Ten protokół demonstruje użycie platformy robotycznej do mikroiniekcji do pojedynczych nerwowych komórek macierzystych i neuronów w wycinkach mózgu. Technika ta jest wszechstronna i oferuje metodę śledzenia komórek w tkance z wysoką rozdzielczością przestrzenną.
Artykuł metodologiczny
Manipulacja pojedynczymi neuronalnymi komórkami macierzystymi i neuronami w wycinkach mózgu za pomocą mikroiniekcji robotycznej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Głównym pytaniem w neurobiologii rozwojowej jest to, w jaki sposób nerwowe komórki macierzyste i progenitorowe tworzą mózg. Aby odpowiedzieć na to pytanie, należy oznaczyć, manipulować i śledzić pojedyncze komórki w tkance mózgowej z wysoką rozdzielczością w czasie. Zadanie to jest niezwykle trudne ze względu na złożoność tkanek w mózgu. Niedawno opracowaliśmy robota, który wprowadza igłę do mikroiniekcji w tkankę mózgową po wykorzystaniu obrazów uzyskanych z mikroskopu do dostarczania femtolitrowych objętości roztworu do pojedynczych komórek. Operacja robotyczna zwiększa się, uzyskując ogólną wydajność, która jest o rząd wielkości większa niż w przypadku ręcznej mikroiniekcji i pozwala na precyzyjne etykietowanie i elastyczną manipulację pojedynczymi komórkami w żywej tkance. Dzięki temu można mikrowstrzykiwać setki komórek w jednym wycinku organotypowym. W artykule przedstawiono zastosowanie robota do mikroiniekcji do automatycznego mikrowstrzykiwania nerwowych komórek progenitorowych i neuronów w wycinkach tkanki mózgowej. W szerszym ujęciu można go stosować na dowolnej tkance nabłonkowej o powierzchni, do której można dotrzeć pipetą. Po skonfigurowaniu robot do mikroiniekcji może wykonać 15 lub więcej mikroiniekcji na minutę. Robot do mikroiniekcji, ze względu na swoją przepustowość i wszechstronność, sprawi, że mikroiniekcja stanie się bardzo prostą, wysokowydajną techniką manipulacji komórkami, która może być stosowana w bioinżynierii, biotechnologii i biofizyce do wykonywania analiz pojedynczych komórek w organotypowych wycinkach mózgu.
Wprowadzenie
Ten protokół opisuje użycie robota do namierzania i manipulowania pojedynczymi komórkami w wycinkach tkanki mózgowej, skupiając się w szczególności na pojedynczych nerwowych komórkach macierzystych i neuronach. Robot został opracowany, aby odpowiedzieć na kluczowe pytanie w neurobiologii rozwojowej, a mianowicie, w jaki sposób nerwowe komórki macierzyste i progenitorowe przyczyniają się do morfogenezy mózgu1,2,3,4,5. Aby odpowiedzieć na to pytanie, należy oznaczyć i śledzić pojedyncze nerwowe komórki macierzyste oraz śledzić ich progresję w czasie, aby skorelować zachowanie pojedynczej komórki z morfogenezą tkanek. Można to osiągnąć na różne sposoby, np. poprzez elektroporację tkanki mózgowej w macicy lub znakowanie pojedynczej komórki za pomocą matryc lipofilowych. Chociaż metody te są skuteczne, brakuje im precyzyjnej rozdzielczości pojedynczej komórki (elektroporacja) i/lub możliwości manipulowania przestrzenią wewnątrzkomórkową (barwnik lipofilowy). Aby sprostać temu wyzwaniu, opracowano mikroiniekcję do pojedynczych komórek6,7,8. Podczas mikroiniekcji pipeta jest na krótko wprowadzana do pojedynczej komórki w nienaruszonej tkance pod ciśnieniem w celu mikroiniekcji femtolitrowych objętości odczynników9. Wcześniej opisaliśmy ręczną procedurę mikrowstrzykiwania pojedynczych nerwowych komórek macierzystych do tkanki organotypowej (Rysunek 1A)10,11. Mikroiniekcja do nerwowych komórek macierzystych polega na użyciu mikropipety, którą wprowadza się do pojedynczych nerwowych komórek macierzystych w celu wstrzyknięcia roztworu zawierającego barwnik fluorescencyjny wraz z innymi cząsteczkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Selektywne celowanie w nerwowe komórki macierzyste osiąga się poprzez zbliżenie się do rozwijającego się kresomózgowia przez powierzchnię komory (lub komorę, patrz rysunek w Rysunek 1A), która jest utworzona przez wierzchołkową błonę plazmatyczną wierzchołkowych przodków (rysunek w Rysunek 1A). Proces ten musi być powtórzony dla każdej komórki, którą eksperymentator pragnie wstrzyknąć. Co więcej, powodzenie mikroiniekcji zależy od precyzyjnej kontroli głębokości i czasu wstrzyknięcia mikropipety w tkankę. Tak więc, pomimo wyjątkowych zalet, ręczne mikroiniekcja jest niezwykle żmudna i wymaga znacznej praktyki, aby wykonać ją z rozsądną przepustowością i wydajnością, co utrudnia stosowanie tej techniki w skalowalny sposób. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowaliśmy niedawno robota sterowanego obrazem, Autoinjector12 (lub robota do mikroiniekcji), który może automatycznie wykonywać mikroiniekcje do pojedynczych komórek.
Robot do mikroiniekcji wykorzystuje algorytmy obrazowania mikroskopowego i widzenia komputerowego, aby precyzyjnie celować w określone miejsca w przestrzeni 3D w tkance do mikroiniekcji (Rysunek 1B). Robot do mikroiniekcji może być skonstruowany poprzez dokonanie stosunkowo prostych modyfikacji istniejącego zestawu do mikroiniekcji. Ogólny schemat robota do mikroiniekcji jest pokazany w Rysunek 1C. Pipeta jest zamontowana w uchwycie na pipety przymocowanym do manipulatora trójosiowego. Kamera mikroskopowa służy do pozyskiwania obrazów tkanki i igły do mikroiniekcji. Niestandardowy system regulacji ciśnienia służy do kontrolowania ciśnienia wewnątrz pipety, a programowalny mikromanipulator służy do kontrolowania pozycji pipety z mikrowtryskiwaczem. Obrazy z kamer tkanki i pipety do mikroiniekcji służą do określenia położenia przestrzennego końcówki pipety do mikroiniekcji oraz miejsc, w których należy wykonać mikroiniekcję. Następnie oprogramowanie oblicza trajektorie potrzebne do przemieszczenia pipety w tkance. Cały sprzęt jest kontrolowany przez oprogramowanie, które wcześniej opracowaliśmy. Całe oprogramowanie jest napisane w języku kodowania (np. Python i Arduino) i można je pobrać ze strony https://github.com/bsbrl/Autoinjector wraz z instrukcjami. Graficzny interfejs użytkownika (GUI) umożliwia użytkownikowi obrazowanie tkanki i mikropipety oraz dostosowanie trajektorii mikroiniekcji. Nasz system można stworzyć za pomocą stosunkowo prostych modyfikacji mikroskopu odwróconego wyposażonego w filtry jasnego pola i epifluorescencji.
Po pierwsze, podajemy instrukcje dotyczące przygotowania wycinków tkanki organotypowej mózgu do mikroiniekcji. Następnie w protokole przedstawiono uruchomienie robota do mikroiniekcji, po którym następują kroki przygotowawcze, takie jak kalibracja ruchu pipety, które należy wykonać przed mikroiniekcją. Następnie następuje zdefiniowanie parametrów wtrysku. Następnie użytkownik może zdefiniować trajektorię używaną przez robota do mikroiniekcji i rozpocząć procedurę iniekcji. Mikrowstrzyknięta tkanka (w tym przypadku wycinki tkanki organotypowej mózgu) może być przechowywana w hodowli przez różne okresy czasu, w zależności od projektu eksperymentalnego10,11. Tkanka może być przetwarzana w celu śledzenia i badania tożsamości i losu wstrzykniętych komórek i ich potomstwa. Alternatywnie, mikrowstrzyknięte komórki można obserwować za pomocą obrazowania na żywo. W ramach tego protokołu demonstrujemy zastosowanie robota do automatycznej mikroiniekcji nerwowych komórek progenitorowych w organotypowych wycinkach grzbietowego kresomózgowia myszy E14.5. Robot jest ponadto zdolny do mikroiniekcji do neuronów noworodków w kresomózgowiu myszy, a także w kresomózgowiu ludzkiego płodu12.
Podsumowując, opisujemy platformę robotyczną, która może być używana do śledzenia i manipulowania pojedynczymi komórkami w tkance. Platforma wykorzystuje ciśnienie i dlatego jest niezwykle wszechstronna, jeśli chodzi o chemiczny charakter związku do wstrzykiwania. Ponadto może być przystosowany do komórek docelowych innych niż komórki macierzyste. Oczekujemy, że nasz system będzie można łatwo dostosować również do innych systemów modelowych.
Protokół
Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckim ustawodawstwem dotyczącym dobrostanu zwierząt, a niezbędne licencje uzyskano od regionalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach w Dreźnie, Niemcy (Tierversuchskommission, Landesdirektion Dresden). Plastry organotypowe przygotowano z mysiego zarodka kresomózgowia E14.5 lub E16.5 C57BL/6 (Janvier Labs).
1. Instalacja oprogramowania
- Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby zainstalować oprogramowanie z https://github.com/bsbrl/Autoinjector.
2. Przygotowanie odczynników i pipet
- Agaroza: Przygotować 3% agarozy, rozpuszczając oddzielnie 3 g agarozy o szerokim zakresie i 3 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 100 ml PBS klasy hodowli komórkowej odpowiednio w dwóch oddzielnych szklanych butelkach o pojemności 200 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej do 3 miesięcy.
- Roztwór Tyrode: Rozpuścić 1 g wodorowęglanu sodu i soli Tyrode'a (użyć zawartości całej butelki) oraz 13 ml 1 M HEPES w 1 l wody destylowanej. Dostosować pH do 7,4. Przefiltrować roztwór przez filtr butelkowy 0,2 μm.
- Pożywka do hodowli w plastrach (SCM): Dodaj 10 ml surowicy szczurów, 1 ml 2 ml glutaminy, 1 ml penicyliny-streptomycyny (100x), 1 ml suplementu N-2 (100x), 2 ml suplementu B27 (50x) i 1 ml buforu HEPES (pH 7,3) do 84 ml pożywki neurobazalnej. Porcję 5 ml SCM do probówek o pojemności 15 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Pożywka do mikroiniekcji niezależna od CO2 (CIMM): Przygotować 5x modyfikowany DMEM roztwór o niskiej zawartości glukozy (bez czerwieni fenolowej), rozpuszczając proszek w 200 ml wody destylowanej. Przefiltruj roztwór przez filtr butelkowy 0,2 μm (w przypadku proszku DMEM użyj zawartości całej butelki). Aby przygotować 100 ml CIMM, wymieszaj 20 ml 5x roztworu modyfikowanego DMEM, 1 ml buforu HEPES, 1 ml suplementu N2 (100x), 2 ml suplementu B27 (50x), 1 ml penicyliny-streptomycyny (100x), 1 ml 2 mM glutaminy i 74 ml wody destylowanej. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
- Bufor do rekonstytucji: Przygotować bufor do rozpuszczenia, rozpuszczając 262 mM NaHCO3, 0,05 N NaOH, 200 mM HEPES w wodzie destylowanej. Wysterylizuj roztwór przez filtrację przez system filtrów 0,22 μm do sterylnej szklanej butelki. Porcję 500 μl buforu do rozpuszczenia w hermetycznych probówkach do mikrowirówek. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Barwnik do mikroiniekcji: Rozpuść znakowany fluorescencyjnie dekstran w wodzie destylowanej wolnej od RNaz (końcowe stężenie 10 μg/μL). Przygotować 5 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
- Wyciągnij pipety do mikroiniekcji z kapilar ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1,2 mm, średnica wewnętrzna 0,94 mm) za pomocą ściągacza do mikropipet. Chroń pipety przed kurzem. Nie przechowuj pipet dłużej niż 2 – 3 dni. W tym eksperymencie parametrami ciągnięcia były CIEPŁO: temperatura rampy +1 – 5; UCIĄG: 100; VEL: 110; DEL: 100. HEAT i VEL to parametry, które mają największy wpływ na kształt i rozmiar pipety.
UWAGA: Optymalna pipeta do mikroiniekcji ma długą i elastyczną końcówkę, aby uniknąć uszkodzenia komórek podczas mikroiniekcji.
3. Przygotowanie plastra tkanki
- Rozpuść 3% agarozę o szerokim zakresie za pomocą kuchenki mikrofalowej przed sekcją tkanki mózgowej. Nie dopuścić do zestalenia się agarozy, przechowując ją w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przed osadzeniem. Upewnij się, że pipety są chronione przed kurzem. Nie przechowuj pipet dłużej niż 2 – 3 dni.
- Rozmrozić podwielokrotność SCM i ogrzać 10–12 ml CIMM i 20 ml roztworu Tyrode'a do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
- Zmieszać znacznik fluorescencyjny (sprzężony z Dextran-3000 lub Dextran-10000-Alexa; stężenie końcowe 5 – 10 μg/μL) z innymi substancjami chemicznymi, które mają zostać wstrzyknięte. Odwirować roztwór do mikroiniekcji o sile 16 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i przenieść do nowej probówki. Roztwór do mikroiniekcji należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.
- Użyj głów mysich zarodków E13.5 – E16.5 do przygotowania organotypowych wycinków tkanki kresomózgowia. Usuń skórę i otwórz czaszkę za pomocą kleszczy, przesuwając się wzdłuż linii środkowej. Wypreparuj mózg embrionalny z otwartej czaszki i usuń opony mózgowe pokrywające tkankę mózgową, zaczynając od brzusznej strony mózgu. Pozostaw wypreparowany cały mózg w roztworze Tyrode'a na bloku grzewczym o temperaturze 37 °C.
UWAGA: Wszystkie etapy preparacji opisane w ppkt 3.4 muszą być wykonane we wstępnie podgrzanym roztworze Tyrode. - Wlej szeroką gamę stopionej agarozy do jednorazowej formy do zatapiania. Gdy agaroza zostanie schłodzona do temperatury 38 – 39 °C, ostrożnie przenieś do niej mózgi (maksymalnie 4) za pomocą pipety Pasteura. Na tym etapie zawsze używaj końcówek do wycinania.
- Wymieszaj agarozę wokół tkanki za pomocą szpatułki lub kleszczy Dumont #1 bez dotykania tkanki. Niech agaroza zestali się w temperaturze pokojowej. Gdy agaroza zastygnie, odetnij nadmiar agarozy otaczającej tkankę.
- Napełnij tacę buforową PBS. Ustaw mózg tak, aby oś rostro-ogonowa tkanki była prostopadła do tacy (użyj jako punktu orientacyjnego opuszki węchowe, reprezentujące najbardziej rostralną część mózgu). Pokrój plastry 250 μm za pomocą wibratomu.
- Napełnij szalkę Petriego o średnicy 3,5 cm 2 ml podgrzanego podłoża. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura przenieś plastry (10 - 15) do tego naczynia. Po zakończeniu przenieś szalkę Petriego z plastrami do inkubatora do hodowli plastrów. Plastry należy przechowywać w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 40%O2 / 5% CO2 / 55% N2 do momentu użycia.
4. Mikroiniekcja
- Włącz komputer, mikroskop, kamerę mikroskopową, manipulatory, zestaw ciśnieniowy i czujnik ciśnienia. Załaduj aplikację, klikając plik "launchapp.py" w głównym folderze pobranym z GitHub i określ ustawienia urządzenia na wyskakującym ekranie (instrukcje instalacji znajdują się w kroku 1.1).
- Wytworzyć ciśnienie na zewnątrz, aby zapobiec niepożądanemu zatkaniu przed zanurzeniem pipety w roztworze. Aby wywrzeć nacisk na pipetę, przesuń pasek kompensacji ciśnienia do pozycji 24 – 45% i kliknij przycisk Set Values (Ustaw wartości). Następnie dostosuj ciśnienie do wystarczającego ciśnienia, przekręcając pokrętło mechanicznego zaworu ciśnienia na 1 – 2 PSI (69 – 138 mbar), zgodnie ze wskazaniami czujnika ciśnienia.
- Przenieś plastry na 3,5 cm szalkę Petriego zawierającą 2 ml wstępnie podgrzanego CIMM. Umieść plastry do mikroiniekcji na środku szalki Petriego. Przenieść szalkę Petriego do wstępnie podgrzanego (37 °C) etapu mikroiniekcji.
- Napełnij pipetę do mikroiniekcji 1,4–1,6 μl roztworu do mikroiniekcji (od kroku 3.3) za pomocą plastikowej pipety z długą końcówką. Włożyć pipetę do mikroiniekcji na uchwyt na pipetę.
- Używając najmniejszego powiększenia mikroskopu, ustaw ostrość wycinka i skieruj mikropipetę na to pole view (FOV) tak, aby była skupiona na tej samej płaszczyźnie co tarcza wycinka. Przełącz wyjście mikroskopu na kamerę, aby zobaczyć pole widzenia w aplikacji.
- Kliknij przycisk powiększenia w lewym górnym rogu interfejsu, aby rozpocząć kalibrację urządzenia. Pojawi się okno z prośbą o wybranie powiększenia. Wybierz powiększenie 10x lub dowolne powiększenie, na które ustawiony jest obiektyw (np. 4x, 10x, 20x, 40x) i naciśnij OK. Oprogramowanie zakłada, że wewnętrzna soczewka obiektywu ma powiększenie 10x (najczęstsze powiększenie soczewki obiektywu).
- Ponownie ustaw ostrość końcówki pipety za pomocą pokrętła mikrometrycznego mikroskopu i kliknij końcówkę pipety kursorem. Następnie naciśnij przycisk kroku 1.1 i naciśnij OK w wyskakującym okienku. Pipeta przesunie się w kierunku Y. Kliknij końcówkę pipety i naciśnij przycisk kroku 1.2. Na koniec wprowadź wartość 45 w polu Kąt pipety i naciśnij przycisk Ustaw kąt.
- Wprowadź żądane parametry do panelu sterowania Automatyczne mikroiniekcje. W przypadku mikroiniekcji do wierzchołkowych komórek progenitorowych należy ustawić odległość iniekcji na 20 – 40 μm, a głębokość na 10 – 15 μm. W przypadku mikroiniekcji do neuronów należy ustawić odległość iniekcji 30 – 40 μm od strony podstawnej, a głębokość na 10 – 30 μm w zależności od tego, co jest celowane. Zawsze ustawiaj prędkość na 100%. Kliknij Ustaw wartości.
UWAGA: Odległość podejścia to odległość, na jaką pipeta wyciąga się z tkanki przed przejściem do następnej odległości wstrzyknięcia, głębokość to głębokość w tkance, w którą przechodzi mikroiniekcja, odstępy to odległość wzdłuż linii między sekwencyjnymi wstrzyknięciami, prędkość to prędkość pipety w μm/s. - Kliknij przycisk Narysuj krawędź i przeciągnij kursor wzdłuż żądanej trajektorii w wyskakującym okienku, aby zdefiniować trajektorię wstrzyknięcia. W przypadku mikroiniekcji progenitorowych komórek macierzystych, brzuszna strona powierzchni kresomózgowia jest ukierunkowana, jak pokazano na Rysunek 2A. Przesuń pipetę na początek linii i kliknij końcówkę pipety. Kliknij opcję Uruchom trajektorię, aby rozpocząć mikrowstrzykiwanie. Powtórz ten krok dla każdej docelowej płaszczyzny iniekcji (zwykle wykonuje się to dla 3 – 4 płaszczyzn z 40 – 75 wstrzyknięciami na płaszczyznę).
5. Hodowla tkankowa i przetwarzanie wycinków tkanek pod kątem immunofluorescencji
- Przygotuj mieszaninę kolagenu (1,5 mg/ml): Do probówki dodać 1,25 ml roztworu matrycy, 0,5 ml wody destylowanej, 0,5 ml 5 x roztworu DMEM-F12 i 0,25 ml buforu do rekonstytucji. Trzymaj go na lodzie do czasu użycia.
- Pobrać szalkę Petriego zawierającą mikrowstrzyknięte wycinki z komory inkubacji kultur plastrów i zanurzyć plastry w mieszaninie kolagenu.
- Przenieś plastry razem z 200 – 300 μl mieszanki kolagenu do 14 mm dołka w naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm. Upewnij się, że plastry są pokryte bardzo małą ilością kolagenu. Taka konfiguracja pozwala na optymalne warunki do pobierania składników odżywczych i tlenu.
- Ustaw plastry, upewniając się, że między plasterkami jest wystarczająco dużo miejsca, używając dwóch par kleszczyków. Inkubować szalkę Petriego przez 5 minut w temperaturze 37 °C przy użyciu bloku grzewczego, aby umożliwić zestalenie się kolagenu. Rozważ ten czas jako t = 0 kultury plastrów.
- Przenieś szalkę Petriego z powrotem do inkubatora do kultur plastrów na dodatkowe 40 minut. Następnie dodaj 2 ml podgrzanego SCM. Plastry są trzymane w kulturze do pożądanego punktu czasowego.
- Wyjmij plastry z inkubatora do hodowli plastrów i odessaj SCM. Umyj plastry zatopione w kolagenie 1x PBS. Dodać 4% (wag./obj.) paraformaldehydu (w 120 mM buforze fosforanowym o pH 7,4) i pozostawić tkankę w temperaturze pokojowej na 30 minut. Następnie ustawić go w temperaturze 4 °C, aby umożliwić utrwalenie przez noc.
- Następnego dnia odessać roztwór paraformaldehydu i wykonać 1x płukanie PBS. Aby usunąć plastry z kolagenu, użyj dwóch par kleszczy, aby delikatnie wydobyć plastry pod mikroskopem stereoskopowym.
- Użyj kuchenki mikrofalowej, aby stopić agarozę o niskiej temperaturze topnienia 3% (wag./obj.) do przetwarzania mikrowstrzykiwanych plastrów. Wlej stopioną agarozę do jednorazowej formy do zatapiania i pozwól jej ostygnąć do około 38 – 39 °C.
- Przenieś plastry tkanki z kroku 5.7 do tej formy zawierającej niskotopliwą agarozę za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Upewnij się, że strona plastra jest skierowana do góry, a powierzchnia komory skierowana w dół. W razie potrzeby odpowiednio się zorientuj. Pozwól agarozie ostygnąć do temperatury RT do zestalenia.
- Przytnij dodatkową agarozę otaczającą plastry. Ustaw blok agarozy tak, aby powierzchnia cięcia była równoległa do ostrza tnącego wibratomu. Za pomocą wibratomu wytnij odcinki o grubości 50 μm.
- Napełnij naczynie z 24 dołkami 1x PBS. Przełóż sekcje do tego naczynia za pomocą pędzla z cienką końcówką. Wykonaj immunofluorescencję zgodnie ze standardowymi protokołami.
Wyniki
Mikroiniekcja służy do śledzenia i manipulowania pojedynczymi neuralnymi komórkami macierzystymi oraz ich potomstwem w żywej tkance, a także do obserwacji progresji ich linii komórkowych w środowisku fizjologicznym. W niniejszym artykule zademonstrowaliśmy zastosowanie robota do mikroiniekcji w celu celowania i automatycznego wstrzykiwania substancji do organotypowych skrawków teleencefalonu myszy. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne obrazy pomyślnie zainiekowanych komórek progenitorowych, a Rysunek 3 przedstawia zainiekowane nowo powstałe neurony. Po wstrzyknięciu barwnika Dextran Alexa-488 (lub Alexa-A555) komórki wydają się całkowicie wypełnione barwnikiem. W przypadku progenitorów apikalnych (Rysunek 2) obrazowanie konfokalne pozwala na rekonstrukcję morfologii komórki z wysoką rozdzielczością przestrzenną, ocenę obecności – lub braku – przyczepu apikalnego i bazalnego oraz na połączenie analizy morfologicznej z ekspresją markerów. Łącząc te kryteria, użytkownik może przypisać konkretny los komórkowy zainiekowanym komórkom i ich potomstwu. W przypadku iniekcji neuronów użytkownik może zrekonstruować morfologię neuronalną, w tym strukturę i cechy dendrytu apikalnego oraz aksonu. Zautomatyzowana mikroiniekcja może zapewnić znacznie wyższą przepustowość w porównaniu z mikroiniekcją manualną (Rysunek 2B). Ponadto znakowanie EdU potwierdza, że automatyzacja nie wpływa na żywotność komórek (Rysunek 2C). Utrzymywanie skrawka organotypowego w kulturze pozwala na śledzenie progresji linii komórkowych zainiekowanych komórek (przedstawiono zakres 4 – 24h na Rysunku 2D). Jeśli roztwór do mikroiniekcji zawiera materiał genetyczny (DNA, mRNA, przewodniki CRISPR-Cas9) lub białka rekombinowane, pozwala to na badanie, czy i w jaki sposób manipulacja wpływa na progresję linii komórkowych.
Mikroiniekcja do pojedynczych komórek macierzystych układu nerwowego w tkance zapewnia doskonałą rozdzielczość na poziomie pojedynczej komórki, dlatego była ona wykorzystywana do analizy biologii komórkowej progresji komórek macierzystych układu nerwowego oraz przejść w ich losach (Rycina 3A). Mikroiniekcja umożliwia dostarczenie złożonych mieszanin substancji chemicznych. Wcześniej wykorzystaliśmy tę cechę do badania sprzężenia złączeniowego w komórkach progenitorowych układu nerwowego, mieszając fluorescencyjne barwniki przepuszczalne przez złącza szczelinowe z barwnikami nieprzepuszczalnymi12. Rozszerzyliśmy poprzednie prace, badając sprzężenie złączeniowe w nowo powstałych neuronach poprzez wstrzyknięcie Lucifer Yellow wraz z Dextran-A555 (Rycina 3B). Jak pokazano na Rycynie 3B, część nowo powstałych neuronów piramidowych jest sprzężona z sąsiednimi neuronami za pomocą złączy szczelinowych. Obserwacja ta jest spójna z tezą, że niedojrzałe neurony komunikują się poprzez złącza szczelinowe13,14. Ponadto, celowanie w neurony pokazuje, że zastosowanie robota do mikroiniekcji można uogólnić na kilka typów komórek w rozwijającym się mózgu ssaków. Ten układ eksperymentalny będzie użyteczny do analizy biologii komórkowej neuronów w tkance, na przykład poprzez dostarczanie specyficznych oligopeptydów w celu zakłócenia oddziaływań białko-białko.
Rysunek 1: Układ i protokół zautomatyzowanej mikroiniekcji. (A) Ogólny protokół przygotowania tkanki i zautomatyzowanych mikroiniekcji z wykorzystaniem robota do mikroiniekcji. Wstawka po prawej: Schematyczny rysunek mózgowia przedniego (Telencephalon) myszy, będącego celem mikroiniekcji w tym protokole. (B) Schemat blokowy etapów zautomatyzowanej mikroiniekcji. (C) Schemat sprzętowy robota do mikroiniekcji. (D) Graficzny interfejs użytkownika (GUI) oprogramowania służącego do sterowania i obsługi robota do mikroiniekcji. Rysunek został opracowany na podstawie ref.12. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Robotyczna mikroiniekcja do prekursorów apikalnych. Schemat i oczekiwane wyniki przy użyciu robota do mikroiniekcji w celu celowania w prekursory apikalne (APs) poprzez powierzchnię apikalną (wstrzykiwanie apikalne). (A) Górny rząd. Po lewej: schemat procesu. Po prawej: interfejs GUI z parametrami istotnymi dla wstrzykiwania apikalnego. Dolny rząd. Po lewej: obraz w kontraście fazowym wykonany podczas procedury wstrzykiwania (V: komora; BL: błona podstawna). Po prawej: reprezentatywne wyniki pokazujące mikroiniekcyjne APs. Linia przerywana reprezentuje komorę (V). Pasek skali: 10 µm. (B) Liczba udanych wstrzyknięć na minutę dla początkującego użytkownika systemu ręcznego mikroiniekcyjnego, doświadczonego użytkownika systemu ręcznego mikroiniekcyjnego oraz robota do mikroiniekcji. (C) Inkorporacja EdU w komórkach poddanych mikroiniekcji oraz w komórkach niepoddanych wstrzykiwaniu w obszarze iniekcji. Organotypowe skrawki grzbietowej części końcowego mózgu myszy E14.5 były albo (i) niepoddane wstrzykiwaniu, albo (ii) poddane ręcznej lub zautomatyzowanej mikroiniekcji (skrawki wstrzyknięte) z użyciem Dextran-A488 (dla mikroiniekcji ręcznej i automatycznej). Skrawki utrzymywano w kulturze w obecności EdU przez 24 h, następnie utrwalono i barwiono na DAPI oraz EdU. Komórki wstrzyknięte i niewstrzyknięte w obszarze iniekcji oceniano pod kątem pozytywności na EdU. (D) Zastosowanie robota do mikroiniekcji w śledzeniu linii komórkowych. Fluorescencyjny barwnik (Dx3-A555, magenta) jest wstrzykiwany do pojedynczej neuralnej komórki macierzystej (t = 0 h). Barwnik fluorescencyjny jest rozdzielany między komórki potomne (d1, d2) podczas mitozy. Pozwala to na śledzenie potomstwa wstrzykniętej komórki (t = 4 h i 24 h) i ujawnienie progresji linii komórkowej w czasie. Dla t = 24 h przedstawiamy kilka przykładów potomstwa, którego można się spodziewać. Paski skali: 10 µm. Wykresy w B i C pochodzą z ref.12 Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Robotyczna mikroiniekcja do neuronów. Schemat i oczekiwane wyniki przy użyciu robota do mikroiniekcji w celu celowania w neurony piramidalne (N) poprzez powierzchnię bazalną (wstrzykiwanie bazalne). (A) Górny rząd. Po lewej: schemat procesu. Po prawej: interfejs GUI z odpowiednimi parametrami dla wstrzykiwania bazalnego. Dolny rząd. Po lewej: obraz w kontraście fazowym wykonany podczas procedury wstrzykiwania (V: komora mózgu; BL: błona podstawna). Po prawej: reprezentatywne wyniki pokazujące mikroiniekcję do N. Linia przerywana reprezentuje błonę podstawną (BL). Pasek skali: 10 µm. (B) Użycie autoiniektora do badania komunikacji poprzez złącza szczelinowe w tkance. Do neuronów piramidalnych wstrzyknięto roztwór zawierający dwa barwniki: nieprzenikający przez złącza szczelinowe Dx-A555 (nie pokazano) oraz przenikający przez złącza szczelinowe Lucifer Yellow (zielony). Dx-A555 pozostaje ograniczony do komórki docelowej (gwiazdki), podczas gdy LY dyfunduje do komórek połączonych ze złączeniami szczelinowymi z komórką docelową (linie przerywane). Panel lewy: niska ekspozycja, widoczne są tylko komórki poddane mikroiniekcji. Panel prawy: wysoka ekspozycja umożliwia wizualizację komórek wstrzykniętych oraz komórek sprzężonych (linie przerywane). Pasek skali: 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Plik uzupełniający: Rozwiązywanie kilku powszechnych błędów występujących podczas mikroiniekcji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Mikroiniekcja do pojedynczych nerwowych komórek macierzystych w tkance zapewnia doskonałą rozdzielczość pojedynczej komórki i z tego powodu została wykorzystana do analizy biologii komórek pod kątem progresji nerwowych komórek macierzystych i przejścia losu (ryc. 2; patrz także 10,11,12). Zautomatyzowana procedura mikroiniekcji może być wykonywana na innych typach komórek zarówno u myszy embrionalnych, jak i w ludzkiej tkance mózgowej. Reprezentatywne wyniki mikroiniekcji nowonarodzonych neuronów poprzez celowanie w podstawową powierzchnię kresomózgowia przedstawiono na rycinie 3.
Ustaloną tutaj zasadę można zastosować do celowania w kilka różnych typów komórek w embrionalnych mózgach myszy i mózgach ludzkich. Wcześniej wykazaliśmy, że robot do mikroiniekcji może być również używany do celowania w pojedyncze komórki progenitorowe w tyłomózgowiu myszy i kresomózgowiu oraz neurony noworodkowe w rozwijającej się korze nowejmyszy i człowieka 12. Aby uzyskać najlepsze efekty procedury iniekcji, należy zoptymalizować wszystkie kroki przed rozpoczęciem iniekcji. Ważne jest, aby dokładnie rozważyć i zoptymalizować przygotowanie żywotnych i dobrze zachowanych wycinków tkanki organotypowej z tkanki mózgowej (ryc. 1). Bardzo ważne jest, aby być szybkim w procedurze rozwarstwiania i krojenia zilustrowanej na rysunku 1. W przypadku iniekcji wierzchołkowej ukierunkowanej na AP należy wybrać plastry pokazujące idealną orientację powierzchni wierzchołkowej. W przypadku wstrzykiwania AP idealną orientacją jest powierzchnia wierzchołkowa prostopadła do dna szalki Petriego. Każda inna orientacja również będzie dopuszczalna, jednak powierzchnia wierzchołkowa prostopadła do szalki Petriego zapewnia szerszą powierzchnię do wstrzyknięcia, zwiększając w ten sposób powodzenie wstrzyknięcia. W przypadku wstrzykiwania do neuronów, orientacja wycinka ma niewielki lub żaden wpływ.
Po wybraniu plastrów do wstrzyknięcia, procedura wstrzykiwania na plasterek trwa około 5 minut. Biorąc pod uwagę, że pracuje się z żywą tkanką, zdecydowanie zaleca się przyspieszenie procedury iniekcji. W tym celu zalecamy ustawienie wszystkich parametrów wstrzyknięcia za pomocą graficznego interfejsu użytkownika (rysunek 1D) przed przygotowaniem tkanki, aby skrócić niepotrzebny czas oczekiwania. Aby uzyskać informacje na temat rozwiązywania problemów, zapoznaj się z plikiem uzupełniającym.
W przypadku długotrwałej hodowli plastrów, kroki po zautomatyzowanej procedurze mikroiniekcji mogą mieć wpływ na zdrowie komórek, a tym samym na eksperyment. Dlatego zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie testu kontroli jakości i optymalizację warunków hodowli plastrów. Aby ocenić żywotność komórek po procedurze krojenia i wstrzykiwania, przeprowadziliśmy znakowanie EdU podczas hodowli i określiliśmy ilościowo liczbę jąder piknotycznych (wskaźnik zastępczy dla komórek apoptotycznych) w kulturach i wstrzykniętej tkance12. Te oceny ilościowe nie wykazały żadnego znaczącego wpływu mikroiniekcji na żywotność tkanek (Figura 2C). Zalecamy przeprowadzenie podobnych kontroli jakości podczas ustanawiania procesu organotypowego krojenia tkanek i mikroiniekcji w laboratorium.
W porównaniu z ręcznym mikroiniekcją, robot do mikroiniekcji ma kilka zalet. Po pierwsze, krzywa uczenia się dla użytkownika jest mniej stroma w porównaniu z ręcznym wstrzykiwaniem: nowy użytkownik osiągnie wysoką biegłość po ograniczonej liczbie sesji, zwykle 1 lub 2. Po drugie, w przypadku ręcznej mikroiniekcji, porównywalna biegłość wymaga miesięcy szkolenia. Procedura iniekcji jest szybsza i bardziej wydajna (ryc. 2B). Określiliśmy ilościowo te parametry i stwierdziliśmy, że robot do mikroiniekcji przewyższał wykwalifikowanego użytkownika ręcznego pod względem powodzenia iniekcji (% udanego wstrzyknięcia/całkowita liczba wstrzyknięć) oraz całkowitej liczby wstrzyknięć na jednostkę czasu12. Skutkuje to ogólnym wzrostem wydajności wtrysku o 300% (% udanego wtrysku/min) dla robota do mikroiniekcji w porównaniu z wykwalifikowanym użytkownikiem. Wzrost wydajności był jeszcze wyraźniejszy w porównaniu z robotem do mikroiniekcji z początkującym użytkownikiem i osiągnął 700%. Wreszcie, co nie mniej ważne, robota do mikroiniekcji można łatwo zaprogramować tak, aby systematycznie badał wszystkie parametry przestrzenne. Jest to szczególnie korzystne w przypadku adaptacji robota do mikroiniekcji do celowania w nowe komórki lub tkanki lub w przypadku używania robota do mikroiniekcji do celów wymagających różnej rozdzielczości przestrzennej.
Budowa robota do mikroiniekcji wymaga minimalnych zmian w istniejącym mikroskopie epifluorescencyjnym12. Wcześniej udostępniliśmy instrukcje dotyczące tej adaptacji w https://github.com/bsbrl/Autoinjector. Po skonfigurowaniu sprzętu protokół ten dostarcza kluczowych szczegółów metodologicznych do pomyślnego przeprowadzenia automatycznych mikroiniekcji. Ogólnie rzecz biorąc, robot do mikroiniekcji osiąga udaną szybkość wtryskiwania wynoszącą 15,52 + 2,48 wstrzyknięć/min, czyli 15 razy większą niż w przypadku niedoświadczonego użytkownika (1,09 ± 0,67 wstrzyknięć/min) i 3 razy większą niż w przypadku doświadczonego użytkownika (4,95 ± 1,05 wstrzyknięć/min)12. Ta poprawa skuteczności wstrzykiwań umożliwia zarówno początkującym, jak i doświadczonym użytkownikom wstrzykiwanie większej liczby komórek w krótszym czasie, co jest niezbędne do zachowania żywotności tkanek. Dodatkowo robot do mikroiniekcji można dostosować, a trajektorię, głębokość wtrysku, liczbę wstrzyknięć, odstępy między iniekcjami można dostroić za pomocą graficznego interfejsu użytkownika. Cechy te pozwalają na wykorzystanie robota do mikroiniekcji jako narzędzia do optymalizacji wcześniej pracochłonnych eksperymentów oraz do badania zasadniczo nowych eksperymentów, które wymagają wyższej wydajności niż było to wcześniej możliwe.
Główne ograniczenia opisanej przez nas procedury mikroiniekcji są związane z przygotowaniem wycinków tkanki, co jest kluczowym krokiem, który wymaga daleko idącej optymalizacji. Ponadto mikroiniekcja opiera się na obecności powierzchni, do której można dotrzeć szklaną pipetą. Ta funkcja ogranicza rodzaj tkanek i ich lokalizacje, które mogą być celowane za pomocą mikroiniekcji przy użyciu obecnej konfiguracji.
Robot do mikroiniekcji wykorzystuje obecnie obrazowanie w jasnym polu i był stosowany w preparatach in vitro do wycinków mózgu. W przyszłości robot do mikroiniekcji może być połączony z obrazowaniem 2-fotonowym, aby zwiększyć specyficzność celowania w pojedyncze komórki in vivo w celu znakowania molekularnego lub barwnikowego. Takie wysiłki zostały już podjęte w przypadku elektrofizjologii pojedynczych komórek15,16. Obecne urządzenie wymaga ręcznej obserwacji procedury mikroiniekcji. Przyszłe wersje mogą obejmować strategie czyszczenia zatkanych pipet do mikroiniekcji17 lub integracji robotów do obsługi płynów18 w celu multipleksowanych, w pełni autonomicznych mikroiniekcji. Urządzenia te mogą zwiększyć skalę mikroiniekcji o rzędy wielkości. Dostosowanie algorytmów do równoległego sterowania wieloma pipetami do mikroiniekcji19 może umożliwić multipleksowane dostarczanie dziesiątek barwników i odczynników molekularnych do tych samych komórek w ramach tych samych eksperymentów. Ma to potencjał, aby otworzyć nowe możliwości badań molekularnych w tkankach.
Robot do mikroiniekcji może być używany do znakowania funkcjonalnie zidentyfikowanych komórek za pomocą kodów kreskowych DNA lub RNA. To z kolei można połączyć z innymi technikami analizy pojedynczych komórek, takimi jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNAseq) i mikroskopia elektronowa. Nasze wstępne wyniki pokazują, że mikrowstrzyknięte komórki i ich potomstwo można odzyskać i wyizolować za pomocą dysocjacji tkanek, a następnie sortowania FACS (Taverna, wyniki niepublikowane). Posortowane komórki FACS można następnie wykorzystać do seq scRNAseq. Co więcej, wstępne wyniki pokazują, że możliwości robota do mikroiniekcji w zakresie rozdzielczości pojedynczych komórek mogą być wykorzystane w połączeniu z analizą mikroskopu elektronowego w celu zbadania biologii komórek macierzystych neuronów w tkance w wysokiej rozdzielczości przestrzennej (Taverna i Wilsch-Bräuninger, wyniki niepublikowane). Dane te sugerują, że robot do mikroiniekcji może być używany jako narzędzie do korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej w tkance oraz w szerszym znaczeniu do multimodalnej analizy tożsamości i zachowania komórek w tkance.
Mikroiniekcja opiera się na zastosowaniu ciśnienia i można sobie pozwolić na wstrzykiwanie roztworów o dużej złożoności molekularnej (np. całego transkryptomu). Ta cecha mikroiniekcji była wykorzystywana w przeszłości do izolowania i klonowania receptorów bramkowanych ligandem20. W związku z tym robot do mikroiniekcji może być wykorzystywany do modelowania i badania cech wielogenowych na poziomie komórkowym. W połączeniu ze strategią sub-poolingu, robot do mikroiniekcji może być również wykorzystywany jako platforma do identyfikacji minimalnego zestawu genów napędzających określoną cechę/zachowanie komórkowe. Do tej pory robot do mikroiniekcji był używany do manipulowania biochemią komórki poprzez dostarczanie mRNA, DNA lub rekombinowanych białek 10,21,22. Przewidujemy zastosowanie robota do mikroiniekcji w badaniu biofizyki przestrzeni wewnątrzkomórkowej, na przykład poprzez dostarczanie nanomateriałów lub nanomaszyn, które umożliwiają wykrywanie i/lub manipulowanie właściwościami biofizycznymi przestrzeni wewnątrzkomórkowej.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Fundacji Nomis (ET). SBK przyjmuje do wiadomości fundusze z Wydziału Inżynierii Mechanicznej, College of Science and Engineering, inicjatywy MnDRIVE RSAM Uniwersytetu Minnesoty, Departamentu Szkolnictwa Wyższego Minnesoty, National Institutes of Health (NIH) 1R21NS103098-01, 1R01NS111028, 1R34NS111654, 1R21NS112886 i 1R21 NS111196. GS był wspierany przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship i grant szkoleniowy NSF IGERT.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chemicals | |||
| Agaroza, niskotopliwy | Carl Roth | Cat# 6351.2 | |
| Agaroza, Wild Range | Sigma-Aldrich | Cat# A2790 | |
| Best-CA 221 Klej | Best Klebstoffe GmbH & Co.KG | Cat# CA221-10ml | |
| B-27 Suplement | Thermo Fisher Scientific | Cat# 17504044 | |
| Cellmatrix Type-IA (Kolagen, Typ!) | FUJIFILM Wako Chemicals | Cat# 637-00653 | |
| destylowana | |||
| DMEM-F12, niezależna od CO2 (bez czerwieni fenolowej) | Sigma-Aldrich | Cat# D2906 | |
| DMEM-F12, niezależna od CO2 (z czerwienią fenolową) | Sigma-Aldrich | Cat# D8900 | |
| HEPES-NAOH, pH 7,2, 1M (bufor HEPES) | Carl Roth | Cat# 9105.3 | |
| L-glutamina, 200 mM | Thermo Fisher Sientific | Cat# 25030024 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | Cat# 81381 | |
| N-2 Suplement | Thermo Fisher Scientific | Cat# 17502048 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | Cat# 21103049 | |
| Woda wolna od nukleaz | Thermo Fisher Scientific | Cat# AM9937 | |
| O2 (40%), CO2 (5%), N2 (55%) Mieszanka, 50 litrów | |||
| Paraformaldehydu | Merck | Cat# 818715 | |
| PBS | |||
| Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15140122 | |
| Serum dla szczurów | Charles River Laboratories | ||
| Japonia | |||
| Wodorowęglan sodu (NaHCO3) | Merck | Cat# 106323 | |
| Wodorotlenek sodu (NaOH) | Merck | Cat# 106482 | |
| Tyrode' s sól | Sigma | Cat# T2145-10x1L) | |
| Equipment | |||
| kapilary ze szkła borokrzemianowego, średnica zewnętrzna 1,2 mm x średnica wewnętrzna 0,94 mm | Sutter Instruments | Cat# BF-120-94-10 | |
| System filtrów butelkowych, 500 ml | Corning | Cat# 430769 | |
| Computer PC | |||
| Niestandardowa platforma | Niestandardowa platforma | ||
| Elektroniczny regulator ciśnienia | Parker Hannifin | Cat# 990-005101-002 | |
| Probówki Falcon, 15 ml | Corning | Cat# 430791 | |
| Falcon, 50 ml | Corning | Cat# 430829 | |
| Pędzel | |||
| Flaming/Brown ściągacz do mikropipet | Sutter Instruments | Cat# P-97 | |
| Kleszcze, Dumont nr 3 | Narzędzia do nauki | Nr kat.# 11231-30 | |
| Kleszcze, Dumont nr 5 | Narzędzia do nauki o sztuce | kat.# 11255-20 | |
| Kleszcze, Dumont nr 55 | Narzędzia do nauki o nauce | kat.# 11252-20 | |
| Blok grzewczy | Labtech International | Cat # Dri block Digi2 | |
| Odwrócony mikroskop fluorescencyjny | Zeiss | Cat# Axiovert 200 | |
| Źródło światła | Olympus | Cat# Highlight 3100 | |
| Ręczny regulator ciśnienia | McMaster Carr | Cat# 0-60 PSI 41795K3 | |
| Końcówki do mikroładowarek | Eppendorf | Cat# 5242956.003 | |
| Mikrokontroler | Arduino | Cat# Arduino Due | |
| Kamera mikroskopowa Hamamatsu Orca Flash 4.0 V3 | |||
| Zmotoryzowany stolik XY do mikroskopu | |||
| Płytka wielodołkowa, 24 dołki | Pipety Nunc | Cat# 142475 | |
| Pasteur, plastikowa | |||
| szalka Petriego, 60 x 15 mm | Greiner | Cat# 628102 | |
| Petriego, 35 x 10 mm | Nunc | Cat# 153066 | |
| szalka Petriego, 34 x 14 mm, w tym szklana osłona Microwell nr 1.5 | MatTek | Cat# P35G-1.5-14-C | |
| Uchwyt na pipety | Warner Instruments | Cat# 64-2354 MP-s12u | |
| Pipeta i końcówki | |||
| Filament ściągający, 3,0 mm kwadratowy filament | pudełkowy Sutter Instrument | Cat# FB330B | |
| Pudełko do inkubacji kultur plastrów | MPI-CBG | Cat# Wykonany | |
| zawór elektromagnetyczny | Cat# LHDA053321H-A | ||
| Stereomikroskop | Olympus | Cat# SZX12 | |
| Wirówka stołowa | Heraeus | Cat# 5431622 | |
| Termometr | |||
| Trójosiowy manipulator | Sensapex Inc | Cat# uMP tree-axis uMP | |
| Vibratome | Leica | Cat# VT1000s | |
| Inkubator systemu hodowli całych zarodków | Ikemoto Company | Cat# RKI-10-0310 | |
| Waterbath | |||
| Software and Algorithms | |||
| Arduino | Arduino | ||
| Fiji | RRID: SCR_002285 | ||
| Python | Python Podstawy oprogramowania | Python 2.7.12 | |
| ZEN | RRID: SCR_013672 |
Bibliografia
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 465-502 (2014).
- Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (10), 777-788 (2005).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesisin a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Developmental Cell. 38 (6), 590-600 (2016).
- Pepperkok, R. et al. Automatic microinjection system facilitates detection of growth inhibitory mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (18), 6748-6752 (1988).
- Pepperkok, R., Lowe, M., Burke, B., Kreis, T. E. Three distinct steps in transport of vesicular stomatitis virus glycoprotein from the ER to the cell surface in vivo with differential sensitivities to GTPγS. Journal of Cell Science. 111 (13), 1877-1888 (1998).
- Pepperkok, R. et al. β-COP is essential for biosynthetic membrane transport from the endoplasmic reticulum to the Golgi complex in vivo. Cell. 74 (1), 71-82 (1993).
- Ansorge, W., Pepperkok, R. Performance of an automated system for capillary microinjection into living cells. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 16 (4), 283-292 (1988).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neuroscience. 15 (2), 329-337 (2012).
- Wong, F. K., Haffner, C., Huttner, W. B., Taverna, E. Microinjection of membrane-impermeable molecules into single neural stem cells in brain tissue. Nature Protocols. 9 (5), 1170-1182 (2014).
- Shull, G., Haffner, C., Huttner, W. B., Kodandaramaiah, S. B., Taverna, E. Robotic platform for microinjection into single cells in brain tissue. EMBO Reports. 20 (10), e47880 (2019).
- Jabeen, S., Thirumalai, V. The interplay between electrical and chemical synaptogenesis. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1914-1922 (2018).
- Nagy, J. I., Pereda, A. E., Rash, J. E. Electrical synapses in mammalian CNS: Past eras, present focus and future directions. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (1), 102-123 (2018).
- Suk, H.J. et al. Closed-loop real-time imaging enables fully automated cell-targeted patch-clamp neural recording in vivo. Neuron. 95 (5), 1037-1047 (2017).
- Annecchino, L. A. et al. Robotic automation of in vivo two-photon targeted whole-cell patch-clamp electrophysiology. Neuron. 95 (5), 1048-1055 (2017).
- Kolb, I. et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Scientific Reports. 6, 35001 (2016).
- Holst, G. L. et al. Autonomous patch-clamp robot for functional characterization of neurons in vivo: development and application to mouse visual cortex. Journal of Neurophysiology. 121 (6), 2341-2357 (2019).
- Kodandaramaiah, S. B. et al. Multi-neuron intracellular recording 1 in vivo via interacting autopatching 2 robots. ELife. 7, 24656 (2018).
- Lubbert, H. et al. cDNA cloning of a serotonin 5-HT1c receptor by electrophysiological assays of mRNA-injected Xenopus oocytes (RNA fractionation/hybrid depletion/hybrid selection/choroid plexus/voltage clamp). Neurobiology. 84 (2) 4332-4336 (1987).
- Florio, M. et al. Human-specific gene ARHGAP11B promotes basal progenitor amplification and neocortex expansion. Science. 347 (6229), 1465-1470 (2015).
- Kalebic, N. et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
Przedruki i uprawnienia
