Manipulacja pojedynczymi neuronalnymi komórkami macierzystymi i neuronami w wycinkach mózgu za pomocą mikroiniekcji robotycznej

Podsumowanie

Ten protokół demonstruje użycie platformy robotycznej do mikroiniekcji do pojedynczych nerwowych komórek macierzystych i neuronów w wycinkach mózgu. Technika ta jest wszechstronna i oferuje metodę śledzenia komórek w tkance z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Streszczenie

Głównym pytaniem w neurobiologii rozwojowej jest to, w jaki sposób nerwowe komórki macierzyste i progenitorowe tworzą mózg. Aby odpowiedzieć na to pytanie, należy oznaczyć, manipulować i śledzić pojedyncze komórki w tkance mózgowej z wysoką rozdzielczością w czasie. Zadanie to jest niezwykle trudne ze względu na złożoność tkanek w mózgu. Niedawno opracowaliśmy robota, który wprowadza igłę do mikroiniekcji w tkankę mózgową po wykorzystaniu obrazów uzyskanych z mikroskopu do dostarczania femtolitrowych objętości roztworu do pojedynczych komórek. Operacja robotyczna zwiększa się, uzyskując ogólną wydajność, która jest o rząd wielkości większa niż w przypadku ręcznej mikroiniekcji i pozwala na precyzyjne etykietowanie i elastyczną manipulację pojedynczymi komórkami w żywej tkance. Dzięki temu można mikrowstrzykiwać setki komórek w jednym wycinku organotypowym. W artykule przedstawiono zastosowanie robota do mikroiniekcji do automatycznego mikrowstrzykiwania nerwowych komórek progenitorowych i neuronów w wycinkach tkanki mózgowej. W szerszym ujęciu można go stosować na dowolnej tkance nabłonkowej o powierzchni, do której można dotrzeć pipetą. Po skonfigurowaniu robot do mikroiniekcji może wykonać 15 lub więcej mikroiniekcji na minutę. Robot do mikroiniekcji, ze względu na swoją przepustowość i wszechstronność, sprawi, że mikroiniekcja stanie się bardzo prostą, wysokowydajną techniką manipulacji komórkami, która może być stosowana w bioinżynierii, biotechnologii i biofizyce do wykonywania analiz pojedynczych komórek w organotypowych wycinkach mózgu.

Wprowadzenie

Ten protokół opisuje użycie robota do namierzania i manipulowania pojedynczymi komórkami w wycinkach tkanki mózgowej, skupiając się w szczególności na pojedynczych nerwowych komórkach macierzystych i neuronach. Robot został opracowany, aby odpowiedzieć na kluczowe pytanie w neurobiologii rozwojowej, a mianowicie, w jaki sposób nerwowe komórki macierzyste i progenitorowe przyczyniają się do morfogenezy mózgu^1,2,3,4,5. Aby odpowiedzieć na to pytanie, należy oznaczyć i śledzić pojedyncze nerwowe komórki macierzyste oraz śledzić ich progresję w czasie, aby skorelować zachowanie pojedynczej komórki z morfogenezą tkanek. Można to osiągnąć na różne sposoby, np. poprzez elektroporację tkanki mózgowej w macicy lub znakowanie pojedynczej komórki za pomocą matryc lipofilowych. Chociaż metody te są skuteczne, brakuje im precyzyjnej rozdzielczości pojedynczej komórki (elektroporacja) i/lub możliwości manipulowania przestrzenią wewnątrzkomórkową (barwnik lipofilowy). Aby sprostać temu wyzwaniu, opracowano mikroiniekcję do pojedynczych komórek^6,7,8. Podczas mikroiniekcji pipeta jest na krótko wprowadzana do pojedynczej komórki w nienaruszonej tkance pod ciśnieniem w celu mikroiniekcji femtolitrowych objętości odczynników⁹. Wcześniej opisaliśmy ręczną procedurę mikrowstrzykiwania pojedynczych nerwowych komórek macierzystych do tkanki organotypowej (Rysunek 1A)^10,11. Mikroiniekcja do nerwowych komórek macierzystych polega na użyciu mikropipety, którą wprowadza się do pojedynczych nerwowych komórek macierzystych w celu wstrzyknięcia roztworu zawierającego barwnik fluorescencyjny wraz z innymi cząsteczkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Selektywne celowanie w nerwowe komórki macierzyste osiąga się poprzez zbliżenie się do rozwijającego się kresomózgowia przez powierzchnię komory (lub komorę, patrz rysunek w Rysunek 1A), która jest utworzona przez wierzchołkową błonę plazmatyczną wierzchołkowych przodków (rysunek w Rysunek 1A). Proces ten musi być powtórzony dla każdej komórki, którą eksperymentator pragnie wstrzyknąć. Co więcej, powodzenie mikroiniekcji zależy od precyzyjnej kontroli głębokości i czasu wstrzyknięcia mikropipety w tkankę. Tak więc, pomimo wyjątkowych zalet, ręczne mikroiniekcja jest niezwykle żmudna i wymaga znacznej praktyki, aby wykonać ją z rozsądną przepustowością i wydajnością, co utrudnia stosowanie tej techniki w skalowalny sposób. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowaliśmy niedawno robota sterowanego obrazem, Autoinjector¹² (lub robota do mikroiniekcji), który może automatycznie wykonywać mikroiniekcje do pojedynczych komórek.

Robot do mikroiniekcji wykorzystuje algorytmy obrazowania mikroskopowego i widzenia komputerowego, aby precyzyjnie celować w określone miejsca w przestrzeni 3D w tkance do mikroiniekcji (Rysunek 1B). Robot do mikroiniekcji może być skonstruowany poprzez dokonanie stosunkowo prostych modyfikacji istniejącego zestawu do mikroiniekcji. Ogólny schemat robota do mikroiniekcji jest pokazany w Rysunek 1C. Pipeta jest zamontowana w uchwycie na pipety przymocowanym do manipulatora trójosiowego. Kamera mikroskopowa służy do pozyskiwania obrazów tkanki i igły do mikroiniekcji. Niestandardowy system regulacji ciśnienia służy do kontrolowania ciśnienia wewnątrz pipety, a programowalny mikromanipulator służy do kontrolowania pozycji pipety z mikrowtryskiwaczem. Obrazy z kamer tkanki i pipety do mikroiniekcji służą do określenia położenia przestrzennego końcówki pipety do mikroiniekcji oraz miejsc, w których należy wykonać mikroiniekcję. Następnie oprogramowanie oblicza trajektorie potrzebne do przemieszczenia pipety w tkance. Cały sprzęt jest kontrolowany przez oprogramowanie, które wcześniej opracowaliśmy. Całe oprogramowanie jest napisane w języku kodowania (np. Python i Arduino) i można je pobrać ze strony https://github.com/bsbrl/Autoinjector wraz z instrukcjami. Graficzny interfejs użytkownika (GUI) umożliwia użytkownikowi obrazowanie tkanki i mikropipety oraz dostosowanie trajektorii mikroiniekcji. Nasz system można stworzyć za pomocą stosunkowo prostych modyfikacji mikroskopu odwróconego wyposażonego w filtry jasnego pola i epifluorescencji.

Po pierwsze, podajemy instrukcje dotyczące przygotowania wycinków tkanki organotypowej mózgu do mikroiniekcji. Następnie w protokole przedstawiono uruchomienie robota do mikroiniekcji, po którym następują kroki przygotowawcze, takie jak kalibracja ruchu pipety, które należy wykonać przed mikroiniekcją. Następnie następuje zdefiniowanie parametrów wtrysku. Następnie użytkownik może zdefiniować trajektorię używaną przez robota do mikroiniekcji i rozpocząć procedurę iniekcji. Mikrowstrzyknięta tkanka (w tym przypadku wycinki tkanki organotypowej mózgu) może być przechowywana w hodowli przez różne okresy czasu, w zależności od projektu eksperymentalnego^10,11. Tkanka może być przetwarzana w celu śledzenia i badania tożsamości i losu wstrzykniętych komórek i ich potomstwa. Alternatywnie, mikrowstrzyknięte komórki można obserwować za pomocą obrazowania na żywo. W ramach tego protokołu demonstrujemy zastosowanie robota do automatycznej mikroiniekcji nerwowych komórek progenitorowych w organotypowych wycinkach grzbietowego kresomózgowia myszy E14.5. Robot jest ponadto zdolny do mikroiniekcji do neuronów noworodków w kresomózgowiu myszy, a także w kresomózgowiu ludzkiego płodu¹².

Podsumowując, opisujemy platformę robotyczną, która może być używana do śledzenia i manipulowania pojedynczymi komórkami w tkance. Platforma wykorzystuje ciśnienie i dlatego jest niezwykle wszechstronna, jeśli chodzi o chemiczny charakter związku do wstrzykiwania. Ponadto może być przystosowany do komórek docelowych innych niż komórki macierzyste. Oczekujemy, że nasz system będzie można łatwo dostosować również do innych systemów modelowych.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckim ustawodawstwem dotyczącym dobrostanu zwierząt, a niezbędne licencje uzyskano od regionalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach w Dreźnie, Niemcy (Tierversuchskommission, Landesdirektion Dresden). Plastry organotypowe przygotowano z mysiego zarodka kresomózgowia E14.5 lub E16.5 C57BL/6 (Janvier Labs).

1. Instalacja oprogramowania

1. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby zainstalować oprogramowanie z https://github.com/bsbrl/Autoinjector.

2. Przygotowanie odczynników i pipet

1. Agaroza: Przygotować 3% agarozy, rozpuszczając oddzielnie 3 g agarozy o szerokim zakresie i 3 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 100 ml PBS klasy hodowli komórkowej odpowiednio w dwóch oddzielnych szklanych butelkach o pojemności 200 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej do 3 miesięcy.
2. Roztwór Tyrode: Rozpuścić 1 g wodorowęglanu sodu i soli Tyrode'a (użyć zawartości całej butelki) oraz 13 ml 1 M HEPES w 1 l wody destylowanej. Dostosować pH do 7,4. Przefiltrować roztwór przez filtr butelkowy 0,2 μm.
3. Pożywka do hodowli w plastrach (SCM): Dodaj 10 ml surowicy szczurów, 1 ml 2 ml glutaminy, 1 ml penicyliny-streptomycyny (100x), 1 ml suplementu N-2 (100x), 2 ml suplementu B27 (50x) i 1 ml buforu HEPES (pH 7,3) do 84 ml pożywki neurobazalnej. Porcję 5 ml SCM do probówek o pojemności 15 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Pożywka do mikroiniekcji niezależna od CO₂ (CIMM): Przygotować 5x modyfikowany DMEM roztwór o niskiej zawartości glukozy (bez czerwieni fenolowej), rozpuszczając proszek w 200 ml wody destylowanej. Przefiltruj roztwór przez filtr butelkowy 0,2 μm (w przypadku proszku DMEM użyj zawartości całej butelki). Aby przygotować 100 ml CIMM, wymieszaj 20 ml 5x roztworu modyfikowanego DMEM, 1 ml buforu HEPES, 1 ml suplementu N2 (100x), 2 ml suplementu B27 (50x), 1 ml penicyliny-streptomycyny (100x), 1 ml 2 mM glutaminy i 74 ml wody destylowanej. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
5. Bufor do rekonstytucji: Przygotować bufor do rozpuszczenia, rozpuszczając 262 mM NaHCO₃, 0,05 N NaOH, 200 mM HEPES w wodzie destylowanej. Wysterylizuj roztwór przez filtrację przez system filtrów 0,22 μm do sterylnej szklanej butelki. Porcję 500 μl buforu do rozpuszczenia w hermetycznych probówkach do mikrowirówek. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
6. Barwnik do mikroiniekcji: Rozpuść znakowany fluorescencyjnie dekstran w wodzie destylowanej wolnej od RNaz (końcowe stężenie 10 μg/μL). Przygotować 5 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
7. Wyciągnij pipety do mikroiniekcji z kapilar ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1,2 mm, średnica wewnętrzna 0,94 mm) za pomocą ściągacza do mikropipet. Chroń pipety przed kurzem. Nie przechowuj pipet dłużej niż 2 – 3 dni. W tym eksperymencie parametrami ciągnięcia były CIEPŁO: temperatura rampy +1 – 5; UCIĄG: 100; VEL: 110; DEL: 100. HEAT i VEL to parametry, które mają największy wpływ na kształt i rozmiar pipety.
   UWAGA: Optymalna pipeta do mikroiniekcji ma długą i elastyczną końcówkę, aby uniknąć uszkodzenia komórek podczas mikroiniekcji.

3. Przygotowanie plastra tkanki

1. Rozpuść 3% agarozę o szerokim zakresie za pomocą kuchenki mikrofalowej przed sekcją tkanki mózgowej. Nie dopuścić do zestalenia się agarozy, przechowując ją w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przed osadzeniem. Upewnij się, że pipety są chronione przed kurzem. Nie przechowuj pipet dłużej niż 2 – 3 dni.
2. Rozmrozić podwielokrotność SCM i ogrzać 10–12 ml CIMM i 20 ml roztworu Tyrode'a do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
3. Zmieszać znacznik fluorescencyjny (sprzężony z Dextran-3000 lub Dextran-10000-Alexa; stężenie końcowe 5 – 10 μg/μL) z innymi substancjami chemicznymi, które mają zostać wstrzyknięte. Odwirować roztwór do mikroiniekcji o sile 16 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i przenieść do nowej probówki. Roztwór do mikroiniekcji należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.
4. Użyj głów mysich zarodków E13.5 – E16.5 do przygotowania organotypowych wycinków tkanki kresomózgowia. Usuń skórę i otwórz czaszkę za pomocą kleszczy, przesuwając się wzdłuż linii środkowej. Wypreparuj mózg embrionalny z otwartej czaszki i usuń opony mózgowe pokrywające tkankę mózgową, zaczynając od brzusznej strony mózgu. Pozostaw wypreparowany cały mózg w roztworze Tyrode'a na bloku grzewczym o temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Wszystkie etapy preparacji opisane w ppkt 3.4 muszą być wykonane we wstępnie podgrzanym roztworze Tyrode.
5. Wlej szeroką gamę stopionej agarozy do jednorazowej formy do zatapiania. Gdy agaroza zostanie schłodzona do temperatury 38 – 39 °C, ostrożnie przenieś do niej mózgi (maksymalnie 4) za pomocą pipety Pasteura. Na tym etapie zawsze używaj końcówek do wycinania.
6. Wymieszaj agarozę wokół tkanki za pomocą szpatułki lub kleszczy Dumont #1 bez dotykania tkanki. Niech agaroza zestali się w temperaturze pokojowej. Gdy agaroza zastygnie, odetnij nadmiar agarozy otaczającej tkankę.
7. Napełnij tacę buforową PBS. Ustaw mózg tak, aby oś rostro-ogonowa tkanki była prostopadła do tacy (użyj jako punktu orientacyjnego opuszki węchowe, reprezentujące najbardziej rostralną część mózgu). Pokrój plastry 250 μm za pomocą wibratomu.
8. Napełnij szalkę Petriego o średnicy 3,5 cm 2 ml podgrzanego podłoża. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura przenieś plastry (10 - 15) do tego naczynia. Po zakończeniu przenieś szalkę Petriego z plastrami do inkubatora do hodowli plastrów. Plastry należy przechowywać w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 40%_O2 / 5% CO₂ / 55% N₂ do momentu użycia.

4. Mikroiniekcja

1. Włącz komputer, mikroskop, kamerę mikroskopową, manipulatory, zestaw ciśnieniowy i czujnik ciśnienia. Załaduj aplikację, klikając plik "launchapp.py" w głównym folderze pobranym z GitHub i określ ustawienia urządzenia na wyskakującym ekranie (instrukcje instalacji znajdują się w kroku 1.1).
2. Wytworzyć ciśnienie na zewnątrz, aby zapobiec niepożądanemu zatkaniu przed zanurzeniem pipety w roztworze. Aby wywrzeć nacisk na pipetę, przesuń pasek kompensacji ciśnienia do pozycji 24 – 45% i kliknij przycisk Set Values (Ustaw wartości). Następnie dostosuj ciśnienie do wystarczającego ciśnienia, przekręcając pokrętło mechanicznego zaworu ciśnienia na 1 – 2 PSI (69 – 138 mbar), zgodnie ze wskazaniami czujnika ciśnienia.
3. Przenieś plastry na 3,5 cm szalkę Petriego zawierającą 2 ml wstępnie podgrzanego CIMM. Umieść plastry do mikroiniekcji na środku szalki Petriego. Przenieść szalkę Petriego do wstępnie podgrzanego (37 °C) etapu mikroiniekcji.
4. Napełnij pipetę do mikroiniekcji 1,4–1,6 μl roztworu do mikroiniekcji (od kroku 3.3) za pomocą plastikowej pipety z długą końcówką. Włożyć pipetę do mikroiniekcji na uchwyt na pipetę.
5. Używając najmniejszego powiększenia mikroskopu, ustaw ostrość wycinka i skieruj mikropipetę na to pole view (FOV) tak, aby była skupiona na tej samej płaszczyźnie co tarcza wycinka. Przełącz wyjście mikroskopu na kamerę, aby zobaczyć pole widzenia w aplikacji.
6. Kliknij przycisk powiększenia w lewym górnym rogu interfejsu, aby rozpocząć kalibrację urządzenia. Pojawi się okno z prośbą o wybranie powiększenia. Wybierz powiększenie 10x lub dowolne powiększenie, na które ustawiony jest obiektyw (np. 4x, 10x, 20x, 40x) i naciśnij OK. Oprogramowanie zakłada, że wewnętrzna soczewka obiektywu ma powiększenie 10x (najczęstsze powiększenie soczewki obiektywu).
7. Ponownie ustaw ostrość końcówki pipety za pomocą pokrętła mikrometrycznego mikroskopu i kliknij końcówkę pipety kursorem. Następnie naciśnij przycisk kroku 1.1 i naciśnij OK w wyskakującym okienku. Pipeta przesunie się w kierunku Y. Kliknij końcówkę pipety i naciśnij przycisk kroku 1.2. Na koniec wprowadź wartość 45 w polu Kąt pipety i naciśnij przycisk Ustaw kąt.
8. Wprowadź żądane parametry do panelu sterowania Automatyczne mikroiniekcje. W przypadku mikroiniekcji do wierzchołkowych komórek progenitorowych należy ustawić odległość iniekcji na 20 – 40 μm, a głębokość na 10 – 15 μm. W przypadku mikroiniekcji do neuronów należy ustawić odległość iniekcji 30 – 40 μm od strony podstawnej, a głębokość na 10 – 30 μm w zależności od tego, co jest celowane. Zawsze ustawiaj prędkość na 100%. Kliknij Ustaw wartości.
   UWAGA: Odległość podejścia to odległość, na jaką pipeta wyciąga się z tkanki przed przejściem do następnej odległości wstrzyknięcia, głębokość to głębokość w tkance, w którą przechodzi mikroiniekcja, odstępy to odległość wzdłuż linii między sekwencyjnymi wstrzyknięciami, prędkość to prędkość pipety w μm/s.
9. Kliknij przycisk Narysuj krawędź i przeciągnij kursor wzdłuż żądanej trajektorii w wyskakującym okienku, aby zdefiniować trajektorię wstrzyknięcia. W przypadku mikroiniekcji progenitorowych komórek macierzystych, brzuszna strona powierzchni kresomózgowia jest ukierunkowana, jak pokazano na Rysunek 2A. Przesuń pipetę na początek linii i kliknij końcówkę pipety. Kliknij opcję Uruchom trajektorię, aby rozpocząć mikrowstrzykiwanie. Powtórz ten krok dla każdej docelowej płaszczyzny iniekcji (zwykle wykonuje się to dla 3 – 4 płaszczyzn z 40 – 75 wstrzyknięciami na płaszczyznę).

5. Hodowla tkankowa i przetwarzanie wycinków tkanek pod kątem immunofluorescencji

1. Przygotuj mieszaninę kolagenu (1,5 mg/ml): Do probówki dodać 1,25 ml roztworu matrycy, 0,5 ml wody destylowanej, 0,5 ml 5 x roztworu DMEM-F12 i 0,25 ml buforu do rekonstytucji. Trzymaj go na lodzie do czasu użycia.
2. Pobrać szalkę Petriego zawierającą mikrowstrzyknięte wycinki z komory inkubacji kultur plastrów i zanurzyć plastry w mieszaninie kolagenu.
3. Przenieś plastry razem z 200 – 300 μl mieszanki kolagenu do 14 mm dołka w naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm. Upewnij się, że plastry są pokryte bardzo małą ilością kolagenu. Taka konfiguracja pozwala na optymalne warunki do pobierania składników odżywczych i tlenu.
4. Ustaw plastry, upewniając się, że między plasterkami jest wystarczająco dużo miejsca, używając dwóch par kleszczyków. Inkubować szalkę Petriego przez 5 minut w temperaturze 37 °C przy użyciu bloku grzewczego, aby umożliwić zestalenie się kolagenu. Rozważ ten czas jako t = 0 kultury plastrów.
5. Przenieś szalkę Petriego z powrotem do inkubatora do kultur plastrów na dodatkowe 40 minut. Następnie dodaj 2 ml podgrzanego SCM. Plastry są trzymane w kulturze do pożądanego punktu czasowego.
6. Wyjmij plastry z inkubatora do hodowli plastrów i odessaj SCM. Umyj plastry zatopione w kolagenie 1x PBS. Dodać 4% (wag./obj.) paraformaldehydu (w 120 mM buforze fosforanowym o pH 7,4) i pozostawić tkankę w temperaturze pokojowej na 30 minut. Następnie ustawić go w temperaturze 4 °C, aby umożliwić utrwalenie przez noc.
7. Następnego dnia odessać roztwór paraformaldehydu i wykonać 1x płukanie PBS. Aby usunąć plastry z kolagenu, użyj dwóch par kleszczy, aby delikatnie wydobyć plastry pod mikroskopem stereoskopowym.
8. Użyj kuchenki mikrofalowej, aby stopić agarozę o niskiej temperaturze topnienia 3% (wag./obj.) do przetwarzania mikrowstrzykiwanych plastrów. Wlej stopioną agarozę do jednorazowej formy do zatapiania i pozwól jej ostygnąć do około 38 – 39 °C.
9. Przenieś plastry tkanki z kroku 5.7 do tej formy zawierającej niskotopliwą agarozę za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Upewnij się, że strona plastra jest skierowana do góry, a powierzchnia komory skierowana w dół. W razie potrzeby odpowiednio się zorientuj. Pozwól agarozie ostygnąć do temperatury RT do zestalenia.
10. Przytnij dodatkową agarozę otaczającą plastry. Ustaw blok agarozy tak, aby powierzchnia cięcia była równoległa do ostrza tnącego wibratomu. Za pomocą wibratomu wytnij odcinki o grubości 50 μm.
11. Napełnij naczynie z 24 dołkami 1x PBS. Przełóż sekcje do tego naczynia za pomocą pędzla z cienką końcówką. Wykonaj immunofluorescencję zgodnie ze standardowymi protokołami.

Wyniki

Mikroiniekcja służy do śledzenia i manipulowania pojedynczymi nerwowymi komórkami macierzystymi i ich potomstwem w żywej tkance oraz do śledzenia ich rozwoju w środowisku fizjologicznym. W tym artykule zademonstrowaliśmy zastosowanie robota do mikroiniekcji do celowania i automatycznego mikrowstrzykiwania organotypowych plastrów mysiego telecefalonu. Rysunek 2 ilustruje reprezentatywne obrazy pomyślnie wstrzykniętych komórek progenitorowych, a Rysunek 3 ilustruje wstrzyknięte nowonarodzone neurony. Po wstrzyknięciu barwnika Dextran Alexa-488 (lub Alexa-A555) komórki wydają się w pełni wypełnione barwnikiem. Jeśli chodzi o przodków wierzchołkowych (Ryc. 2), obrazowanie konfokalne pozwala zrekonstruować z wysoką rozdzielczością przestrzenną morfologię komórki, obecność - lub brak - przyczepu wierzchołkowego i podstawnego, a także połączyć badanie morfologiczne z ekspresją markera. Łącząc te kryteria, użytkownik może przypisać określony los komórkowy mikrowstrzykniętym komórkom i ich potomstwu. Jeśli chodzi o iniekcję neuronu, użytkownik może zrekonstruować morfologię neuronów, w tym strukturę i cechy dendrytu wierzchołkowego i aksonu. Zautomatyzowana mikroiniekcja może zapewnić znacznie wyższą przepustowość w porównaniu z ręczną mikroiniekcją (Rysunek 2B). Co więcej, oznakowanie EdU potwierdza, że automatyzacja nie ma wpływu na żywotność komórek (Rysunek 2C). Utrzymanie wycinka organotypowego w hodowli pozwala na śledzenie progresji linii mikrowstrzykniętych komórek (pokazaliśmy 4 - 24 godziny w Rysunek 2D). Jeśli roztwór do mikroiniekcji zawiera materiał genetyczny (DNA, mRNA, przewodniki CRISPR-Cas9) lub rekombinowane białka, pozwala to na zbadanie, czy i jak manipulacja wpływa na progresję linii.

Mikroiniekcja do pojedynczych nerwowych komórek macierzystych w tkance zapewnia doskonałą rozdzielczość pojedynczej komórki i z tego powodu została wykorzystana do analizy biologii komórek w zakresie progresji nerwowych komórek macierzystych i przejścia losu (Rysunek 3A). Mikroiniekcja pozwala na dostarczenie złożonej mieszaniny chemikaliów. Wcześniej wykorzystaliśmy tę funkcję do badania sprzężenia węzłowego w neuronalnych komórkach progenitorowych poprzez mieszanie przepuszczalnych ze szczelinowymi nieprzepuszczalnymi barwnikami fluorescencyjnymi¹². Rozszerzyliśmy poprzednie prace, badając sprzężenie złączowe w nowonarodzonych neuronach, wstrzykując Lucyfer Yellow wraz z Dextran-A555 (Figura 3B). Jak pokazano na Rysunek 3B, pewna część nowo narodzonych neuronów piramidowych jest sprzężona za pomocą połączeń szczelinowych z sąsiednimi neuronami. Ta obserwacja jest zgodna z ideą, że niedojrzałe neurony komunikują się za pośrednictwem połączenia szczelinowego^13,14. Co więcej, celowanie w neurony pokazuje, że zastosowanie robota do mikroiniekcji można uogólnić na kilka typów komórek w rozwijającym się mózgu ssaków. Ten eksperymentalny układ będzie przydatny do analizy biologii neuronów w tkance, na przykład poprzez dostarczanie określonych oligopeptydów, które zakłócają interakcje białko-białko.

Rysunek 1: Konfiguracja i protokół zautomatyzowanej mikroiniekcji. (A) Ogólny protokół przygotowania tkanek i automatycznych mikroiniekcji przy użyciu robota do mikroiniekcji. Prawa wstawka: Schemat kreskówkowy myszy Telencephalon przeznaczony do mikroiniekcji w tym protokole. (B) Schemat blokowy etapów zautomatyzowanego mikroiniekcji. (C) Schemat sprzętu robota do mikroiniekcji. (D) Graficzny interfejs użytkownika (GUI) oprogramowania używanego do sterowania i obsługi robota do mikroiniekcji. Ten rysunek jest zaadaptowany z ref.¹². Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Mikroiniekcja robotyczna do wierzchołkowych komórek progenitorowych. Schemat i oczekiwane wyniki przy użyciu robota do mikroiniekcji do celowania w progenitory wierzchołkowe (AP) przez powierzchnię wierzchołkową (iniekcja wierzchołkowa). (A) Górny rząd. Po lewej: schemat procesu. Po prawej: GUI z odpowiednimi parametrami do iniekcji wierzchołkowej. Dolny rząd. Po lewej: zdjęcie z kontrastem fazowym wykonane podczas zabiegu iniekcji (V: komora; BL: blaszka podstawna). Po prawej: reprezentatywne wyniki pokazujące mikroiniekcyjne punkty dostępowe. Linia przerywana reprezentuje komorę (V). Podziałka: 10 μm. (B) Udane iniekcje na minutę dla początkującego użytkownika korzystającego z ręcznego systemu mikroiniekcji, doświadczonego użytkownika korzystającego z ręcznego systemu mikroiniekcji oraz robota do mikroiniekcji. (C) Włączenie EdU do komórek z mikrowstrzyknięciem i z komórek bez wstrzyknięcia w obszarze wstrzyknięcia. Organotypowe plastry mysiego kresomózgowia grzbietowego E14.5 były albo (i) niewstrzykiwane, albo (ii) poddawane ręcznej lub automatycznej mikroiniekcji (wstrzykiwany plasterek) przy użyciu Dextran-A488 (do wstrzykiwacza ręcznego i automatycznego). Plastry trzymano w kulturze w obecności EdU przez 24 godziny, następnie utrwalono je i wybarwiono pod kątem DAPI i EdU. Wstrzyknięte i niewstrzyknięte komórki w obszarze wstrzyknięcia oceniano pod kątem dodatniego wyniku EdU. (D) Korzystanie z robota do mikroiniekcji Śledzenie linii. Barwnik fluorescencyjny (Dx3-A555, magenta) jest wstrzykiwany do pojedynczej nerwowej komórki macierzystej (t = 0 h). Barwnik fluorescencyjny jest dzielony na komórki potomne (d1, d2) podczas mitozy. Pozwala to na śledzenie potomstwa wstrzykniętej komórki (t = 4 h i 24 h) i ujawnienie progresji linii w czasie. Dla t = 24 h pokazujemy kilka przykładów potomstwa, które spodziewamy się znaleźć. Podziałka skali: 10 μm. Wykresy w B i C pochodzą z ref.¹² Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 3: Mikroiniekcja robota do neuronów. Schemat i oczekiwane wyniki przy użyciu robota do mikroiniekcji do celowania w neurony piramidowe (N) przez powierzchnię podstawy (iniekcja podstawna). (A) Górny rząd. Po lewej: schemat procesu. Po prawej: graficzny interfejs użytkownika z odpowiednimi parametrami do iniekcji podstawowej. Dolny rząd. Po lewej: zdjęcie z kontrastem fazowym wykonane podczas zabiegu iniekcji (V: komora; BL: blaszka podstawna). Po prawej: reprezentatywne wyniki pokazujące mikrowstrzykniętą N. Linia przerywana reprezentuje blaszkę podstawną (BL). Podziałka: 10 μm. (B) Zastosowanie automatycznego wstrzykiwacza do badania komunikacji szczelinowej w tkance. Neuronom piramidowym wstrzyknięto roztwór zawierający dwa barwniki: nieprzepuszczalny dla węzłów szczelinowych Dx-A555 (nie pokazano) i przepuszczalny dla węzłów szczelinowych Lucyfer Yellow (zielony). Dx-A555 jest ograniczony do komórki docelowej (gwiazdki), podczas gdy LY dyfunduje do komórek, które są połączone złączem szczelinowym z komórką docelową (linie przerywane). Lewy panel: Niska ekspozycja, widoczne są tylko mikrowstrzyknięte komórki. Prawy panel: Wysoka ekspozycja umożliwia wizualizację wstrzykniętych komórek, a także sprzężonych komórek (linie przerywane). Podziałka skali: 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający: Rozwiązywanie kilku typowych błędów, które pojawiają się podczas mikroiniekcji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Mikroiniekcja do pojedynczych nerwowych komórek macierzystych w tkance zapewnia doskonałą rozdzielczość pojedynczej komórki i z tego powodu została wykorzystana do analizy biologii komórek pod kątem progresji nerwowych komórek macierzystych i przejścia losu (ryc. 2; patrz także 10,11,12). Zautomatyzowana procedura mikroiniekcji może być wykonywana na innych typach komórek zarówno u myszy embrionalnych, jak i w ludzkiej tkance mózgowej. Reprezentatywne wyniki mikroiniekcji nowonarodzonych neuronów poprzez celowanie w podstawową powierzchnię kresomózgowia przedstawiono na rycinie 3.

Ustaloną tutaj zasadę można zastosować do celowania w kilka różnych typów komórek w embrionalnych mózgach myszy i mózgach ludzkich. Wcześniej wykazaliśmy, że robot do mikroiniekcji może być również używany do celowania w pojedyncze komórki progenitorowe w tyłomózgowiu myszy i kresomózgowiu oraz neurony noworodkowe w rozwijającej się korze nowej^{myszy i człowieka 12}. Aby uzyskać najlepsze efekty procedury iniekcji, należy zoptymalizować wszystkie kroki przed rozpoczęciem iniekcji. Ważne jest, aby dokładnie rozważyć i zoptymalizować przygotowanie żywotnych i dobrze zachowanych wycinków tkanki organotypowej z tkanki mózgowej (ryc. 1). Bardzo ważne jest, aby być szybkim w procedurze rozwarstwiania i krojenia zilustrowanej na rysunku 1. W przypadku iniekcji wierzchołkowej ukierunkowanej na AP należy wybrać plastry pokazujące idealną orientację powierzchni wierzchołkowej. W przypadku wstrzykiwania AP idealną orientacją jest powierzchnia wierzchołkowa prostopadła do dna szalki Petriego. Każda inna orientacja również będzie dopuszczalna, jednak powierzchnia wierzchołkowa prostopadła do szalki Petriego zapewnia szerszą powierzchnię do wstrzyknięcia, zwiększając w ten sposób powodzenie wstrzyknięcia. W przypadku wstrzykiwania do neuronów, orientacja wycinka ma niewielki lub żaden wpływ.

Po wybraniu plastrów do wstrzyknięcia, procedura wstrzykiwania na plasterek trwa około 5 minut. Biorąc pod uwagę, że pracuje się z żywą tkanką, zdecydowanie zaleca się przyspieszenie procedury iniekcji. W tym celu zalecamy ustawienie wszystkich parametrów wstrzyknięcia za pomocą graficznego interfejsu użytkownika (rysunek 1D) przed przygotowaniem tkanki, aby skrócić niepotrzebny czas oczekiwania. Aby uzyskać informacje na temat rozwiązywania problemów, zapoznaj się z plikiem uzupełniającym.

W przypadku długotrwałej hodowli plastrów, kroki po zautomatyzowanej procedurze mikroiniekcji mogą mieć wpływ na zdrowie komórek, a tym samym na eksperyment. Dlatego zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie testu kontroli jakości i optymalizację warunków hodowli plastrów. Aby ocenić żywotność komórek po procedurze krojenia i wstrzykiwania, przeprowadziliśmy znakowanie EdU podczas hodowli i określiliśmy ilościowo liczbę jąder piknotycznych (wskaźnik zastępczy dla komórek apoptotycznych) w kulturach i wstrzykniętej tkance¹². Te oceny ilościowe nie wykazały żadnego znaczącego wpływu mikroiniekcji na żywotność tkanek (Figura 2C). Zalecamy przeprowadzenie podobnych kontroli jakości podczas ustanawiania procesu organotypowego krojenia tkanek i mikroiniekcji w laboratorium.

W porównaniu z ręcznym mikroiniekcją, robot do mikroiniekcji ma kilka zalet. Po pierwsze, krzywa uczenia się dla użytkownika jest mniej stroma w porównaniu z ręcznym wstrzykiwaniem: nowy użytkownik osiągnie wysoką biegłość po ograniczonej liczbie sesji, zwykle 1 lub 2. Po drugie, w przypadku ręcznej mikroiniekcji, porównywalna biegłość wymaga miesięcy szkolenia. Procedura iniekcji jest szybsza i bardziej wydajna (ryc. 2B). Określiliśmy ilościowo te parametry i stwierdziliśmy, że robot do mikroiniekcji przewyższał wykwalifikowanego użytkownika ręcznego pod względem powodzenia iniekcji (% udanego wstrzyknięcia/całkowita liczba wstrzyknięć) oraz całkowitej liczby wstrzyknięć na jednostkę czasu¹². Skutkuje to ogólnym wzrostem wydajności wtrysku o 300% (% udanego wtrysku/min) dla robota do mikroiniekcji w porównaniu z wykwalifikowanym użytkownikiem. Wzrost wydajności był jeszcze wyraźniejszy w porównaniu z robotem do mikroiniekcji z początkującym użytkownikiem i osiągnął 700%. Wreszcie, co nie mniej ważne, robota do mikroiniekcji można łatwo zaprogramować tak, aby systematycznie badał wszystkie parametry przestrzenne. Jest to szczególnie korzystne w przypadku adaptacji robota do mikroiniekcji do celowania w nowe komórki lub tkanki lub w przypadku używania robota do mikroiniekcji do celów wymagających różnej rozdzielczości przestrzennej.

Budowa robota do mikroiniekcji wymaga minimalnych zmian w istniejącym mikroskopie epifluorescencyjnym¹². Wcześniej udostępniliśmy instrukcje dotyczące tej adaptacji w https://github.com/bsbrl/Autoinjector. Po skonfigurowaniu sprzętu protokół ten dostarcza kluczowych szczegółów metodologicznych do pomyślnego przeprowadzenia automatycznych mikroiniekcji. Ogólnie rzecz biorąc, robot do mikroiniekcji osiąga udaną szybkość wtryskiwania wynoszącą 15,52 + 2,48 wstrzyknięć/min, czyli 15 razy większą niż w przypadku niedoświadczonego użytkownika (1,09 ± 0,67 wstrzyknięć/min) i 3 razy większą niż w przypadku doświadczonego użytkownika (4,95 ± 1,05 wstrzyknięć/min)¹². Ta poprawa skuteczności wstrzykiwań umożliwia zarówno początkującym, jak i doświadczonym użytkownikom wstrzykiwanie większej liczby komórek w krótszym czasie, co jest niezbędne do zachowania żywotności tkanek. Dodatkowo robot do mikroiniekcji można dostosować, a trajektorię, głębokość wtrysku, liczbę wstrzyknięć, odstępy między iniekcjami można dostroić za pomocą graficznego interfejsu użytkownika. Cechy te pozwalają na wykorzystanie robota do mikroiniekcji jako narzędzia do optymalizacji wcześniej pracochłonnych eksperymentów oraz do badania zasadniczo nowych eksperymentów, które wymagają wyższej wydajności niż było to wcześniej możliwe.

Główne ograniczenia opisanej przez nas procedury mikroiniekcji są związane z przygotowaniem wycinków tkanki, co jest kluczowym krokiem, który wymaga daleko idącej optymalizacji. Ponadto mikroiniekcja opiera się na obecności powierzchni, do której można dotrzeć szklaną pipetą. Ta funkcja ogranicza rodzaj tkanek i ich lokalizacje, które mogą być celowane za pomocą mikroiniekcji przy użyciu obecnej konfiguracji.

Robot do mikroiniekcji wykorzystuje obecnie obrazowanie w jasnym polu i był stosowany w preparatach in vitro do wycinków mózgu. W przyszłości robot do mikroiniekcji może być połączony z obrazowaniem 2-fotonowym, aby zwiększyć specyficzność celowania w pojedyncze komórki in vivo w celu znakowania molekularnego lub barwnikowego. Takie wysiłki zostały już podjęte w przypadku elektrofizjologii pojedynczych komórek^15,16. Obecne urządzenie wymaga ręcznej obserwacji procedury mikroiniekcji. Przyszłe wersje mogą obejmować strategie czyszczenia zatkanych pipet do mikroiniekcji¹⁷ lub integracji robotów do obsługi płynów¹⁸ w celu multipleksowanych, w pełni autonomicznych mikroiniekcji. Urządzenia te mogą zwiększyć skalę mikroiniekcji o rzędy wielkości. Dostosowanie algorytmów do równoległego sterowania wieloma pipetami do mikroiniekcji¹⁹ może umożliwić multipleksowane dostarczanie dziesiątek barwników i odczynników molekularnych do tych samych komórek w ramach tych samych eksperymentów. Ma to potencjał, aby otworzyć nowe możliwości badań molekularnych w tkankach.

Robot do mikroiniekcji może być używany do znakowania funkcjonalnie zidentyfikowanych komórek za pomocą kodów kreskowych DNA lub RNA. To z kolei można połączyć z innymi technikami analizy pojedynczych komórek, takimi jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNAseq) i mikroskopia elektronowa. Nasze wstępne wyniki pokazują, że mikrowstrzyknięte komórki i ich potomstwo można odzyskać i wyizolować za pomocą dysocjacji tkanek, a następnie sortowania FACS (Taverna, wyniki niepublikowane). Posortowane komórki FACS można następnie wykorzystać do seq scRNAseq. Co więcej, wstępne wyniki pokazują, że możliwości robota do mikroiniekcji w zakresie rozdzielczości pojedynczych komórek mogą być wykorzystane w połączeniu z analizą mikroskopu elektronowego w celu zbadania biologii komórek macierzystych neuronów w tkance w wysokiej rozdzielczości przestrzennej (Taverna i Wilsch-Bräuninger, wyniki niepublikowane). Dane te sugerują, że robot do mikroiniekcji może być używany jako narzędzie do korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej w tkance oraz w szerszym znaczeniu do multimodalnej analizy tożsamości i zachowania komórek w tkance.

Mikroiniekcja opiera się na zastosowaniu ciśnienia i można sobie pozwolić na wstrzykiwanie roztworów o dużej złożoności molekularnej (np. całego transkryptomu). Ta cecha mikroiniekcji była wykorzystywana w przeszłości do izolowania i klonowania receptorów bramkowanych ligandem²⁰. W związku z tym robot do mikroiniekcji może być wykorzystywany do modelowania i badania cech wielogenowych na poziomie komórkowym. W połączeniu ze strategią sub-poolingu, robot do mikroiniekcji może być również wykorzystywany jako platforma do identyfikacji minimalnego zestawu genów napędzających określoną cechę/zachowanie komórkowe. Do tej pory robot do mikroiniekcji był używany do manipulowania biochemią komórki poprzez dostarczanie mRNA, DNA lub rekombinowanych białek 10,21,22^. Przewidujemy zastosowanie robota do mikroiniekcji w badaniu biofizyki przestrzeni wewnątrzkomórkowej, na przykład poprzez dostarczanie nanomateriałów lub nanomaszyn, które umożliwiają wykrywanie i/lub manipulowanie właściwościami biofizycznymi przestrzeni wewnątrzkomórkowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chemicals
Agaroza, niskotopliwy	Carl Roth	Cat# 6351.2
Agaroza, Wild Range	Sigma-Aldrich	Cat# A2790
Best-CA 221 Klej	Best Klebstoffe GmbH & Co.KG	Cat# CA221-10ml
B-27 Suplement	Thermo Fisher Scientific	Cat# 17504044
Cellmatrix Type-IA (Kolagen, Typ!)	FUJIFILM Wako Chemicals	Cat# 637-00653
			destylowana
DMEM-F12, niezależna od CO2 (bez czerwieni fenolowej)	Sigma-Aldrich	Cat# D2906
DMEM-F12, niezależna od CO2 (z czerwienią fenolową)	Sigma-Aldrich	Cat# D8900
HEPES-NAOH, pH 7,2, 1M (bufor HEPES)	Carl Roth	Cat# 9105.3
L-glutamina, 200 mM	Thermo Fisher Sientific	Cat# 25030024
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich	Cat# 81381
N-2 Suplement	Thermo Fisher Scientific	Cat# 17502048
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	Cat# 21103049
Woda wolna od nukleaz	Thermo Fisher Scientific	Cat# AM9937
O2 (40%), CO2 (5%), N2 (55%) Mieszanka, 50 litrów
Paraformaldehydu	Merck	Cat# 818715
PBS
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	Cat# 15140122
Serum dla szczurów	Charles River Laboratories
	Japonia
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)	Merck	Cat# 106323
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Merck	Cat# 106482
Tyrode' s sól	Sigma	Cat# T2145-10x1L)
Equipment
kapilary ze szkła borokrzemianowego, średnica zewnętrzna 1,2 mm x średnica wewnętrzna 0,94 mm	Sutter Instruments	Cat# BF-120-94-10
System filtrów butelkowych, 500 ml	Corning	Cat# 430769
Computer PC
Niestandardowa platforma		Niestandardowa platforma
Elektroniczny regulator ciśnienia	Parker Hannifin	Cat# 990-005101-002
Probówki Falcon, 15 ml	Corning	Cat# 430791
Falcon, 50 ml	Corning	Cat# 430829
Pędzel
Flaming/Brown ściągacz do mikropipet	Sutter Instruments	Cat# P-97
Kleszcze, Dumont nr 3	Narzędzia do nauki	Nr kat.# 11231-30
Kleszcze, Dumont nr 5	Narzędzia do nauki o sztuce	kat.# 11255-20
Kleszcze, Dumont nr 55	Narzędzia do nauki o nauce	kat.# 11252-20
Blok grzewczy	Labtech International	Cat # Dri block Digi2
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny	Zeiss	Cat# Axiovert 200
Źródło światła	Olympus	Cat# Highlight 3100
Ręczny regulator ciśnienia	McMaster Carr	Cat# 0-60 PSI 41795K3
Końcówki do mikroładowarek	Eppendorf	Cat# 5242956.003
Mikrokontroler	Arduino	Cat# Arduino Due
Kamera mikroskopowa Hamamatsu Orca Flash 4.0 V3
Zmotoryzowany stolik XY do mikroskopu
Płytka wielodołkowa, 24 dołki	Pipety Nunc	Cat# 142475
Pasteur, plastikowa
szalka Petriego, 60 x 15 mm	Greiner	Cat# 628102
Petriego, 35 x 10 mm	Nunc	Cat# 153066
szalka Petriego, 34 x 14 mm, w tym szklana osłona Microwell nr 1.5	MatTek	Cat# P35G-1.5-14-C
Uchwyt na pipety	Warner Instruments	Cat# 64-2354 MP-s12u
Pipeta i końcówki
Filament ściągający, 3,0 mm kwadratowy filament	pudełkowy Sutter Instrument	Cat# FB330B
Pudełko do inkubacji kultur plastrów	MPI-CBG	Cat# Wykonany
zawór elektromagnetyczny	Cat# LHDA053321H-A
Stereomikroskop	Olympus	Cat# SZX12
Wirówka stołowa	Heraeus	Cat# 5431622
Termometr
Trójosiowy manipulator	Sensapex Inc	Cat# uMP tree-axis uMP
Vibratome	Leica	Cat# VT1000s
Inkubator systemu hodowli całych zarodków	Ikemoto Company	Cat# RKI-10-0310
Waterbath
Software and Algorithms
Arduino	Arduino
Fiji	RRID: SCR_002285
Python	Python Podstawy oprogramowania	Python 2.7.12
ZEN		RRID: SCR_013672