Analiza danych SEC-SAXS za pomocą dekonwolucji i rozproszenia EFA

Podsumowanie

Pomiary makrocząsteczek biologicznych SEC-BioSAXS są standardowym podejściem do określania struktury roztworu makrocząsteczek i ich kompleksów. W tym miejscu analizujemy dane SEC-BioSAXS z dwóch typów powszechnie spotykanych śladów SEC - chromatogramów z pikami w pełni rozdzielczymi i częściowo rozdzielczymi. Demonstrujemy analizę i dekonwolucję za pomocą rozpraszania i BioXTAS RAW.

Streszczenie

BioSAXS to popularna technika używana w biologii molekularnej i strukturalnej do określania struktury roztworu, wielkości i kształtu cząstek, stosunku powierzchni do objętości oraz zmian konformacyjnych makrocząsteczek i kompleksów makromolekularnych. Wysokiej jakości zestaw danych SAXS do modelowania strukturalnego musi pochodzić z monodyspersyjnych, jednorodnych próbek, a często osiąga się to tylko poprzez połączenie chromatografii liniowej i natychmiastowego pomiaru SAXS. Najczęściej chromatografia wykluczająca wielkość jest stosowana do oddzielania próbek i wykluczania zanieczyszczeń i agregacji z cząstki będącej przedmiotem zainteresowania, co pozwala na wykonanie pomiarów SAXS na podstawie dobrze rozdzielonego piku chromatograficznego pojedynczego gatunku białka. Jednak w niektórych przypadkach nawet oczyszczanie w linii produkcyjnej nie gwarantuje próbek monodyspersyjnych, ponieważ wiele składników jest zbyt blisko siebie pod względem wielkości lub zmian kształtu wywołanych wiązaniem zmienia postrzegany czas elucji. W takich przypadkach możliwe jest zdekonwoluowanie danych SAXS mieszaniny w celu uzyskania wyidealizowanych krzywych SAXS poszczególnych składników. Tutaj pokazujemy, jak to się osiąga, a praktyczna analiza danych SEC-SAXS jest przeprowadzana na idealnych i trudnych próbkach. W szczególności pokazujemy analizę SEC-SAXS egzonukleazy polimerazy DNA krowianki E9 minus mutant.

Wprowadzenie

Makrocząsteczki biologiczne są zbyt małe, aby można je było zobaczyć nawet za pomocą najlepszych mikroskopów świetlnych. Obecne metody określania ich struktur zazwyczaj obejmują krystalizację białka lub pomiary na ogromnej liczbie identycznych cząsteczek w tym samym czasie. Podczas gdy krystalografia dostarcza informacji na poziomie atomowym, reprezentuje sztuczne środowisko próbki, biorąc pod uwagę, że większość makrocząsteczek nie jest prezentowana w komórce w postaci krystalicznej. W ciągu ostatnich kilku lat mikroskopia krioelektronowa dostarczyła podobnych struktur o wysokiej rozdzielczości dużych makrocząsteczek / kompleksów makromolekularnych, ale chociaż próbki są bliższe stanowi fizjologicznemu, nadal są zamrożone, a więc nieruchome i statyczne. Bio-małe kątowe rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego (BioSAXS) zapewnia pomiar strukturalny makrocząsteczki w warunkach istotnych dla biologii. Stan ten można zwizualizować jako kształt 3D o niskiej rozdzielczości określony w skali nanometrowej i obejmuje całą przestrzeń konformacyjną makrocząsteczki w roztworze. Eksperymenty BioSAXS skutecznie oceniają stan oligomeryczny, układy domenowe i złożone, a także elastyczność między domenami^1,2,3. Metoda jest dokładna, w większości nieniszcząca i zwykle wymaga jedynie minimalnego przygotowania próbki i czasu. Jednakże, aby uzyskać najlepszą interpretację danych, próbki muszą być monodyspersyjne. Jest to trudne; Cząsteczki biologiczne są często podatne na zanieczyszczenia, słabe oczyszczanie i agregację, na przykład w wyniku zamrażania, rozmrażania⁴. Opracowanie chromatografii inline, po której następuje natychmiastowy pomiar SAXS, pomaga złagodzić te skutki. Chromatografia wykluczania wielkości rozdziela próbki według wielkości, wykluczając w ten sposób większość zanieczyszczeń i agregacji^5,6,7,8,9,10. Jednak w niektórych przypadkach nawet SEC-SAXS nie wystarcza do wytworzenia próbki monodyspersyjnej, ponieważ mieszanina może składać się ze składników o zbyt zbliżonej wielkości lub ich właściwości fizyczne lub ich szybka dynamika prowadzą do nakładania się pików w śladzie SEC UV. W takich przypadkach programowy krok dekonwolucji uzyskanych danych SAXS może prowadzić do wyidealizowanej krzywej SAXS pojedynczego komponentu^5,11,12. Jako przykład w sekcji 2 protokołu pokazujemy standardową analizę SEC-SAXS egzonukleazy polimerazy krowianki E9 DNA minus mutant (egzo^minus E9) w kompleksie z DNA. Krowianka jest organizmem modelowym rodziny Poxviridae, zawierającej kilka patogenów, na przykład ludzki wirus ospy prawdziwej. Wykazano, że polimeraza ściśle wiąże się z DNA w podejściach biochemicznych, a struktura kompleksu została niedawno rozwiązana za pomocą krystalografii rentgenowskiej¹³.

Większość obiektów synchrotronowych zapewni zautomatyzowany potok przetwarzania danych, który przeprowadzi normalizację i integrację danych, tworząc zestaw nieodejmowanych ramek. Ale podejście opisane w tym manuskrypcie może być również stosowane ze źródłem laboratoryjnym, pod warunkiem, że zostanie przeprowadzony SEC-SAXS. Ponadto może być dostępna dodatkowa automatyzacja, która odrzuci ramki uszkodzone przez promieniowanie i wykona odejmowanie bufora¹⁴. W sekcji 2 pokażemy, jak przeprowadzić pierwotną analizę danych na wstępnie przetworzonych danych i jak najlepiej wykorzystać dostępne dane.

W sekcji 3 pokazujemy, jak dekonwolucjonizować dane SEC-SAXS i efektywnie analizować krzywe. Chociaż istnieje kilka metod dekonwolucji, takich jak dekonwolucja piku Gaussa, zaimplementowana w US-SOMO¹⁵ i zoptymalizowana metoda maksymalnego prawdopodobieństwa Guiniera, zaimplementowana w oprogramowaniu DELA¹⁶, zazwyczaj wymagają one modelu dla kształtu piku¹². Skończony rozmiar poszczególnych pików, które badamy, pozwala na wykorzystanie analizy czynników ewoluujących (EFA) jako ulepszonej formy dekompozycji wartości osobliwych (SVD) do dekonwolucji nakładających się pików, bez polegania na kształcie piku lub profilu rozpraszania^5,11. Implementację specyficzną dla SAXS można znaleźć w BioXTAS RAW¹⁷. EFA został po raz pierwszy użyty na danych chromatograficznych, gdy dane z matrycy diod 2D pozwoliły na utworzenie matryc z absorbancji w stosunku do czasu retencji i danych o długości fali¹⁸. Tym, co wyróżnia EFA, jest to, że skupia się na ewoluującym charakterze wartości pojedynczych, na tym, jak zmieniają się one wraz z pojawianiem się nowych komponentów, z zastrzeżeniem, że w akwizycji istnieje nieodłączny porządek¹⁰. Na szczęście dane SEC-SAXS dostarczają wszystkie niezbędne uporządkowane dane akwizycji w zorganizowanych tablicach danych 2D, co dobrze nadaje się do techniki EFA.

W sekcji 4 pokażemy podstawy analizy SAXS niezależnej od modelu na podstawie odjętej krzywej SAXS z odjętym tłem bufora. Analiza niezależna od modelu określa promień bezwładności cząstki (Rg), objętość korelacji (Vc), objętość Poroda (Vp) i wykładnik Poroda-Debye'a (PE). Analiza zapewnia półilościową ocenę stanu termodynamicznego cząstki pod względem zwartości lub elastyczności za pomocą bezwymiarowego wykresu Kratky'ego^2,4,19.

Na koniec, dane SAXS są mierzone w odwrotnych jednostkach przestrzeni i pokażemy, jak przekształcić dane SAXS w przestrzeń rzeczywistą, aby odzyskać funkcję rozkładu par odległości, P(r). Rozkład P(r) jest zbiorem wszystkich odległości znajdujących się w cząstce i obejmuje maksymalny wymiar cząstki, d_max. Ponieważ jest to pomiar termodynamiczny, rozkład P(r) reprezentuje przestrzeń fizyczną zajmowaną przez przestrzeń konformacyjną cząstek. Właściwa analiza zestawu danych SAXS może dostarczyć informacji o stanie roztworu, które uzupełniają informacje o wysokiej rozdzielczości z krystalografii i krio-EM.

Protokół

1. Ekspresja, oczyszczanie i pomiar SEC-SAXS są oparte na opublikowanym protokole¹³

1. Postępuj zgodnie z wbudowanym protokołem gromadzenia danych SEC-SAXS (Brennich et al.⁶) w skrócie.
   1. Zrównoważyć kolumnę SEC z co najmniej 2 objętościami kolumny buforu roboczego SEC (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl).
   2. Przygotować 50 μl próbki E9 exo^minus przy 8\u201210 mg/ml z 20% nadmiarem molowym częściowego dsDNA (TCAGGAAGATAACAGCGGTTTAGCC i GGCTAAACCGCTGTTATCTT). Egzo^minus E9 wiąże się z_{K D} 12 ± 6 nM (patrz dane uzupełniające).
   3. Wstrzyknąć 50 μl tej mieszaniny do kolumny SEC (S200 Increase) w linii z komórką przepływową w celu pomiarów SAXS przy 0,3 ml/min.
   4. Zbierz 1000 klatek z ekspozycją 1 s każda.
      UWAGA: Na linii badawczej BM29 BioSAXS, w Europejskim Ośrodku Synchrotronowym (ESRF) poszczególne klatki są przetwarzane automatycznie i niezależnie w ramach EDNA framework¹⁴. Po zebraniu danych otwórz bazę danych ISPyB²⁰ i w zakładce Pozyskiwanie danych naciśnij przycisk Go, aby uzyskać dostęp do zestawu danych i wyników automatycznej analizy²¹.
2. Pobierz dane.

2. Analiza danych pierwotnych

1. Otwórz oparty na Javie program Scatter IV (patrz tabela materiałów) i wykonaj odejmowanie tła dla danych chromatografii wykluczania wielkości (SEC).
   1. Otwórz zakładkę SEC. Przeciągnij i upuść zredukowane pliki danych (*.dat) do okna "Upuść dane poniżej". Ustaw katalog wyjściowy "Out Dir ::", klikając przycisk Output Dir oznaczony na niebiesko.
      UWAGA: Jeśli twoje dane zostały zebrane w ^nm-1, pole konwersji będzie musiało być zaznaczone (lewy dolny róg panelu) podczas upuszczania plików do okna lub zakładki odejmowania.
   2. Edytuj szczegóły eksperymentu, użyj przycisku Edytuj szczegóły i wypełnij jak najwięcej pól, w tym sekcje dotyczące źródła/linii badawczej użytej do zebrania danych, parametry zbierania i szczegóły próbki. Zostaną one zapisane wraz z danymi i pozwolą na łatwiejsze uzupełnienie sekcji "Parametry zbierania danych" w przyszłych publikacjach.
   3. Wprowadź nazwę przykładu w polu Zapisz jako. Kliknij TRACE.
      UWAGA: Ma to dwa skutki. Po pierwsze, utworzy plik *.sec dla danych. Jest to pojedynczy plik tekstowy, który zestawi wszystkie obserwacje eksperymentalne z oddzielnych plików *.dat. Ponadto plik *.sec zawiera uśredniony zestaw klatek, który jest tłem bufora, wszystkie klatki użyte w uśrednianiu, a także ramki odjęte przez tło bufora w całym eksperymencie SEC-SAXS. Po drugie, tworzony jest wykres sygnałowy, który wykreśla numer klatki w funkcji stosunku całki do tła. Pokazuje zaznaczone klatki (szare), które zostały uśrednione w celu odejmowania bufora. Punkty dla średniego bufora są wyznaczane na podstawie całego zakresu danych. Zaleca się jednak ręczny wybór ramek bufora do uśredniania, ponieważ źle zdefiniowane tło może wystąpić z powodu źle wyważonych lub brudnych kolumn lub zanieczyszczenia kapilarnego²².
   4. Ręczne zaznaczanie ramek bufora. Kliknij przycisk Wyczyść, a następnie ponownie wybierz region bufora, przeciągając lewym przyciskiem myszy na krzywej śledzenia. Idealnie byłoby, gdyby był to płaski obszar przed pustą objętością kolumny SEC wynoszącą około 100 klatek. Kliknij USTAW BUFOR, a następnie Aktualizuj, aby ponownie obliczyć plik *.sec, co może potrwać kilka minut.
   5. Zidentyfikuj obszar zainteresowania (ROI). Na wykresie sygnału wybierz obszar interesującego Cię szczytu, przeciągając lewym przyciskiem myszy.
      UWAGA: Spowoduje to wypełnienie trzech wykresów w panelu po prawej stronie. Dwa górne wykresy są połączone krzyżykiem przechodzącym między nimi, drugi wykres sygnału (u góry po prawej) pokazuje tylko wybrany zwrot z inwestycji, z intensywnością każdej klatki w kolorze niebieskim i odpowiadającym jej Rg każdej klatki w kolorze czerwonym oraz odpowiednią mapą cieplną poniżej, pokazującą reszty dla każdej klatki pokolorowane zgodnie z analizą automatycznej korelacji Durbina-Watsona. Obszary o wysokim podobieństwie są zabarwione na niebieskozielony (Durbin-Watson, d = 2), podczas gdy odmienne ramki będą podążać za ciemniejszymi niebieskimi do różowych i ostatecznie do czerwonych, w zależności od nasilenia odmienności (d > 2). Dolny wykres to odjęta krzywa I w funkcji q dla środkowej wybranej klatki (również oznaczona linią pionową). strzałek mogą być używane do poruszania się po odjętych ramkach. Wykres I w kontra q pokaże jakość odjętych ramek z eksperymentu SEC.
   6. Zaznacz ramki do scalenia. Kliknij krzyżyk nitkowy na wykresie mapy skupień, aby wybrać podzbiór klatek, które zostaną użyte do scalenia. Celownik identyfikuje trójkątny obszar z przewagą cyjanu, który wypada na dolną prawą stronę celownika. Kliknij myszką, aby ustawić te klatki jako zaznaczone i podświetlić klatki w odpowiednim obszarze wykresu Sygnał powyżej. Te ramki powinny idealnie podkreślać region o stabilnym Rg.
      UWAGA: W razie potrzeby powiększ mapę cieplną, przeciągając lewym przyciskiem myszy i pomniejsz, przesuwając lewym przyciskiem myszy w prawo.
   7. Jeśli wybrane ramki są zadowalające, kliknij przycisk SCAL. Spowoduje to scalenie odjętych ramek i zaprezentowanie ich w zakładce ANALIZA.

3. Dekonwolucja danych

1. Otwórz program do dekonwolucji (np. BioXTAS Raw 2.0.0).
2. W programie do dekonwolucji załaduj zestaw danych, na karcie Pliki w Panelu sterowania użyj symbolu foldether, aby zlokalizować dane lub skopiuj i wklej lokalizację w pasku adresu.
   UWAGA: Upewnij się, że folder zawiera tylko nieprzetworzone pliki *.dat i nie zawiera plików danych przetworzonych lub średnich.
3. Zaznacz wszystkie pliki *.dat, naciśnij przycisk Plot Series, wykres o zintegrowanej intensywności w funkcji numeru klatki zostanie narysowany w "Wykresie serii".
4. W Panelu sterowania wybierz kartę Serie, a następnie kliknij, aby podświetlić krzywą. Otwórz wyskakujące okno Analiza LC za pomocą przycisku znajdującego się u podstawy panelu sterowania. To okno daje dostęp do kilku opcji, takich jak wybór różnych typów cząsteczek (białka lub RNA). Pozwala również użytkownikowi wybrać region buforowy dla wykresu. W pierwszym przypadku kliknij Auto; powinno to wybrać odpowiedni region bufora.
   UWAGA: Jeśli to się nie powiedzie, prawdopodobnie z powodu niestabilnej linii bazowej, wybierz opcję "Dodaj region", aby zoptymalizować region bufora. Spowoduje to wypełnienie pola Bufor mniejszym polem, w którym można ręcznie dodać numery ramek, które mają być używane dla bufora. Alternatywnie kliknij "Wybierz", aby dać możliwość wyboru obszaru na działce. Zlokalizuj obszar, kliknij raz lewym przyciskiem myszy, aby ustawić pozycję początkową, przesuń kursor do następnej pozycji i ponownie kliknij lewym przyciskiem myszy. Może być konieczne dodanie więcej niż jednej lokalizacji bufora. Kliknij Ustaw bufor, a krzywe zostaną odjęte, a Rg obliczone w poprzek piku SEC. Jeśli pojawi się wyskakujące okienko, kliknij przycisk OK.
5. Aby rozpocząć Evolving Factor Analysis (EFA), kliknij prawym przyciskiem myszy podświetlony plik u dołu Panelu sterowania, a następnie wybierz z menu opcję EFA.
   1. Sprawdź, czy otworzy się wyskakujące okienko pokazujące dekompozycję pojedynczej wartości (SVD) zestawu danych. W polu kontrolki zaznacz pole Użyj klatek, aby cały obszar piku do dekonwolucji został pokryty na wykresie intensywności. Wykres "Wartości pojedyncze" w prawym górnym rogu pokazuje intensywność wartości pojedynczych (oddzielnych szczytów/gatunków) powyżej linii bazowej.
      UWAGA: Liczba punktów znajdujących się powyżej linii podstawowej reprezentuje liczbę obecnych gatunków rozpraszających. Z zastrzeżeniem, że liczy się względna wielkość wartości pojedynczej w stosunku do płaskiego obszaru/linii bazowej.
   2. Aby ułatwić sprawdzanie poprawności liczby pojedynczych wartości, należy użyć dolnego wykresu Autokorelacja. Pokazuje to prawy i lewy pojedynczy wektor korelacji. Kliknij Dalej.
      UWAGA: Zasadniczo reprezentują one profile rozpraszania lub koncentracji dla wektora w roztworze. Gdzie rozmiar bezwzględny reprezentuje znaczenie wektora. Istotny składnik będzie miał autokorelację bliską 1 (praktyczna wartość odcięcia to >0,6\u20120,7). RAW pomaga to obliczyć i jest pokazany w polu #Significant SVs, w lewym dolnym rogu, chociaż w razie potrzeby możesz to zmienić. Jeśli istnieje kilka pojedynczych wartości (np. 4+), może być konieczne przyjrzenie się tylko 2 lub 3 komponentom, zmieniając zakres używanych danych. Im mniejsza liczba komponentów, tym łatwiejsza będzie analiza EFA, ale kosztem wykorzystania mniejszej ilości danych. W złożonej sytuacji, gdy lewy i prawy wektor osobliwy, które powinny być podobne, nie pasują do siebie, zmniejsz znaczącą liczbę SV i zmniejsz liczbę używanych ramek, aż lewy i prawy wektor osobliwy będą podobne.
   3. Sprawdź, czy wskaźnik EFA został obliczony, generując wykresy w kierunku do przodu i do tyłu dla każdego wektora. Wykresy te pokazują, kiedy komponenty rozpoczynają (wykres do przodu) i kończą (wykres wstecz) profilu rozwiązania dla wybranych danych SEC-SAXS. RAW próbuje zidentyfikować te zakresy; Zmień je za pomocą strzałek obok liczników, tak aby każdy okrąg znajdował się na początku punktu przegięcia wznoszącego się od linii bazowej lub opadającego do niej. Kliknij Dalej.
      UWAGA: Ostatni etap EFA zamienia wektory SVD z powrotem w krzywe rozpraszania. Po lewej stronie okna u góry wykreślane są wcześniej zdefiniowane zakresy. Te zakresy są ograniczeniami określającymi, gdzie należy obrócić wektory osobliwe z powrotem do krzywych rozproszenia. Prawy panel pokazuje odpowiednie profile krzywych rozpraszania dla każdego oddzielonego piku. Wykres dla stężenia każdego piku, który powinien być reprezentatywny dla profili elucji, oraz wykres dla średniego błędu ważonego chi². Wykres chi² mierzy zestaw danych dekonwolucji do oryginalnego zestawu danych. Idealnie byłoby, gdyby był płaski, jednak często można zobaczyć kolce.
   4. Spróbuj zredukować lub wyeliminować skoki, zmieniając elementy sterujące zakresem komponentu, najpierw określ w przybliżeniu, która klatka odpowiada spajkowi (z wykresu chi²), a następnie, w kontrolkach zakresu, który składnik zawiera tę ramkę (może to być więcej niż jeden), używając strzałek, przesuń w górę lub w dół odpowiedniego zakresu.
      UWAGA: Powinno to wywołać odpowiedź, zwiększając lub zmniejszając skok. Jeśli ramka kolca była obecna w więcej niż jednym komponencie, może być konieczne wykonanie kilku prób i błędów między każdym komponentem.
   5. Gdy zostanie osiągnięta minimalna liczba chi², wykonaj sprawdzenie poprawności, klikając wstecz, pojawi się poprzednie okno, aby sprawdzić, czy wprowadzone zmiany drastycznie zmieniły oryginalne wykresy EFA. Jeśli nadal wyglądają na prawidłowe, kliknij przycisk Dalej. Kliknij przycisk Zapisz dane programu EFA, aby zapisać wykresy, a następnie kliknij przycisk Gotowe; , aby zamknąć okno programu EFA.
      UWAGA: Drugą walidacją jest zaznaczenie kolejno pola wyboru obok każdego zakresu komponentów. Zapewniają one dodatnie ograniczenie stężenia dla każdego komponentu, a wyłączenie ich spowoduje sprawdzenie, czy mają one znaczący wpływ na zestaw danych. Jeżeli na wykresie stężenia nie widać żadnych zmian, oznacza to, że dane są prawidłowe.
6. Wróć do okna RAW kliknij kartę Profile w Panelu sterowania, aby wyświetlić krzywe, a następnie na karcie Manipulacja w Panelu sterowania dalej manipuluj krzywymi lub zapisz krzywe jako pliki *.dat, klikając plik prawym przyciskiem myszy i wybierając Zapisz wybrane pliki z menu podręcznego. Zapisz plik. Użyj Scatter IV do dalszej analizy.
   UWAGA: Więcej informacji i instrukcji dotyczących dekonwolucji i EFA BioXTAS RAW można znaleźć na stronie https://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/

4. Określ właściwości SAXS

UWAGA: Szczegółowy samouczek dotyczący wyznaczania SAXS znajduje się na stronie Bioisis.net. Tutaj pokazujemy podstawowe podejście krok po kroku, podkreślając najbardziej przydatne przyciski w Scatter.

1. Na karcie Analiza punktowa naciśnij przycisk G, aby wyświetlić ręczne narzędzie do analizy Guiniera, po prawej stronie każdego przykładowego pliku. Wykres, który zostanie otwarty, pokazuje ln[I(q)] w funkcji q² w górnym polu i odpowiadające im reszty w dolnym polu. Dodaj lub usuń punkty w taki sposób, aby reszty nie miały funkcji "uśmiechnij się" lub "zmarszcz brwi". Wybrane dane w dopasowaniu Guiniera nie powinny przekraczać maksymalnego limitu q x Rg wynoszącego 1,3.
2. Naciśnij przycisk Normalized Kratky; wykres, który się pojawi, zapewnia półilościową ocenę stanu strukturalnego makrocząsteczki, znormalizowanego pod względem masy i stężenia.
   UWAGA: Krzyżyk oznacza punkt Guiniera-Kratky'ego na (√3, 1.1)¹⁹. Zwarte, kuliste białko pokaże pojedynczy pik z maksymalną wartością w punkcie Guiniera-Kratky'ego. Biopolimer wewnętrznie nieuporządkowany lub cylindryczny miałby maksimum większe niż celownik i nie zmniejszyłby się. Białko, które miałoby zarówno pofałdowane domeny, jak i długie, wydłużone, nieustrukturyzowane regiony, może wykazywać zwiększone maksimum przez celownik, ale wykazywałoby również wyraźną tendencję spadkową przy wyższym q x Rg.
3. Kliknij przycisk Vc (Objętość korelacji), który wyświetla dwa wykresy, całkowitą intensywność rozproszenia i zintegrowany obszar całkowitej intensywności rozproszenia w funkcji q. Wykresy są używane jako szybkie odniesienie do walidacji jakości krzywej rozpraszania.
   UWAGA: Całkowita intensywność rozproszenia jest wrażliwa na I(0) i jeśli nie została ona prawidłowo zmierzona, wykres nie będzie pokazywał linii ciągłej. Najlepiej byłoby, gdyby zintegrowany wykres powierzchniowy pokazywał linię sigmoidalną z rozszerzonym plateau dla każdej krzywej SAXS. Jeśli w próbce występuje niedopasowanie/odejmowanie bufora, agregacja lub interferencja między cząstkami, przy wyższych wartościach q zaobserwuje się ostre nachylenie.
4. Naciśnij przycisk Elastyczność, aby rozpocząć analizę elastyczności. Spowoduje to otwarcie okna z czterema panelami i suwakiem na dole. Każdy otwarty panel przedstawia wykres wykorzystujący zależność potęgowo-prawną, która istnieje między zwartymi i wydłużonymi/elastycznymi biopolimerami²³. Aby użyć, przesuń suwak u dołu pola od prawej do lewej z wciśniętym lewym przyciskiem myszy. Idź powoli w lewo, aż osiągniesz płaskowyż na jednej z działek.
   UWAGA: Jeśli plateau jest widoczne na wykresie Poroda-Debye'a, oznacza to, że próbka ma charakter zwarty, co powinno być zgodne z pojedynczym pikiem w punkcie Guiniera-Kratky'ego na znormalizowanym wykresie Kratky'ego. Jeśli plateau zostanie osiągnięte jako pierwsze na wykresie Kratky'ego-Debye'a, próbka jest najprawdopodobniej wydłużona lub elastyczna. Jeśli wykres SIBYLS jako pierwszy osiąga plateau, to próbka najprawdopodobniej zawiera obszary zarówno zwartości, jak i elastyczności, cząstkę o stanach mieszanych. Teoria tej zależności elastyczności od prawa Poroda-Debye'a jest znakomicie omówiona w Rambo, et al.²³
5. Kliknij Głośność. Określenie objętości powinno być przeprowadzone natychmiast po analizie elastyczności od góry. Po otwarciu po analizie elastyczności generowane jest wyskakujące okienko z trzema kolejnymi wykresami. W lewym dolnym rogu wykres Poroda-Debye'a pamięta miejsce, w którym jeden z suwaków został pozostawiony na wykresie elastyczności, pokazując obszar płaskowyżu.
   1. Aby obliczyć objętość cząstki, przesuń początek i koniec za pomocą przycisków strzałek lub wpisz pola, tak aby niebieska linia na wykresie pasowała do obszaru plateau. Aby uzyskać bezstronny wynik, reszty w prawym górnym rogu wykładniczego dopasowania potęgowego Poroda-Debye'a nie powinny wykazywać żadnego wzorca.
6. Naciśnij zakładkę P(r). Rozkład w przestrzeni rzeczywistej znajduje się w lewym panelu, a krzywa rozpraszania próbki w prawym panelu. Celem jest stworzenie reprezentacji próbki w przestrzeni rzeczywistej na podstawie krzywej SAXS w przestrzeni odwrotnej. Idealnie byłoby, gdyby krzywa rozkładu była gładka, bez obecności fal i powinna po prostu delikatnie całować oś x.
   UWAGA: Zmierzony zakres q przyrządu może nie być w pełni użyteczny ze względu na słabe dopasowanie bufora, agregację, uszkodzenia promieniowania, nieoptymalne czasy ekspozycji i niskie stężenia cząstek. Etap wyznaczania P(r) zasadniczo określi użyteczny zakres q_min i q_max zestawu danych SAXS i powinien to być ten zakres danych, który jest używany do każdego kolejnego modelowania lub dopasowania.
   1. Kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę próbki, a następnie kliknij Znajdź DMAX, aby otworzyć nowe okno. Limity dla d_max są wstępnie ustawione z sugerowanym_{q max} (maksymalna liczba użytych punktów danych), dolne i górne limity_{d max} oraz dolny i górny wynik alfa. Do wyboru są trzy modele (L1-norm, Legendre i Moore) oraz użycie tła. W pierwszej kolejności pozostaw je bez zmian.
   2. Naciśnij przycisk Start. W lewym panelu tworzony jest rozkład złożony z sugerowanym poziomem d_max i alfa zapisanym pod spodem. Jeśli wygląda to akceptowalnie, zamknij okno i wróć do zakładki P(r). Wykres odwrotności przestrzeni zostanie przycięty tak, aby pasował do sugerowanego q_max.
   3. Wybierz model Moore, kliknij Tło, a następnie ustaw poziom alfa i d_max na sugerowane wartości z wyskakującego okienka. Naciśnij przycisk udoskonalania. Pojawi się wykres walidacji krzyżowej pokazujący, czy jakieś punkty musiały zostać odrzucone, zaznaczony na czerwono. Jeśli odrzuconych jest tylko kilka punktów, a rozkład wygląda dobrze, oznacza to, że model jest dobry.
      UWAGA: Wykres walidacji krzyżowej wyróżni obszary danych, które są niespójne z ustalonym rozkładem P(r). Jeśli odrzucony region znajduje się głównie w regionie low-q, czyli w pobliżu osi y, prawdopodobnie sugeruje to zbyt krótkie d_max, obecność agregacji lub oligomerów wyższego rzędu. Zwraca uwagę na niespójność między informacjami o wyższej i niższej rozdzielczości. W tym przypadku d_max i q_min (rosnąca wartość początkowa) powinny być regulowane przy użyciu ręcznego podejścia opartego na próbach i błędach. Podobnie, jeśli odrzucony obszar znajduje się głównie w obszarze wysokiego q, może to wskazywać na problem z odejmowaniem tła lub na to, że sygnał jest zbyt słaby, aby można go było sensownie wyjaśnić za pomocą wyznaczonego rozkładu P(r). W takim przypadku q_max powinno być obcinane (malejący koniec) do momentu, aż żadne dodatkowe dane nie zostaną odrzucone. Idealnie byłoby, gdyby odrzucone punkty były rozmieszczone losowo i stanowiły mniej niż 5% użytecznych danych. Prawidłowo zdefiniowane q_min, q_max i "d_max" dadzą gładki rozkład, w którym d_max całuje oś x. Nie należy jednak zwiększać tej wartości tak bardzo, aby całkowicie usunąć region Guiniera. Ten punkt można łatwo znaleźć, zaznaczając pole q x l(q) (po lewej stronie panelu nad tabelą). Krzywa rozpraszania jest zastępowana przez "wykres całkowitej intensywności rozproszenia", na tej krzywej wszystkie punkty przed maksymalnym przegięciem są częścią obszaru Guiniera. Po usunięciu punktów spróbuj ponownie, zwiększyć/zmniejszyć "d_max", a następnie ponownie doprecyzować. Jeśli problemy utrzymują się, zwłaszcza gdy wiele punktów jest odrzucanych od początku krzywej walidacji, zdecydowanie sugeruje to, że dane nie są idealne do modelowania strukturalnego.
7. Aby wydrukować raport, wróć do zakładki Analiza, kliknij lewym przyciskiem myszy, aby podświetlić próbkę, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę próbki i przejdź do opcji Utwórz raport z pojedynczego zestawu danych w menu. Otworzy się pole tekstowe umożliwiające dodawanie komentarzy. Tworzony jest dokument PDF przedstawiający wszystkie wygenerowane liczby i wartości.

Wyniki

Zaletą zastosowania dekonwolucji w porównaniu do klasycznego wyboru klatek¹³ jest usunięcie wzajemnego wpływu gatunków, co pozwala na uzyskanie monodyspersyjnego sygnału rozproszeniowego. Często wiąże się to również z lepszym stosunkiem sygnału do szumu. Gdy E9 exo^minus wiąże się z DNA i jest analizowany za pomocą SEC-SAXS, obserwuje się dwa piki (Rysunek 1). Pierwszy, duży pik (w przybliżeniu klatki 420‒475) odpowiada kompleksowi E9 exo^minus-DNA, a drugi (w przybliżeniu klatki 475‒540) stanowi niezwiązana forma (patrz Dane uzupełniające: Rysunek 2). Podczas gdy klasyczne podejście polegające na wyborze klatek zapewnia stabilną wartość Rg kompleksu w pierwszym piku (patrz Dane uzupełniające: Rysunek 3), drugi pik jest wyraźnie zlewający się, a wartość Rg na wykresie pokazuje, że drugi analizowany pik nie posiada stabilnego Rg ze względu na zanieczyszczenie sygnałem z sąsiedniego piku. Można było wykorzystać jedynie 5 klatek wykazujących półstabilne Rg; po odjęciu dały one Rg = 36,3 Å (Rysunek 2, zielony). Po przeprowadzeniu dekonwolucji pików za pomocą EFA, odpowiadająca krzywa dla drugiego piku (Rysunek 2, niebieski) została nałożona na oryginalną i wykazała wyraźny spadek stosunku sygnału do szumu, a zarejestrowano niższą wartość Rg wynoszącą 34,1 Å. Wykres Kratky'ego (Rysunek 3) pokazuje, że kompleks z dekonwolucyjnym pikiem (niebieski) jest bardziej globularny. Potwierdza to krzywa P(r) (Rysunek 4), która daje d_max 108,5 Å dla krzywej dekonwolucyjnej (niebieska), podczas gdy krzywa niedekonwolucyjna jest bardziej wydłużona z d_max 120 Å (zielona), co najprawdopodobniej wynika z heterogeniczności spowodowanej obecnością niezwiązanego E9 exo^minus.

Rysunek 1: Wykres sygnału E9 exo^minus osobno oraz w kompleksie z DNA.
Górny panel przedstawia wykres stosunku całki do tła dla każdej klatki pomiaru SEC-SAXS (jasnoniebieski). Czerwone punkty wskazują wartość Rg dla każdej klatki w obrębie piku. Dolny panel przedstawia odpowiadającą mu mapę ciepła obrazującą residua dla każdej klatki, pokolorowane zgodnie z analizą autokorelacji Durbina-Watsona; obszary o wysokim podobieństwie są zaznaczone kolorem cyjanowym, natomiast klatki niepodobne są zaznaczone kolorami od ciemnoniebieskiego, przez różowy, aż po czerwony, w zależności od stopnia różnicy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2: Wykres intensywności w funkcji wektora rozpraszania.
Nałożenie odjętych danych SAXS z formy E9 exo^minus. Na zielono 5 klatek (klatki 517‒522) uśrednionych i odjętych z obszaru półstabilnego Rg, a na niebiesko reprezentatywna krzywa rozpraszania uzyskana z dekonwolucji EFA piku SEC-SAXS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 3: Bezwymiarowa krzywa Kratky'ego.
Nałożenie na siebie zdekonwolucyjnej (niebieska) i niezdekonwolucyjnej (zielona) krzywej Kratky'ego wykazujące, że E9 exo^minus ma budowę globularną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 4: Krzywa P(r).
Nałożenie krzywych dekonwolucyjnych (niebieska) i niedekonwolucyjnych (zielona) dla E9 exo^minus. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dane uzupełniające. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik

Dyskusja

Pożądane jest posiadanie próbki monodyspersyjnej przed rozpoczęciem eksperymentu SAXS, ale w rzeczywistości wiele zbiorów danych nie spełnia tego wymagania i musi zostać ulepszone poprzez połączenie pomiaru z chromatografią liniową - w większości przypadków SEC. Jednak nawet brak czasu między oczyszczaniem a akwizycją danych monodyspersji próbki nie jest gwarantowana. Najczęściej dotyczy to eksperymentów, w których komponenty są zbyt zbliżone rozmiarem lub właściwościami fizycznymi, aby można je było rozdzielić, lub są podatne na szybką dynamikę. W tym miejscu dostarczyliśmy protokół łączący dekompozycję pojedynczej wartości z ewoluującą analizą czynnikową w celu usunięcia wpływu^egzo-minusa związanego z DNA E9 z jego niezwiązanej formy, tworząc monodyspersyjny profil rozpraszania, który następnie byliśmy w stanie przeanalizować za pomocą pakietu SAXS Scatter IV.

SVD z EFA danych SEC-SAXS są bardzo skutecznymi metodami opracowanymi w celu dekonwolucji danych SAXS i poprawy analizy, ale mają ograniczenia. Wymagają one, aby szum lub dryft w linii podstawowej bufora SEC-SAXS był ograniczony do minimum. Może to wiązać się z dodatkowym wyrównaniem kolumn (lepiej użyć więcej niż 3 objętości kolumn, w zależności od bufora) przed załadowaniem próbki. Jednak najbardziej krytycznym krokiem jest wybór liczby wartości osobliwych i zakresu wykorzystywanych danych, ponieważ będzie to miało duży wpływ na dokładność dekonwolucji. Z tego powodu wyniki nie powinny być podejmowane samodzielnie, ale dalej analizowane przy użyciu technik takich jak analityczne ultrawirowanie (AUC) lub wielokątowe rozpraszanie światła laserowego (MALLS) do interpretacji biologicznej.

Scatter IV to nowy pakiet oprogramowania, bezpłatny do użytku badawczego i przemysłowego, z intuicyjnym interfejsem użytkownika, który pozwala nawet laikom analizować swoje dane. Scatter IV ma kilka nowych funkcji, które pomagają usprawnić analizę danych SEC-SAXS, takich jak mapa cieplna połączona z wykresem sygnału, umożliwiająca większą dokładność wyboru klatek. W pierwotnej analizie danych analiza piku Guiniera i wykres walidacji krzyżowej związany z analizą P(r) oferują zintegrowaną możliwość rozwiązywania problemów w oprogramowaniu.

Należy wspomnieć, że do pierwotnej analizy danych można wykorzystać wiele innych programów; Zawierają one te same podstawowe funkcje i są również regularnie aktualizowane, takie jak BioXTAS, RAW¹⁷ , ATSAS Package²⁴ i US-SOMO¹⁵ , aby wymienić tylko kilka.

Jednak niezależnie od tego, który pakiet SAXS jest używany do analizy, główne ograniczenia są wspólne: przygotowanie próbki, przed pobraniem i analizą. W pokazanym przykładzie E9 exo^minus wyraźnie widać poprawę stosunku sygnału do szumu oraz zmniejszenie Rg_{d max} związanego z próbką monodyspersyjną. To znacznie ułatwi dalsze przetwarzanie danych, takie jak dopasowywanie lub modelowanie ze znanymi strukturami o wysokiej rozdzielczości.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oprogramowanie sterujące linią badawczą BsXCuBE	ESRF	Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664	rozwój lokalny
BioXTAS Raw 1.2.3.	MacCHESS	http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html	Po raz pierwszy opracowany w 2008 roku przez Sorena Skou w ramach projektu BioXTAS (biological x-ray total analysis system). Od tego czasu został szeroko rozwinięty, a ostatnie prace zostały wykonane przez Jesse B. Hopkins
HPLC program LabSolutions	Shimadzu	n.a.ISPyB
	ESRF	De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.	Rozwój lokalny
NaCl	VWR Chemicals (BDH Prolabo)	27808.297
Scatter	Diamond Light Source Ltd	http://www.bioisis.net/tutorial/9	Wspierany przez linię badawczą SIBYLS (ALS berkeley, Ca) i Bruker Cororation (Karlsruhe, Niemcy)
Kolumna Superdex 200 Increase 5/150 GL	Kolumna GE Healthcare	28990945	SEC-SAXS
podstawa Tris	Euromedex	26-128-3094-B

, używana