Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar naturalnie nabytych przeciwciał indukujących fagocytozę przeciwko pasożytom Plasmodium falciparum za pomocą testu opartego na cytometrii przepływowej

5.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61538

⸱

6 sierpnia 2020

 ,  , 
1Centre for Medical Parasitology, Department of Immunology and Microbiology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2West African Centre for Cell Biology of Infectious Pathogens, Department of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, University of Ghana, 3Department of Immunology, Noguchi Memorial Institute for Medical Research, 4Centre for Medical Parasitology, Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet

W tym artykule

Podsumowanie

Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie instrukcji, jak mierzyć zdolność przeciwciał obecnych w surowicach lub osoczu osób, naturalnie narażonych na zakażenie Plasmodium falciparum, do opsonizacji i indukowania fagocytozy erytrocytów zakażonych pasożytami (IE).

Streszczenie

Protokół opisuje, jak skonfigurować i uruchomić test fagocytozy oparty na cytometrii przepływowej erytrocytów (IE) zakażonych Plasmodium falciparum, opsonizowanych przez naturalnie nabyte przeciwciała IgG specyficzne dla VAR2CSA. VAR2CSA jest antygenem pasożytniczym, który pośredniczy w selektywnej sekwestracji IE w łożysku, co może powodować ciężką postać malarii u kobiet w ciąży, zwaną malarią łożyskową (PM). W ochronie przed PM pośredniczą przeciwciała specyficzne dla VAR2CSA, które, jak się uważa, działają poprzez hamowanie sekwestracji łożyska i / lub opsonizację IE dla fagocytozy. Test wykorzystuje zsynchronizowane IE w późnym stadium, które zostały wybrane in vitro do ekspresji VAR2CSA, przeciwciała w osoczu/surowicy od kobiet z naturalnie nabytą odpornością swoistą dla PM oraz fagocytarną linię komórkową THP-1. Protokół można jednak łatwo zmodyfikować w celu zbadania funkcjonalności przeciwciał przeciwko dowolnemu antygenowi pasożyta obecnemu na powierzchni IE, niezależnie od tego, czy jest on wywołany przez naturalną ekspozycję, czy przez szczepienie. Test oferuje prostą i wysokoprzepustową ocenę, z dobrą odtwarzalnością, ważnego funkcjonalnego aspektu odporności opartej na przeciwciałach w malarii. Jest zatem przydatny do oceny odporności klinicznej na malarię P. falciparum, główną przyczynę zachorowalności i śmiertelności w tropikach, szczególnie w Afryce Subsaharyjskiej.

Wprowadzenie

Malaria jest chorobą przenoszoną przez wektory, wywoływaną u ludzi po zakażeniu pięcioma różnymi gatunkami z rodzaju Plasmodium. Najbardziej rozpowszechnionym gatunkiem jest P. falciparum, który jest również odpowiedzialny za największą zachorowalność i śmiertelność1. Obraz kliniczny malarii waha się od bezobjawowych lub łagodnych infekcji do skomplikowanej/ciężkiej choroby, przy czym ta ostatnia występuje głównie u dzieci w wieku poniżej pięciu lat. Narażenie na P. falciparum nie wywołuje bezpłodnej odporności, ale osoby żyjące na obszarach endemicznych powoli rozwijają odporność przeciwko chorobie klinicznej. Ochrona jest zależna od wieku/ekspozycji, a odporność nabywa się zwykle w ciągu pierwszych 5-10 lat życia2. Dorosłe kobiety są ważnym wyjątkiem, ponieważ ciężka postać malarii może wystąpić w czasie ciąży w postaci obrazu klinicznego znanego jako malaria łożyskowa (PM). PM jest ważną przyczyną poronień, martwych urodzeń, przedwczesnych porodów, niskiej masy urodzeniowej, śmierci płodu i niedokrwistości matki. Oporność na PM rozwija się w kolejnych ciążach3. Ochrona przed PM wiąże się z nabyciem przeciwciał przeciwko PfEMP14,5, zakażonemu antygenowi powierzchniowemu erytrocytów (IE), który wiąże się z siarczanem chondroityny A (CSA), umożliwiając sekwestrację IE w łożysku. Przeciwciała pośredniczą w ochronie, wykonując różne czynności funkcjonalne (omówione w6,7), w tym opsonizację IE w celu wywołania fagocytozy. Wczesne badania in vitro wykazały, że przeciwciała mogą ograniczać wzrost P. falciparum w obecności monocytów poprzez fagocytozę8,9. Nowsze badania wykazały, że wyższe poziomy przeciwciał indukujących fagocytozę są związane z lepszymi wynikami ciąży (w kontekście koinfekcji HIV)10,11, co wskazuje na znaczenie tej funkcji efektorowej w naturalnie nabytej odpowiedzi immunologicznej.

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru tej funkcji przeciwciał obecnych w ludzkim osoczu/surowicy, używając in vitro hodowanych IE wyrażających VAR2CSA razem z linią monocytów THP-1. Test był wcześniej używany11,12,13,14,15,16,17,18 i jest uważane za ulepszone i łatwiejsze podejście w porównaniu z wcześniejszymi protokołami opartymi na mikroskopie8, ponieważ umożliwia badanie większej liczby próbek przeciwciał w jednym cyklu przy użyciu mniejszych objętości przeciwciał i pozwala uniknąć żmudnego i tendencyjnego liczenia mikroskopowego. Mimo że test był używany przez wiele laboratoriów, a jego wykonanie jest dość proste, wymaga starannego planowania i przygotowania, dlatego szczegółowy protokół pozwoliłby na jego zastosowanie przez laboratoria i badaczy bez wcześniejszego doświadczenia. Jako przykład używamy zsynchronizowanych IE w późnym stadium, które wyrażają VAR2CSA opsonizowane przeciwciałami obecnymi w surowicy pobranej od kobiet z naturalnie nabytą odpornością swoistą dla PM. Protokół można jednak łatwo zmodyfikować w celu zbadania funkcjonalności przeciwciał przeciwko dowolnemu antygenowi pasożyta obecnemu na powierzchni IE, niezależnie od tego, czy jest on wywołany przez naturalną ekspozycję, czy przez szczepienie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Próbki ludzkiej surowicy użyte do przedstawionych tutaj wyników zostały zebrane w osobnym badaniu19. Kolekcja została zatwierdzona przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Instytutu Badań Medycznych Noguchi Memorial Institute na Uniwersytecie Ghany (badanie 038/10-11) oraz przez Regionalne Komisje Etyczne ds. Badań Naukowych w Regionie Stołecznym Danii (protokół H-4-2013-083).

1. Hodowla pasożytów

UWAGA: Postępuj zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi postępowania z ludzkimi patogenami.

  1. Utrzymuj pasożyty P. falciparum zgodnie ze standardowym protokołem, jak opisano wcześniej20 w pożywce do hodowli pasożytów (patrz Tabela materiałów).
  2. Utrzymuj pasożyty w ścisłej synchronizacji, stosując leczenie sorbitolem, jak opisano wcześniej21.
  3. Aby zapewnić VAR2CSA ekspresję na powierzchni IE, wykonaj powtarzające się rundy selekcji immunologiczno-magnetycznej przy użyciu przeciwciała anty-VAR2CSA (np. przeciwciała PAM1.4, reaktywnego krzyżowo ludzkiego monoklonalnego VAR2CSA specyficznego dla IgG22) sprzężonego z białkowymi kulkami magnetycznymi G23.
    1. Krótko mówiąc, inkubuj późne stadium trofozoitów-IE za pomocą kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałem anty-VAR2CSA i pozytywnie wybierz za pomocą magnesu.
    2. Rozwijaj wybrane pasożyty w kulturze przez kilka cykli, aż parazytemia osiągnie co najmniej 5%.
    3. Alternatywnie, wybierz pasożyty, które wiążą się z unieruchomionym plastikiem CSA (receptorem dla VAR2CSA), jak opisano wcześniej24.
  4. Aby zweryfikować VAR2CSA ekspresję na wybranych pasożytach, wykonaj cytometrię przepływową, jak opisano wcześniej25.
    1. Krótko mówiąc, oznacz późne stadium trofozoitów-IE tym samym przeciwciałem, które jest używane do selekcji magnetycznej (krok 1.3), a następnie fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym.
    2. Zmierzyć reaktywność powierzchniową IE za pomocą cytometrii przepływowej. Udana selekcja przeciwciał zwykle prowadzi do powstania populacji pasożytów, która wykazuje ekspresję VAR2CSA u większości pasożytów (≈80%).
  5. Do testu fagocytozy należy użyć oczyszczonych trofozoitów-IE w średnim i późnym stadium. Wykonaj oczyszczanie za pomocą separacji magnetycznej, jak opisano wcześniej26.
    UWAGA: Aby dokładnie określić stadium pasożytów, należy wykonać barwienie metodą Giemsa na rozmazach krwi, a następnie obserwację pod mikroskopem świetlnym. Postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami i wytycznymi morfologicznymi, jak opisano wcześniej27. Oczyszczanie na późnym etapie można również przeprowadzić przy użyciu podłoża o gradiacji gęstości. Z naszego doświadczenia wynika, że wydajność IE jest jednak niższa i dlatego preferowane jest oczyszczanie magnetyczne.
    1. W celu separacji magnetycznej wiruj kulturę pasożytów (5-10% parazytemii) w temperaturze 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki do hodowli pasożytów.
    2. Dodaj zawiesinę pasożyta do kolumny CS sprzężonej z magnesem (patrz Tabela materiałów) i pozwól jej powoli przejść przez kolumnę. Trophozoite-IE są paramagnetyczne (ze względu na obecność hemoozyny) i pozostaną w siatce kolumny.
    3. Przemyć kolumnę 50 ml pożywki do hodowli pasożytów i wymyć IE z kolumny magnetycznej za pomocą 50 ml pożywki do hodowli pasożytów.
  6. Wirować eluat z 1.5.3 przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić sklarowany osad i ponownie zawiesić w 1 ml pożywki hodowlanej pasożytów.
  7. Za pomocą hemocytometru policz liczbę IE (łatwo zidentyfikowanych za pomocą mikroskopu świetlnego jako erytrocyty z ciemnym barwnikiem hemozozyiny) i całkowitą liczbę komórek, aby obliczyć końcową parazytemię (procent IE).
    UWAGA: Używaj tylko pasożytów o czystości co najmniej 80% (80% IE).
  8. Na podstawie liczby próbek surowicy/przeciwciał planowanych do testowania, oszacuj całkowitą ilość potrzebnych IE i odpowiednio zwiększ liczbę kultur pasożytów. Kolba hodowlana o średnicy 75cm2 z 25 ml kultury przy 5% hematokrycie i 5-10% parazytemii powinna dać wystarczającą ilość IE, aby uruchomić pełną płytkę 96-dołkową. W przypadku pełnej płytki (42 próbki plus 6 próbek kontrolnych w dwóch częściach) potrzebne jest co najmniej 1,5 ml zawiesiny pasożyta o stężeniu 3,3 x 107 IEs/ml.

2. Komórki THP-1

UWAGA: Linia komórkowa THP-1 jest używana w tym teście. Ta linia komórek monocytów pochodzi od pacjenta z białaczką monocytową28 i można ją kupić w ATCC. Utrzymuj linię komórkową zgodnie z instrukcjami dostawcy w pożywce hodowlanej THP-1 (patrz Tabela materiałów).

  1. W celu regularnej konserwacji rozpocznij hodowlę komórek THP-1 przy 2-4 x 105 komórek/ml i subkulturę, gdy stężenie komórek osiągnie 8 x 105 komórek/ml.
    UWAGA: Nie pozwól, aby stężenie komórek przekroczyło 1 x 106 komórek/ml i śledź numer przejścia. Unikaj używania komórek, które nie są w stanie przejść 25. Średni czas podwajania linii komórkowej THP-1 waha się w granicach 19-50 godzin. Określ czas podwajania partii komórek przed rozpoczęciem eksperymentów z fagocytozą. Pomoże to w przybliżeniu oszacować niezbędną ilość kultury potrzebną do zbadania określonej liczby próbek surowicy (np. w przypadku pełnej płytki 96-dołkowej potrzeba 10 ml kultury o wymiarach 5 x 105 komórek/ml).
  2. Okresowo sprawdzaj komórki THP-1 pod kątem ekspresji powierzchniowej receptorów Fcγ I (CD64), II (CD32) i III (CD16), jak opisano wcześniej15.
    1. Krótko mówiąc, wybarwić komórki THP-1 (oddzielnie) przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie anty-CD64, anty-CD32 i anty-CD16 (tabela materiałów) przez 30 minut w temperaturze pokojowej (rozcieńczenie 1:100 przygotowane w 2% FBS w PBS).
    2. Przemyć trzykrotnie 2% FBS w PBS i zmierzyć zabarwienie powierzchni za pomocą cytometrii przepływowej.
      UWAGA: Komórki THP-1 są ujemne dla CD16 i dodatnie dla CD32 i CD64, jak wcześniej zgłoszono29,30 (Rysunek 1).
  3. Do testu fagocytozy należy ustawić kolbę do hodowli komórek THP-1 z 2,5 x 105 komórek/ml dzień przed eksperymentem, aby uzyskać około 5 x 105 komórek/ml w dniu testu.
    UWAGA: Upewnij się, że w dniu testu obecne jest 4-6 x 105 komórek/ml.

3. Test fagocytozy (Rysunek S1)

  1. Przed rozpoczęciem testu należy zablokować (>1 h) dwie okrągłodenne 96-dołkowe płytki (jedną do opsonizacji, a drugą do fagocytozy) przy użyciu 150 μl na studzienkę sterylnego 2% FBS w PBS.
    UWAGA: Oznacz płytkę 1 jako płytkę opsonizacyjną i używaj jej zarówno do barwienia bromkiem etydyny (EtBr), jak i opsonizacji. Oznacz płytkę 2 jako płytkę fagocytozy i użyj zarówno do posiewu komórek THP-1, jak i do etapu fagocytozy.
  2. Barwienie i opsonizacja pasożytów
    1. Pobrać zawiesinę IE przygotowaną w 1,6 i dostosować liczbę komórek do 3,3 x 107 IEs/ml, dodając pożywkę do hodowli pasożytów i EtBr, aby uzyskać końcowe stężenie 2,5 μg/ml (rozcieńczenie 1:40, z podstawowego roztworu 0,1 mg/ml).
      UWAGA: EtBr barwi DNA pasożyta, umożliwiając wykrycie za pomocą cytometrii przepływowej.
      UWAGA: EtBr jest mutagenem i działa drażniąco na skórę, oczy i drogi oddechowe. Stosuj odpowiednie zabezpieczenia i utylizuj odpady zgodnie z lokalnymi przepisami.
    2. Usunąć roztwór blokujący z jednej z 96 płytek dołkowych (płytki opsonizacyjnej), strzepując płytkę i usuwając nadmiar płynu z kawałka ręcznika.
    3. Dodać 30 μl do dołka zawiesiny IE przygotowanej powyżej w górnej połowie płytki. Pozostawić jedną studzienkę pustą i dodać 30 μl pożywki do hodowli pasożytów (bez IE do kontroli samego THP-1). (Rysunek S2A). Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem.
    4. Dodać 170 μl pożywki do hodowli pasożytów na studzienkę. Obracać płytkę o masie 500 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant, przesuwając płytkę nad odpowiednim pojemnikiem na odpady.
    5. Przemyć IE znakowane EtBr jeszcze dwa razy, używając 200 μl na studzienkę pożywki do hodowli pasożytów, obracając płytkę przy 500 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Supernatant z pierwszego prania można usunąć, przesuwając płytkę. Ostrożnie usunąć supernatant z drugiego płukania za pomocą pipety wielokanałowej, aby upewnić się, że cała objętość medium myjącego została usunięta. Nie naruszaj pelletu.
    6. Ponownie zawiesić IE znakowane EtBr w 30 μl roztworu przeciwciała/osocza/surowicy przygotowanego w żądanych stężeniach w pożywce do hodowli pasożytów.
    7. Zawsze dołączaj następujące kontrole (Rysunek S2B): kontrola bez kontroli komórek IEs/THP-1 (pożywka do hodowli pasożytów); kontrola bez przeciwciał lub osocza/surowicy (kontrola nieopsonizowana); kontrola pozytywna przy użyciu dostępnego w handlu królika przeciwciała przeciwko ludzkim erytrocytom w rozcieńczeniu 1:100 (patrz Tabela materiałów); dwie ujemne próby kontrolne osocza/surowicy w rozcieńczeniu 1:5 (pula nieleczona wcześniej malarią i pula mężczyzn narażonych na malarię); oraz dodatnia kontrola surowicy w rozcieńczeniu 1:5 (pula od kobiet narażonych na malarię, które wcześniej były w ciąży (najlepiej multigravidae).
      UWAGA: Rozcieńczenie 1:100 dla kontroli pozytywnej wydaje się działać spójnie w różnych partiach zakupionego przeciwciała (dane nie pokazane). Zaleca się jednak wykluczenie różnic między partiami poprzez testowanie kilku rozcieńczeń za każdym razem, gdy stosuje się nową partię przeciwciał.
    8. Inkubować przez 45 minut w ciemności w temperaturze 37 °C.
  3. Przygotowanie komórek THP-1 i fagocytoza
    1. Podczas gdy IE są opsonizowane (3.2.8), zacznij przygotowywać komórki THP-1.
    2. Wyjąć komórki THP-1 z kolby hodowlanej, odwirować je (500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej), zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce do hodowli komórek THP-1.
    3. Ponownie odwirować (500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej), zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki do hodowli komórek THP-1.
    4. Oznaczyć liczbę komórek w roztworze przygotowanym powyżej i dodać więcej pożywki, aby uzyskać końcowe stężenie 5 x 105 komórek/ml.
    5. Usuń roztwór blokujący z pozostałej płytki 96-dołkowej (płytki fagocytozy), przesuwając płytkę i usuwając nadmiar płynu na kawałek ręcznika.
    6. Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej THP-1 przygotowanej w 3.3.4 na studzienkę i umieścić z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych (Rysunek S2C).
    7. Po zakończeniu czasu inkubacji przeciwciała/osocza/surowicy dodać 170 μl pożywki do hodowli pasożytów na studzienkę. Obracać płytkę o masie 500 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant, przesuwając płytkę nad odpowiednim pojemnikiem na odpady.
    8. Przemyć opsonizowane IE jeszcze dwa razy, używając 200 μl na studzienkę pożywki do hodowli pasożytów, obracając płytkę o masie 500 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Supernatant z pierwszego prania można usunąć, przesuwając płytkę. Ostrożnie usunąć supernatant z drugiego płukania, używając pipety wielokanałowej, aby upewnić się, że cała objętość medium myjącego została usunięta. Nie naruszaj pelletu.
    9. Na koniec ponownie zawiesić opsonizowane IE w 100 μl wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórek THP-1. Przenieś 50 μl opsonizowanej zawiesiny IE do każdej studzienki na płytce fagocytozy. Ponieważ w sumie jest 100 μl IEs, każde rozcieńczenie przeciwciała/surowicy można przeprowadzić w dwóch egzemplarzach na płytce fagocytozy (Rysunek S2D)
      UWAGA: Ilość komórek IE i THP-1 użytych w teście odpowiada stosunkowi 10:1.
    10. Inkubować przez 40 minut w ciemności w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
      UWAGA: Nie pozwól, aby fagocytoza postępowała dłużej niż 40 minut.
    11. Zatrzymać fagocytozę przez odwirowanie w temperaturze 4 °C (500 x g, 5 min) i wyrzucić supernatant, przesuwając płytkę. Dodać 150 μl roztworu lizy chlorku amonu o temperaturze pokojowej (tabela materiałów) i wymieszać pipetując, inkubować dokładnie przez 3 minuty
      UWAGA: Ten etap spowoduje lizę erytrocytów, które nie zostały fagocytozowane przez komórki THP-1.
    12. Zatrzymaj lizę, dodając 100 μl lodowatego 2% FBS do PBS. Odwirować płytkę w temperaturze 4 °C (500 x g przez 3 min) i usunąć supernatant, przesuwając płytkę nad odpowiednim pojemnikiem na odpady.
    13. Umyć trzykrotnie, używając 200 μl na studzienkę lodowatego 2% FBS w PBS, obracając płytkę w temperaturze 4°C (500 x g przez 3 min). Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić w 200 μl lodowatego 2% FBS w PBS i natychmiast przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej.
      UWAGA: W poprzednich publikacjach stosowano utrwalanie komórek w 2% paraformaldehydzie przed cytometrią przepływową31, ale przedstawione tutaj wyniki uzyskano natychmiast po zakończeniu testu. Nie zaleca się odkładania pozyskiwania danych z cytometrii przepływowej poprzez przechowywanie płytki w temperaturze 4°C, ponieważ odsetek komórek EtBr + THP-1 szybko się rozpada (Rysunek S3).
  4. Akwizycja i analiza cytometrii przepływowej
    UWAGA: Można użyć dowolnego cytometru przepływowego obsługującego format płytki 96-dołkowej i posiadającego odpowiednie lasery/filtry do pomiaru fluorescencji EtBr.
    1. W celu akwizycji, bramka na komórkach THP-1 za pomocą liniowego wykresu rozproszenia do przodu (FSC) w porównaniu z liniowym rozrzutem bocznym (SSC) przy użyciu studzienek, w których nie dodano żadnych IE (Rysunek 2A) i uzyskaj 10 000 zdarzeń na tej bramce.
    2. Zmierz intensywność fluorescencji dla EtBr (FL3-Log) na bramce THP-1 za pomocą wykresu histogramu.
    3. W przypadku bramkowania, pierwsza bramka na komórkach THP-1 na wykresie gęstości FSC vs. SSC, przy użyciu studzienek, w których nie dodano żadnych IE (Rysunek 2A). Następnie ustaw bramkę dodatnią na histogramie FL3 (EtBr), używając komórek THP-1 (bez dodanych IE) i nieopsonizowanej kontroli (Rysunek 2B).
    4. Skopiuj te bramki we wszystkich innych próbkach testowanych na tej samej płytce i określ procent komórek THP-1 EtBr-dodatnich (komórek THP-1, które mają fagocytację co najmniej jednego IE). Dla każdej z badanych próbek fagocytozę można podać jako wartości bezwzględne (procent komórek EtBr+ THP-1) lub jako względną fagocytozę obliczoną jako procent, przy użyciu kontroli dodatniej jako maksimum.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy szczegółowo przedstawiamy protokół, który został wcześniej opisany31 i wykorzystany11,12,13,14,15,16,17,18 do pomiaru zdolności przeciwciał skierowanych przeciwko powierzchni IEs P. falciparum do indukowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół został wcześniej opisany i wykorzystany 12,15,17,31 do pomiaru zdolności przeciwciał skierowanych na powierzchnię IE P. falciparum do indukowania opsonizacji i fagocytozy przez komórki THP-1. Zaprezentowane wyniki koncentrują się na naturalnie nabytych przeciwciałach swoistych dla VAR2CSA w osoczu/surowicy kobiet żyjących w regionie endemicznym P. falci...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Maiken Visti dziękuje za doskonałą pomoc techniczną. Praca ta została częściowo sfinansowana z grantu (MAVARECA II; 17-02-KU) Ministerstwa Spraw Zagranicznych Danii i była zarządzana przez Danida Fellowship Centre. Grantodawca nie odgrywał żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowywaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych, okrągłe dno z pokrywkąCorning3799Można użyć dowolnej podobnej płytki, upewnij się, że jest ona kompatybilna z cytometrem przepływowym, którego zamierzasz używać
AlbuMAX-IIGibco11021-037
AlbuMAX-II (5%)--5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0,2 g / L hipoksantyny (Sigma, H9377) w RPMI1640 (Sigma, R5886)
Anty-czerwone krwinki przeciwciałoAbcamab34858Przygotuj 2μ l podwielokrotności i zamrażać -20°C. Użyj jednej porcji na eksperyment.
DPBSSigmaP8622
Dynabeads Protein GInvitrogen10003D
Roztwór bromku etydynySigmaE1510Przygotować roztwór podstawowy o sile 0,1 mg/ml w RPMI1640 (R5886). Przechowywać w bezpiecznym miejscu przed światłem
Cytometr przepływowy FC500Beckman CoulterMożna użyć dowolnego cytometru przepływowego obsługującego format płytki 96-dołkowej i posiadającego odpowiednie lasery/filtry do pomiaru fluorescencji EtBr.
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco10099-141Unieszkodliwić na gorąco przed użyciem.
Mysz FITC anty-ludzka CD16BD Biosciences555406 lub 556618
Mysz FITC anty-ludzka CD32BD Biosciences552883
Mysz FITC anty-ludzka CD64BD Oprogramowanie FlowLogic
TechnologieInivaiMożna zastosować dowolną analizę cytometrii przepływowej, na przykład FlowJo lub Winlist
Gentamycyna (10 mg / ml)SigmaG1272
HipoksantynaSigmaH9377
L-glutamina (200mM)SigmaG7513
Roztwór lizujący--15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA
MACS CS Kolumna CS i akcesoriaMiltenyi Biotec130-041-305
Pożywka do hodowli pasożytów--2mM L-glutamina (Sigma, G7513), 50&mikro; g / ml gentamycyny (Sigma, G1272), 0,5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) w RPMI1640 (Sigma, R5886)
Penicylina / Streptomycyna (10000 U i 10 mg / ml)SigmaP0781
RPMI-1640 pożywkaSigmaR5886
THP-1 pożywkahodowlana - 10% FBS (Gibco, 10099-141), 2 mM L-glutamina (Sigma, G7513), 100 U / ml penicylina, 0,1 mg / ml Streptomycyna (Sigma, P0781) w RPMI1640 (Sigma, R5886)
Magnes Vario MACSMiltenyi Biotec
555527

Bibliografia

  1. World Health Organization. World Malaria Report - 2018. World Health Organization. , (2018).
  2. Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).
  3. Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development. International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).
  4. Staalsoe, T., et al. Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria. Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).
  5. Feng, G., et al. Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy. The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).
  6. Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria. Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).
  7. Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks. Immunology & Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).
  8. Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).
  9. Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes. The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).
  10. Jaworowski, A., et al. Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).
  11. Ataíde, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes. PLoS One. 6 (7), 22491(2011).
  12. Ghumra, A., et al. Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum. PloS One. 6 (1), 0016414(2011).
  13. Ghumra, A., et al. Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites. PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665(2012).
  14. Chan, J. A., et al. Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity. J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).
  15. Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1α domain. Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).
  16. Chan, J. A., et al. A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies. Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).
  17. Quintana, M. P., et al. Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface. Scientific Reports. 8 (1), 3262(2018).
  18. Hommel, M., et al. Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays. Parasites & Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).
  19. Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites. Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).
  20. Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).
  21. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
  22. Barfod, L., et al. Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA. Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).
  23. Staalsoe, T., et al. In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children. Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).
  24. Chan, S., et al. Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor. Nature Microbiology. 2, 17068(2017).
  25. Barfod, L., et al. Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).
  26. Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. Methods in Malaria Research. , MR4/ATCC. Manassas, Virginia. (2013).
  27. WHO. Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide. World Health Organization. , (1991).
  28. Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  29. Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl. Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).
  30. Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells. Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).
  31. Ataíde, R., et al. Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria. PloS One. 5 (5), 10807(2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Test fagocytozyzakażone erytrocytyprzeciwciała VAR2CSAkomórki THP-1test opsonizacjiodporność zależna od przeciwciałmalaria łożyskowareceptory Fc gamma
Pomiar naturalnie nabytych przeciwciał indukujących fagocytozę przeciwko pasożytom Plasmodium falciparum za pomocą testu opartego na cytometrii przepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.