCTTCAATCAGCGTGC | 5' mRNA | |
| lacZ25 | ACCATTTTCAATCCGCACCT | ||
| lacZ26 | TTAACGCCTCGAATCAGCAA | ||
| lacZ27 | ATGCAGAGGATGATGCTCGT | ||
| lacZ28 | TCTGCTCATCCATGACCTGA | ||
| lacZ29 | TTCATCAGCAGGATATCCTG | ||
| lacZ30 | CACGGCGTTAAAGTTGTTCT | ||
| lacZ31 | TGGTTCGGATAATGCGAACA | ||
| lacZ32 | TTCATCCACCACATACAGGC | ||
| lacZ33 | TGCCGTGGGTTTCAATATTG | ||
| lacZ34 | ATCGGTCAGACGATTCATTG | ||
| lacZ35 | TGATCACACTCGGGTGATTA | ||
| lacZ36 | ATACAGCGCGTCGTGATTAG | ||
| lacZ37 | GATCGACAGATTTGATCCAG | ||
| lacZ38 | AAATAATGGTGGGGGTG | ||
| lacZ39 | TTTGATGGACCATTTCGGCA | ||
| lacZ40 | TATTCGCAAAGGATCAGCGG | ||
| lacZ41 | AAGACTGTTACCCATCGCGT | ||
| lacZ42 | TGCCAGTATTTAGCGAAACC | ||
| lacZ43 | AAACGGATACTGACGAAAA | ||
| lacZ44 | TAATCAGCGACTGATCCACC | ||
| lacZ45 | GGGTTGCCGTTTTCATCATA | ||
| lacZ46 | TCGGCGTATCGCCAAAATCA | ||
| lacZ47 | TTCATACAGAACTGGCGATC | ||
| lacZ48 | TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG | ||
| lacZ49 | ACGGAACTGGAAAAAACTGCT | 3' mRNA | |
| lacZ50 | TATTCGCTGGTCACTTCGAT | 3' mRNA | |
| lacZ51 | GTTATCGTATGACGGAACA | 3' mRNA | |
| lacZ52 | TTTACCTTGTGGAGCGACAT | 3' mRNA | |
| lacZ53 | GTTCAGGCAGTTCAATCAAC | 3' mRNA | |
| lacZ54 | TTGCACTACGCGTACTGTGA | 3' mRNA | |
| lacZ55 | AGCGTCACACTGAGGTTTTC | 3' mRNA | |
| lacZ56 | ATTTCGCTGGTGGTCAGATG | 3' mRNA | |
| lacZ57 | ACCCAGCTCGATGCAAAAAT | 3' mRNA | |
| lacZ58 | CGGTTAAATTGCCAACGCTT | 3' mRNA | |
| lacZ59 | CTGTGAAAGAAAGCCTGACT | 3' mRNA | |
| lacZ60 | GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT | 3' mRNA | |
| lacZ61 | TACGCCAATGTCGTTATCCA | 3' mRNA | |
| lacZ62 | TAAGGTTTTCCCCTGATGCT | 3' mRNA | |
| lacZ63 | ATCAATCCGGTAGGTTTTCC | 3' mRNA | |
| lacZ64 | GTAATCGCCATTTGACCACT | 3' mRNA | |
| lacZ65 | AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT | 3' mRNA | |
| lacZ66 | ATGTCTGACAATGGCAGATC | 3' mRNA | |
| lacZ67 | ATAATTCAATTCGCGCGTCC | 3' mRNA | |
| lacZ68 | TGATGTTGAACTGGAAGTCG | 3' mRNA | |
| lacZ69 | TCAGTTGCTGTTGACTGACT 3 | ' mRNA | |
| lacZ70 | ATTCAGCCATGTGCCTTCTT | 3' mRNA | |
| lacZ71 | AATCCCCATATGGAAACCGT | 3' mRNA | |
| lacZ72 | AGACCAACTGGTAATGGTAG | 3' mRNA |
Bibliografia
- Bervoets, I., Charlier, D. Diversity, versatility and complexity of bacterial gene regulation mechanisms: opportunities and drawbacks for applications in synthetic biology. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 304-339 (2019).
- Epshtein, V., Nudler, E. Cooperation between RNA polymerase molecules in transcription elongation. Science. 300 (5620), 801-805 (2003).
- Vogel, U., Jensen, K. F. The RNA chain elongation rate in Escherichia coli depends on the growth rate. Journal of Bacteriology. 176 (10), 2807-2813 (1994).
- Tennyson, C. N., Klamut, H. J., Worton, R. G. The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is cotranscriptionally spliced. Nature Genetics. 9, 184(1995).
- Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16, 1128(2009).
- Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation. Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).
- Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. -H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).
- Pérez-Ortín, J. E., Medina, D. A., Chávez, S., Moreno, J. What do you mean by transcription rate. BioEssays. 35 (12), 1056-1062 (2013).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
- Kuchina, A., et al. Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding. BioRxiv. , 869248(2019).
- Blattman, S. B., Jiang, W., Oikonomou, P., Tavazoie, S. Prokaryotic single-cell RNA sequencing by in situ combinatorial indexing. Nature Microbiology. , (2020).
- Femino, A., Fay, F., Fogarty, K., Singer, R. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Montero Llopis, P., et al. Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria. Nature. 466 (7302), 77-81 (2010).
- So, L. -h, et al. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nature Genetics. 43 (6), 554-560 (2011).
- Taniguchi, Y., et al. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells. Science. 329 (5991), 533-538 (2010).
- Jones, D. L., Brewster, R. C., Phillips, R. Promoter architecture dictates cell-to-cell variability in gene expression. Science. 346 (6216), 1533-1536 (2014).
- Iyer, S., Park, B. R., Kim, M. Absolute quantitative measurement of transcriptional kinetic parameters in vivo. Nucleic Acids Research. 44 (18), 142(2016).
- Kim, S., Beltran, B., Irnov, I., Jacobs-Wagner, C. Long-Distance Cooperative and Antagonistic RNA Polymerase Dynamics via DNA Supercoiling. Cell. 179 (1), 106-119 (2019).
- Wang, M., Zhang, J., Xu, H., Golding, I. Measuring transcription at a single gene copy reveals hidden drivers of bacterial individuality. Nature Microbiology. 4 (12), 2118-2127 (2019).
- Joo, C., Ha, T. Labeling DNA (or RNA) for single-molecule FRET. 2012 (9), Cold Spring Harbor. 1005-1008 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Standard Ethanol Precipitation of DNA in Microcentrifuge Tubes. 2006 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 4456(2006).
- Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Adesnik, M., Levinthal, C. The synthesis and degradation of lactose operon messenger RNA in E. coli. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 35, 451-459 (1970).
- Campbell, E. A., et al. Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase. Cell. 104 (6), 901-912 (2001).
- Raj, A., Tyagi, S. Methods in Enzymology. Walter, N. G. 472, Academic Press. 365-386 (2010).
- Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Molecular Microbiology. 80 (3), 612-627 (2011).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).
- Moffitt, J. R., Zhuang, X. Methods in Enzymology. Filonov, G. S., Jaffrey, S. R. 572, Academic Press. 1-49 (2016).
- Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. Probing gene expression in live cells, one protein molecule at a time. Science. 311 (5767), 1600-1603 (2006).
- Chen, H., Shiroguchi, K., Ge, H., Xie, X. S. Genome-wide study of mRNA degradation and transcript elongation in Escherichia coli. Molecular Systems Biology. 11 (1), 781(2015).
- Vogel, U., Sørensen, M., Pedersen, S., Jensen, K. F., Kilstrup, M. Decreasing transcription elongation rate in Escherichia Coli exposed to amino acid starvation. Molecular Microbiology. 6 (15), 2191-2200 (1992).
- Yang, S., et al. Transcription and translation contribute to gene locus relocation to the nucleoid periphery in E. coli. Nature Communications. 10 (1), 5131(2019).
- Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (12), 1263-1271 (2008).
- Fontenete, S., Guimarães, N., Wengel, J., Azevedo, N. F. Prediction of melting temperatures in fluorescence in situ hybridization (FISH) procedures using thermodynamic models. Critical Reviews in Biotechnology. 36 (3), 566-577 (2016).
- Sepúlveda, L. A., Xu, H., Zhang, J., Wang, M., Golding, I. Measurement of gene regulation in individual cells reveals rapid switching between promoter states. Science. 351 (6278), 1218-1222 (2016).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. eLife. 5, 13065(2016).
- Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
Przedruki i uprawnienia
