Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model niedoczynności wypieracza u szczurów za pomocą przecięcia stożka medullaris

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61576

⸱

28 sierpnia 2020

 ,  ,  , 
1Department of Urology, Beijing YouAn Hospital, Capital Medical University, 2Department of Urology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy metodę tworzenia modelu niedoczynności wypieracza przez przecięcie stożka rdzenia u szczurów. U tych zwierząt skutecznie stymulowano niedoczynność wypieracza. Model może być wykorzystany do badania funkcji dróg moczowych.

Streszczenie

Celem przedstawionego protokołu było ustanowienie modelu niedoczynności wypieracza (DU) u szczura poprzez przecięcie stożka rdzenia. Laminektomię wykonano łącznie u 40 samic szczurów rasy Wistar (grupa kontrolna: 10 szczurów; grupa badana: 30 szczurów) o masie 200–220 g, a stożek rdzenia został przecięty na poziomie L4–L5 w grupie badanej. Wszystkie szczury były trzymane i karmione w tych samych warunkach środowiskowych przez sześć tygodni. W grupie badanej oddawanie moczu wykonywano dwa razy dziennie przez sześć tygodni i rejestrowano średnią resztkową objętość moczu. W obu grupach wykonano cystometrogram. Zarejestrowano i obliczono maksymalną pojemność cystometryczną (MCC), ciśnienie otwarcia wypieracza (DOP) oraz podatność pęcherza moczowego. Grupa badana wykazała znaczne zatrzymanie moczu po operacji, zarówno w trakcie, jak i po wstrząsie rdzeniowym. Nie zaobserwowano jednak żadnych nieprawidłowości w grupie kontrolnej. W porównaniu z grupą kontrolną, MCC i podatność pęcherza moczowego w grupie badanej były istotnie wyższe niż w grupie badanej (3,24 ± 2,261 ml w porównaniu z 1,04 ± 0,571 ml; 0,43 ± 0,578 mL/cmH2O w porównaniu z 0,032 ± 0,016 mL/cmH2O), natomiast DOP w grupie badanej był niższy niż w grupie kontrolnej (20,28 ± 14,022 cmH2O w porównaniu z 35 ± 13,258 cmH2Ta metoda tworzenia zwierzęcego modelu DU przez przecięcie stożka rdzenia stanowi doskonałą okazję do lepszego zrozumienia patofizjologii DU.

Wprowadzenie

Niedźwiedź wypieracza (DU) to typowa dysfunkcja dolnych dróg moczowych, która pozostała niedostatecznie zbadana. Mimo że DU został zdefiniowany przez Międzynarodowe Towarzystwo Kontynencji (ICS)1, w odniesieniu do tej choroby używa się wielu różnych terminologii, np. "awaria wypieracza", "pęcherz skurczowy", "refleksja wypieracza"2. DU, zgodnie z definicją Międzynarodowego Towarzystwa Kontynencji (ICS) z 2002 roku, to skurcz o zmniejszonej sile i czasie trwania, który powoduje wydłużenie czasu opróżniania pęcherza, co skutkuje niemożnością osiągnięcia całkowitego opróżnienia pęcherza w normalnym czasie.

DU może wystąpić u 48% mężczyzn i 12% kobiet (w wieku >70 lat)3 z objawami ze strony dolnych dróg moczowych. Wydaje się, że jest wieloczynnikowy i nie istnieje żadne skuteczne leczenie. Doniesiono, że DU jest wszechobecny u pacjentów z neurogenną dysfunkcją pęcherza moczowego, taką jak stwardnienie rozsiane4, diabetes mellitus5, choroba Parkinsona6, lub udar mózgu7. DU może być również spowodowany jatrogennym uszkodzeniem nerwów, takim jak laparoskopowa histerektomia, prostatektomia lub inne interwencje chirurgiczne w miednicy małej8. Zmiany patofizjologii i dostępne metody leczenia DU są nadal mylące z powodu braku odpowiedniego modelu zwierzęcego do badań.

Odruch mikcji jest kontrolowany przez szlaki rdzeniowo-opuszkowo-rdzeniowe, które łączą centrum mikcji mostu, krzyżowe jądro przywspółczulne i starsze centra kory mózgowej9. Aktywacja i utrzymanie odruchu mikcji zależy głównie od regularnego transportu sygnałów czuciowych z pęcherza moczowego do starszych ośrodków kory mózgowej. Można postulować, że dysfunkcja sensoryczna przyczynia się do DU.

Większość eksperymentalnych badań na zwierzętach związanych z dysfunkcjami dolnych dróg moczowych skupiała się na modelach pęcherza nadreaktywnego (OAB)10. Modele te zapewniają rozsądne zrozumienie patofizjologii i rokowania OAB. Jednak zgłoszono tylko kilka modeli DU, np. uraz nadrdzeniowy (zmiany miejscowe, decerebracja i niedrożność tętnicy środkowej mózgu), przecięcie rdzenia kręgowego lub uszkodzenie stłuczenia, ogólnoustrojowe (np. cyklofosfamid) lub dopęcherzowe podawanie czynników drażniących lub zapalnych (np. kwasu, akroleiny i lipopolisacharydu)11,12,13,14. Spośród tych metod, tylko metoda przecięcia rdzenia kręgowego lub uszkodzenia stłuczenia może być wykorzystana do ustalenia modelu zwierzęcego DU13. Próby uszkodzenia ośrodka mikcji mostu i ośrodków kory wyższej zostały zaniechane z powodu ciężkiego urazu. W związku z tym zwraca się większą uwagę na znalezienie dokładnej lokalizacji w ośrodku odruchu mikcji, aby wywołać DU przy minimalnych skutkach ubocznych.

Jak wspomniano wcześniej, jednym z mechanizmów indukowania DU jest uszkodzenie rdzenia kręgowego w celu uszkodzenia szlaku sygnałowego odruchu mikcji. Metoda zmniejszania masy ciała Allena została opracowana w celu ustalenia zwierząt laboratoryjnych z uszkodzonym rdzeniem kręgowym15. Nie ma jednak dostępnych dalszych danych doświadczalnych dotyczących tej metody. Co więcej, ponieważ część zwierząt odzyskała funkcję kręgosłupa po udarze bez DU, nie można jej uznać za idealną metodę generowania modelu zwierzęcego DU16.

W 1987 roku Bregman opracował proces transekcji rdzenia kręgowego w celu wygenerowania modelu zwierzęcego DU i zebrał dane eksperymentalne17. Niemniej jednak metoda ta nie została zastosowana do ustalenia modelu zwierzęcego DU. W tym czasie naukowcy nadal byli zdezorientowani co do patogenezy DU. Ponieważ miejsca w rdzeniu kręgowym związane z indukcją OAB lub DU sąsiadują ze sobą, nie byli w stanie znaleźć dokładnego miejsca uszkodzenia rdzenia kręgowego, aby wywołać DU17. OAB i DU zostały wprowadzone razem lub oddzielnie tą metodą. Tak więc, chociaż metoda ta wprowadziła DU, była nieprecyzyjna i nie mogła być wykorzystana do zrozumienia występowania i przetwarzania DU.

Jak stwierdzono powyżej, brak odpowiedniego modelu zwierzęcego DU jest jedną z głównych przeszkód w badaniu DU. Naukowcy nieustannie poszukują dokładnego i łatwego do opanowania modelu, który mógłby symulować patologię DU. Nawet możliwości leczenia DU nie uległy znaczącej poprawie w ciągu ostatnich 20 lat. Podsumowując, istnieje ogromna potrzeba opisania standardowego protokołu ustanawiania zwierzęcego modelu DU.

Więc, w tym artykule, opisujemy metodę skutecznego ustanowienia szczurzego modelu DU poprzez przecięcie stożka rdzeniowego. Przekrój przeprowadzono na poziomie L4\u2012L5 w celu oddzielenia stożka rdzenia. Maksymalna pojemność cystometryczna (MCC), ciśnienie otwarcia wypieracza (DOP) i zgodność pęcherza zostały zarejestrowane i przeanalizowane w celu walidacji protokołu. Poniższy protokół łączy w sobie zarówno wykonalność, jak i niezawodność w ustandaryzowany sposób w celu ustalenia modelu zwierzęcego DU, symulującego występowanie i przetwarzanie DU. Protokół może być wykorzystany jako technika do dalszych badań nad DU.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie szczury zostały wykorzystane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Doświadczalny ds. Zwierząt Szpitala Przyjaźni w Pekinie, Stołecznego Uniwersytetu Medycznego.

1. Przygotowanie chirurgiczne, znieczulenie i techniki chirurgiczne

UWAGA: Do niniejszego badania uzyskano łącznie 40 samic szczurów rasy Wistar, ważących 200–220 g. Spośród 40 szczurów, 10 zostało losowo wybranych jako grupa kontrolna, a reszta została potraktowana jako grupa testowa. Wszystkie zwierzęta były trzymane w sterylnym środowisku w obiektach dla zwierząt Beijing Friendship Hospital Stołecznego Uniwersytetu Medycznego.

  1. Znieczulenie ogólne należy przeprowadzić, podając pentobarbital sodu dootrzewnowo (40 mg/kg). Alternatywnie, wywołać znieczulenie za pomocą 3%-4% izofluranu i utrzymać go na poziomie 1%-3% (wziewnie). Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie umieść szczura na platformie chirurgicznej i zapewnij wsparcie termiczne.
    UWAGA: Na początku zabiegu należy podać leki przeciwbólowe, takie jak buprenorfina, 0,05 mg/kg, SC, 0,1-0,2 ml.
  2. Sprawdź głębokość znieczulenia przez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi. Ogol futro z całej tylnej części za pomocą brzytwy.
  3. Wysterylizuj miejsce operacyjne za pomocą co najmniej 3 cykli dwuetapowego peelingu, takiego jak chlorheksydyna lub jod powidonu, a następnie alkohol izopropylowy. Zabezpiecz kończyny taśmą chirurgiczną i wykonaj środkowe nacięcie około 3 cm na plecach nożyczkami chirurgicznymi.
  4. Pogłęb nacięcie przez tkanki podskórne za pomocą nożyczek chirurgicznych i odetnij mięśnie przyczepione do kręgosłupa.
  5. Wizualnie zidentyfikuj i odsłoń 13. żebro (przestrzeń międzykręgowa połączona z tym żebrem to interwał T13\u2012L1). Zaznacz 13. żebro za pomocą szwu.
  6. Po identyfikacji należy ostrożnie wyciąć mięśnie przyczepione do kręgosłupa i odsłonić kręgosłup. Wytnij więzadło nadkolcowe i więzadło międzykolcowe, aby uzyskać dokładną identyfikację kręgosłupa. Eksponuj poziom L4\u2012L5 za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy.
    UWAGA: Więzadło nadkolcowe można łatwo zidentyfikować ze względu na obecność cienkiej tkanki podskórnej. Po resekcji więzadła nadkolcowego więzadło między wyrostkiem kolczystym jest więzadłem międzykolcowym.
  7. Ostrożnie wypreparuj wyrostek kolczysty kręgów L4\u2012L5 i części wyrostka poprzecznego za pomocą kleszczy Kelly'ego, aby odsłonić rdzeń kręgowy (Rysunek 1).
  8. Całkowicie odsłonić stożek rdzenia na poziomie L4\u2012L5 i całkowicie przeciąć stożek rdzenia za pomocą nożyczek do irydektomii. Włóż trochę tkanki, aby zablokować regenerację rdzenia kręgowego.
  9. Zamknij leżące mięsień i skórę na zewnętrznej warstwie skóry za pomocą niewchłanialnego szwu 4-0.
  10. W przypadku grupy kontrolnej wykonaj kroki 1.1\u20121.7 i pozostaw stożek rdzenia nienaruszony. Zamknij nacięcie zgodnie z krokiem 1.9.

2. Odzyskiwanie zwierząt

  1. Szczury należy przechowywać w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze (37 °C) przez pierwszą godzinę po operacji i monitorować je do momentu, gdy osiągną poziom mostka lub będą się aktywnie poruszać.
    UWAGA: Całkowite odzyskanie zajmuje około pół godziny.
  2. Przenieś zwierzę do czystej klatki z wystarczającą ilością jedzenia i wody. Trzymaj szczury w oddzielnych klatkach.
    UWAGA: Powodzenie transsekcji jest wskazane, gdy szczury w grupie testowej poruszają się tylko za pomocą kończyn przednich, podczas gdy szczury w grupie kontrolnej mogą chodzić normalnie.

3. Zarządzanie po operacji

  1. Wstrzyknąć dootrzewnowo penicylinę G, antybiotyk (50 000 j./ml na zwierzę). Podawać leki przeciwbólowe, takie jak buprenorfina, 0,05 mg/kg, SC, 0,1-0,2 ml co 6-12 godzin przez 48 godzin po operacji.
  2. Ściskaj pęcherz moczowy na podbrzuszu, aby pomóc w oddawaniu moczu. Wykonuj to dwa razy dziennie o tej samej porze (8 rano i 8 wieczorem) przez sześć tygodni.
    UWAGA: Utrata normalnego zwężenia wypieracza jest symbolem DU.
  3. Umieść wszystkie szczury w klatkach metabolicznych, z których każda zawiera lejek do zbierania moczu umieszczony na wcześniej zważonym papierze chłonnym w celu monitorowania mikcji i nietrzymania moczu.
  4. Zbierz i zanotuj osobno zmianę masy papieru chłonnego, która wskazuje objętość mikcji (VV) i objętość zalegającego moczu.

4. Badania urodynamiczne

  1. Po sześciu tygodniach od operacji należy wykonać cystometrogram przy użyciu sprzętu do pomiaru urodynamicznego w następujący sposób.
    1. Znieczulenie szczurów należy poprzez wstrzyknięcie 10% hydratu chloralu do jamy otrzewnej (3 ml/kg).
    2. Ściśnij pęcherz w celu opróżnienia mikcji, a następnie przymocuj szczura do platformy chirurgicznej za pomocą taśmy.
    3. Wprowadzić cewnik zewnątrzoponowy (3F) do pęcherza moczowego i podłączyć urodudynamiczne urządzenie pomiarowe, cewnik zewnątrzoponowy i pompę infuzyjną za pomocą rurki trójramiennej.
    4. Pompować sól fizjologiczną z prędkością 0,2 ml/min do pomiaru urodynamicznego (patrz Tabela materiałów). Zapisz MCC i DOP oraz zgodność pęcherza (obliczone δ podzielenie objętości pęcherza przez nacisk δ wypieracza).

5. Analiza statystyczna

  1. Wykonuj analizy statystyczne za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania.
  2. Użyj testu Kołmogorowa-Smirnowa, aby przetestować normalność danych.
  3. Zmienne o rozkładzie normalnym należy wyrazić jako wartości średnie z odchyleniami standardowymi. Użyj dwustronnych sparowanych testów t-Studenta, aby porównać parametry cystometrogramu w obu grupach.
    UWAGA: p < 0,05 wskazuje, że różnica miała istotność statystyczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Cała procedura przecięcia stożka rdzeniowego może zostać wykonana w ciągu 45 min przez doświadczonych chirurgów. Nasze laboratorium przeprowadziło ponad 10 przypadków operacji przecięcia stożka rdzeniowego. Współczynnik sukcesu wynosi ponad 95%, definiowany przez przeżywalność szczurów i skuteczną indukcję DU. Badanie urodynamiczne potwierdziło indukcję DU.

W oparciu o nasze doświadczenie, indukcję DU można wstępnie ocenić na podstawie objętości moczu resztkowego. Zatrzymanie moczu zaobserwowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

DU jest częstą przyczyną objawów ze strony dolnych dróg moczowych zarówno u mężczyzn, jak i kobiet. Jest to złożona konstelacja objawów z niewielką liczbą opcji leczenia, które mogą znacznie obniżyć jakość życia (Qol) osób dotkniętych chorobą18. Chociaż uważa się, że DU jest wieloczynnikowy, zrozumienie jego patogenezy pozostaje szczątkowe. Badania wykazały, że patogeneza DU może być związana z czynnikami miogennymi i neurogennymi.

W hipotezach miogennych zaobserwowano,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% sól fizjologicznaPompa Wuhan Prosai CompanyEY-C1178do pomiaru urodynamicznego
10% hydrat chloraluShandong Yulong Co., LtdH370226733 ml / kg, podawany dootrzewnowo
Chlorowodorek buprenorfiny do wstrzykiwańTianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co. LTDH120202750,05 mg / kg podskórnie 24 godziny i 48 godzin po operacji
Cewnik zewnątrzoponowyShandong Xinghua Co, LtdVABR3Ldo pomiaru urodynamicznego
Penicylina GAlta Technology Co., Ltd1ST563750 000 jednostek/ml na zwierzę
pentobarbitalBeijing solabo Technology Co., LtdNK-WF000140 mg / kg, podawany dootrzewnowo
Linia do szycia (4-0)ETHICONVCP422Hzszycia urazu
Rurka trójramiennaShandong Xinghua Co, LtdVAB3Tdo pomiaru urodynamicznego
Śladowa pompa infuzyjnaZhejiang Smith Medical Instrument Co., Ltd20162540335Pompuj sól fizjologiczną z prędkością 0,2 ml / min do pomiaru urodynamicznego
Sprzęt do pomiaru urodynamicznegoMedical Measurement SystemsB.V.08-0467Uroddynamiczny sprzęt pomiarowy może nie tylko pomóc w diagnozie dyzurii, ale także dostarczyć obiektywnych materiałów do leczenia i efektu terapeutycznego. Jest to najczęściej stosowana metoda badania w diagnostyce klinicznej i leczeniu chorób funkcjonalnych dolnych dróg moczowych
Wistar RatsHFK Biotechnology Co., Ltd, Pekin, ChinySCXK2012-0023200-220g

Bibliografia

  1. van Koeveeringe, G. A., et al. Detrusor underactivity: Pathophysiological considerations, models and proposals for future research. Neurourology and Urodynamics. 33 (5), ICI-RS 2013 591-596 (2014).
  2. Osman, N. I., Esperto, F., Chapple, C. R. Detrusor Underactivity and the Underactive Bladder: A Systematic Review of Preclinical and Clinical Studies. European Urology. 74 (5), 633-643 (2018).
  3. Osman, N. I., Chapple, C. R. Contemporary concepts in the aetiopathogenesis of detrusor underactivity. Nature Reviews. Urology. 11 (11), 639-648 (2014).
  4. Panicker, J. N., Nagaraja, D., Kovoor, J. M. E., Nair, K. P. S., Subbakrishna, D. K. Lower urinary tract dysfunction in acute disseminated encephalomyelitis. Multiple Sclerosis. 15 (9), Houndmills, Basingstoke, England. 1118-1122 (2009).
  5. Lee, W. C., Wu, H. P., Tai, T. Y., Yu, H. J., Chiang, P. H. Investigation of urodynamic characteristics and bladder sensory function in the early stages of diabetic bladder dysfunction in women with type 2 diabetes. The Journal of Urology. 181 (1), 198-203 (2009).
  6. Araki, I., Kitachara, M., Oida, T., Kuno, S. Voiding dysfunction and Parkinson’s disease: urodynamic abnormalities and urinary symptoms. The Journal of Urology. 164 (5), 1640-1643 (2000).
  7. Meng, N. H., et al. Incomplete bladder emptying in patients with stroke: is detrusor external sphincter dyssynergia a potential cause. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 91 (7), 1105-1109 (2010).
  8. FitzGerald, M. P., Brubaker, L. The etiology of urinary retention after surgery for genuine stress incontinence. Neurourology and Urodynamics. 20 (1), 13-21 (2001).
  9. Rahman, M., Siddik, A. B. Neuroanatomy, Pontine Micturition Center. StatPearls. , (2020).
  10. Wrobel, A., Lancut, M., Rechberger, T. A. A new model of detrusor overactivity in conscious rats induced by retinyl acetate instillation. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 74 (7), 16(2015).
  11. Rosenzweig, E. S., McDonald, J. W. Rodent models for treatment of spinal cord injury: research trends and progress toward useful repair. Current Opinion in Neurology. 17 (2), 121-131 (2004).
  12. Yoo, K. H., Lee, S. J. Experimental animal models of neurogenic bladder dysfunction. International Neurourology Journal. 14 (1), 1-6 (2010).
  13. Kanai, A., et al. Sophisticated models and methods for studying neurogenic bladder dysfunction. Neurourology and Urodynamics. 30 (5), 658-667 (2011).
  14. Nomiya, M., et al. Progressive vascular damage may lead to bladder underactivity in rats. The Journal of Urology. 191 (5), 1462-1469 (2014).
  15. Seki, T., Hida, K., Tada, M., Koyanagi, I., Iwasaki, Y. Graded contusion model of the mouse spinal cord using a pneumatic impact device. Neurosurgery. 50 (5), discussion 1081-1082 1075-1081 (2002).
  16. Yeo, S. J., et al. Development of a rat model of graded contusive spinal cord injury using a pneumatic impact device. Journal of Korean Medical Science. 19 (4), 574-580 (2004).
  17. Bergman, B. S. Spinal cord transplants permit the growth of serotonergic axons across the site of neonatal spinal cord transection. Brain Research. 431 (2), 265-279 (1987).
  18. Chancellor, M. B., et al. Underactive bladder; Review of progress and impact from the International CURE-UAB Initiative. International Neurourology Journal. 24 (1), 3-11 (2020).
  19. Pfisterer, M. H. D., Griffiths, D. J., Schaefer, W., Resnick, N. M. The effect of age on lower urinary tract function: a study in women. Journal of the American Geriatrics Society. 54 (3), 405-412 (2006).
  20. Duchen, L. W., Anjorin, A., Watkins, P. J., Mackay, J. D. Pathology of autonomic neuropathy in diabetes mellitus. Annals of Internal Medicine. 92 (2), 301-303 (1980).
  21. Schneider, T., Hein, P., Bai, J., Michel, M. C. A role for muscarinic receptors or rho-kinase in hypertension associated rat bladder dysfunction. The Journal of Urologoy. 173 (6), 2178-2181 (2005).
  22. Drake, M. J., Harvey, I. J., Gillespie, J. I., Van Duyl, W. A. Localized contractions in the normal human bladder and in urinary urgency. BJU International. 95 (7), 1002-1005 (2005).
  23. Suskind, A. M., Smith, P. P. A new look at detrusor underactivity: impaired contractility versus afferent dysfunction. Current Urology Reports. 10 (5), 347-351 (2009).
  24. Osman, N. I., et al. Detrusor underactivity and the underactive bladder: A new clinical entity? A review of current terminology, definitions, epidemiology, aetiology, and diagnosis. European Urology. 65 (2), 389-398 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model szczuraprocedura laminektomiiodsłonięcie rdzenia kręgowegobadania urodynamicznemaksymalna pojemność cystometrycznapodatność pęcherzaciśnienie otwarcia detrusoraretencja moczu
Model niedoczynności wypieracza u szczurów za pomocą przecięcia stożka medullaris
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.