Przygotowanie i wstrzykiwanie zarodków komarów Culex w celu wygenerowania mutacji zerowych przy użyciu CRISPR/Cas9

Podsumowanie

CRISPR/Cas9 jest coraz częściej używany do charakteryzowania funkcji genów w organizmach niemodelowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób generować linie nokautujące Culex pipiens, od przygotowania mieszanek iniekcyjnych, po pozyskiwanie i wstrzykiwanie zarodków komarów, a także jak hodować, krzyżować i badać przesiewowo komary, którym wstrzyknięto implanty i ich potomstwo pod kątem pożądanych mutacji.

Streszczenie

Komary Culex są głównymi wektorami wielu chorób, które negatywnie wpływają na zdrowie ludzi i zwierząt, w tym wirusa Zachodniego Nilu i chorób wywoływanych przez nicienie filarialne, takie jak nicienie sercowe i słoniowacica. Ostatnio edycja genomu CRISPR/Cas9 została wykorzystana do wywołania mutacji ukierunkowanych na miejsce poprzez wstrzyknięcie białka Cas9, które zostało skompleksowane z przewodnikiem RNA (gRNA) do świeżo złożonych zarodków kilku gatunków owadów, w tym komarów należących do rodzajów Anopheles i Aedes. Manipulowanie i wstrzykiwanie komarów Culex jest nieco trudniejsze, ponieważ komary te składają jaja pionowo na tratwach, a nie pojedynczo, jak inne gatunki komarów. Tutaj opisujemy, jak projektować gRNA, kompleksować je białkiem Cas9, nakłaniać samice komarów Culex pipiens do składania jaj oraz jak przygotować i wstrzyknąć nowo złożone zarodki do mikroiniekcji Cas9/gRNA. Opisujemy również, jak hodować i przesiewać komary, którym wstrzyknięto implant, pod kątem pożądanej mutacji. Reprezentatywne wyniki pokazują, że technika ta może być stosowana do indukowania mutacji ukierunkowanych na miejsce w genomie komarów Culex i, z niewielkimi modyfikacjami, może być stosowana do generowania mutantów zerowych również u innych gatunków komarów.

Wprowadzenie

Komary Culex są rozmieszczone w umiarkowanych i tropikalnych regionach świata i przenoszą kilka śmiertelnych wirusów, w tym wirusa Zachodniego Nilu¹, St. Louis encephalitis class² a także nicienie filarialne, które powodują dirofilariozę psów³ i słoniowacizna⁴. Członkowie kompleksu Culex pipiens, który obejmuje Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens i Cx. pipiens molestus, wykazują uderzające różnice w wielu aspektach swojej biologii. Na przykład, podczas gdy Cx. quinquefasciatus i Cx. pipiens molestus nie są w stanie wejść w stan spoczynku zimowego^5,6, Cx. pipiens pipiens wykazują silne odpowiedzi sezonowe i wchodzą w diapauzę w odpowiedzi na krótkie dni^7,8. Dodatkowo, Cx. pipiens molestus wydają się być bardziej antropofilne, podczas gdy Cx. pipiens i Cx. quinquefasciatus są bardziej zoofilne⁶. Jednak w Stanach Zjednoczonych i w wielu innych miejscach na świecie gatunki te krzyżują się, co ma silne implikacje dla przenoszenia chorób jako hybrydy Cx. pipiens pipiens i Cx. pipiens molestus są oportunistycznymi żywicielami i gryzą zarówno ptaki, jak i ludzi⁹, służąc w ten sposób jako wektory pomostowe dla wirusa Zachodniego Nilu. Studiowanie tych i innych fascynujących aspektów biologii komarów Culex było utrudnione, częściowo dlatego, że komary Culex są nieco trudniejsze do wyhodowania w laboratorium niż komary Aedes, które produkują jaja w stanie spoczynku i odporne na wysuszenie^{10 oraz dlatego, że} funkcjonalne narzędzia molekularne nie są tak dobrze rozwinięte dla gatunków Culex.

Edycja genomu CRISPR/Cas9 to potężna technologia, która została wykorzystana do oceny biologii kilku ważnych gatunków komarów^11,12,13, w tym południowego komara domowego, Culex quinquefasciatus^14,15,16. Ta technologia, opracowana przez Jennifer Doudna i Emmanuelle Charpentier, wykorzystuje naturalną obronę bakteryjną przed wirusami przez endonukleazy pochodzenia bakteryjnego i związanego z CRISPR (białka Cas; patrz recenzja Van der Oost i wsp.¹⁷). Po wstrzyknięciu do zarodków zwierzęcych białka Cas9 w połączeniu z odpowiednim przewodnikiem RNA mogą powodować dwuniciowe pęknięcia w genomie. Najczęściej odbywa się to za pomocą białka Cas9, które jest skompleksowane z przewodnikowymi RNA, które kieruje aktywność endonukleazy do określonego regionu genomu. Po tym, jak białko Cas9 wytworzy specyficzne dla miejsca dwuniciowe pęknięcie, maszyneria komórkowa próbuje naprawić pęknięcie za pomocą jednego z dwóch mechanizmów. Pierwsza polega na podwiązaniu dwóch końców razem poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), które jest podatne na błędy i często powoduje insercje i delecje poza ramką w genomie, co może skutkować niefunkcjonalnymi białkami, generując w ten sposób mutację nokautującą. Alternatywnie, maszyneria komórkowa może wykorzystywać naprawę kierowaną homologią (HDR), znajdując podobne sekwencje w celu prawidłowej naprawy przerwy. Podobną sekwencję może zapewnić drugi chromosom w organizmie (patrz review¹⁸). Jeśli jednak naprawiona sekwencja dokładnie pasuje do oryginalnej sekwencji, białko Cas9 będzie w stanie ponownie przeciąć DNA. Alternatywnie, naukowcy mogą również dołączyć plazmid dawcy, który zawiera sekwencje homologiczne po obu stronach miejsca cięcia sekwencji docelowej z alternatywną sekwencją naprawczą - często białkiem markera fluorescencyjnego, zmodyfikowaną wersją oryginalnego genu lub inną modyfikacją - którą można skopiować i wprowadzić do genomu lub "wbić".

Czas jest krytyczny podczas wstrzykiwania embrionów, a szczególnie podczas korzystania z edycji genomu CRISPR/Cas9 do tworzenia mutacji u owadów. Dzieje się tak, ponieważ białko Cas9 i gRNA mają największą zdolność do generowania mutacji tylko wtedy, gdy zarodek jest w stanie syncytialnym, przed utworzeniem błon komórkowych i gdy w zarodku dostępnych jest wiele jąder. W przypadku komarów jądra docierają do obrzeży ~2-4 godziny po złożeniu jaj, w zależności od temperatury¹⁹, a zatem udana mikroiniekcja musi nastąpić przed tym czasem. Dodatkowo, białko Cas9 przetnie wszelkie jądrowe DNA, do którego ma dostęp, tak że osoba powstała w wyniku wstrzyknięcia będzie zawierała mozaikę komórek, z których niektóre będą miały pożądaną mutację, a inne nie. Aby te mutacje mogły być pomyślnie dziedziczone, białko Cas9 musi przeciąć DNA, które znajduje się w linii zarodkowej, która da początek przyszłym jajom i plemnikom. Aby upewnić się, że mutacje powstają w linii zarodkowej, najlepiej jest wstrzyknąć wszystkie materiały w pobliżu lokalizacji komórek biegunowych w zarodku, które są przodkami linii zarodkowej owadów. Komórki biegunowe znajdują się w pobliżu tylnego końca zarodków Culex²⁰. Oprócz wstrzykiwania zarodków konieczne jest opracowanie starannego planu krzyżowania i badań przesiewowych potomstwa w celu wykrycia pożądanej mutacji.

Ten protokół opisuje, jak generować gRNA i łączyć je z białkiem Cas9 w celu przygotowania mieszanek iniekcyjnych, a także jak nakłonić samice komarów Culex pipiens do złożenia jaj oraz jak przygotować i wstrzyknąć te jaja do edycji genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9. Dodatkowo opisujemy, w jaki sposób hodować, krzyżować i badać przesiewowo wstrzyknięte zarodki i ich potomstwo, aby potwierdzić, że pożądana mutacja została uzyskana. Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy mutacje zerowe dla interesującego nas genu, cyklu, w szczepie Buckeye Culex pipiens. Szczep ten został pierwotnie założony w 2013 roku z komarów zebranych w terenie w Columbus w stanie Ohio i jest utrzymywany przez laboratorium Meuti. Protokół ten może być wykorzystany do dodatkowych badań, które wymagają edycji genomu CRISPR/Cas9 u komarów Culex, a także innych gatunków komarów, a bardziej ogólnie, jest istotny dla zastosowania edycji genomu CRISPR/Cas9 do dowolnego gatunku owadów.

Protokół

W większości instytucji badawczych musi istnieć zatwierdzony Protokół Bezpieczeństwa Biologicznego przed wygenerowaniem lub utrzymaniem transgenicznych owadów, aby zapewnić, że genetycznie modyfikowane organizmy nie uciekną lub nie zostaną usunięte z laboratorium. Mogą również obowiązywać dodatkowe przepisy rządowe. Przed rozpoczęciem projektu tego rodzaju należy sprawdzić wszystkie zasady i procedury instytucji, aby określić, jakie dokumenty i zgody są wymagane.

1. Projektowanie gRNA i przygotowywanie mieszanek iniekcyjnych

1. Zaprojektuj 2-5 gRNA dla każdego genu docelowego, ponieważ niektóre gRNA działają lepiej niż inne. gRNA, które celują w gen będący przedmiotem zainteresowania, mogą być zaprojektowane ręcznie lub można użyć bezpłatnych programów, takich jak Chop-Chop.
2. Zaprojektuj i uporządkuj startery, które amplifikują fragmenty o długości 100-200 pz wokół każdego gRNA. Idealnie byłoby, gdyby miejsce cięcia znajdowało się mniej więcej w środkowej jednej trzeciej do połowy produktu PCR. Zwróć uwagę, ile bp w każdym miejscu cięcia zostanie wyprodukowane.
3. Uzyskać gRNA.
   1. Kupuj gRNA od firm komercyjnych, takich jak Integrated DNA Technologies, Fisher Scientific, Genescript i innych. To najłatwiejsza opcja.
   2. Alternatywnie, utwórz gRNA w laboratorium za pomocą amplifikacji PCR, aby wygenerować matryce do późniejszej syntezy izotermicznej. Zobacz protokół opisany przez Port et al.²¹ oraz Kistler et al.²².
   3. Dostarczaj gRNA za pośrednictwem plazmidu, który jest wstrzykiwany do zarodków. W takim przypadku gRNA powinno być sterowane przez promotor U6 (szczegóły w ^23,24).
4. Otrzymać białko Cas9.
   1. Zamów Cas9 komercyjnie w kilku firmach, w tym Fisher Scientific. To najłatwiejsza opcja.
   2. Zrób białko Cas9 i oczyść je w laboratorium zgodnie z Basu et al.²⁵ i Kistler et al.²².
   3. Wstrzyknij mRNA Cas9 do zarodków, gdzie później zostanie przetłumaczone na aktywne białko Cas9. MRNA Cas9 może być syntetyzowane w laboratorium przy użyciu transkrypcji in vitro²² lub zakupione od dostawców takich jak Sigma.
      UWAGA: Przekształcone białko Cas9 musi zawierać sygnał lokalizacji jądrowej (NLS) na C-końcu, a zatem NLS musi być również obecny w wstrzykniętym mRNA Cas9.
   4. Ekspresja białka Cas9 in vivo poprzez ekspresję opartą na plazmidzie. W takim przypadku najlepiej jest uzyskać ekspresję Cas9 na plazmidzie napędzanym przez promotor embrionalny, który został dobrze scharakteryzowany u gatunku docelowego.
      UWAGA: Do tej pory promotory embrionalne nie zostały dobrze scharakteryzowane u komarów Culex, dlatego zaleca się wstrzykiwanie oczyszczonego białka lub mRNA Cas9.
5. Kompleks gRNA z białkiem Cas9, zaadaptowanym z Kistler et al.²².
   1. W przypadku wstrzykiwania białka Cas9 z gRNA razem (zalecane), upewnij się, że końcowe stężenie białka Cas9 wynosi 300 ng/μL, a końcowe stężenie pojedynczego gRNA wynosi 80 μg/μL. Wymieszaj białko i pojedyncze gRNA w probówce PCR o pojemności 0,2 ml.
   2. Inkubować przez 20 minut na lodzie.
6. Testowanie gRNA za pomocą testu in vitro (np. Zestaw do badań przesiewowych Guide-it sgRNA).
   1. Amplifikuj fragmenty wokół miejsca cięcia dla każdego gRNA za pomocą PCR.
   2. Uruchom produkty PCR na żelu, aby upewnić się, że mają odpowiedni rozmiar. Następnie oczyść produkty PCR i zsekwencjonuj je, aby upewnić się, że są ukierunkowane na właściwy region genu.
   3. Zmieszać 200 ng pozostałego oczyszczonego produktu PCR z 1 μl buforu reakcyjnego Cas9, 1 μl BSA, 1,5 μl skompleksowanego Cas9:gRNA i doprowadzić całkowitą objętość reakcji do 15 μl. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37°C.
   4. Ponownie uruchom produkt na żelu. Jeśli białko Cas9 skutecznie przetnie produkt PCR, prążek pierwotny powinien wydawać się słabszy i powinny być obecne dodatkowe mniejsze prążki. Zwróć uwagę na zmniejszenie rozmiaru oryginalnego produktu PCR i, jeśli chcesz, oblicz zmniejszenie intensywności pasma, aby w przybliżeniu określić wydajność cięcia.
7. Przygotowanie końcowej mieszanki iniekcyjnej
   1. Dla każdego gRNA, które pomyślnie przecięło swój docelowy produkt PCR, wymieszaj objętości każdego Cas9 i gRNA w probówce o pojemności 0,5 ml tak, aby końcowa objętość pozostała 300 ng / μl białka Cas9 i 80 ng / μl każdego gRNA.
   2. Skompleksowane Cas9 i gRNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne do wstrzyknięcia.

2. Igły do ciągnięcia i fazowania

UWAGA: Udane wstrzyknięcia i przeżycie zarodków wymaga ostrych igieł (Rysunek 1).

1. Użyj mikrokapilar ze szkła borokrzemianowego lub kwarcowego o średnicy zewnętrznej 1 mm. Ssilikonowaj mikrokapilary w chemicznym okapie wyciągowym przed wyciągiem.
   1. Krótko mówiąc, umieścić 3 ml Sigmacote w szklanej zlewce i wciągnąć próżniowo do drugiej zlewki zawierającej szklane mikrokapilary na co najmniej 4 godziny, pozwalając roztworowi silikonowemu odparować i osiąść na wszystkich powierzchniach mikronaczyń włosowatych.
   2. Następnie powoli pozwól, aby komora próżniowa wyrównała się z ciśnieniem otoczenia, stopniowo otwierając zawór odcinający i pozwalając powietrzu powrócić do komory. Igły są wtedy gotowe do wyciągnięcia.
   3. Zawsze czytaj instrukcję obsługi ściągaczy igieł przed użyciem.
      UWAGA: Poniższe instrukcje szczegółowo opisują, jak używać laserowego ściągacza igieł P-2000 do ciągnięcia szklanych igieł. Ważne jest, aby pamiętać, że wszystkie ściągacze igieł, nawet tej samej marki, nie są skalibrowane do ciągnięcia dokładnie tej samej igły przez różne jednostki. Kluczem do uzyskania dobrych igieł jest rozpoczęcie od określonego zestawu parametrów, a następnie wyciągnięcie igieł przy użyciu parametrów, które są powyżej i poniżej tych wartości. Należy przetestować igły przy każdym z tych parametrów, oceniając, jak dobrze igła przebija zarodki i jak dobrze mieszanina iniekcyjna przepływa z igły. Udoskonalaj parametry, aż uzyskasz igłę, która jest łatwa do otwarcia lub ukosowania, która gładko przebija zarodki i łatwo dostarcza mieszankę do wstrzykiwań.
2. Wyciąganie igieł za pomocą laserowego ściągacza igieł P-2000
   1. Włącz laserowy ściągacz igieł i pozwól laserowi rozgrzać się przez 15 minut przed pierwszym pociągnięciem.
   2. Zaprogramuj maszynę dla typu szklanej rurki mikrokapilarnej (pamiętaj, że wszelkie parametry ściągacza igieł są punktem wyjścia, ponieważ ściągacze igieł nie są skalibrowane do wytwarzania tej samej igły na wszystkich ściągaczach):
      Kwarc: Ciepło = 730; Fil = 4; Vel = 40; Del = 122; Pul = 156
   3. Po zaprogramowaniu ściągacza igłowego załaduj mikrokapilę i zaciśnij ją na miejscu, uważając, aby dotykać tylko końca rurki mikrokapilarnej, a nie obszaru, który będzie ogrzewany przez laser.
   4. Po zaciśnięciu mikrokapilary połóż kciuk i palec wskazujący na prętach palcowych, a następnie zwolnij drążki pociągowe, naciskając pojedynczo zwalniacze sprężynowe.
   5. Ściśnij kciuk i palec wskazujący, aby całkowicie ściągnąć pręty do siebie.
   6. Umieść drugą stronę rurki mikrokapilarnej w jej zacisku tak, aby niewielka część rurki wystawała z obu stron. Dokręć zaciski, upewniając się, że oba zaciski są dokręcone palcami i że mocno utrzymują "drążki ciągnące" na miejscu.
   7. Zamknij osłonę ochronną na ściągaczu.
   8. Naciśnij przycisk Pull, a laser zacznie nagrzewać szybę, sygnalizowaną czerwoną lampką "laser on" znajdującą się pod osłoną. Ciągnięcie jest zakończone, gdy pręty ciągnące są całkowicie oddzielone, czemu towarzyszy metaliczny łomot.
   9. Upewnij się, że kontrolka "laser włączony" nie świeci się przed podniesieniem osłony.
   10. Przytrzymaj mały koniec rurki mikrokapilarnej, która wystaje poza zacisk kciukiem i palcem wskazującym, a następnie poluzuj zacisk. Następnie wyjmij rurkę mikrokapilarną z zacisku.
   11. Za pomocą kleszczy ostrożnie umieść rurkę mikrokapilarną na kwadratowej szalce Petriego wyłożonej dwustronną taśmą. Podczas umieszczania igły w pudełku do trzymania upewnij się, że tylny koniec igły dotyka jako pierwszy, a igła jest delikatnie opuszczana na miejsce, aby ostra końcówka nie została uszkodzona.
3. Wyciąganie igieł za pomocą ściągacza igieł PC-10/PC-100
   1. Ustaw ściągacz PC-10 za pomocą 4 ciężarków i ustaw temperaturę na 50.4 °C dla jednoetapowego ciągnięcia.
   2. Umieść mikrokapilę ze szkła borokrzemianowego w górnym zacisku. Następnie podnieś obciążony dolny zacisk na miejsce i zaciśnij dolną część mikrokapilary, upewniając się, że kapilara jest w pozycji do wyciągnięcia dwóch dobrych igieł. Jest to dość długi cykl ciągnięcia, ale daje dobre igły do ukosowania.
4. Igły do fazowania.
   UWAGA: Ta metoda ukosowania na mokro daje informację zwrotną w czasie rzeczywistym o względnym rozmiarze otwarcia igły.
   1. Zamontuj płytkę ścierną i pierścień ustalający ukosownika igłowego. Upewnij się, że szara strona tarczy ściernej jest skierowana do góry między górnym i dolnym pierścieniem ustalającym. Dokręć na pierścieniu ustalającym, naprzemiennie ze na, aby upewnić się, że każda śruba jest równomiernie dokręcona. Płyta ścierna i pierścienie ustalające będą dalej określane jako zespół szlifierski.
   2. Umieść 13 kropli (~ 520 μL) oleju stojącego na płaskiej powierzchni optycznej, a następnie umieść zestaw szlifierski na wierzchu płytki. Umieść zespół pod mikroskopem preparacyjnym, a następnie włącz ukosowanie. Stosuje się trochę więcej oleju w porównaniu z zaleceniami Suttera, ponieważ utrzymuje to tarczę ścierną w ruchu przez dłuższy czas, gdy jest używana w połączeniu z tą metodą ukosowania na mokro.
   3. Dodaj 1% roztworu Photo-Flo do powierzchni szlifierskiej i przesuń na miejsce, tak aby był zanurzony w roztworze Photo-Flo.
   4. Włącz powietrze w głównym źródle. Następnie umieść ciągniętą igłę borokrzemianową w uchwycie i dokręć pierścień ustalający. Włącz powietrze na regulatorze i zwiększaj, aż ciśnienie osiągnie 26 PSI.
   5. Obserwując z boku, opuść igłę za pomocą pokrętła regulacji zgrubnej, aż prawie dotknie powierzchni płynu Photo-Flo.
   6. Wyreguluj mikroskop, aby zlokalizować igłę w polu view. Zacznij od najmniejszego powiększenia i zwiększaj powiększenie. Ostrożnie wyreguluj położenie igły za pomocą pokrętła regulacji zgrubnej, aż dotknie powierzchni płynu Photo-Flo.
   7. Używając pokrętła regulacji zgrubnej i kontynuując patrzenie pod mikroskop, opuść igłę, aż znajdzie się blisko powierzchni ściernej, ale jej nie dotyka
   .
   8. Za pomocą pokrętła precyzyjnej regulacji ostrożnie i powoli opuść igłę, zwracając szczególną uwagę na igłę i cień, jaki pozostawia na ściernej powierzchni ukosownika. Gdy igła i jej cień wyglądają, jakby miały dotknąć powierzchni ściernej, kontynuuj opuszczanie igły jeszcze wolniej i ostrożniej.
   9. Na przemian pozwól igle "ukosować", opuszczając ją na powierzchnię ścierną, a następnie podnosząc. Przed podniesieniem igły należy szybko zanotować ustawienie na mikrometrze na pokrętle precyzyjnej regulacji, aby igłę można było opuścić do tej samej pozycji lub, jeśli to konieczne, do nieco niższej pozycji. Pamiętaj, aby trzymać igłę poniżej warstwy płynu Photo-Flo. Gdy igła zostanie podniesiona ponad powierzchnię ścierną, szybko zatrzymaj i ponownie uruchom obrót ukosownika, aby sprawdzić, czy nie ma pęcherzyków. Jeśli igła została odpowiednio skośna, pęcherzyki powietrza powinny wypłynąć z igły do Photo-Flo. Jeśli płytka nie zostanie zatrzymana, bąbelki prawdopodobnie nie staną się widoczne, dopóki otwór igły nie będzie zbyt duży.
   10. Jeśli nie pojawią się żadne pęcherzyki, gdy igła jest podniesiona ponad powierzchnię ścierną, a ukosowarka się zatrzymała, powtórz procedurę ukosowania, opuszczając igłę do nieco niższej pozycji na mikrometrze znajdującym się na pokrętle precyzyjnej regulacji, podnosząc igłę, zatrzymując płytkę ukosowania i sprawdzając, czy nie ma pęcherzyków powietrza. Powtarzaj, aż pojawi się mały, ale stały strumień bąbelków.
   11. Gdy pojawią się pęcherzyki powietrza, sprawdź względny rozmiar otworu, zatrzymując płytę ścierną i obniżając ciśnienie powietrza, zwracając uwagę na PSI, przy którym ustaje tworzenie pęcherzyków, ponieważ jest to względne wskazanie wielkości otworu skośnych igieł. Im niższe ciśnienie, przy którym powietrze przestaje uciekać z końcówki igły, tym większy otwór igły. Igły ścięte do punktu, w którym pęcherzyki przestają uciekać z igły przy 18-20 PSI, wskazują, że igła ma stosunkowo mały otwór i powinna powodować minimalne uszkodzenie zarodka, gdy jest używana do mikroiniekcji.
   12. Po sprawdzeniu otworu igły zwiększ ciśnienie powietrza do 26 PSI, aby zapobiec przedostawaniu się płynu do igły. Następnie podnieś igłę do góry i wyjmij ją z warstwy Photo-Flo za pomocą pokrętła regulacji zgrubnej. Ważne jest, aby pamiętać, że tak długo, jak powietrze wypływa z igły, Photo-Flo nie dostaje się do igły, a zatem wnętrze igły jest chronione przed zanieczyszczeniem.
   13. Po wyjęciu igły z Photo-Flo wyłącz dopływ powietrza i wyjmij igłę z uchwytu igły.
   14. Za pomocą kleszczy umieść nowo ściętą igłę na szalce Petriego, która ma dwustronną taśmę lub plastelinę, aby utrzymać ją na miejscu. Powtarzaj proces, aż zostanie wyprodukowanych 10-20 skośnych igieł.

3. Karmienie krwią rodzicielskiego pokolenia komarów

1. Tylne larwy komarów Cx. pipiens w jednoznacznie długich warunkach dziennych (>13 h światła/dzień) w temperaturze 25–27 °C, aby zapewnić, że komary nie wejdą w stan spoczynku zimowego lub diapauzy.
2. Siedem do dziesięciu dni po szczytowym wzejściu dorosłych osobników należy przygotować system karmienia membraną Hemotek, podłączając urządzenia grzewcze do zasilania. Dostosuj temperaturę każdej jednostki do 37 °C (wewnętrzna temperatura ciała człowieka) lub 41 °C (wewnętrzna temperatura ciała kurczaka) za pomocą regulacyjnej na górze urządzenia. Upewnij się, że została osiągnięta właściwa temperatura za pomocą termometru elektrycznego.
3. Przygotuj zbiornik na mączkę z krwi do karmienia.
   1. Wytnij jeden kwadrat parafilmu na każdy cylinder podający krew i pocieraj parafilm o bose stopy. Zapewnia to zapachy, które są atrakcyjne dla komarów.
   2. Rozciągnij parafilm tak cienko, jak to możliwe, i szczelnie owiń krawędzie wokół zbiornika na posiłek. W razie potrzeby zabezpiecz na miejscu za pomocą gumowego O-ringu.
   3. Dodać około 200 μl 0,1 M roztworu ATP do 15 ml świeżej lub rozmrożonej całej krwi kurczaka poddanej działaniu cytrynianu sodu. ATP pomaga stymulować karmienie krwią, a cytrynian sodu zapobiega krzepnięciu krwi.
   4. Przytrzymaj zbiornik tak, aby strona parafilmu była skierowana w dół i ostrożnie użyj jednorazowej pipety do napełnienia zbiornika. Każdy zbiornik zawiera ~3 ml krwi. Uszczelnij porty napełniania plastikowymi zatyczkami.
   5. Przykręć zbiorniki na posiłek do urządzeń grzewczych i umieść je na klatce na komary tak, aby strona parafilmu była skierowana w dół, a komary mogły przenikać przez siatkę.
4. Przykryj klatki czarnymi workami na śmieci, aby symulować zmierzch i energicznie w każdą klatkę, ponieważ zwiększone stężenie CO₂ stymuluje odżywianie krwi.
5. Trzymaj karmnik na klatce przez 2-8 godzin, aby zmaksymalizować karmienie krwią. Sprawdzaj okresowo i zwracaj uwagę na odsetek samic, które spożyły posiłek z krwi (widoczne po ich czerwonych i rozdętych brzuchach).

4. Wywoływanie składania jaj u dorosłych komarów

1. Cztery do pięciu dni po karmieniu krwią przygotuj stożkową probówkę o pojemności 50 ml do składania jaj przez komary.
   1. Utwórz otwór ~20 mm w pobliżu dolnej części stożkowej rury.
   2. Zakryj otwór dwoma kwadratami (35 mm²) z gumy kodulacji, jeden z poziomym rozcięciem, a drugi z pionowym rozcięciem. Użyj taśmy, aby przymocować kwadraty koferdamu do stożkowej rurki.
   3. Umieść kawałek bibuły filtracyjnej o długości 4,25 cm na szalce Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm i zwilż bibułę filtracyjną 750 μl wody destylowanej.
   4. Odwróć stożkową rurkę na bibułę filtracyjną i przekręć kilka razy w przód iw tył, aby upewnić się, że jest bezpieczna.
2. Użyj aspiratora doustnego, aby ostrożnie usunąć ~10 samic Cx. pipiens z klatki i przenieść je do przygotowanej stożkowej probówki.
3. Umieść nieprzezroczysty cylinder na stożkowej rurce, aby zapewnić komarom, aby zaciemnić jaja, ponieważ stymuluje to składanie jaj, i odczekaj 20-25 minut.

5. Mikromanipulacja świeżo złożonymi jajami Culex

1. Przygotuj szkiełko do mocowania zarodków komarów do mikroiniekcji.
   1. Przymocuj kawałek taśmy dwustronnej do szerokości szkła nakrywkowego.
   2. Przymocuj cienki pasek przezroczystego opatrunku medycznego (np. Tegaderm o szerokości 2-3 mm) do taśmy dwustronnej tak, aby przebiegał równolegle do krótszego końca szkła nakrywkowego i znajdował się około 5 mm od końca szkła nakrywkowego.
   3. Usuń nadmiar taśmy dwustronnej za pomocą ostrej żyletki i usuń 2-3 mm opatrunku medycznego i taśmy dwustronnej z każdego końca szkła nakrywkowego. Dzięki temu po zamontowaniu jaj na szkle nakrywkowym pozostaje warstwa oleju.
   4. Za pomocą ołówka woskowego narysuj kształt litery "D" wokół taśmy dwustronnej i paska opatrunku medycznego. Będzie to działać jako bariera zatrzymująca wodę wokół jaj po wstrzyknięciu.
2. Po przygotowaniu szkiełka i upływie 20-25 minut wyjmij nieprzezroczystą rurkę i ustal, czy komary złożyły jaja.
   1. Jeśli nie, przykryj je na kolejne 5-10 minut.
   2. Jeśli komary złożyły jaja, ostrożnie, ale szybko podnieś stożkową rurkę i przykryj nakrętką. Umieść komary w osobnej klatce i zapisz czas zbierania jaj w arkuszu kalkulacyjnym. Następnie dodaj 50-100 μl wody DI do bibuły filtracyjnej zawierającej tratwy z jajami.
3. Pod mikroskopem preparacyjnym ułóż jaja w jednej linii.
   1. Umieść kawałek bibuły filtracyjnej (prostokąty o wymiarach 10 mm x 30 mm wycięte z grubej bibuły filtracyjnej o szybkim natężeniu przepływu) pod szkłem nakrywkowym o wymiarach 24 mm x 40 mm tak, aby szkło nakrywkowe zakrywało 50-60% lewej strony bibuły filtracyjnej.
   2. Zwilż bibułę filtracyjną 50 μl wody DI. Woda będzie powoli rozprzestrzeniać się pod szkłem nakrywkowym, tworząc zbiornik, który utrzyma bibułę filtracyjną i jaja mokre podczas mikromanipulacji. Między szkłem nakrywkowym a bibułą filtracyjną utworzy się menisk, gdy zostanie nałożona odpowiednia ilość wody.
   3. Oddziel jaja od ich tratwy jajowych za pomocą cienkiego pędzla i ustaw tak, aby wąski, tylny koniec zarodka dotykał szkła nakrywkowego (po lewej), a szerszy, przedni koniec był po prawej.
   4. Ułóż jajka przez 20 minut, uważnie obserwując zmianę ich koloru z mlecznobiałego na bardzo jasnoszary. Rutynowo sprawdzaj film wodny pod szkłem nakrywkowym, aby upewnić się, że jest odpowiednia ilość wody. Jeśli wydaje się, że jaja wysychają, dodaj niewielką ilość wody DI (20-30 μl) do bibuły filtracyjnej.
   5. Po 20 minutach wyrzuć wszystkie pozostałe jajka.
4. Przenieść jaja do szkiełka do mikroiniekcji.
   1. Użyj małego (10 mm x 30 mm) kawałka grubej bibuły filtracyjnej, aby odprowadzić wodę od strony nasyconej bibuły filtracyjnej i usuń odprowadzającą wilgoć bibułę filtracyjną za pomocą kleszczyków. Powtórz 2-3 razy, aby upewnić się, że bibuła filtracyjna z jajkami jest jak najbardziej sucha.
   2. Połóż świeży, suchy prostokąt bibuły filtracyjnej i przytrzymaj go na miejscu za pomocą kleszczy. Ostrożnie odciągnij szklankę nakrywkową w lewo, z dala od wyrównanych jaj.
   3. Wysusz nadmiar wody na scenie, nie naruszając małej bibuły filtracyjnej, która zawiera wyrównane jaja. Kontynuować suszenie mokrej bibuły filtracyjnej wraz z jajami jeszcze kilka razy, naciskając kciukami i/lub kleszczami na małe prostokąty bibuły filtracyjnej, aby upewnić się, że jaja są jak najbardziej suche przed przeniesieniem ich do szkiełka nastrzykowego.
   4. Za pomocą kleszczy usuń papierowy spód z paska opatrunku medycznego z szkiełka montażowego.
   5. Trzymaj szkiełko montażowe kciukiem i środkowym palcem, a odsłonięty opatrunek medyczny skierowany w dół i opuść pod kątem 45° na linię wyrównanych jaj. Ustawić szkiełko w taki sposób, aby szerszy, przedni koniec jaj (po lewej) zwisał nieco z końca opatrunku medycznego, ponieważ zwiększa to zdolność larw Culex do pomyślnego wyklucia się z zamontowanych jaj.
   6. Przyciśnij palec wskazujący do spodu szkła nakrywkowego, jednocześnie trzymając szkło nakrywkowe między kciukiem a palcem środkowym, aby upewnić się, że wszystkie wyrównane jaja są mocno przymocowane do opatrunku medycznego.
   7. Natychmiast odwróć szkło nakrywkowe tak, aby jajka były skierowane do góry, i nałóż cienką warstwę oleju Olej halowęglowy (2-3 krople; ~20 μL) na jajka. Zapobiega to wysuszaniu się jaj podczas mikroiniekcji. Usuń wszystkie jaja, które nie są przymocowane do opatrunku medycznego lub nie są pokryte olejem.
   8. Umieść szklaną pokrywę z zamontowanymi jajami skierowanymi do góry wewnątrz kwadratowej szalki Petriego z dużym kwadratem mokrej bibuły filtracyjnej do transportu do mikroiniekcji.

6. Wstrzykiwanie zarodków Culex

1. Wypełnianie igieł iniekcyjnych mieszanką do wstrzykiwań
   1. Wybierz igłę do wypełniania lub końcówkę do napełniania żelem, która z łatwością zmieści się w tylnej części wybranej igły iniekcyjnej i będzie miała trochę miejsca między końcem wypełniacza igłowego a igłą do wstrzykiwań.
   2. Ostrożnie umieścić pojedynczą i małą kroplę mieszanki iniekcyjnej (~0,5-1 μl) w igle do wstrzykiwań, używając wypełniacza igłowego do wypełnienia igły. Umieścić kroplę mieszanki do wstrzykiwań w pobliżu miejsca, w którym igła do wstrzykiwań zaczyna się zwężać.
2. Przymocować igłę do wstrzykiwania do mikrowstrzykiwacza.
3. Umieścić szkiełko zawierające zarodki na stoliku mikroskopu.
4. Otwieranie igły
   UWAGA: W przypadku używania igieł ze skosem nie jest to konieczne.
   1. Użyj początkowego ciśnienia wtrysku ~30 PSI i dostosuj w razie potrzeby, aby dostarczyć odpowiednią objętość mieszanki wtryskowej.
   2. Pod mikroskopem preparacyjnym umieść igłę nad zarodkiem i ostrożnie użyj mikromanipulatora, aby opuścić igłę na zarodek. Gdy igła ledwo dotyka zarodka, szybko przesuń zarodek prostopadle do długiej osi igły.
   3. Aby ustalić, czy igła została pomyślnie otwarta, należy nacisnąć spust wstrzykiwania i sprawdzić, czy z igły nie wydostają się pęcherzyki/mieszanka do wstrzykiwań. W przeciwnym razie należy powtórzyć przesuwanie zarodka względem igły, aż igła zostanie otwarta, a mieszanina do wstrzykiwań wydostanie się na zewnątrz po naciśnięciu spustu.
5. Wstrzykiwanie zarodków
   1. Umieść pierwszy zarodek w linii w środku view w mikroskopie i upewnij się, że jest ostry.
   2. Umieść igłę nad pierwszym jajkiem, również w środku pola widzenia w mikroskopie.
   3. Stopniowo zwiększaj powiększenie mikroskopu, ostrożnie obniżając igłę, aby utrzymać ją tuż nad pierwszym zarodkiem, wyśrodkowaną i ostrą. Kontynuuj, aż mikroskop osiągnie największe powiększenie i zarówno zarodek, jak i igła będą ostre.
   4. Ostrożnie przesuń zarodek na stoliku nieco w lewo i lekko opuść igłę, tak aby igła i zarodek znalazły się teraz w tej samej płaszczyźnie view.
   5. Używając stolika mikroskopowego do przesuwania zarodka, ostrożnie i delikatnie dotknij zarodka do końcówki igły. Wąski, tylny koniec zarodka powinien się lekko odchylić. Dostosuj wysokość igły, jeśli jest za wysoka lub za niska.
   6. Za pomocą stolika mikroskopowego przesuń tylny koniec zarodka na igłę i obserwuj, jak igła przenika przez kosmówkę jaja komara. Igła powinna po prostu przebić się przez błonę w przybliżonym położeniu komórek biegunowych w zarodkach Culex. Gdy to nastąpi, należy pociągnąć za spust iniekcji 1-3 razy, aby wstrzyknąć mieszankę do wstrzykiwań do zarodka. Dostarczyć niewielką ilość mieszanki do wstrzykiwań, tylko tyle, aby można było wykryć niewielkie prześwity w embrioplazmie.
   7. Za pomocą stolika przesuń zarodek w prawo, na zewnątrz i poza końcówkę igły. Jeśli wstrzyknięcie poszło dobrze, z zarodka powinno wyciekać niewiele płynu lub nie powinno go wcale wyciekać.
   8. Przesuń stolik w dół, tak aby następny zarodek w linii znalazł się przed igłą. Następnie ponownie przesunąć stolik w lewo, umieszczając zarodek na igle do wstrzykiwań i pociągnąć za spust wstrzyknięcia.
   9. Jeśli wydaje się, że mieszanka do wstrzykiwań nie wypływa i (lub) jeśli po wyjęciu igły z zarodka wydostaje się duża ilość płynu, należy wymienić igłę do wstrzykiwań i rozpocząć od nowa.
   10. Zniszcz wszystkie jaja, które nie zostały wstrzyknięte lub są uszkodzone.
6. Opieka nad zarodkami po wstrzyknięciu
   1. Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków na szkiełku zmyj olej halowęglowy, nakładając wodę z odwróconej osmozy za pomocą butelki ze spryskiwaczem, tak aby strumień wody został skierowany na wierzch szklanego szkiełka nakrywkowego nad wstrzykniętymi zarodkami i pozwolił wodzie spłynąć po szkiełku nakrywkowym i nad zarodkami w celu wypłukania oleju. Należy uważać, aby nie kierować strumienia wody bezpośrednio na zarodki, ponieważ może to spowodować ich uszkodzenie lub oderwanie od opatrunku medycznego. Proces ten usuwa większość, ale nie całość, oleju halowęglowego.
   2. Przykryj szkiełko 150 μl wody DI.
   3. Umieścić szkiełko z wstrzykniętymi zarodkami na mokrej bibule filtracyjnej wewnątrz kwadratowej szalki Petriego.
   4. Umieścić szalkę Petriego zawierającą wstrzyknięte zarodki w komorze środowiskowej ustawionej na 25-27 °C, 70-80% wilgotności względnej z długim fotoperiodem dnia (>13 h światła na dobę).

7. Hodowla wstrzykniętych zarodków (F₀) do dorosłości i zakładanie krzyżówek

1. Codziennie należy badać szkiełka zarodków, którym wstrzyknięto zarodki, spodziewając się, że 1 larwa w stadium rozwojowym powinna pojawić się 1,5 dnia po wstrzyknięciu.
2. Policz liczbę larw 1^st instar i umieść 100-200 larw w pojemniku Tupperware wielkości pudełka po butach z 450 ml wody DI i 50 mg mielonego pokarmu dla ryb. W tym czasie stwórz 1-5 razy więcej pojemników zawierających larwy typu dzikiego lub niewstrzyknięte, które zostaną użyte do krzyżowania się z wstrzykniętymi komarami.
3. Karm larwy codziennie, nieznacznie zwiększając ilość pokarmu, który otrzymują każdego dnia, aż osiągną 300-500 mg w 6 dniu życia larwalnego.
4. Gdy pojawią się poczwarki, użyj pipety transferowej, aby umieścić jedną poczwarkę w probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml wypełnionych w 50-75% wodą demineralizowaną. Powtórzyć tę czynność dla wszystkich poczwarek, zarówno poczwarek, które zostały wstrzyknięte jako zarodki, jak i poczwarek typu dzikiego bez wstrzyknięcia. Ostrożnie dociśnij pokrywki tak, aby były lekko uchylone, zapobiegając ucieczce komarów, ale nadal pozwalając na niewielką ilość wymiany gazowej.
5. Gdy dorosłe komary pojawią się w probówkach do mikrowirówek, należy wypuścić wstrzyknięte samice komarów do klatki zawierającej dziewicze samce komarów typu dzikiego, osiągając stosunek co najmniej 1 samca typu dzikiego na każdą wstrzykniętą samicę. Podobnie, wypuść wstrzyknięte samce komarów do klatki zawierającej dziewicze samice typu dzikiego, osiągając stosunek około 5-10 dziewiczych samic typu dzikiego na każdego wstrzykniętego samca. Zaleca się wyższy stosunek samic typu dzikiego do samców, którym wstrzyknięto implant, ponieważ każdy samiec komara może kojarzyć się wiele razy. W związku z tym posiadanie większej liczby samic typu dzikiego, które kojarzą się z wstrzykniętymi samcami, zwiększa liczbę potomstwa F1, które można wyprodukować.

8. Pozyskiwanie i hodowla komarów F₁ oraz badanie ich pod kątem mutacji

1. Siedem do dziesięciu dni po pojawieniu się dorosłego osobnika podaj posiłek z krwi samicom w każdej klatce, jak opisano powyżej (krok 3).
2. Cztery dni po karmieniu krwią umieść wodę do składania jaj w każdej klatce. Każda tratwa z jajami reprezentuje potomstwo pojedynczej samicy komara i dlatego powinna zostać umieszczona we własnym plastikowym pojemniku hodowlanym wielkości pudełka po butach wkrótce po złożeniu jaj. Oznacz każdy pojemnik niepowtarzalnym identyfikatorem, a także wskaż, że larwy należą do pokolenia F₁ dla genu będącego przedmiotem zainteresowania, niezależnie od tego, czy wstrzyknięto mu samca, czy samicy, daty założenia szalka, warunków chowu oraz inicjałów eksperymentatora.
3. Codziennie monitoruj garnki z larwami. Gdy tylko larwy wyklują się na patelniach, podaj 50 mg mielonego pokarmu dla ryb. Zwiększaj ilość pokarmu dziennie przez 6 dni, jak opisano powyżej (krok 7.3).
4. Przenieś pojedyncze poczwarki do probówek mikrowirówek o pojemności 2 ml zawierających od 1 do 1,5 ml wody demineralizowanej, oznacz każdą probówkę i rozbij pokrywki.
5. Gdy pojawią się dorosłe komary, ostrożnie otwórz probówkę do mikrowirówki o pojemności 2 ml, zakrywając ją palcem wskazującym, a drugą ręką umieść szklaną fiolkę o pojemności 3 ml na górze probówki do mikrowirówki. Naturalnym odruchem komara powinno być wlatanie w górę i do szklanej fiolki. Gdy to nastąpi, przesuń palcem po otworze szklanej fiolki i szybko ją odwróć, umieszczając małą kulkę bawełny, która została lekko zwilżona 10% roztworem sacharozy, w górnej części fiolki. Zapobiega to ucieczce komara i zapewnia niezbędne źródło pożywienia i wody.
6. Oznaczyć zarówno probówkę zawierającą wysięk poczwarki, jak i szklaną fiolkę zawierającą dorosłego komara, aby wskazać larwy, z której pochodzi, płeć komara oraz niepowtarzalny identyfikator tego osobnika. Np.: II.C.M32, gdzie "II" oznacza, że rodzic płci męskiej został wstrzyknięty, "C" oznacza tratwę z jajami, z której pochodzi osobnik, a "M32" oznacza, że był to 32. samiec, który wyłonił się z tego pojemnika do hodowli larw.
7. Umieść dorosłe komary w ich indywidualnych szklanych fiolkach z powrotem w komorze środowiskowej i codziennie dodawaj niewielką ilość (~20 μl) 10% roztworu sacharozy do ich bawełny. Pamiętaj, aby nie przekarmiać ani nie nasycać bawełny, ponieważ komary utkną w roztworze sacharozy i umrą.
8. Badania przesiewowe komarów pod kątem pożądanej mutacji
   1. Wyodrębnij genomowe DNA z 5-10 wydzieliny poczwarek z każdej tratwy jajowej/patelni larw za pomocą zestawu Phire Direct PCR Kit zgodnie z instrukcjami producenta, a także 1-2 osobników typu dzikiego, które będą służyć jako kontrola.
      UWAGA: Ponieważ potomstwo z każdej tratwy jest prawdopodobnie pełnym rodzeństwem, badanie przesiewowe 5-10 larw z każdej patelni określi, czy mutacja została przekazana potomstwu. Jeśli żadna z przesianych larw z jednej patelni nie ma pożądanej mutacji, nie należy przeprowadzać badań przesiewowych dodatkowych osobników dorosłych. Jeśli niektóre larwy mają mutację, każdy osobnik z tej patelni powinien zostać przebadany.
   2. Korzystając z wcześniej zaprojektowanych starterów PCR (krok 1.2), amplifikuj fragment wokół przewidywanej lokalizacji mutacji za pomocą zestawu Phire PCR zarówno w potomstwie typu dzikiego, jak i F1, a następnie uruchom fragmenty PCR na 3-4% żelu agarozowym, aby określić, czy są widoczne insercje lub delecje (indele).
      UWAGA: Wszystkie osobniki, które mają pożądaną mutację, będą heterozygotyczne i powinny mieć 2 prążki, jeden dziki i jeden nieco krótszy lub dłuższy w pożądanej pozycji. Aby je rozróżnić, porównaj położenie i grubość prążków osobników typu dzikiego z tymi w prążkach u potomstwa F1. Idealnie byłoby widoczne 2 dyskretne pasma, ale jeśli indel jest bardzo mały, pasmo może wydawać się szersze i/lub bardziej rozmyte.
   3. Produkt PCR należy oczyścić albo przez wycięcie pasma zawierającego podejrzane indele (zalecane), albo przez oczyszczenie pozostałego produktu PCR, który nie został załadowany do żelu. Prześlij oczyszczony PCR do sekwencjonowania w celu ustalenia, czy występuje pożądana mutacja.

9. Pozyskiwanie i hodowla komarów F₂ i F₃ oraz badanie ich pod kątem mutacji

1. Uwolnić wszystkie dorosłe komary F₁, u których stwierdzono pożądaną mutację, poprzez przesiewanie wydzieliny poczwarki z ich indywidualnych szklanych fiolek i do klatki zawierającej komary płci przeciwnej typu dzikiego, którym nie wstrzyknięto. Krzyżowanie wsteczne dla tego drugiego pokolenia powinno usunąć wszystkie szkodliwe skutki iniekcji i chowu wsobnego.
2. Krew zasila klatki zmutowanych komarów F₁ i ich dzikich odpowiedników, jak opisano wcześniej. Cztery do pięciu dni później zbierz powstałe tratwy z jajami F₂.
3. Oznaczyć i wyhodować larwy F₂ zgodnie z powyższym opisem, umieszczając każdą tratwę z jajami w oddzielnym, oznakowanym pojemniku. Po przepoczwarzeniu ponownie oddziel poszczególne poczwarki do pojedynczych probówek mikrowirówek o pojemności 2 ml i przenieś każdą osobę dorosłą do oddzielnych szklanych fiolek wypełnionych bawełną nasączoną sacharozą po pojawieniu się. Następnie przebadaj wysięk poczwarki każdego osobnika F₂ pod kątem pożądanej mutacji, jak opisano wcześniej (kroki 8.5-8.8).
   UWAGA: Tutaj wszystkie osoby, które mają pożądaną mutację, będą heterozygotyczne, dlatego produkt PCR powinien idealnie wytwarzać 2 odrębne prążki, gdy jest uruchamiany na 3-4% żelu agarozowym.
4. Po zidentyfikowaniu zmutowanych larw F₂ umieść wszystkie samce i samice, które mają mutację, w tej samej klatce, aby się kojarzyć. Krew należy karmić 7-10 dni po pojawieniu się osobników dorosłych, a 4-5 dni później zebrać tratwy z jajami F₃.
5. Umieścić każdą tratwę z jajami F₃ w oddzielnym pojemniku do hodowli larw, a następnie oznaczyć i podawać w sposób opisany powyżej.
6. Rozdzielić poczwarki F₃ do pojedynczych probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml. Gdy pojawią się dorosłe osobniki, przenieś je do pojedynczych szklanych fiolek pokrytych 10% bawełną nasączoną sacharozą. Przebadaj wysięk poczwarki, jak opisano wcześniej. Tym razem około 25% potomstwa na każdej patelni powinno być homozygotyczne pod względem mutacji zerowej. Umieść te osobniki w jednej klatce i użyj ich do stworzenia i utrzymania nowo wygenerowanej zmutowanej linii komarów.
   UWAGA: Jeśli obecna jest niewielka liczba homozygotycznych komarów, heterozygotyczne samce i samice F₃ mogą być krzyżowane ze sobą, aby wytworzyć dodatkowe homozygotyczne komary zerowe w pokoleniu F₄.

Wyniki

Korzystając z opisanego protokołu, udało nam się z powodzeniem wstrzyknąć zarodki Cx. pipiens i zaobserwowaliśmy wysoki wskaźnik przeżywalności wśród wstrzykniętych zarodków (~55%, Rysunek 1). Wcześniejsze badania wykazały niższy odsetek przeżycia, prawdopodobnie dlatego, że przednia część pęcherzyka jajowego była przymocowana do paska opatrunku medycznego, co zapobiegało ucieczce larw komarów z kosmówki i skutecznemu pływaniu do wody. Zapewnienie, że przedni koniec wystaje poza pasek opatrun...

Dyskusja

Protokół ten przedstawia metody wprowadzania określonych mutacji do genomu komarów Culex i może być również stosowany do edycji genomu innych komarów. Protokół jest istotny, ponieważ zawiera szczegółowe informacje nie tylko na temat przygotowania materiałów do wstrzykiwań, ale także szczegółowy przegląd wideo na temat tego, jak nakłonić komary do złożenia jaj, a także jak przygotować i wstrzyknąć te jaja. Podsumowujemy również, jak wykorzystać biologię samic Cx. pipiens do składania jaj w pojedynczych t...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Podajnik sztucznej membrany	Hemotek	SP5W1-3	Lokalizacja firmy: Blackburn, Wielka Brytania
ATP	Invitrogen	18330019	Lokalizacja firmy: Carlsbad, CA, USA
Rurki mirocapillaralne ze szkła borokrzemianowego, średnica zewnętrzna 1 mm	World Precision Instruments	1B100-6	Lokalizacja firmy: Sarasota, FL, USA
BV10 Igła do ukosowania	Sutter Instruments	BV-10-B	Lokalizacja firmy: Nobato, CA, USA
Whatman Okrągła bibuła filtracyjna (12,5 cm)	Sigma Aldrich	WHA1001125	Lokalizacja firmy: St. Louis, MO, USA
Rurka stożkowa (50 ml)	Thermo Fisher Scientific	339652	Lokalizacja firmy: Waltham, MA, USA
Bibuła filtracyjna Fisherbrand o szybkim natężeniu przepływu	Thermo Fisher Scientific	09-800	Lokalizacja firmy: Waltham, MA, USA
Szkło nakrywkowe (24 x 40 mm)	Thermo Fisher Scientific	50-311-20	Lokalizacja firmy: Waltham, MA, USA
Dam dentystyczna	Henry Schein Inc	1010171	Lokalizacja firmy: Melville, NY USA
Taśma dwustronna szkocka	Thermo Fisher Scientific	NC0879005	Lokalizacja firmy: Waltham, MA, USA
Mikrowtryskiwacz FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000021	Lokalizacja firmy: Hamburg, Niemcy
Szklana fiolka (2 dram)	Thermo Fisher Scientific	033401C	Lokalizacja firmy: Waltham, MA, USA
Olej halowęglowy	Sigma Aldrich	H8898-50ML	Lokalizacja firmy: St. Louis, MO, USA
P-2000 Laserowy ściągacz igieł	Sutter Instruments	P-2000/G	Lokalizacja firmy: Nobato, CA, USA
Parafilm	Thermo Fisher Scientific	50-998-944	Lokalizacja firmy: Waltham, MA, USA
PC-100 Ściągacz igieł z obciążeniem	Narishige	PC-100	Jest to zgodne z wcześniejszym modelem PC-10, który został wycofany z produkcji. Lokalizacja firmy: Amityville, NY, USA
Zestaw do bezpośredniego PCR Phire	Thermo Fisher Scientific	F140WH	Lokalizacja firmy: Waltham, MA, USA
Kodak Photo-Flo (1%)	Thermo Fisher Scientific	50-268-05	Lokalizacja firmy: Waltham, MA, USA
Rurki mirokapilarne ze szkła kwarcowego, średnica zewnętrzna 1 mm	Rurka kapilarna Supplies Limited	QGCT 1.0	Lokalizacja firmy: Kornwalia, Wielka Brytania
Przewodnik i handel; Zestaw do badań przesiewowych sgRNA Takara	, Bio USA	632639	Ten zestaw pozwala określić, czy gRNA przecinają sekwencje DNA in vitro. Lokalizacja firmy: Mountain View, CA, USA
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Lokalizacja firmy: St. Louis, MO, USA
Małe szalki Petriego (35X10 mm)	Thermo Fisher Scientific	50-190-0273	Lokalizacja firmy: Waltham, MA, USA
Cytrynian sodu krew	kurczaka Lampire biologiczne	7201406	Lokalizacja firmy: Everett, PA, USA
Fisherbrand Kwadratowa szalka Petriego (10 cm x 10 cm)	Thermo Fisher Scientific	FB0875711A	Company Lokalizacja: Waltham, MA, USA
Tegaderm	Henry Schein Inc.	7771180	Lokalizacja firmy: Melville, NY USA
Pokarm dla ryb tropikalnych	Tetramin	N/A
Bibuła filtracyjna Whatman	Thermo Fisher Scientific	09-927-826	Lokalizacja firmy: Waltham, MA, USA
Bibuła filtracyjna Whatman, 4,25 cm	Sigma Aldrich	1001-042	Lokalizacja firmy: St. Louis, MO, USA