Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiary FLIM-FRET interakcji białko-białko u żywych bakterii.

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61602

⸱

25 sierpnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Université de Strasbourg, Laboratoire de Bioimagerie et Pathologies, UMR CNRS 7021, 2Université de Strasbourg, UMR 7242, ESBS, 3CNRS, UMR 7242, ESBS, 4Groupe Méthode Recherche Clinique, Hôpitaux Universitaires de Strasbourg

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy tutaj protokół charakteryzujący interakcje białko-białko pomiędzy dwoma białkami o bardzo różnej ekspresji u żywych Pseudomonas aeruginosa za pomocą pomiarów FLIM-FRET. Protokół obejmuje konstrukcje szczepów bakterii, immobilizację bakterii, procedury obrazowania i analizy danych po obrazowaniu.

Streszczenie

Interakcje białko-białko (PPI) kontrolują różne kluczowe procesy w komórkach. Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) w połączeniu z rezonansowym transferem energii Förstera (FRET) dostarcza dokładnych informacji o IPP w żywych komórkach. FLIM-FRET opiera się na pomiarze zaniku fluorescencji w czasie życia dawcy FRET w każdym pikselu obrazu FLIM, dostarczając ilościowych i dokładnych informacji o IPP i ich przestrzennych organizacjach komórkowych. Proponujemy tutaj szczegółowy protokół pomiarów FLIM-FRET, który zastosowaliśmy do monitorowania IPP w żywych Pseudomonas aeruginosa w szczególnym przypadku dwóch oddziałujących białek ulegających ekspresji o bardzo różnej liczbie kopii, aby zademonstrować jakość i solidność techniki ujawniania krytycznych cech IPP. Protokół ten szczegółowo opisuje wszystkie niezbędne kroki do charakterystyki PPI - począwszy od konstrukcji mutantów bakteryjnych, aż do końcowej analizy przy użyciu niedawno opracowanych narzędzi zapewniających zaawansowane możliwości wizualizacji dla prostej interpretacji złożonych danych FLIM-FRET.

Wprowadzenie

Oddziaływania białko-białko (PPIs) kontrolują różne kluczowe procesy w komórkach1. Role PPIs różnią się w zależności od składu białek, powinowactwa, funkcji i lokalizacji w komórkach2. PPIs można badać za pomocą różnych technik3. Na przykład koimmunoprecypitacja jest stosunkowo prostą, niezawodną i niedrogą techniką, powszechnie wykorzystywanym narzędziem do identyfikacji lub potwierdzania PPIs. Jednak badanie PPIs może być trudne, gdy oddziałujące białka wykazują niski poziom ekspresji lub gdy oddziaływania są przejściowe bądź występują tylko w specyficznych środowiskach. Badanie PPIs zachodzących między różnymi enzymami szlaku piowerdyny u P. aeruginosa wymaga zniesienia represji przez ogólny repressor zależny od żelaza Fur, aby umożliwić ekspresję wszystkich białek szlaku piowerdyny w komórce4,5,6. Ta wspólna regulacja dla wszystkich białek szlaku skutkuje terminową ekspresją w komórce, co ma sprzyjać ich oddziaływaniom. Różnorodność pod względem wielkości, natury, poziomów ekspresji i liczby białek tego szlaku metabolicznego utrudnia jego badanie w systemach zrekonstytuowanych6. Badanie PPIs w ich środowisku komórkowym jest zatem kluczowe dla lepszego zrozumienia funkcji biologicznych białek w ich natywnym kontekście.

Jedynie nieliczne metody, w tym fluorescencja, pozwalają na badanie PPI w żywych komórkach7. Wśród różnych mierzalnych parametrów fluorescencji czas życia fluorescencji (tj. średni czas, przez który fluorofor pozostaje w stanie wzbudzonym przed emisją fotonu) jest prawdopodobnie jednym z najciekawszych parametrów do badania w żywych komórkach. Czas życia fluorescencji fluoroforu jest bardzo wrażliwy na jego otoczenie, w związku z czym FLIM może dostarczać informacji chemicznych lub fizycznych dotyczących środowiska fluoroforu8. Obejmuje to obecność Försterowskiego rezonansowego transferu energii (FRET), który może wystąpić w obecności „akceptora” fluorescencji znajdującego się w niewielkiej odległości od „donora” fluorescencji. Transfer energii skutkuje znacznym skróceniem czasu życia fluorescencji donora (Rysunek 1A), co czyni mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) potężnym podejściem do badania oddziaływań białko-białko bezpośrednio w żywych komórkach. FLIM może ponadto dostarczyć informacji przestrzennych o tym, gdzie w komórkach dochodzi do tych oddziaływań7,8. Podejście to jest niezwykle skuteczne w badaniu PPI w sytuacjach, gdy możliwe jest znakowanie fluoroforami obu oddziałujących partnerów.

Aby doszło do FRET, wymagane są krytyczne warunki dotyczące odległości między dwoma fluoroforami8,9. Dwa fluorofory nie mogą być oddalone od siebie o więcej niż 10 nm. Dlatego podczas projektowania eksperymentów FLIM-FRET należy zachować ostrożność, aby zapewnić, że donor i akceptor fluorescencji mają możliwość znajdowania się blisko siebie w kompleksie oddziałującym. Choć może się to wydawać ograniczające, w rzeczywistości jest to istotna zaleta, ponieważ zależność FRET odległości gwarantuje, że dwa znakowane białka podlegające FRET muszą fizycznie ze sobą oddziaływać (Rysunek 1A). Trudności w uzyskaniu jednoznacznych odpowiedzi na temat PPI w eksperymentach z kolokalizacją (dwa kolokalizowane białka niekoniecznie muszą oddziaływać) nie stanowią zatem problemu w przypadku zastosowania FLIM-FRET.

Schemat transferu energii między fluorescencyjnymi donoremami i akceptorem; proces FRET z wykresem nakładania się intensywności.
Rysunek 1: Zasada analizy FLIM-FRETKażdy piksel wielowymiarowego obrazu FLIM-FRET zawiera informacje o zaniku fluorescencji zarejestrowanym w tym konkretnym miejscu (#counts = liczba fotonów wykrytych w kanale t).AKlasyczna reprezentacja obrazu FLIM to zazwyczaj dwuwymiarowy obraz w fałszywych kolorach z zakodowanym czasem życia (po lewej). W obecności FRET można zaobserwować skrócenie średniego czasu życia fluorescencji donora – widoczne jako zmiana w skali kolorystycznej – co dostarcza informacji o występowaniu PPI w tym obszarze przestrzennym.BNakładanie się widma emisji donora i widma absorpcji akceptora jest niezbędne do zajścia procesu FRET. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Drugim wymaganiem dla FRET jest to, aby widmo emisji donora i widma absorpcji akceptora nakładały się na siebie8 (Rysunek 1B). Wzbudzanie fluorescencji donora powinno odbywać się przy długościach fal, które w niewielkim stopniu przyczyniają się do bezpośredniego wzbudzania fluorescencji akceptora. Nie wszystkie kombinacje fluoroforów są możliwe i dodatkowo zalecamy preferencyjne stosowanie donorów o monoeksponencjalnym zaniku fluorescencji, aby ułatwić interpretację wyników FLIM-FRET10. Kilka par białek fluorescencyjnych spełnia te wymagania, w tym popularna para eGFP-mCherry1 (przegląd palety dostępnych par białek fluorescencyjnych do FRET znajduje się w12,13).

Metoda FLIM-FRET umożliwia pomiar zaniku czasu życia fluorescencji donora FRET w każdym pikselu obrazu FLIM (Ryc. 1A). Istnieją dwie główne techniki wyznaczania czasu życia fluorescencji, które różnią się sposobem akwizycji i analizy: dziedzinowa częstotliwości (FD)14 oraz dziedzinowa czasu (TD). TD FLIM jest bardziej rozpowszechniona i realizowana przy użyciu oświetlenia impulsowego w połączeniu z różnymi konfiguracjami detekcji, w tym metodami bramkowania15, kamerą smugową16 lub technikami czasowo skorelowanego zliczania pojedynczych fotonów (TCSPC)8. W obu technikach, FD i TD, czas życia fluorescencji nie jest mierzony bezpośrednio, lecz wymaga analizy zebranych danych w celu oszacowania czasu (lub czasów) życia lub stwierdzenia obecności oddziaływań. W przypadku technik TCSPC najpowszechniejsza analiza opiera się na dopasowywaniu krzywych zaniku do funkcji jedno- lub wielo-wykładniczych przy użyciu iteracyjnych rekonwolucji metodą najmniejszych kwadratów, co pozwala zminimalizować ważoną sumę rezyduów.

Wreszcie, technikę FLIM-FRET można przeprowadzić zarówno z wykorzystaniem wzbudzenia jednofotonowego, jak i wielofotonowego. To drugie oferuje kilka zalet, takich jak redukcja autofluorescencji i fotouszkodzeń poza płaszczyzną ogniskowania. Wzbudzenia wielofotonowe umożliwiają również uzyskanie większej głębokości wzbudzenia podczas pracy z grubymi próbkami 3D8. Z kolei wzbudzenie jednofotonowe jest zazwyczaj bardziej wydajne, ponieważ przekroje czynne absorpcji dwufotonowej białek fluorescencyjnych są ograniczone17.

W niniejszej pracy proponujemy protokół pomiarów FLIM-FRET w celu badania PPI w żywych komórkach P. aeruginosa w konkretnym przypadku dwóch oddziałujących białek (PvdA i PvdL) wykazujących znaczną różnicę w liczbie kopii, aby zademonstrować jakość i niezawodność tej techniki w ujawnianiu kluczowych cech PPI. Białka PvdA i PvdL biorą udział w biosyntezie piowerdyny. PvdA jest L-ornitynową N5-oksygenazą i syntetyzuje L-N5-formylo-N5-hydroksyornitynę z L-ornityny poprzez hydroksylację (PvdA) i formylację (PvdF)18. PvdL jest enzymem syntezy peptydów nierybosomalnych (NRPS) składającym się z czterech modułów. Pierwszy moduł katalizuje acylację kwasu mirystynowego. Drugi moduł katalizuje aktywację L-Glu i jego kondensację z mirystylo-CoA. Następnie trzeci moduł kondensuje aminokwas L-Tyr, który jest następnie izomeryzowany do D-Tyr. W końcu czwarty moduł wiąże aminokwas L-Dab (kwas diaminobutyrowy), tworząc acylowany tripeptyd L-Glu/D-Tyr/L-Dab6. PvdL jest zatem odpowiedzialny za syntezę trzech pierwszych aminokwasów prekursora piowerdyny. Oddziaływanie białka PvdA z PvdL jest zaskakujące, ponieważ PvdL, w przeciwieństwie do PvdI i PvdJ, nie posiada modułu specyficznego dla L-N5-formylo-N5-hydroksyornityny. Oddziaływanie to sugeruje, że wszystkie enzymy odpowiedzialne za biosyntezę prekursora piowerdyny są zorganizowane w duże, przejściowe i dynamiczne kompleksy wieloenzymatyczne19,20.

W niniejszym raporcie szczegółowo wyjaśniamy, jak konstruować szczepy bakteryjne natywnie wykazujące ekspresję dwóch oddziałujących ze sobą białek znakowanych eGFP i mCherry. Opisujemy również przygotowanie próbek oraz warunki umożliwiające wydajne obrazowanie komórek metodą FLIM-FRET. Na koniec proponujemy instrukcję analizy obrazu krok po kroku, obejmującą niedawno opracowane narzędzie zapewniające zaawansowane możliwości wizualizacji, co pozwala na prostą interpretację złożonych danych FLIM-FRET. Poprzez ten raport chcielibyśmy przekonać nie tylko odważnych, ale większość biologów, że FRET-FLIM jest przystępną i potężną techniką, która pozwala bezpośrednio badać PPI w natywnym środowisku komórkowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Konstrukcja plazmidu

  1. Przeprowadzić amplifikację za pomocą dwóch reakcji PCR (PCR1 i 3) sekwencji DNA (wykorzystując DNA genomiczne P. aeruginosa PAO1) obejmujących 70 par zasad powyżej i poniżej regionów odpowiadających miejscu insercji w genomie P. aeruginosa, stosując polimerazę DNA o wysokiej wierności. Do starterów zaznaczonych kolorem niebieskim i zielonym dodać miejsca restrykcyjne, a do starterów zaznaczonych kolorem czerwonym dodać sekwencję nakładającą z mCherry (Rycina 2).
    1. W przypadku białka PvdA znakowanego eGFP na C-końcu, amplyfikować region 70 bp powyżej kodonu stop za pomocą starterów niebieskich oraz region 70 bp poniżej, zawierający kodon stop, za pomocą starterów zielonych.
    2. W przypadku białka PvdL znakowanego mCherry na N-końcu, amplyfikować region 70 bp powyżej genu PvdL, wliczając kodon start, za pomocą starterów niebieskich oraz region 700 bp poniżej za pomocą starterów zielonych.

Schemat edycji genu pvdA u P. aeruginosa; PCR, miejsca restrykcyjne, proces integracji mcherry
Rycina 2: Przegląd strategii PCR oraz konstrukcji plazmidów wykorzystanych do stworzenia PvdA-mCherry. Szczegóły znajdują się w tekście – pvdA koduje enzym biorący udział w biosyntezie pyowerdyny, siderofora będącego metabolitem wtórnym zaangażowanym w pozyskiwanie żelaza. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Amplifikuj DNA kodujące eGFP (bez kodonów start i stop) za pomocą starterów zaznaczonych na czerwono, wykorzystując polimerazę DNA o wysokiej wierności (High-Fidelity DNA polymerase).
  2. Oczyść produkty PCR na kolumnie do oczyszczania PCR (Tabela materiałów).
  3. Zmieszaj nakładające się produkty PCR w stosunku ekimolarnym i przeprowadź drugą reakcję PCR, używając starterów z miejsc restrykcyjnymi wykorzystanymi dla PCR 1 i 3 (kolor zielony i niebieski na Rysunku 2).
  4. Przeprowadź elektroforezę produktu PCR w żelu agarozowym 1x TAE (Tris-Base Acetate EDTA pH 8.0), wytnij odpowiedni prążek i wyizoluj amplikon za pomocą zestawu do oczyszczania PCR (Tabela materiałów).
    UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół.
  5. Przetraw amplikon PCR i plazmid pEXG2 za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych21.
  6. Liguj plazmid i insert za pomocą ligazy T4 DNA, używając 90 ng plazmidu i stosunku molowego 1:1 (plazmid:insert).
  7. Transformuj konstrukcje plazmidowe do chemicznie kompetentnych komórek E. coli TOP10, mieszając produkt ligacji z 10 µL komórek TOP10. Inkubuj mieszaninę kompetentnych bakterii i plazmidu na lodzie przez 30 min przed przeprowadzeniem szoku termicznego w 42 °C przez 60 s. Następnie umieść probówkę na lodzie na 10 min.
  8. Dodaj 1 mL pożywki LB (lysogeny broth) do bakterii i inkubuj w 37 °C przez 1 h.
  9. Wysewij 100 µL bakterii na agar LB zawierający 15 µg/mL gentamicinu.
  10. Inkubuj przez noc w 37 °C.
  11. Przesiewaj obecność insertu za pomocą PCR kolonii: z jednej wyizolowanej kolonii transformanta pobierz niewielką ilość bakterii i dodaj do mieszaniny PCR zawierającej startery hybrydyzujące z plazmidem w taki sposób, aby obecność amplikonu można było wykryć poprzez elektroforezę produktu na żelu agarozowym (polimeraza DNA). Z tej samej kolonii użytej do PCR przenieś niewielką ilość bakterii na świeżą płytkę zawierającą 15 µg/mL gentamicinu w celu izolacji i wykorzystania do ekstrakcji plazmidu. Na koniec wyizoluj i oczyść plazmid (Tabela materiałów) i zweryfikuj insert za pomocą sekwencjonowania.
  12. Przechowuj bakterie TOP10 zawierające plazmid w pożywce LB z 20 % glicerolem w mikroprobówce 1,5 mL w -80 °C, a oczyszczony plazmid w probówce 1,5 mL w -20 °C.
    UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół

2. Wprowadzenie znacznika fluorescencyjnego do genomu chromosomowego P. aeruginosa (Rysunek 3)

  1. Hodowla P. aeruginosa, TOP10 i E. coli bakterie pomocnicze, każda z nich w 5 ml pożywki LB bez antybiotyku w 30 °C pod inkubacją z wytrząsaniem orbitalnym przez noc22Wywołanie insercji znacznika fluorescencyjnego w genomie P. aeruginosa poprzez przeniesienie plazmidu z szczepu E. coli TOP10 do szczepu PAO1 i zintegrowanie plazmidu z genomem poprzez rekombinację homologiczną. Drugie zdarzenie crossing-over, wycinające wektor, prowadzi do powstania odpowiedniego mutanta.
  2. Zmierz gęstość optyczną przy 600 nm (OD60 nm) hodowli bakteryjnej i wymieszać z równą ilością P. aeruginosa (500 µL, OD60 nm = 1,0) z E. coli TOP10 pEXG2 (500 µL, OD60 nm = 1,0) oraz E. coli komórki pomocnicze HB101 pRK60 (500 µL, gęstość optyczna60 nm = 1,0) w mikroprobowce 1,5 ml.
  3. Wirować przez 5 min przy 9 30 x g g w celu odwirowania bakterii do postaci osadu.
    UWAGA: Do przeliczenia siły odśrodkowej (g) na liczbę obrotów na minutę (rpm) w celu dostosowania prędkości wirówki można wykorzystać narzędzia online.
  4. Zachować osad bakteryjny i odrzucić nadsącz.
  5. Resuspendować pellet zawierający bakterie w 50 µL pożywki LB.
  6. Nanieś kropelkę (~50 µL) mieszaniny na środku agaru LB (podgrzanego do 37 °C) i inkubować przez 5 h w temperaturze 37 °C.
  7. Zeskrob zeskrobcie miejsce zrostu za pomocą sterylnej pętli do szczepień i resuspendujcie w 1 ml pożywki LB.
  8. Płytka 100 µL tej zawiesiny bakteryjnej na agar LB zawierający 10 µg/mL chloramfenikol w celu wyeliminowania E. coli (E. coli TOP10 pEXG2 oraz E. coli Komórki pomocnicze HB101 pRK60 są wrażliwe na chloramfenikol, lecz P. aeruginosa wykazuje naturalną oporność) i 30 µg/mL gentamicyną i inkubować przez 2 dni w 37 °C.
  9. Resuspender jedną kolonię w 1 ml LB i inkubować w temperaturze 37 °C podczas wstrząsania orbitalnego przez 4 h.
  10. Wiruj przez 3 min w temperaturze 9 30 x g g i utylizować 950 µL nadosadu. Przesuspenduj osad w 50 µL z LB i wyizolować mieszaninę na agarze LB zawierającym sacharozę i bez NaCl.
  11. Inkubować przez noc w temperaturze 30 °C.
  12. Wykryj pojedyncze kolonie na agarze LB oraz na agarze LB zawierającym 15 mg/ml gentamyciny, aby sprawdzić wrażliwość na gentamycynę.
  13. Weryfikacja insercji eGFP lub mCherry za pomocą PCR kolonii (polimeraza DNA) i sekwencjonowania z użyciem specyficznych starterów.

Schemat koniugacji plazmidowej bakterii; przedstawia transfer genów, selekcję na agarze LB oraz walidację metodą PCR.
Rysunek 3: Protokół konstrukcji P. aeruginosa szczepy poprzez insercję znacznika fluorescencyjnego. Proszę o przesłanie tekstu źródłowego w celu rozpoczęcia tłumaczenia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

3. Pomiar pyoverdyny

  1. Hodować bakterie w 5 mL pożywki LB w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu orbitalnym przez noc.
  2. Zgranulować bakterie poprzez wirowanie, przemyć i hodować je w 5 mL pożywki SM (pożywka bursztynianowa, skład: 6 g∙L−1 K2HPO4, 3 g∙L−1 KH2PO4, 1 g∙L−1 (NH4)2 SO4, 0,2 g∙L−1 MgSO4∙7 H2O oraz 4 g∙L−1 bursztyniany sodu, z pH dostosowanym do 7,0 poprzez dodanie NaOH) w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu orbitalnym przez noc. SM jest pożywką ubogą w żelazo – brak żelaza aktywuje ekspresję białek szlaku pyowerdyny, które są normalnie represowane w obecności żelaza.
  3. Zmierzyć OD600 nm i ponownie rozcieńczyć bakterie w świeżej pożywce SM do OD60 nm = 0,1, a następnie hodować je w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu orbitalnym przez noc.
  4. Zmierzyć OD60 nm , aby określić ilość bakterii w każdej próbce.
  5. Przygotować kuwetę kwarcową zawierającą 10 µL kultury P. aeruginosa i uzupełnić do 1 mL pożywki SM (90 µL). Przygotować kuwetę kwarcową zawierającą 1 mL pożywki SM (próba blank).
  6. Za pomocą spektrofotometru UV-Vis zmierzyć absorbancję w maksimum piku absorpcji. Przy pH 7,0 maksimum absorpcji pyowerdyny występuje przy ~40 nm. Wyznaczyć stężenie pyowerdyny (w formie apo) w próbce zgodnie z prawem Beer-Lamberta, stosując współczynnik ekstynkcji molowej przy 40 nm wynoszący e = 19 0 M-1∙cm-1.
    UWAGA: Pyowerdynę można ilościowo określić w zakresie absorbancji od ~0,1 do ~1 (w zależności od spektrofotometru UV-Vis), w którym absorbancja rośnie liniowo wraz ze stężeniem.

4. Hodowla bakterii i warunki ekspresji PvdA, PvdL i PvdJ przez komórki

  1. W dniu 1. z odpowiedniego zapasu bakterii w glicerolu zaszczepić probówkę zawierającą 5 mL LB i hodować bakterie przez noc w temperaturze 30 °C przy 20 rpm w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną.
  2. W dniu 2. odwirować komórki przez centryfugację przy 3,0 x g przez 3 min i odlać supernatant.
  3. Resuspender komórki w 10 mL SM.
  4. Powtórzyć kroki 4.2-4.3 raz i hodować bakterie w SM przez noc w temperaturze 30 °C przy 20 rpm.
  5. W dniu 3. rozcieńczyć kulturę bakterii 1/10 w świeżej pożywce SM.
  6. Ponownie hodować rozcieńczone bakterie przez noc w tych samych warunkach.
    UWAGA: Obecność pyoverdyny można wykryć wizualnie, ponieważ barwi ona pożywkę hodowlaną na kolor żółto-zielony. Wskazuje to na aktywację ekspresji białek szlaku pyoverdyny oraz na to, że interesujące nas enzymy są eksponowane w komórkach.

5. Przygotowanie podkładki agarozowej (Rysunek 4)

  1. Połóż szkiełko mikroskopowe na płaskiej poziomej powierzchni. Po obu stronach początkowego szkiełka ułóż dwa szkiełka, na których brzegach naklejono dwie warstwy taśmy klejącej.
    UWAGA: Zachowaj odstęp 1-2 mm między trzema wyrównanymi szkiełkami, aby zapobiec ewentualnemu rozlaniu się roztopionej agarozy na szkiełka z taśmą klejącą.
  2. Pipetuj i nanieś kropelkę 70 µL 1% roztopionej agarozy na szkiełko. Nałóż czwarte szkiełko na wierzch, aby spłaszczyć kropelkę agarozy, i delikatnie dociśnij. Odczekaj około minuty.
  3. Zdejmij górne szkiełko i nanieś pipetą około 3 µL bakterii w 3 do 4 miejscach w różnych punktach podkładki agarowej.
  4. Przykryj szkiełko osłoneczką do mikroskopu (na przykład o wymiarach 2x22 mm i grubości #1.5).
    UWAGA: Płaskość i grubość osłoneczek są istotne przy pracy z wzbudzeniami dwufotonowymi. Zazwyczaj dobrym wyborem są precyzyjne osłoneczki o kontrolowanej, jednorodnej płaskości i niskiej autofluorescencji.
  5. Przymocuj osłoneczkę za pomocą roztopionej parafiny, aby uszczelnić ją na szkiełku. Zacznij od utrwalenia czterech narożników osłoneczki.

Schemat przygotowania preparatu, szkiełka przedmiotowe, aplikacja cieczy, nakładanie szkiełka nakrywkowego, analiza próbki.
Rycina 4: Przygotowanie podkładu agarowego. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

6. Obrazowanie z wykorzystaniem układu mikroskopii dwufotonowej

UWAGA: Wykorzystujemy własnej konstrukcji skaningowy odwrócony mikroskop z wzbudzeniem dwufotonowym, wyposażony w obiektyw imersyjny z wodą 60x 1,2NA, pracujący w trybie zbierania fluorescencji poza skanerem (de-scanned). Długość fali wzbudzenia dwufotonowego ustawiono na 930 nm. Jest ona dostarczana przez laser Ti:Szafir (częstotliwość repetycji 80 MHz, szerokość impulsu ≈ 70 fs) pracujący z mocą 10-20 mW. Fotony fluorescencji zbierano poprzez filtr krótkoprzepustowy 680 nm oraz filtr pasmowy 525/50 nm, a następnie kierowano je do sprzęgniętej z włóknem fotodiody lawinowej podłączonej do modułu czasowo-skorelowanego zliczania pojedynczych fotonów (TCSPC). Mikroskop jest również wyposażony w lampę fluorescencyjną do oświetlenia przechodzącego. Obecnie dostępne są komercyjnie kilka mikroskopów FLIM-FRET, a wiele ośrodków obrazowania dysponuje zestawami umożliwiającymi wykonywanie pomiarów FLIM-FRET.

  1. Użyj lampy fluorescencyjnej, aby ustawić ostrość obiektywu na monowarstwie bakterii w próbce i wybrać obszary zainteresowania.
  2. Upewnij się, że migawka lasera wzbudzającego jest zamknięta, a światło podczerwone emitowane przez laser jest blokowane i nie dostaje się do mikroskopu.
    Uwaga: Podczas pracy z impulsowymi laserami IR należy zachować szczególną ostrożność i stałą czujność, ponieważ światło laserowe jest niewidoczne dla oka, a każda, nawet przejściowa, bezpośrednia ekspozycja lub odbicie wiązki laserowej może być niezwykle szkodliwe i spowodować nieodwracalne uszkodzenia wzroku. Przed korzystaniem z zestawów mikroskopowych zapoznaj się z lokalnymi procedurami bezpieczeństwa laserowego i przejdź odpowiednie szkolenie.
  3. Umieść preparat na stole obiektowym tak, aby szkiełko nakrywki było skierowane w stronę obiektywu.
  4. Sprawdź, czy lampa fluorescencyjna jest włączona.
  5. Obróć rewolwer z kostkami filtrów, aby wybrać kostkę eGFP, i otwórz migawkę lampy fluorescencyjnej.
  6. Kieruj światło fluorescencyjne do okularu mikroskopu.
    Uwaga: Upewnij się, że w torze świetlnym znajdują się odpowiednie filtry, które odrzucają bezpośrednie światło wzbudzające z lampy fluorescencyjnej, mogące uszkodzić wzrok.
  7. Ustaw ostrość obiektywu na bakteriach za pomocą pokrętła mikroskopu.
  8. Wybierz obszar zainteresowania w próbce, przesuwając ją za pomocą dżojstika sterującego zmotoryzowanym stołem obiektowym.
    UWAGA: Ustawianie ostrości jest łatwiejsze przy silnie fluorescencyjnych próbkach, co pozwala na bezpośrednie dostrzeżenie fluorescencji gołym okiem.
  9. Przełącz wzbudzenie na laser 2PE do pomiarów FLIM-FRET.
  10. Przekieruj tor emisji fluorescencji z powrotem w stronę detektora.
  11. Obróć z powrotem rewolwer z kostkami filtrów, aby wybrać kostkę dichroiczną dla lasera 930 nm.
  12. Ustaw moc lasera na 20 mW.
  13. Ustaw rozmiar obszaru zainteresowania na 30 µm. Operacja ta reguluje napięcie sterujące lustrami galwanometrycznymi i definiuje zakres ich ruchów (Rycina 5).
  14. Włącz detektor i rozpocznij skanowanie próbki – przyciski start i stop sterujące skanowaniem kontrolują również otwieranie i zamykanie migawki lasera, zarówno ze względów bezpieczeństwa, jak i w celu ograniczenia fotobleachingu próbki (Rycina 5).

Interfejs oprogramowania do sterowania mikroskopem wyświetlający proces obrazowania; skanowanie komórek i ruch stolika.
Rysunek 5: Schematyczny przedstawienie interfejsu oprogramowania sterującego mikroskopem. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. W razie potrzeby wyreguluj ostrość, lekko poruszając mikrometrycznym pokrętłem ostrości mikroskopu.
  2. Wybierz pole widzenia do obrazowania, precyzyjnie przesuwając stolik za pomocą interfejsu komputerowego. Można to zrobić w ustawieniu, przesuwając krzyżyk na obrazie w oprogramowaniu sterującym mikroskopem (Rycina 5), co zdefiniuje nowy środek obrazu, a następnie naciskając Move Stage. Odpowiednie pole widzenia do akwizycji to obraz zawierający 10-30 nieruchomych bakterii, wszystkie prawidłowo ustawione w ostrości (wszystkie bakterie znajdują się w tej samej płaszczyźnie). Jeśli celem jest wyodrębnienie danych FLIM-FRET dla pojedynczych komórek, upewnij się, że bakterie są dobrze odseparowane (ułatwi to segmentację obrazu).
  3. Otwórz oprogramowanie SPCM (komercyjne oprogramowanie do akwizycji danych) i sprawdź, czy szybkość zliczania fotonów nie jest zbyt wysoka, aby uniknąć efektu spiętrzenia (pile-up), który może wpływać na pomiary czasu życia. W razie potrzeby zmniejsz intensywność lasera, aby utrzymać niską szybkość zliczania fotonów (około 1% częstotliwości repetycji lasera).
    UWAGA: Efekt spiętrzenia (pile-up) opisuje utratę fotonów przy wysokich szybkościach zliczania ze względu na czas martwy urządzeń do zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych w czasie (TCSPC). Jeśli wystąpi efekt spiętrzenia, zmierzony średni czas życia staje się sztucznie krótszy, a w rozkładzie zaniku może pojawić się dodatkowa, krótsza składowa z powodu nadpróbkowania szybko emitowanych fotonów.
  4. Dostosuj parametry akwizycji, w tym czas zbierania danych (zazwyczaj wymagane jest od 60 s do 180 s, aby zebrać wystarczającą liczbę fotonów).
  5. Naciśnij przycisk Start i poczekaj na zakończenie akwizycji.
  6. Zapisz dane.
  7. Zatrzymaj skanowanie próbki i wyłącz detektor.
  8. Wybierz inne pole widzenia w próbce i powtórz kroki 6.14-6.2 lub obrazuj nowy preparat mikroskopowy, powtarzając kroki 6.1-6.22.
    UWAGA: P. aeruginosa może przeżyć i dzielić się do 6-8 godzin w temperaturze pokojowej na podkładce agarowej (co odpowiada co najmniej ~4 czasom podwojenia w 20°C). Optymalnie nie należy zwlekać zbyt długo z wykonaniem pomiaru FLIM-FRET, aby uniknąć obserwacji podkładki całkowicie pokrytej bakteriami.

7. Analiza danych

Analiza zaniku fluorescencji z dopasowaniem wielowykładniczym w obrazowaniu mikroskopowym i wyświetlaniu spektrogramów.
Rycina 6: Główny panel okna analizy danych w oprogramowaniu SPCImageObraz intensywności (niebieska ramka), obraz czasu życia (fioletowa ramka), histogram czasu życia (prawy górny róg), krzywa zaniku w wybranym punkcie (zielona ramka) oraz parametry zaniku w wybranym punkcie (cyjanowa ramka) reprezentatywnego zaniku PvdA-eGFP zarejestrowanego w żywych *P. aeruginosa* z wykorzystaniem karty akwizycji bh SPC830 w autorskiej konfiguracji Two-Photon Excitation-FLIM-FRET. Na zielonym panelu przedstawiono eksperymentalną krzywą zaniku dla piksela wskazanego na powyższej grafice oraz dopasowanie monoeksponencjalne (krzywa czerwona), uzyskane poprzez dekonwolucję zaniku z obliczonej funkcji odpowiedzi aparatury (krzywa zielona). Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

  1. Podstawowa analiza
    1. Uruchom oprogramowanie SPCImage.
    2. Zaimportuj zapisany plik SPCM. Obraz intensywności jest wyświetlany w lewym górnym panelu oprogramowania (Rysunek 6 niebieska ramka).
    3. Przeanalizuj okno krzywej wygaszania (Rysunek 6 zielona ramka), które wyświetla dane o wygaszaniu odpowiadające pikselowi wybranemu na obrazie intensywności (Rysunek 6 niebieska ramka). Liczba fotonów dla każdego kanału czasowego jest przedstawiona w postaci niebieskich kropek, a dopasowanie wygaszania jest zaznaczone czerwoną linią. Należy pamiętać, że po załadowaniu danych oprogramowanie wyświetla najjaśniejszy piksel obrazu. Przesuwaj niebieski krzyżyk po obrazie, aby zbadać piksele o niższej intensywności. Okno wygaszania będzie automatycznie odświeżać się przy każdej nowej pozycji piksela.
      UWAGA: Pomiar funkcji odpowiedzi instrumentalnej (IRF) w systemie skanowania laserowego jest bardzo trudny. Do dekonwolucji wygaszania można użyć IRF obliczonej z narastającej krawędzi krzywych wygaszania fluorescencji w danych FLIM. Jest to opcja domyślna w SPCimage (Rysunek 6 zielona krzywa).
    4. Dostosuj zakres dopasowania, przesuwając kanały początkowe i końcowe ramki dopasowania (T1 i T2 w zielonej ramce). T1 powinno zaczynać się w pierwszych kilku kanałach narastającego wygaszania, a T2 definiuje ostatni kanał na końcu wygaszania i może być wybrane jako jeden z ostatnich kanałów wygaszania z liczbą fotonów powyżej przesunięcia liczników fotonów (tj. poziomów fotonów liczonych przed wzrostem wygaszania).
    5. Wybierz binowanie, zmieniając wartość Bin. Krzywa wygaszania integruje zliczanie fotonów wybranego piksela wraz z obszarem i pikseli wokół pozycji kursora zdefiniowanym przez parametr bin (zwiększenie binowania zwiększy liczbę fotonów w wygaszaniu i może pomóc w osiągnięciu liczby fotonów wymaganej dla modeli wielowykładniczych).
    6. Dostosuj wartość Threshold. Piksele, które nie mają co najmniej jednego kanału z liczbą fotonów wyższą niż wartość progowa, nie zostaną uwzględnione w procedurze dopasowania. Oczywiście im większa liczba pikseli do dopasowania, tym dłuższa analiza.
      UWAGA: Dane FLIM mogą zawierać ogromną liczbę pikseli i kanałów czasowych. Najnowsze wersje oprogramowania umożliwiają wykorzystanie GPU (Graphics Processor Unit) do równoległego przetwarzania dużej liczby pikseli, co znacznie skraca czas przetwarzania. Warto dostosować parametry binowania i progu, używając obrazów odpowiadających konstrukcjom bakteryjnym wykazującym najniższą intensywność fluorescencji (np. z szczepami bakteryjnymi o najniższych poziomach ekspresji). Zapewni to, że odpowiednie wygaszania obserwowane w tych próbkach spełnią kryteria filtrowania i zostaną uwzględnione w analizie. Parametry te mogą następnie zostać zastosowane do wszystkich obrazów.
    7. Dostosuj, jeśli to konieczne, parametry wygaszania (błękitna ramka). Pozostaw wartość przesunięcia (shift) zmienną; w większości przypadków rozproszenie (scatter) i offset mogą zostać ustawione na zero, jeśli analiza funkcji wygaszania wykaże, że ich wpływ jest pomijalny. Offset można oszacować, patrząc na pierwsze kanały wygaszania – należy zauważyć, że obrazowanie przez długi czas ze względu na niską fluorescencję w próbce zazwyczaj skutkuje niezerowym offsetem. Rozproszenie występuje głównie w grubych próbkach, w innym przypadku można je uznać za pomijalne.
    8. Przed uruchomieniem dopasowania wybierz algorytm dopasowania. Otwórz okno ustawień algorytmu w Show/Hide Model Options. Wybierz algorytm estymacji największej wiarygodności (MLE) (Rysunek 7A).
    9. Uruchom dopasowanie obrazu, klikając Calculate | Decay matrix. Po zakończeniu w panelu obrazu czasu życia pojawi się obraz FLIM z zakodowanym czasem życia (Rysunek 6 fioletowa ramka).
      UWAGA: W oknie krzywej wygaszania (Rysunek 6 zielona ramka) można zobaczyć wartość czasu życia odpowiadającą każdemu pikselowi obrazu, przesuwając niebieski krzyżyk.
      UWAGA: do automatycznego przetwarzania dużej liczby podobnych plików danych FLIM można użyć trybu przetwarzania wsadowego.
    10. Sprawdź jakość dopasowania, analizując reszty (idealnie rozłożone losowo wokół 0) oraz wartość Chi kwadrat bliską 1.
    11. Dopasowane dane można eksportować w różnych formatach. Aby wyeksportować pliki w formacie txt, przejdź do File | Export. W oknie opcji Export (Rysunek 7B) wybierz Select All, a następnie kliknij Export.
    12. Na koniec zapisz plik analizy. Pliki analiz są zapisywane jako pliki *.img i mogą być otwierane bezpośrednio w SPCImage.
      UWAGA: W szczególnych przypadkach niezrównoważonych ilości donora/akceptora, FLIM-FRET może ujawnić subpopulacje w mieszaninie oddziałujących kompleksów białkowych – zwłaszcza gdy stężenia dwóch partnerów są bardzo różne, co prowadzi do powstania mieszanin kompleksów i wolnych cząsteczek. Gatunki nieoddziałujące (charakteryzujące się wygaszaniem bardzo podobnym do wygaszania samego donora) można odróżnić od oddziałujących, zakładając przestrzenną niezmienność składowych czasu życia donora w całym zestawie danych. Podobnie mogą tworzyć się niestochiometryczne kompleksy oddziałujące z nadmiarem donora lub akceptora fluorescencji. Wygaszania fluorescencji takich kompleksów są zazwyczaj trudne do interpretacji. Wykres diagramu FLIM może dostarczyć kluczowych informacji o stochiometrii i trybie wiązania PPI20,23. Wykres diagramu FLIM jest graficzną reprezentacją najkrótszej składowej czasu życia jako funkcji jej amplitudy. Może być użyty do wizualizacji pikseli o podobnych sygnaturach wygaszania. Aby narysować takie reprezentacje, eksperymentalne wygaszania fluorescencji muszą zostać dopasowane do modelu dwuwykładniczego. Poniższe kroki mogą służyć jako przewodnik po tym procesie.
    13. Zacznij od analizy danych konstrukcji z samym donorem. Pozwoli to na wyznaczenie wartości czasu życia donora. Idealnie należy zmierzyć tę wartość na kilku obrazach zarejestrowanych w tych samych warunkach, co konstrukcje donor/akceptor, aby uzyskać wiarygodną wartość czasu życia donora.
    14. Po wyznaczeniu tej wartości, dopasuj wygaszania fluorescencji konstrukcji donor/akceptor do modelu dwuwykładniczego. W błękitnej ramce parametrów wygaszania (Rysunek 6) ustaw liczbę składowych na 2. Ustaw parametr t2(ps) na wiarygodną wartość czasu życia donora wyznaczoną w kroku 1 i zaznacz pole, aby zablokować ten parametr.
      UWAGA: Ważne jest zablokowanie długiego czasu życia τ2, aby ograniczyć nadmierne dopasowanie (over-fitting), poprawić zbieżność dopasowania i uzyskać bardziej wiarygodne parametry dopasowania dwuwykładniczego24,25,26.
    15. Zapisz plik *img i wyeksportuj dane jako pliki *.asc zgodnie z krokiem 7.1.11.

Panel wyboru parametrów algorytmicznych do dopasowania danych i opcje eksportu w oprogramowaniu do analizy spektroskopowej.
Rysunek 7: (A) Ustawienia algorytmu dopasowania zaników do modeli wykładniczychWybierając MLE (algorytm największej wiarygodności lub estymację największej wiarygodności, MLE) jako model dopasowania oraz (B) okno opcji eksportu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Zaawansowana analiza obrazów FLIM w środowisku R
    1. W razie potrzeby zainstaluj R (https://cran.r-project.org) oraz RStudio (https://rstudio.com).
    2. Otwórz RStudio i utwórz nowy projekt.
    3. Przenieś wszystkie pliki analizy *.asc do folderu o nazwie „data” w głównym folderze projektu.
    4. Otwórz nowy plik skryptu (lub otwórz uzupełniający skrypt FLIM_analysis.R).
    5. Zainstaluj dedykowany pakiet flimDiagRam do analizy danych FLIM: https://github.com/jgodet/flimDiagRam. Wywołaj pakiet w obszarze roboczym. (Zobacz instrukcję HowTo_FlimDiagRam)
      UWAGA: Instalację pakietów należy przeprowadzić tylko raz. Po zainstalowaniu pakiety można wywoływać w każdej nowej sesji R. Pobieranie pakietów R z serwisu GitHub wymaga zainstalowania pakietu „devtools”. Instalacja „devtools” może potrwać kilka minut. Pakiet flimDiagRam może być wykorzystany do przedstawiania parametrów i rozkładów danych FLIM, wyodrębniania danych FLIM na poziomie pojedynczych, zindywidualizowanych komórek, porównywania wyników FLIM pomiędzy różnymi warunkami lub szczepami oraz eksploracji danych FLIM przy użyciu zaawansowanych narzędzi wizualizacji, takich jak wykresy diagramów FLIM.
    6. Skorzystaj z opisanego krok po kroku kodu oraz udostępnionych danych, aby niezależnie odtworzyć wszystkie podrysunki przedstawione w poniższej sekcji Reprezentatywne wyniki. Niniejszy samouczek znajduje się w instrukcji HowTo_FlimDiagRam pod adresem https://github.com/jgodet/flimDiagRam/blob/master/HowTo.pdf. Kod można łatwo dostosować do analizy własnych danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Empiryczne funkcje rozkładu skumulowanego (ecdf) czasów życia fluorescencji zmierzonych dla różnych szczepów bakteryjnych przedstawiono na Rysunku 8. W przypadku wystąpienia zjawiska FRET, ecdf są przesunięte w stronę krótszych czasów życia (Rysunek 8A,8B). Należy zauważyć, że gdy oddziaływanie dwóch białek skutkuje dużą odległością między dwoma fluoroforami, FRET nie może wystąpić (Rysunek 8C). Sytuacji tej nie moż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

FLIM-FRET oferuje kilka kluczowych zalet w porównaniu z obrazowaniem FRET opartym na intensywności. Czas życia fluorescencji jest nieodłącznym parametrem fluoroforu. W konsekwencji nie jest ono zależne ani od lokalnych stężeń fluoroforów, ani od intensywności wzbudzenia świetlnego. Na żywotność fluorescencji dodatkowo słabo wpływa fotowybielanie. Szczególnie interesujące jest udowodnienie IPP w komórkach, w których lokalne stężenia białek mogą być wysoce niejednorodne w przedziałach lub regionach subkomórkowych. FLIM-FRE...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy dr Ludovicowi Richertowi za jego cenną pomoc w pozyskiwaniu danych FLIM oraz za techniczną konserwację i rozwój konfiguracji FLIM. Praca ta została sfinansowana z grantów Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). VN jest finansowany przez Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-SPF201809006906). YM jest wdzięczny Institut Universitaire de France (IUF) za wsparcie i zapewnienie dodatkowego czasu na badania. IJS i JG dziękują Instytutowi Dostarczania Leków w Strasburgu za wsparcie finansowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtr pasmowo-przepustowy 525/50 nmF37-516, AHF, Niemcy
Filtr krótkoprzepustowy 680 nmF75-680, AHF, Niemcy
AgarozaSigma-AldrichA9539
Siarczan amonu (NH4)2SO4Sigma-AldrichA4418
DreamTaq Polimeraza DNA 5U/μ LThermoFisher ScientificEP0714
E. coli TOP10InvitrogenC404010
Fotodioda lawinowa sprzężona z włóknemSPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer
Szkiełka nakrywkowe (grubość nr 1,5, 20 razy; 20mmKnitel glassMS0011
High-Fidelity DNA polimeraza Phusion 2U/μ LThermoFisher ScientificF530S
Rosół lizogeniczny (LB)Milipor1.10285
Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4 . 7H2O)Sigma-Aldrich10034-99-8
Szkiełka mikroskopowe (25 razy; 75mm)Knitel glassMS0057
NucleoSpin Żel i czyszczenie PCRMacherey-Nagel740609.50
NucleoSpin PlazmidMacherey-Nagel740588.10
Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)Sigma-AldrichRES20765
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655
Sód Bursztynian (disód)Sigma-Aldrich14160
SPCImage, oprogramowanie SPCMBecker & Hickl
Sterylna pętla inokulacyjnaNunc7648-1PAK
T4 Ligaza DNA 1U/μ L15224017ThermoFisher Scientific
SPC830, Becker & Hickl, Niemcy
Ti:Szafirowy laserInsight DeepSee, Rurki do fizyki
50 mlFalcon352070
Moduł TCSPC widm

Bibliografia

  1. Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
  2. Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 325, 991-1018 (2003).
  3. Hayes, S., Malacrida, B., Kiely, M., Kiely, P. A. Studying protein-protein interactions: Progress, pitfalls and solutions. Biochemical Society Transactions. 44, 994-1004 (2016).
  4. Guillon, L., Altenburger, S., Graumann, P. L., Schalk, I. J. Deciphering protein dynamics of the siderophore pyoverdine pathway in Pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 8, 1-9 (2013).
  5. Ringel, M. T., Brüser, T. The biosynthesis of pyoverdines. Microbial Cell. 5, 424-437 (2018).
  6. Schalk, I. J., Rigouin, C., Godet, J. An overview of siderophore biosynthesis among fluorescent Pseudomonads and new insights into their complex cellular organization. Environmental Microbiology. 22, 1447-1466 (2020).
  7. Cui, Y., et al. Techniques for detecting protein-protein interactions in living cells: principles, limitations, and recent progress. Science China Life Sciences. , (2019).
  8. Day, R. N., Mazumder, N., Sun, Y., Christopher, K. G. FRET microscopy: Basics, issues and advantages of FLIM-FRET imaging. Springer Series in Chemical Physics. 111, 249-276 (2015).
  9. Bastiaens, P. I. H., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: Spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends in Cell Biology. 9, 48-52 (1999).
  10. Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16, 551-561 (2006).
  11. Tramier, M., Zahid, M., Mevel, J. -C., Masse, M. -J., Coppey-Moisan, M. Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry Pairs to Donor Photobleaching on FRET Determination by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy in Living Cells. Microscopy Research and Technique. 71, 146-157 (2008).
  12. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Switzerland). 16, 1-24 (2016).
  13. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32, 407-414 (2007).
  14. Leray, A., et al. Optimized protocol of a frequency domain fluorescence lifetime imaging microscope for fret measurements. Microscopy Research and Technique. 72, 371-379 (2009).
  15. Elson, D. S., et al. Real-time time-domain fluorescence lifetime imaging including single-shot acquisition with a segmented optical image intensifier. New Journal of Physics. 6, 1-13 (2004).
  16. Rajoria, S., Zhao, L., Intes, X., Barroso, M. FLIM-FRET for Cancer Applications. Current Molecular Imaging. 3, 144-161 (2014).
  17. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8, 393-399 (2011).
  18. Visca, P., Ciervo, A., Orsi, N. Cloning and nucleotide sequence of the pvdA gene encoding the pyoverdin biosynthetic enzyme L-ornithine N5-oxygenase in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 176, 1128-1140 (1994).
  19. Imperi, F., Visca, P. Subcellular localization of the pyoverdine biogenesis machinery of Pseudomonas aeruginosa: A membrane-associated 'siderosome'. FEBS Letters. 587, 3387-3391 (2013).
  20. Gasser, V., et al. In cellulo FRET-FLIM and single molecule tracking reveal the supra-molecular organization of the pyoverdine bio-synthetic enzymes in Pseudomonas aeruginosa. Quarterly Reviews of Biophysics. , 1-11 (2019).
  21. Rietsch, A., Mekalanos, J. J. Metabolic regulation of type III secretion gene expression in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 59, 807-820 (2006).
  22. Herrero, M., De Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172, 6557-6567 (1990).
  23. Godet, J., Mély, Y. Exploring protein-protein interactions with large differences in protein expression levels using FLIM-FRET. Methods and Applications in Fluorescence. 8, 014007(2019).
  24. El Meshri, S. E., et al. Role of the nucleocapsid domain in HIV-1 gag oligomerization and trafficking to the plasma membrane: A fluorescence lifetime imaging microscopy investigation. Journal of Molecular Biology. 427, 1480-1494 (2015).
  25. Becker, W. The bh TCSPC Handbook. Scanning. , 1(2010).
  26. Richert, L., Didier, P., de Rocquigny, H., Mély, Y. Monitoring HIV-1 protein oligomerization by FLIM FRET microscopy. Springer Series in Chemical Physics. , 111(2015).
  27. Fereidouni, F., Blab, G. A., Gerritsen, H. C. Phasor based analysis of FRET images recorded using spectrally resolved lifetime imaging. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
  28. Fereidouni, F., Gorpas, D., Ma, D., Fatakdawala, H., Marcu, L. Rapid fluorescence lifetime estimation with modified phasor approach and Laguerre deconvolution: a comparative study. Methods and Applications in Fluorescence. 5, 035003(2017).
  29. Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
  30. Guzmán, C., Oetken-Lindholm, C., Abankwa, D. Automated High-Throughput Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy to Detect Protein-Protein Interactions. Journal of Laboratory Automation. 21, 238-245 (2016).
  31. Liu, W., Cui, Y., Ren, W., Irudayaraj, J. Epigenetic biomarker screening by FLIM-FRET for combination therapy in ER+ breast cancer. Clinical Epigenetics. 11, 1-9 (2019).
  32. Liu, X., et al. Fast fluorescence lifetime imaging techniques: A review on challenge and development. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12, 1-27 (2019).
  33. Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Non fitting based FRET-FLIM analysis approaches applied to quantify protein-protein interactions in live cells. Biophysical Reviews. 3, 63-70 (2011).
  34. Padilla-Parra, S., Audugé, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).
  35. Stringari, C., et al. Phasor approach to fluorescence lifetime microscopy distinguishes different metabolic states of germ cells in a live tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13582-13587 (2011).
  36. Digman, M. A., Caiolfa, V. R., Zamai, M., Gratton, E. The phasor approach to fluorescence lifetime imaging analysis. Biophysical Journal. 94, 14-16 (2008).
  37. Liang, Z., Lou, J., Scipioni, L., Gratton, E., Hinde, E. Quantifying nuclear wide chromatin compaction by phasor analysis of histone Förster resonance energy transfer (FRET) in frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) data. Data in Brief. 30, 105401(2020).
  38. Grimm, J. B., Heckman, L. M., Lavis, L. D. The chemistry of small-molecule fluorogenic probes. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 113, Elsevier Inc. (2013).
  39. Li, L., Sun, H. Next Generation of Small-Molecule Fluorogenic Probes for Bioimaging. Biochemistry. 59, 216-217 (2020).
  40. Yao, R., Ochoa, M., Yan, P., Intes, X. Net-FLICS: fast quantitative wide-field fluorescence lifetime imaging with compressed sensing - deep learning approach. Light: Science and Applications. 8, 1-7 (2019).
  41. Smith, J. T., et al. Fast fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging via deep learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 24019-24030 (2019).
  42. Yao, R., Ochoa, M., Intes, X., Yan, P. Deep compressive macroscopic fluorescence lifetime imaging. Proceedings - International Symposium on Biomedical Imaging. 2018, 908-911 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie czasu ycia fluorescencjianaliza FRETPseudomonas aeruginosakonstrukcja mutant w bakteryjnychnarz dzia do analizy danychrozk ad czasu ycia fluorescencjipomiary stechiometrii
Pomiary FLIM-FRET interakcji białko-białko u żywych bakterii.
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.