Artykuł metodologiczny

Krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61660

⸱

11 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Université Grenoble Alpes, CEA, CNRS, IBS, 2CNRS, Solvay LOF, UMR 5258, Université Bordeaux, 3ELVESYS SAS

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół wytwarzania mikroprzepływowych chipów opracowanych do krystalizacji białek na chipie metodą dializy i eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Proces mikroprodukcji umożliwia zintegrowanie półprzepuszczalnej membrany do dializy z regenerowanej celulozy z dowolnym odcięciem masy cząsteczkowej między dwiema warstwami chipa.

Streszczenie

Ten protokół opisuje produkcję powtarzalnych i niedrogich urządzeń mikroprzepływowych, obejmujących cały rurociąg do krystalizacji białek na chipie metodą dializy i umożliwiających eksperymenty in situ z monokryształami lub krystalografią seryjną w temperaturze pokojowej. Protokół szczegółowo opisuje proces wytwarzania mikrochipów, manipulowanie eksperymentami krystalizacji na chipie oraz obróbkę zebranych in situ danych dyfrakcji rentgenowskiej w celu wyjaśnienia strukturalnego próbki białka. Główna cecha tej procedury mikroprodukcji polega na zintegrowaniu dostępnej na rynku, półprzepuszczalnej membrany do dializy z regenerowanej celulozy pomiędzy dwiema warstwami chipa. Odcięcie masy cząsteczkowej osadzonej membrany różni się w zależności od masy cząsteczkowej makrocząsteczki i środków strącających. Urządzenie wykorzystuje zalety technologii mikroprzepływowej, takie jak wykorzystanie niewielkich objętości próbek (<1 μl) i precyzyjne dostrajanie zjawisk transportowych. Chip połączył je z metodą dializy, zapewniając precyzyjną i odwracalną kontrolę nad procesem krystalizacji i może być używany do badania diagramów fazowych białek w skali mikrolitrów. Urządzenie jest wzorowane przy użyciu fotoutwardzalnej żywicy na bazie tiolenu z miękką litografią odciskową na optycznie przezroczystym podłożu polimerowym. Co więcej, oceniono rozproszenie tła materiałów składających się na mikroczipy i generujące szum tła, dzięki czemu chip jest kompatybilny z eksperymentami dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Gdy kryształy białka zostaną wyhodowane na chipie do odpowiedniej wielkości i jednorodności populacji, mikroczipy można zamontować bezpośrednio przed wiązką promieniowania rentgenowskiego za pomocą uchwytu wydrukowanego w 3D. Podejście to pozwala w łatwy i niedrogi sposób sprostać wyzwaniom wynikającym ze stosowania krioprotektantów i ręcznego zbierania w konwencjonalnych eksperymentach krystalografii białek. Kompletne zestawy danych dyfrakcji rentgenowskiej z wielu izomorficznych kryształów lizozymu wyhodowanych na chipie zebrano w temperaturze pokojowej w celu określenia struktury.

Wprowadzenie

Wyjaśnienie trójwymiarowej (3D) struktury makrocząsteczek biologicznych jest nieustannym dążeniem w biologii strukturalnej, gdzie krystalografia rentgenowska pozostaje główną techniką badawczą. Stosowana do odkrywania szczegółów strukturalnych złożonych makrocząsteczek, takich jak białka, ma na celu ułatwienie zrozumienia ich mechanizmów działania i udziału w różnych funkcjach biologicznych. Potężne źródła promieniowania rentgenowskiego w synchrotronach i rentgenowskie lasery na swobodnych elektronach (XFEL) dostarczają wszystkich narzędzi niezbędnych do głębszego wglądu w strukturę białek w rozdzielczości bliskiej atomowej. Pomimo zalet związanych z zastosowaniem promieni rentgenowskich do badań strukturalnych, istnieją nieodłączne ograniczenia dotyczące promieniowania rentgenowskiego i samego procesu krystalizacji. Uszkodzenia spowodowane promieniowaniem wywołanym przez wysoki strumień promieniowania rentgenowskiego i długie czasy ekspozycji kryształu białka przed wiązką promieniowania rentgenowskiego są restrykcyjnymi parametrami, które krystalografowie muszą przekroczyć za pomocą chłodzenia kriogenicznego1. Jednak znalezienie optymalnych warunków kriochłodzenia może być pracochłonne, ponieważ zmiany konformacyjne wynikające z natywnej struktury białka lub artefaktów mogą być ukryte2,3. Co więcej, ostatnie badania wskazują, że przeprowadzanie eksperymentów dyfrakcyjnych w temperaturze pokojowej prowadzi do niższych uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem właściwym4. Kolejnym wąskim gardłem w biologii strukturalnej jest pozyskiwanie dobrze dyfrakcyjnych kryształów o wystarczającej wielkości5. Małe kryształy są łatwiejsze do wyprodukowania, szczególnie w przypadku białek błonowych, ale są bardziej podatne na uszkodzenia spowodowane promieniowaniem nawet w warunkach kriochłodzenia, ponieważ wysoka dawka promieniowania musi być skierowana na mniejszą objętość w porównaniu z przypadku większych kryształów białkowych6. Nowatorskie podejście krystalografii szeregowej7,8 w synchrotronach i XFEL może obejść ograniczenia uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem i jednocześnie wykorzystać mniejsze kryształy (od 200 nm do 2 μm)7 poprzez łączenie zestawów danych z wielu, izomorficznych i losowo zorientowanych kryształów białkowych oraz czerpanie korzyści z powiązanych osiągnięć technologicznych, takich jak impulsy femtosekundowe, krótsze czasy naświetlania i mikroogniskowane wiązki promieniowania rentgenowskiego5,7,9,10.

Technologia mikroprzepływowa jest cenna dla krystalografii rentgenowskiej, wykazując wielorakie zalety krystalizacji makrocząsteczek biologicznych i ich badań strukturalnych. Przeprowadzanie eksperymentów krystalizacji w urządzeniach mikroprzepływowych wymaga małych objętości próbek białek, co ogranicza koszty produkcji tych wysoko cenionych biomakrocząsteczek i ułatwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe i optymalizację wielu warunków krystalizacji. Co więcej, nieodłączny stosunek dużej powierzchni do objętości w skali mikroprzepływowej i zjawiska transportu ograniczone dyfuzją umożliwiają precyzyjną kontrolę nad przepływami i gradientami temperatury lub stężenia11,12,13,14, co sprawia, że urządzenia mikroprzepływowe są odpowiednie do hodowli kryształów o jednolitych rozmiarach i eksploracji diagramów fazowych15,16,17,18,19. Co więcej, narzędzia mikroprzepływowe wykazują szczególny potencjał w zakresie rozwiązania kolejnej przeszkody w krystalografii białek, jaką jest dostarczanie próbek oraz konieczność obróbki i zbierania kryształów białkowych przed ich użyciem do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej. Metoda krystalografii rentgenowskiej na chipie i in situ eliminuje manipulację kryształami i potencjalne pogorszenie jakości kryształów przed zebraniem danych. Szeroka gama chipów mikroprzepływowych kompatybilnych z krystalografią białek rentgenowskich in situ została zaprojektowana, opracowana i przetestowana przez wiele grup badawczych, które konfrontują się z powiązanymi ograniczeniami wynikającymi z charakteru materiałów mikroprodukcyjnych i ich interakcji z promieniowaniem rentgenowskim14,19,20,21,22,23. Materiały produkcyjne muszą być optycznie przezroczyste, biologicznie obojętne i wykazywać wysoką przezroczystość dla promieniowania rentgenowskiego oraz optymalny stosunek sygnału do szumu podczas zbierania danych.

Większość metod krystalizacji stosowanych w konwencjonalnej krystalografii białek24,25 zostały również zaimplementowane w skali mikroprzepływowej11,14 do krystalizacji na chipie i analizy dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Proste, hybrydowe lub wielowarstwowe aparaty mikroprzepływowe zawierające dyfuzję pary26, evaporation27, free interface diffusion (FID)28, microbatch26, a nawet seeding29 były używane do krystalizacji białek rozpuszczalnych i błonowych. Można osiągnąć wysoką przepustowość badań przesiewowych i optymalizację warunków krystalizacji30,31 w dobrze opartych 32, droplet-based33, lub uruchamiane zaworem34. In situ Eksperymenty dyfrakcji rentgenowskiej trudnych celów białkowych w temperaturze pokojowej przeprowadzono w mikroczipach wykonanych z różnych materiałów, takich jak PDMS (polidimetylosiloksan), COC (cykliczny kopolimer olefiny), PMMA (poli(metakrylan metylu)))21,22,26,28,29, graphene films23, Kapton35, epoxy glue6, lub NOA (Norland Optical Adhesive)19 oraz oceniono przezroczystość materiałów na promieniowanie rentgenowskie i ich wpływ na szum tła. Co więcej, mikroczipy zostały zaprojektowane tak, aby łączyć strategie zbierania danych in situ i szeregowego w jednym narzędziu do eksperymentów krystalografii białek rentgenowskich w źródłach synchrotronowych23,35,36 i XFELs7.

Zbieranie danych in situ o temperaturze pokojowej zostało również zaimplementowane w różnych metodach dostarczania i urządzeniach. Na przykład Nogly et al.54 użyli iniektora lipidowej fazy sześciennej (LCP) w celu zbadania struktury sterowanej światłem pompy fotonowej bakteriorodopsyny (bR) za pomocą seryjnej krystalografii femtosekundowej (SFX) przy użyciu źródła XFEL. Struktura krystaliczna bR została rozwiązana z rozdzielczością 2,3 A, wykazując kompatybilność wtryskiwacza LCP z czasowo-rozdzielczą szeregową krystalografią femtosekundową (TR-SFX). Baxter i in.55 zaprojektowali wielokrystaliczną siatkę o dużej gęstości, wykonaną z poliwęglanowego tworzywa sztucznego o grubości 100 lub 200 μm z laserowo wycinanymi otworami o różnych rozmiarach. Dodatkowa folia poliwęglanowa o grubości 5 μm może być przymocowana po jednej stronie siatki podczas korzystania z urządzenia do eksperymentów krystalizacji w pozycji siedzącej lub wiszącej. Ta siatka o dużej gęstości może być używana na wiele sposobów, ponieważ kryształy mogą być ładowane bezpośrednio do portów urządzenia lub kryształy mogą być hodowane na urządzeniu przez dyfuzję pary lub metodę LCP. Co więcej, siatkę można ustawić w standardowej podstawie magnetycznej i wykorzystać do zbierania danych rentgenowskich in situ w warunkach kriogenicznych lub w temperaturze pokojowej. Niedawno Feiler et al.56 opracowali uchwyt na próbkę do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej in situ w temperaturze kriogenicznej i temperaturze otoczenia przy minimalnym udziale szumów tła. W szczególności uchwyt składa się z plastikowego wspornika, przezroczystej folii COC i mikroporowatej strukturalnej folii poliimidowej. Został zaprojektowany, aby zastąpić powszechnie używane szkiełka pokrywowe do ustawiania kropli krystalizacji, umożliwiając jednocześnie manipulację na miejscu, taką jak moczenie ligandów, tworzenie kompleksów i ochrona kriogeniczna bez otwierania kropli krystalizacji lub ręcznego obchodzenia się z kryształami. Co więcej, uchwyt próbki można wyjąć z płytki krystalizacyjnej i umieścić na podstawie magnetycznej w celu zbierania danych in situ na standardowych liniach badawczych opartych na goniometrze. W celu zebrania danych o temperaturze otoczenia folia COC jest usuwana przed eksperymentem i tylko folia poliimidowa o grubości 21 μm przyczynia się do rozpraszania tła, które w tym przypadku jest minimalne. Przykłady te stanowią tylko niewielki ułamek trwających badań i mnogość wszechstronnych mikroczipów opracowanych do krystalografii białek rentgenowskich.

Jednakże, metoda krystalizacji białek dializacyjnych nie została powszechnie włączona do mikrofluidyki. Dializa jest metodą opartą na dyfuzji, mającą na celu zrównoważenie stężenia strącania przez półprzepuszczalną membranę w celu zbliżenia się do nominalnego stężenia krystalizacji białka i umożliwia precyzyjną i odwracalną kontrolę warunków krystalizacji24. Odcięcie masy cząsteczkowej (MWCO) półprzepuszczalnej membrany dializacyjnej można wybrać w zależności od masy cząsteczkowej makrocząsteczki i środków strącających, aby umożliwić dyfuzję małych cząsteczek strącających przy jednoczesnym zachowaniu makrocząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania. Ze względu na odwracalność procesu dializy, może być on stosowany w połączeniu z kontrolą temperatury w celu niezależnego oddzielania i optymalizacji zarodkowania i wzrostu kryształów37 do badania diagramów fazowych poprzez zmianę stężenia strącania przy użyciu tej samej próbki białka. Integracja membran w mikrofluidyce została oceniona przez de Jong et al.38, a studia przypadków w biologii wszczepiającej dializę do mikroczipów można głównie wymienić w zastosowaniach związanych z przygotowaniem, zatężaniem lub filtracją próbek39,40,41,42 lub badania związane z komórkami43,44. Perwaporacja przez PDMS została wykorzystana przez Shim et al.37 do badania zarodkowania i wzrostu ksylanazy w różnych warunkach. Woda przenikała przez membranę PDMS o grubości 15 μm do zbiornika białkowego urządzenia mikroprzepływowego, zmieniając następnie stężenie białka i strącacza.

Przedstawiono protokół opracowany przez Junius et al.19,45 do produkcji mikroprzepływowego chipa kompatybilnego zarówno z krystalizacją białek na chipie za pomocą mikrodializy, jak i eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ w temperaturze pokojowej. Protokół produkcji urządzenia jest bezpośrednio inspirowany pionierską pracą wykonaną przez Studera i współpracowników12,46 dla mikrowzorzystych naklejek z fotoutwardzalnej żywicy na bazie tiolenu NOA 81 osadzającej dostępne na rynku membrany, przy użyciu miękkiej litografii. Innowacyjna modyfikacja metody zaowocowała opracowaniem mikroczipów umożliwiających wykorzystanie mikrodializy do dokładnego monitorowania i kontrolowania parametrów eksperymentalnych wzrostu kryształów białek w układzie scalonym przy jednoczesnym wykorzystaniu zalet mikrofluidyki, takich jak zmniejszone zużycie próbek białek na eksperyment (<1 μl). W poprzedniej pracy zademonstrowano zasady dializy stosowane w systemie makroskalowym (typowa objętość >20 μl) do badania przesiewowego i optymalizacji warunków krystalizacji poprzez mapowanie wykresów fazowych stężenia temperatury i strącania47. W niniejszej pracy opisano protokół produkcji mikroczipów do dializy zawierających membrany dializacyjne z regenerowanej celulozy (RC) różnych MWCO w celu przeprowadzenia testów krystalizacji na chipie i zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Materiały, z których wykonane są mikroczipy, zostały ocenione pod kątem ich przezroczystości na promieniowanie rentgenowskie19, a urządzenia można ustawić bezpośrednio przed wiązką promieniowania rentgenowskiego w celu przeprowadzenia eksperymentów dyfrakcyjnych in situ w temperaturze pokojowej, z wyłączeniem ręcznej obsługi i zminimalizowania degradacji delikatnych kryształów białkowych. W jednym ze studiów przypadków kryształy lizozymu z białka jaja kurzego wyhodowano na chipie za pomocą mikrodializy, generując populację o jednolitej wielkości. Mikrochip został następnie zamontowany przed wiązką promieniowania rentgenowskiego za pomocą wydrukowanego w 3D supportu19 i kompletne zestawy danych dyfrakcyjnych in situ zebrano w temperaturze pokojowej z wielu izomorficznych kryształów, wykazując wysoki potencjał i znaczenie chipów dla badań krystalografii szeregowej synchrotronu trudnych celów makromolekularnych.

Protokół

1. Projekt maski i wykonanie mistrzowskie

  1. Narysuj żądaną geometrię urządzenia mikroprzepływowego za pomocą dowolnego oprogramowania do rysowania wektorowego. Dla każdej warstwy fotorezystu, która zostanie wykorzystana do kolejnego etapu fotolitografii, przygotuj indywidualną maskę: jedną maskę obrysowaną kanałami i filarami oraz jedną maskę zawierającą tylko filary.
  2. Przetłumacz pliki CIF wygenerowane przez oprogramowanie do rysowania na fotomaski filmowe. Można to zrobić za pośrednictwem usług komercyjnych. Wymagaj odpowiedniej fotomaski w zależności od wyboru fotorezystu używanego podczas fotolitografii.
    UWAGA: Do fotorezystu SU-8 zamów maski z czarnymi elementami na przezroczystym tle. SU-8 to fotorezystor ujemny na bazie żywicy epoksydowej, co oznacza, że podczas ekspozycji na światło UV (365 nm) części wystawione na działanie promieniowania UV są sieciowane, podczas gdy reszta pozostaje rozpuszczalna. W związku z tym wszystkie czarne wzory na masce nie będą sieciowane światłem UV podczas fotolitografii. Kanały i filary zostaną wygrawerowane na mistrzach.
  3. Przygotuj dwa wzorce na płytkach krzemowych dla projektu każdego układu za pomocą fotolitografii przy użyciu SU-8 negative photoresist.
    UWAGA: Kroki 1.3.1-1.3.7 są wykonywane w czystym pomieszczeniu. Kroki opisane poniżej są tradycyjnymi etapami fotolitografii, po których następuje miękka litografia PDMS, które są opisane w wielu podręcznikach. Wszystkie wartości parametrów eksperymentalnych (fotorezyst, czas trwania, temperatura itp.) zależą od wielu subtelnych parametrów i muszą być optymalizowane w zależności od zastosowanej aparatury.
    1. Użyj 3-calowej płytki krzemowej i traktuj powierzchnię plazmą przez 90 s, aby ułatwić osadzenie i zamocowanie fotorezystu SU-8.
    2. Wlej około 3 ml rezystancji SU-8 na środek wafla i obróć SU-8 do żądanej grubości (Rysunek 1A). Dla grubości nominalnej 50 μm należy użyć SU-8 3050 i wirować przez 10 s przy 500 obr./min i kolejno przez 30 s przy 3500 obr./min. Miękkie pieczenie fotorezystu na gorącej płycie przez 15 minut w temperaturze 368 K w celu częściowego zestalenia się poprzez odparowanie rozpuszczalnika zawartego w żywicy i zapobieżenie jego przyklejaniu się do fotomaski. Następnie pozostaw wafel w temperaturze pokojowej na 2 minuty.
    3. Wystaw fotorezystor na działanie światła UV (Rysunek 1B). Użyj nakładki do maski o mocy 35 mW cm-2 i czasie naświetlania 8 s.
    4. Kontynuuj pieczenie poekspozycyjne. Umieść wafel na gorącej płycie na 5 minut w temperaturze 368 K, aby zakończyć fotoreakcję wywołaną przez ekspozycję na promieniowanie UV.
    5. Usuń cały opór SU-8, który nie był usieciowany, umieszczając wafel w kąpieli zawierającej octan eteru metylowego glikolu propylenowego (PGMEA) i mieszaj przez 15 minut. Przepłucz wafel izopropanolem, aż nie będzie można zaobserwować rozmytego wytrącania się. Osusz wafel azotem i przechowuj go na szalce Petriego (standardowy rozmiar 100 mm x 15 mm).
    6. Potraktuj powierzchnię płytki silanem, aby ułatwić oderwanie polidimetylosiloksanu (PDMS), który zostanie użyty do wytworzenia 2 znaczków. Umieść wafel na naruszonej płycie grzejnej w temperaturze 368 K na 10 minut w atmosferze pary heksametylodylazanu (HMDS).
      UWAGA: Jeśli odklejanie PDMS od wafla staje się trudne po kilku użyciach, powierzchnię płytki należy ponownie pokryć parą HMDS.
    7. Pierwszy mistrz zawierający kanały i filary jest gotowy. Powtórz te kroki i przygotuj drugi wzór wzorcowy, używając tylko filarów.
      UWAGA: Podczas fotolitografii celem jest uzyskanie geometrii urządzenia na wzorcach SU-8 o wysokości 50 μm. Jednak po wyprodukowaniu dwóch wzorców SU-8 zmierz wysokość geometrii wygrawerowanych na wzorcach za pomocą profilometru, aby uzyskać wartość eksperymentalną. Zmierzona wartość dla obu masterów SU-8 wyprodukowanych dla tego protokołu wynosi około 45 μm.

2. Produkcja form PDMS

UWAGA: Następujące kroki protokołu mogą być wykonane w dowolnym laboratorium, o ile używany jest okap z przepływem laminarnym, żółte światło w pomieszczeniu jest używane podczas pracy z żywicą NOA 81 (kroki 3.6-3.11) i dostępne jest źródło światła UV do polimeryzacji żywicy NOA 81 (kroki 3.7 i 3.11).

  1. Przygotuj 50 g bazy silikonowej PDMS i jej utwardzacza w proporcji 10:1.
  2. Wymieszaj oba składniki w zlewce za pomocą szpatułki i umieść mieszaninę w komorze próżniowej, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.
  3. Wlać 25 g wstępnie zmieszanego PDMS do wzorca SU-8 (przechowywanego na szalce Petriego), modelując kanały i filary do wysokości około 5 mm. Wlej pozostałe 25 g PDMS do drugiego wzorca SU-8, wzorując tylko filary do wysokości około 5 mm (Rysunek 1C).
  4. Umieścić obie szalki Petriego w piekarniku i utwardzić warstwy PDMS w temperaturze 338 K przez 1 godzinę.
  5. Przeciąć utwardzoną warstwę PDMS wokół wzorów mistrzów SU-8 za pomocą skalpela i delikatnie oderwać formy PDMS od wzorców (Rysunek 1D).
    UWAGA: Opisana powyżej procedura, zwana formowaniem replik, jest często stosowana do przygotowania form PDMS, które zostaną przymocowane do powierzchni szklanych i będą częścią urządzenia mikroprzepływowego53. W tym protokole formy PDMS nie są częścią chipa, ale są używane jako półprodukty do produkcji chipów. Dla każdego projektu przygotowywane są 2 formy PDMS z odpowiednich wzorców SU-8 (Rysunki 1D i 1E) i zostaną odpowiednio użyte (jak opisano poniżej) do produkcji mikroprocesora.

3. Produkcja chipów do dializy

  1. Umieść formę PDMS z wzorem zarówno kanałów, jak i filarów na szkiełku mikroskopowym (3 x 1 cal standardowy rozmiar) z wzorami skierowanymi do góry (Rysunek 1F). Środkowy filar odpowiadający zbiornikowi białka wykracza w pionie o 45 μm od poziomej powierzchni formy PDMS.
  2. Wytnij i oddziel suchy kawałek membrany dializacyjnej z regenerowanej celulozy (RC) i umieść go na centralnym filarze formy PDMS, który jest wsparty na szklanym szkiełku (Rysunek 1F).
    UWAGA: Membrana do dializy RC jest dostępna na rynku, a granica masy cząsteczkowej (MWCO) jest dobierana odpowiednio do masy cząsteczkowej badanego białka i użytych środków strącających. Rozmiar kawałka membrany do dializy RC zależy od konstrukcji chipa. W tym protokole zaprojektowano 2 prototypy, w których objętość zbiornika białka wynosi 0,1 lub 0,3 μl. W takich przypadkach rozmiar membrany do dializy wynosi odpowiednio 2 x 2 mm2 lub 4 x 4 mm2.
  3. Umieść drugi wzór formy PDMS tylko filary skierowane w dół na górze formy PDMS podpartej na szkiełku (Rysunek 1F). Środkowy filar tej formy odpowiada zbiornikowi białka i wykracza pionowo (w dół) o 45 μm od powierzchni poziomej.
  4. Wyrównaj środkowe filary 2 form PDMS. Membrana do dializy RC jest "umieszczona" pomiędzy 2 formami PDMS (Rysunek 1G).
    UWAGA: Wyrównanie między mikrostrukturami 2 form PDMS można wykonać wizualnie, bez dodatkowego wyposażenia. W przeciwnym razie tę manipulację można osiągnąć pod mikroskopem. Niewielkie przesunięcie między zbiornikami nie jest problematyczne, o ile kanał fluidyczny i punkty wejściowe lub wyjściowe nie są całkowicie pokryte.
  5. Osuszaj zespół przez 30 minut w komorze próżniowej, aby usunąć wszystkie uwięzione pęcherzyki powietrza w formach PDMS i ułatwić wprowadzenie żywicy podczas następnego etapu wytwarzania.
    UWAGA: 2 formy PDMS są utrzymywane na miejscu przez adhezję PDMS-PDMS i nie jest wymagany dodatkowy nacisk ani inny sposób tymczasowego łączenia.
  6. Wypełnij pustą przestrzeń między 2 formami PDMS fotoutwardzalną żywicą na bazie tiolenu NOA 81 przez wchłanianie kapilarne (Rysunek 1H i 1I).
  7. Żywicę utwardzać przez wystawienie na działanie światła UV (365 nm) przez 8 s za pomocą skolimowanej lampy UV (moc 35 mW cm-2).
    UWAGA: Ta pierwsza ekspozycja pozwala na częściowe usieciowanie żywicy NOA 81, ponieważ cienka warstwa NOA 81 stykająca się z formami PDMS po obu stronach pozostaje nieutwardzona.
  8. Odetnij nadmiar NOA 81 z zewnętrznych stron form PDMS za pomocą skalpela.
  9. Wyjmij górną formę PDMS z częściowo usieciowaną NOA 81 przyklejoną do niej z dolnej formy PDMS i szkiełka podstawowego.
  10. Wytnij arkusz PMMA o grubości 175 μm w standardowych wymiarach szkiełka mikroskopowego (3 x 1 cal) i odklej plastikowe arkusze ochronne z każdej strony elementu PMMA. Delikatnie dociśnij zespół górnej formy PDMS i częściowo utwardzonego NOA 81 na elemencie PMMA (Rysunek 1J).
  11. Utwardź ponownie NOA 81 przez wystawienie na działanie światła UV przez 60 s i usuń górną pleśń PDMS (Rysunek 1K). Żywica przylega do podłoża PMMA bez dalszej obróbki.
    UWAGA: Formy PDMS mogą być ponownie użyte około 5 razy po umyciu ich izopropanolem i acetonem, o ile formy nie są wygięte. Membrana do dializy RC jest wbudowana w naklejkę NOA 81 i nie jest wymagana żadna dalsza manipulacja ani mechaniczne zaciskanie.

4. Złącza hydrauliczne

UWAGA: Konstrukcja chipa mikroprzepływowego składa się z liniowego kanału fluidycznego dla roztworu krystalizacyjnego i centralnego zbiornika dla próbki białka (zbiornika białka), oba pokazane z góry na dwa mikrochipy w Rysunek 2A. Membrana do dializy RC jest osadzona pomiędzy tymi dwiema mikrostrukturami (Rysunek 2D), a proces krystalizacji ewoluuje, podczas gdy środki strącające z roztworu krystalizacyjnego dyfundują przez membranę z powodu gradientu stężenia między dwoma przedziałami chipa, które są oddzielone membraną. Kanał mikroprzepływowy jest nadrukowany na dolnej formie PDMS (Rysunek 1F). Po zakończeniu protokołu produkcyjnego chipów, kanał liniowy znajduje się na dolnej warstwie naklejki NOA 81 w kontakcie z podłożem PMMA, jak pokazano na Rysunek 1K. Wlot i wylot punktu dostępu do roztworu krystalizacyjnego znajdują się na każdym końcu kanału liniowego i wyglądają jak otwory (całkowita wysokość 90 μm), jak widać na Rysunek 2A. Do obsługi roztworu krystalizacyjnego należy dodać złącza w punktach dostępowych.

  1. Złącza łączące, które są dostępne na rynku (NanoPort) na wlocie i wylocie kanału mikroprzepływowego za pomocą szybkiego kleju epoksydowego (Rysunek 2C).
  2. Wybierz odpowiednią średnicę rurek PTFE w zależności od rozmiaru złączy. Rurki PTFE zostaną wykorzystane do wprowadzenia roztworu krystalizacyjnego do kanału fluidycznego chipa.
    UWAGA: Dostępne na rynku zestawy są zalecane do łatwej i precyzyjnej kontroli natężenia przepływu i są zwykle łączone z automatycznymi systemami napędzanymi ciśnieniem lub kontrolowanym przepływem (pompy strzykawkowe) do mieszania i obsługi płynów. Jednak roztwór krystalizacyjny można wprowadzić ręcznie do kanału liniowego za pomocą jednorazowej plastikowej strzykawki. W takim przypadku sugerowane są kroki od 4.3 do 4.5.
  3. Napełnij jednorazową strzykawkę o pojemności 1 ml roztworem krystalizacyjnym. W przypadku chipów przedstawionych w tym protokole 400 μL jest wystarczające do wypełnienia całego kanału płynowego.
  4. Wytnij dwie końcówki pipet tak, aby średnica końcówki po jednej stronie była równa średnicy wewnętrznej rurki PTFE, która będzie używana do obsługi roztworu. Przyklej przycięte końcówki w punktach dostępowych kanału za pomocą szybkiego kleju epoksydowego (Rysunek 2B).
  5. Połączyć strzykawkę z przyciętymi końcówkami z kawałkiem rurki PTFE o odpowiednim rozmiarze i wprowadzić roztwór do kanału, ciągle powoli naciskając tłok strzykawki.

5. Kapsułkowanie białek

UWAGA: Wzór chipa dedykowanego do wykorzystania jako rezerwuar białka pozostaje jak dotąd otwarty na atmosferę. Proponuje się następujący protokół, aby ostrożnie ograniczyć próbkę białka w chipie mikroprzepływowym.

  1. Ręcznie odpipetować kroplę próbki białka wewnątrz zbiornika białka, znajdującego się bezpośrednio na membranie dializacyjnej RC, jak pokazano na rysunku Rysunek 2E. Objętość próbki białka różni się w zależności od konstrukcji chipa i może wynosić 0,1 lub 0,3 μl.
  2. Nałóż cienką warstwę wysokopróżniowego smaru silikonowego wokół zbiornika białka.
  3. Wytnij mały kawałek arkusza PMMA o grubości 175 μm i delikatnie umieść go nad cienką warstwą smaru silikonowego. Kawałek PMMA musi pokrywać całą powierzchnię zbiornika białkowego, w którym osadza się roztwór białka.
    UWAGA: Smar silikonowy służy do zwiększenia szczelności i zapobiegania rozprzestrzenianiu się kropelki białka. Nie ma klejenia ani uszczelniania między kawałkiem PMMA używanym do przykrycia zbiornika białka a naklejką NOA 81. Kontakt między nimi to interfejs solidny/solidny. W celu uzyskania ogólnego uszczelnienia i hermetycznego zamknięcia próbki białka, stosuje się kawałek taśmy kaptonowej, jak opisano w kroku 5.4.
    UWAGA: Czasami trudno jest zamknąć próbkę białka w dedykowanej wnęce urządzenia (zbiornika białka), gdy do wprowadzenia roztworu krystalizacyjnego do kanału fluidycznego stosuje się system sterowany ciśnieniem (krok 6.4). Aby uniknąć wspomnianego wyżej problemu, podczas cyrkulacji roztworu krystalizacyjnego należy utrzymywać stosunkowo niskie wartości ciśnienia. Sugerowane jest ciśnienie wtrysku 20-60 mbar dla roztworów wodnych lub 50-150 mbar dla roztworów o większej lepkości (PEG, glicerol)19.
  4. Wytnij kawałek taśmy kaptonowej (o grubości 20 μm) na tyle duży, aby przykrył kawałek PMMA ustawiony nad zbiornikiem białka i przykleił się do chipa NOA na wszystkich krawędziach. Próbka białka jest zamknięta w zbiorniku, a chip jest gotowy do użycia w eksperymencie krystalizacji, jak pokazano na Rysunek 2C.
    UWAGA: Chipy mogą być ponownie użyte kilka razy, o ile membrana dializy i przyczepność NOA do podłoża PMMA nie ulegną pogorszeniu. Jeśli te części chipa są uszkodzone, obserwuje się wycieki, które sprawdzają, czy urządzenie nie może być już używane. Mycie wiórów zależy od roztworu krystalizacyjnego. W przypadku roztworów o niskiej lepkości (sole,) kanał fluidyczny można przemyć, wprowadzając wodę destylowaną i pozwalając jej płynąć przez kilka minut. 400 μl to objętość wymagana do całkowitej wymiany roztworu w kanale na inny roztwór. W przypadku bardziej lepkich roztworów (PEG, glicerol) ponowne użycie wiórów nie jest zalecane, ponieważ mycie kanału tylko wodą nie jest wystarczające. Górna część chipa, w której znajduje się zbiornik białka, można również umyć wodą destylowaną i wysuszyć powietrzem pod ciśnieniem.

6. Krystalizacja białek na chipie

  1. Zważyć liofilizowany lizozym z białka jaja kurzego w proszku i rozpuścić w wodzie destylowanej, aby uzyskać końcowe stężenie 30 mg mL-1.
  2. Przefiltrować roztwór białkowy przez filtr 0,22 μm i odwirować przez 5 minut z najwyższą prędkością w temperaturze 293 K, aby usunąć wszystkie cząstki stałe. Użyj supernatantu do eksperymentu krystalizacji.
  3. Przygotować 500 μl roztworu krystalizacyjnego zawierającego bufor i środek strącający w stężeniach podanych w tabeli 1. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm.
  4. Wstrzyknąć roztwór do punktu wlotowego chipa za pomocą strzykawki lub zautomatyzowanego systemu płynowego napędzanego ciśnieniem lub pompy strzykawkowej, jak opisano w krokach 4.1-4.5.
    UWAGA: Eksperyment krystalizacji może odbyć się albo w warunkach statycznych, jeśli kanał mikroprzepływowy jest wypełniony roztworem krystalizacyjnym i odstawiony na bok, albo w warunkach przepływu, jeśli jest on w sposób ciągły wstrzykiwany do kanału ze stałym natężeniem przepływu. W tym drugim przypadku zaleca się stosowanie zewnętrznego systemu napędzanego ciśnieniem lub pompy strzykawkowej. Realizacja eksperymentu w warunkach przepływowych daje również możliwość dynamicznej wymiany roztworów krystalizacyjnych w obrębie kanału fluidycznego. W ten sposób można przeprowadzić wiele eksperymentów przy użyciu tej samej próbki białka.
  5. Gdy kanał fluidyczny zostanie wypełniony roztworem krystalizacyjnym, uszczelnij porty wlotowe i wylotowe chipa taśmą parafilmową.
  6. Odpipetować odpowiednią objętość roztworu białkowego w zbiorniku białkowym i zalać próbkę białka w kapsułkę zgodnie z opisem w krokach 5.1-5.4.
  7. Przechowuj chip w temperaturze 293 K.
    UWAGA: Krystalizacja za pomocą dializy przebiega według innej trajektorii kinetycznej niż eksperymenty przeprowadzone metodą dyfuzji parowej lub krystalizacji okresowej i zależy w dużym stopniu od charakteru cząsteczek strącających biorących udział w procesie dyfuzji, zgodnie z danymi pomiarowymi51, a rozpoczęcie zarodkowania może zająć więcej czasu. Aby zapobiec parowaniu, jeśli występuje, w tym okresie umieść chip w atmosferze nasyconej wilgocią o temperaturze 293 K.

7. Dyfrakcja rentgenowska in situ i na chipie

  1. Drukowana w 3D podpora dla linii badawczych
    1. Wydrukuj podporę, która może przenosić do trzech chipów jednocześnie. Wymiary nośnika są takie same jak wymiary komercyjnych płytek krystalizacyjnych (standard 96 dołków/SBS) kompatybilnych z eksperymentami dyfrakcji rentgenowskiej w płytach.
      UWAGA: Druk podpory może być przypisany do usług komercyjnych. Podpora została zaprojektowana przy użyciu oprogramowania do projektowania 3D-CAD i jest pokazana na Rysunek 3A podczas eksperymentów krystalizacji białek na chipie oraz w Rysunek 3B podczas zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej in situ w BM30A-FIP (ESRF).
    2. Ustabilizuj chipy do dializy na podporze za pomocą taśmy jedno- lub dwustronnej.
  2. Dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego in situ
    1. Zbierz dane dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej z kryształów wyhodowanych w zbiorniku białkowym. Na przykład użyj promieni rentgenowskich o energii 12,656 keV, strumieniu 3,32 x10 10 fotonów s-1 i rozmiarze wiązki 250 x 250μm2. Rejestruj obrazy dyfrakcyjne za pomocą detektora ADSC Quantum 315r z matrycą 3 x 3 CCD dla powierzchni czynnej 315 x 315 mm2 i rozdzielczości 9,4 megapiksela.
      UWAGA: Dane dyfrakcyjne dla kryształów lizozymu wyhodowanych na chipach dializacyjnych zostały zebrane na linii badawczej BM30A-FIP w Europejskim Zakładzie Promieniowania Synchrotronowego (ESRF). Jednak rozmiar wiązki, strumień i typ detektora mogą być różne w innych źródłach promieniowania rentgenowskiego. Wydrukowana w 3D podpora umożliwia zbieranie danych w zakresie kątowym od -40° do +40° wokół kryształu. W tabeli 2 podsumowano liczbę kryształów lizozymu wystawionych na działanie promieni w celu zebrania danych in situ, liczbę wzorów dyfrakcyjnych zebranych dla każdego kryształu, zakres kąta oscylacji dla każdej ekspozycji oraz czas ekspozycji.
  3. Przetwarzanie danych
    1. Przetwarzaj kompletne lub częściowe zestawy danych z wzorami dyfrakcyjnymi dla kryształów lizozymu za pomocą programu XDS48.
    2. Wygeneruj plik HKL dla każdego zestawu danych i przeskaluj go za pomocą oprogramowania XSCALE 48.
    3. Użyj zastępowania molekularnego za pomocą programu Phaser z pakietu CPP4 suite49 i określ fazy budowy modelu. Na tym etapie użyj znanych współrzędnych 3D lizozymu z wpisu 193L w Banku Danych Białek (PDB).
    4. Udoskonal strukturę za pomocą Phenix52 i sprawdź ostateczny model białka za pomocą COOT50.

Wyniki

Chip mikrofluidyczne opracowane przez Juniusa i współpracowników19,45 są kompatybilne zarówno z krystalizacją białek na chipie metodą mikrodializy, jak i z pomiarem danych dyfrakcji promieni rentgenowskich in situ w temperaturze pokojowej. Zdjęcia mikrochipów, ich szczegółowy projekt, złącza fluidyczne oraz membrana dializacyjna RC zostały przedstawione na Rysunku 2. Eksperymenty krystalizacyjne przygotowuje się poprzez ręczne pipetowanie próbki białka bezpośrednio do zbiornika na białko i wprowadzanie roztworu krystalizacyjnego do liniowego kanału fluidycznego za pomocą zautomatyzowanego systemu sterowanego ciśnieniem, pompy strzykawkowej lub ręcznie przy użyciu strzykawki. Zbiornik na białko oraz kanał fluidyczny można rozróżnić na Rysunku 2A. Projekty chipów z maksymalną objętością zbiornika na białko wynoszącą 0,1 µL lub 0,3 µL pokazano odpowiednio po lewej i prawej stronie na Rysunku 2A. Chipy o maksymalnej pojemności dla próbki białka 0,2 µL lub 0,7 µL opisano w innym opracowaniu19. Kluczowym elementem protokołu wytwarzania urządzenia jest zastosowanie fotoutwardzalnej żywicy na bazie tiolenu NOA 81, w której zatopiono dostępne komercyjnie membrany dializacyjne RC o różnych wartościach MWCO. Podczas wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych liniowy kanał fluidyczny jest odciskany na dolnej formie z PDMS (Rysunek 1F), podczas gdy górna forma z PDMS składa się wyłącznie z uformowanych filarów dla zbiornika na białko oraz portów wlotowego i wylotowego (Rysunek 1F). Po usieciowaniu NOA 81 i usunięciu form z PDMS z zestawu (Rysunek 1K), kanał fluidyczny znajduje się w dolnej warstwie mikrochipu, a kanał białkowy oraz porty wlotowe/wylotowe znajdują się w obu warstwach. Rysunek 1L przedstawia schematyczną widok boczny chipu dializacyjnego, na którym zaznaczono wszystkie warstwy urządzenia oraz ich odpowiednią grubość. Wysokość wzorów odciskanych na dolnej warstwie chipów (kanał fluidyczny) wynosi około 45 µm, natomiast całkowita wysokość portów wlotowych i wylotowych wynosi około 90 µm. Zbiornik na białko (wysokość 45 µm) przedstawiono również na Rysunku 2D oraz 2E. Dopasowanie obu warstw zbadano pod mikroskopem optycznym; fragment membrany dializacyjnej RC wbudowanej w mikrochip jest wyraźnie widoczny na Rysunku 2D. Na tym samym rysunku widać pęcherzyk powietrza uwięziony w kanale fluidycznym podczas wstrzykiwania roztworu krystalizacyjnego, co widoczne jest w górnej lewej części zbiornika na białko. Rysunek 2E to zdjęcie z bliska zbiornika na białko po ręcznym naniesieniu kropli białka pipetą i przed zamknięciem kropli fragmentem PMMA i taśmy Kapton, zgodnie z opisem w krokach 5.2 i 5.3 protokołu. Chip mikrofluidyczny gotowy do użycia w eksperymentach krystalizacyjnych, po zamknięciu próbki białka i przyklejeniu złączy fluidycznych, przedstawiono na Rysunku 2C. Hermetyczny montaż zapobiega wyciekom. Złącza fluidyczne dla portów wlotowych i wylotowych kanału mikrofluidycznego mogą być dostępne komercyjnie, jak opisano w kroku 4.1 protokołu i pokazano na Rysunku 2C, lub w tym samym celu można zastosować jednorazowe końcówki do pipet laboratoryjnych (Rysunek 2B, krok 4.4 protokołu).

Do produkcji chipów mikroprzepływowych wybrano materiały optycznie przezroczyste i biologicznie obojętne, wykazujące wysoką kompatybilność z eksperymentami dyfrakcji promieni X in situ w temperaturze pokojowej. Oddziaływania promieni rentgenowskich (absorpcja i rozpraszanie) z materiałami tworzącymi urządzenie mikroprzepływowe oraz z otaczającą atmosferą (powietrzem) generują sygnał znany jako szum tła. Szum ten nakłada się na sygnał dyfrakcyjny kryształów białek rejestrowany przez detektor, co obniża stosunek sygnału do szumu; dlatego podczas zbierania danych dyfrakcyjnych należy utrzymać go na możliwie najniższym poziomie. Przeanalizowano szum tła generowany przez materiały tworzące rezerwuar białka, który znajduje się bezpośrednio na drodze wiązki promieniowania X. Rezerwuar białka składa się z membrany dializacyjnej RC, taśmy Kapton oraz dwóch elementów z PMMA – jednego służącego jako podłoże dla mikrochipu, a drugiego do enkapsulacji próbki białka. Grubość PMMA wynosi 2 x 175 µm, taśmy Kapton 20 µm, a membrana dializacyjna RC ma grubość około 40 µm (Rycina 1L). Całkowita grubość tych warstw wynosi około 410 µm, a warstwa NOA 81 nie znajduje się bezpośrednio na drodze promieni X. Oprócz grubości materiałów konstrukcyjnych, kluczowa dla pomiaru szumu rozproszenia tła jest również ich gęstość, ponieważ rozpraszanie promieni X wzrasta wraz z liczbą atomową pierwiastków. Z tego powodu podczas zbierania danych w celu charakterystyki materiałów oraz w eksperymentach dyfrakcyjnych białek, zamiast powietrza zastosowano przepływ helu (funkcja dostępna w BM30A-FIP w ESRF). Rycina 3C ilustruje szum tła generowany przez taśmę Kapton, membranę dializacyjną RC, arkusz PMMA oraz ich zestaw w atmosferze helu. Każdy materiał był naświetlany przez 20 s promieniami X o długości fali 0,98 Å, a odległość próbka-detektor wynosiła 200 mm. Eksperymenty przeprowadzono na linii wiązki BM30A-FIP w ESRF, zgodnie z opisem w kroku 7 protokołu. Rozproszone pierścienie przypisywane oddziaływaniom wiązki promieni X z materiałami można odróżnić dla taśmy Kapton przy rozdzielczości niższej niż 4 Å, dla arkusza PMMA w zakresie 4-8 Å oraz dla membrany dializacyjnej w zakresie rozdzielczości 4-5 Å. Szum tła generowany przez chip dializacyjny jest obserwowany głównie przy rozdzielczości niższej niż 6 Å, co nie wpływa na przetwarzanie danych dyfrakcyjnych o wysokiej rozdzielczości dla dużych kryształów lizozymu. Intensywność rozproszenia tła w funkcji rozdzielczości dla mikrochipu i poszczególnych materiałów przedstawiono w innym opracowaniu19. W pomiarze przedstawionym na Rycynie 3C chip dializacyjny był pusty (bez żadnego roztworu białka lub wytrącającego), zatem nie zmierzono wpływu obecności roztworu na szum tła. Chipy montowano przed wiązką promieni X za pomocą wspornika wydrukowanego w technologii 3D (Rycina 3B), zaprojektowanego do eksperymentów dyfrakcyjnych in situ19. Ten sam wspornik, o wymiarach odpowiadających standardowej płytce krystalizacyjnej 96-dołkowej/SBS, może być wykorzystany do jednoczesnego przeprowadzania od 1 do 3 eksperymentów krystalizacji, ponieważ może pomieścić do 3 chipów jednocześnie (Rycina 3A).

Przeprowadzono doświadczenia w celu oceny wydajności urządzeń mikroprzepływowych do krystalizacji na chipie modelowych białek rozpuszczalnych z wykorzystaniem metody mikrodializy. Kanał przepływowy wypełniono zgodnie z opisem w kroku 4 protokołu, natomiast kroki 5 i 6 opisywały sposób inkapsulacji próbki białka w dedykowanym zbiorniku na białko oraz sposób przygotowania eksperymentów krystalizacyjnych. Rycina 4 przedstawia kryształy lizozymu wyhodowane w temperaturze 293 K w obecności 1,5 M chlorku sodu (NaCl) z 0,1 M octanu sodu (CH3COONa) pH 4,0 (A) oraz w 1 M NaCl, 0,1 M CH3COONa pH 4,5 z 30% glikolem polietylenowym (PEG) 40 (B). Liofilizowany proszek lizozymu rozpuszczono w wodzie do końcowego stężenia ~30 mg mL-1 lub w buforze 20 mM CH3COONa pH 4,2 do końcowego stężenia ~20 mg mL-1 dla doświadczeń przedstawionych odpowiednio na Rycini 4A i 4B. Objętość próbki białka w obu doświadczeniach wynosiła około 0,3 µL, a MWCO membrany dializacyjnej RC osadzonej w mikrochipach mieści się w zakresie 6-8 kDa. Kryształy lizozymu pokazane na Rycini 3A wyrosły w ciągu 1 h, a kryształy na Rycini 3B wyrosły w ciągu 30 min od rozpoczęcia eksperymentu. Doświadczenia krystalizacyjne przeprowadzono w warunkach statycznych. Wykazano jednak19, że prowadzenie doświadczeń w warunkach przepływowych umożliwia dynamiczną wymianę warunków krystalizacji i badanie diagramów fazowych, co pozwala zweryfikować odwracalność metody mikrodializy.

In situ Dane z dyfrakcji rentgenowskiej uzyskane z kryształów lizozymu przedstawionych w Rycina 4A zebrano w celu wykazania przydatności chipów do dializy w tego rodzaju eksperymentach. Gromadzenie danych przeprowadzono na linii wiązki BM30A-FIP (ESRF) w temperaturze pokojowej, zgodnie z opisem w kroku 7.2.1 protokołu. Mikrochipy zamocowano na linii wiązki za pomocą wydrukowanego w technologii 3D wspornika (Rysunek 3B) oraz kompletne zestawy danych z dyfrakcji rentgenowskiej zebrano z dwóch pojedynczych kryształów lysozymu, wyhodowanych na chipie w warunkach podanych w drugiej linii Tabela 1Obserwowane refleksy zestawów danych zostały przetworzone, indeksowane i zintegrowane przy użyciu programu XDS48 a wymianę molekularną i uszczegółowienie przeprowadzono za pomocą programu Phaser49 oraz Phenix52odpowiednio. Statystyki krystalograficzne dla pełnego zestawu danych każdego kryształu lizozymu oraz dla połączonych dwóch zestawów danych przedstawiono w Tabela 2Do wymiany molekularnej wykorzystano wpis PDB 193L.

Mapy gęstości elektronowej z pojedynczego kryształu lizozymu oraz z połączonego zestawu danych z dwóch kryształów zostały uzyskane odpowiednio przy rozdzielczości 1,95 Å i 1,85 Å i są przedstawione na Rysunkach 5A i 5B. Obie mapy gęstości elektronowej zawierają szczegółowe informacje strukturalne, które można uzyskać dzięki eksperymentom dyfrakcji rentgenowskiej in situ przeprowadzonym bezpośrednio na mikroczipie dializacyjnym w temperaturze pokojowej z pojedynczego kryształu lub z wielu kryształów, co czyni czipy kompatybilnymi z badaniami krystalografii rentgenowskiej in situ.

Wytwarzanie urządzeń mikrofluidycznych; formy PDMS na SU-8, naświetlanie UV; schemat montażu chipa dializacyjnego.
Rysunek 1Schematyczny rysunek procesu wytwarzania chipa do dializy. (AŻywica SU-8 jest nanoszona na dwa wafle krzemowe i rozprowadzana metodą spin-coatingu.B) Matrycę z SU-8 otrzymuje się poprzez naświetlanie fotorezystu światłem UV przez fotomaskę, a następnie wywołanie części nienaświetlonych. (CPDMS nakłada się na matryce SU-8, a następnie utwardza w temperaturze 38 K przez 1 h,D) dwie formy z PDMS, wykonane metodą odlewu replikacyjnego i odwzorowania mikrostruktur, są oddzielane od form macierzystych i (E) przyciąć do odpowiedniego rozmiaru. (FFormy z PDMS są zamocowane na szkiełku przedmiotowym, z membraną dializacyjną RC umieszczoną pomiędzy dwoma środkowymi filarami.GNastępnie dwie formy z PDMS są wyrównywane i osuszane przez ok. 30 min w komorze próżniowej.HŻywicę NOA 81 wlewa się pomiędzy dwie formy iI) wypełnia przestrzeń poprzez kapilarność. (JPo pierwszej ekspozycji na światło UV dolną formę z PDMS zostaje usunięta, a cały układ naniesiony na arkusz PMMA.KNastępnie przeprowadza się drugą ekspozycję na promieniowanie UV w celu pełnej polimeryzacji żywicy NOA 81; po usunięciu pozostałej górnej formy z PDMS chip do dializy jest gotowy do użycia.L) Schemat widoku z boku chipa do dializy, na którym zaznaczono wszystkie warstwy urządzenia oraz ich odpowiednią grubość. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Schemat urządzenia mikroprzepływowego do analizy białek z konektorami i układem membrany dializacyjnej.
Rycina 2Chip dializacyjny z wbudowaną membraną dializacyjną RC do krystalizacji białek na chipie i in situ Eksperymenty dyfrakcyjne rentgenowskie. (A) mikroczipy NOA 81 na 175 µm gruba podłoże z PMMA z rezerwuarem białka o 0.1 µL (po lewej) i 0.3 µL (prawo) objętość nominalna. (B) Mikroczipy z końcówkami do pipet jako złączami fluidycznymi, przyklejonymi do portów wlotowego i wylotowego kanału fluidycznego. (CZdjęcie mikrochipu podczas eksperymentu krystalizacji. Próbka białka jest zamknięta za pomocą fragmentu 175 µm gruba płyta PMMA oraz taśma Kapton. Złącza Peek Nanoport są wykorzystywane jako porty wlotowe i wylotowe kanałuy mikrofluidycznego. (DWidok z góry zbiornika z białkiem podczas cyrkulacji roztworu krystalizacyjnego w kanale płynowym. W górnej części zbiornika, bezpośrednio pod membraną dializacyjną RC, widoczne jest uwięzione powietrze, które można wyraźnie zidentyfikować.E) Widok z góry na rezerwuar dializacyjny pod mikroskopem optycznym podczas nanoszenia próbki białka. Kropla białka zostaje naniosiona bezpośrednio nad osadzoną membraną dializacyjną RC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Równowaga statyczna w eksperymencie z chipem dializacyjnym; schemat przedstawia wyniki analizy rozpraszania rentgenowskiego.
Rycina 3Wspornik wydrukowany w technologii 3D (A) dla mikrochipów wykorzystywanych podczas eksperymentów krystalizacyjnych oraz (B) zamontowany przed wiązką promieni rentgenowskich na linii BM30A-FIP w ESRF w celu in situ Doświadczenia z dyfrakcji rentgenowskiej.C) Szum tła generowany przez oddziaływanie promieni rentgenowskich z Kaptonem, membraną dializacyjną RC, PMMA oraz chipem dializacyjnym (od lewej do prawej). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Obraz mikroskopowy etapów rozwoju nasiona; po lewej zarodek z różnicowaniem komórkowym, po prawej łupina nasiona.
Rycina 4Krystalizacja lizozymu na chipie z wykorzystaniem metody mikrodializy. (A) lizozym (~30 mg mL-1)-1) kryształy wyhodowane na płytce w roztworze 1,5 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4,0 oraz (B) lizozym (~20 mg mL⁻¹)-1) kryształy wyhodowane w warunkach krystalizacji zawierających 1 M NaCl, 0,1 M CH3COONa o pH 4,5 oraz 30% PEG 40. Oba eksperymenty przeprowadzono w temperaturze 293 K. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza struktury białek, mapy gęstości elektronowej, porównywanie konformacji molekularnych, krystalografia.
Rysunek 5Mapy gęstości elektronowej udoskonalonej struktury lizozymu z (A) pojedynczego kryształu oraz (B) połączonego zestawu danych z dwóch kryształów wyhodowanych na płytce metodą mikrodializy. Mapy uzyskano odpowiednio przy rozdzielczościach 1,95 Å i 1,84 Å, z poziomem izopowierzchni ustawionym na 1σ. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

BiałkoStężenie białka
(mg/ml)-1)		Bufor białkowyStężenie początkowe
roztwór wytrącający		MWCO regeneratora (RC)
membrana dializacyjna
(kDa)		Temperatura
(K)
Lizozym~ 30Woda1,5 M NaCl
0,1 M CH3COONa pH 4,0		6 - 8293
Lizozym~ 2020 mM CH3COONa pH 4,21 M NaCl
0,1 M CH3COONa pH 4,5
30% PEG 40		6 - 8293

Tabela 1: Skład buforu białkowego i roztworu wytrącającego dla krystalizacji lizozymu na chipie metodą mikrodializy. Kryształy lizozymu wyhodowane na chipie w warunkach podanych w drugiej linii zostały wykorzystane do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej in situ.

BiałkoLysozymLysozymLysozym
Liczba kryształów112
Liczba klatek dyfrakcyjnych403070
Oscylacja (°) na ekspozycję11
Czas ekspozycji (s)3030
Temperatura (K)293293293
Grupa przestrzennaP43212P43212P43212
Parametry komórki elementarnej78.86 78.86 37.87
90.0 90.0 90.0		79.17 79.17 37.95
90.0 90.0 90.0		78.47 78.47 37.65
90.0 90.0 90.0
Zakres rozdzielczości (Å)27.31 - 1.95
(2.02 - 1.95)		27.39 - 1.96
(2.03 - 1.96)		27.17 - 1.85
(1.91 - 1.85)
Mozaikowość (°)0.3190.121
Całkowita liczba odbić (obserwowane)25127 (352)1991 (301)
Unikalne odbicia (obserwowane)8641 (1357)8295 (1321)10404 (975)
Redundancja2.90 (2.61)2.41 (2.27)
Kompletność (%)95.0 (94.8)91.9 (93.3)98.23 (93.15)
Średnie I/σ6.83 (1.16)7.09 (1.6)3.7
CC(1/2)9.1 (42.4)97.9 (37.0)97.0
R-merge0.184
R-meas0.1390.2210.219
R-pim0.16
Odbicia użyte w udoskonalaniu8645 (787)8451 (857)10391 (965)
Odbicia użyte do R-free864 (78)846 (85)1039 (96)
R-work0.198 (0.2968)0.1853 (0.2872)0.1839 (0.3102)
R-free0.2430 (0.3437)0.297 (0.362)0.207 (0.3703)
Liczba atomów nie-wodór106910711096
makromolekuły101210121012
woda55782
ligand222
Reszty białkowe131131131
Rms (wiązania, Å)0.080.090.005
Rms (kąty, °)1.171.261.05
Ramachandran obszary preferowane (%)98.4397.649.21
Ramachandran obszary dopuszczalne (%)1.572.360.79
Ramachandran wartości odstające (%)0.00.00.0
Średni czynnik B34.2628.5424.34
białko3.9428.1423.62
woda40.2335.573.16
ligandy3.2329.6324.7

Tabela 2: Parametry zbierania danych, statystyki krystalograficzne i statystyki udoskonalania kryształów lysozymu hodowanych na chipie metodą mikrodializy. Wartości podane w nawiasach odpowiadają powłoce o najwyższej rozdzielczości. Czwarta kolumna odpowiada wartościom uzyskanym po połączeniu zestawów danych z drugiej i trzeciej kolumny.

Dyskusja

Opracowano urządzenie mikroprzepływowe do krystalizacji białek w układzie scalonym metodą mikrodializy oraz eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ w temperaturze pokojowej. Można wytwarzać chipy NOA 81 integrujące membrany dializacyjne RC dowolnego MWCO w celu wykorzystania mikrodializy do krystalizacji białek w chipie. Użyto materiałów produkcyjnych o stosunkowo wysokiej przezroczystości rentgenowskiej, dzięki czemu chipy są kompatybilne z krystalografią białek in situ. Materiały produkcyjne, które składają się na komorę do krystalizacji białek w urządzeniu (PMMA, Kapton, membrana do dializy RC) zostały ocenione pod kątem generowania niskiego poziomu szumów tła. W szczególności szum tła generowany przez chip do dializy obserwuje się głównie w niskiej rozdzielczości (> 6 A) i nie ma on wpływu na przetwarzanie danych dyfrakcyjnych o wysokiej rozdzielczości dużych kryształów lizozymu wymaganych do określenia struktury białka. Automatyzacja zbierania danych jest wzmocniona za pomocą wydrukowanego w 3D wspornika, który może być montowany bezpośrednio w liniach badawczych krystalografii makromolekularnej i przenosić do trzech mikroprocesorów jednocześnie. W ten sposób unika się ręcznego zbierania i manipulowania delikatnymi kryształami białka. Co więcej, gromadzenie danych odbywa się w temperaturze pokojowej, co pozwala uniknąć konieczności krioprotekcji, która może być związana ze zmianami konformacyjnymi w natywnej strukturze białka 2,3.

Zastosowanie mikrodializy jako metody hodowli kryształów na chipie pozwala na dokładne monitorowanie i kontrolowanie procesu krystalizacji. Jak omówiono we wprowadzeniu, większość konwencjonalnych metod krystalizacji białek została wdrożona przy użyciu urządzeń mikroprzepływowych11,14. Jednak korzyści płynące z dializy w krystalizacji białek nie zostały jeszcze w pełni wykorzystane w mikroskali. Mikrodializa wbudowana w chip daje możliwość badania diagramów fazowych oraz przeprowadzania badań przesiewowych i optymalizacji warunków krystalizacji na tej samej próbce białka19. W przypadku prototypów przedstawionych w tej pracy zużycie białka na chip jest ograniczone do 0,1 lub 0,3 μl. Na podstawie dotychczasowych prac eksperymentalnych można stwierdzić, że najbardziej krytyczne etapy protokołu nie wynikają z procedury wytwarzania chipów, ale z procesu krystalizacji. Protokół produkcyjny obejmuje wiele kroków, ale jest prosty i umożliwia wytwarzanie wielu urządzeń (od 20 do 30 chipów) w ciągu jednego dnia w czystym pomieszczeniu, przy użyciu stosunkowo niedrogich materiałów. Jednak krystalizacja białek w układzie scalonym może być delikatną procedurą ze względu na wewnętrzną stochastyczną naturę zarodkowania i wzrostu kryształów, zwłaszcza w mikroskali. Opisano studium przypadku, w którym do krystalizacji lizozymu wykorzystano dobrze ugruntowane warunki, w wyniku których uzyskano solidne, dobrze zdefiniowane kryształy nadające się do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Niemniej jednak mogą pojawić się trudności w przypadku stosowania bardziej wymagających celów białkowych, takich jak białka błonowe, w przypadku których podłoże krystalizacyjne jest znacznie bardziej skomplikowane, schematy fazowe nie są znane, a dobrze działające warunki krystalizacji nie są jeszcze dobrze ustalone. Chip do dializy daje możliwość pokonania tych trudności i badania diagramów faz na chipie, bez pozbywania się cennej i często kosztownej próbki białka, poprzez zwykłą wymianę roztworu krystalizacyjnego w kanale mikroprzepływowym.

Wszechstronność urządzeń mikroprzepływowych wynika z wykorzystania mikrodializy do krystalizacji białek w układzie scalonym w celu odwracalnej kontroli warunków krystalizacji oraz mapowania diagramów fazowych o zmiennym stężeniu i temperaturze przy użyciu małej objętości białka. Co więcej, urządzenie jest kompatybilne z eksperymentami dyfrakcji rentgenowskiej in situ , a prototypowanie urządzeń jest niedrogie i szybkie. Liczne, izomorficzne kryształy białek rozpuszczalnych i błonowych (w przygotowaniu) mogą być hodowane na chipie i oczekuje się, że wszystkie te cechy mogą być wykorzystane do seryjnych badań krystalografii rentgenowskiej trudnych celów białkowych w obiektach synchrotronowych i XFEL. Wreszcie, przeprowadzanie badań rozdzielczych w układzie scalonym i in situ z rozdzielczością czasową jest przyszłą możliwością, która może być bardzo interesująca dla społeczności krystalograficznej. W związku z tym, poprzez hodowanie kryształów na chipie dializacyjnym i wprowadzanie odczynników do kanału mikroprzepływowego, ręcznie (za pomocą strzykawki) lub automatycznie (za pomocą systemu płynu kontrolującego ciśnienie lub pompy strzykawkowej), przyszłe wysiłki będą koncentrować się na udowodnieniu, że chipy mikroprzepływowe mogą być z powodzeniem wykorzystywane do uruchamiania eksperymentów czasowo-rozdzielczych na liniach synchrotronowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

MBS potwierdza wsparcie MI / CNRS w ramach kontraktu Instrumentation at the limits 2014-2015. NJ przyjmuje do wiadomości Międzynarodowy Program Badań Doktoranckich CEA (Irtelis) w celu uzyskania stypendium doktoranckiego. MBS i SJ potwierdzają finansowanie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji "Horyzont 2020" w ramach umowy o udzielenie dotacji "Maria Skłodowska-Curie" nr 722687. MBS, SJ i NJ dziękują LIPhy (UGA) za ustanowienie pomieszczenia czystego do eksperymentów mikrofabrykacyjnych. IBS potwierdza integrację z Interdyscyplinarnym Instytutem Badawczym w Grenoble (IRIG, CEA).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3 w wafliSilicon Materials Inc.Wirówka do wafli krzemowych
EppendorfMinispinWirówka stołowa
CleWin 3.0OprogramowanieOprogramowanie do projektowania
Klej epoksydowyDevcon5 minut klej epoksydowy
Złącza płynoweCluzeau Info LabN-333Zestaw NanoPort do węży o średnicy zewnętrznej 1/16"
Lizozym z białka kurzegoRoche10 837 059 001Liofilizowany smar białkowy w proszku
Wysokopróżniowy smar silikonowySigma-AldrichZ273554Dow Corning  wysokopróżniowy smar silikonowy
HMDSSigma-Aldrich440191Silan, chemiczny
Płyta grzejnaSawatecHP-200-Z-HMDS BMPłyta grzejna
Alkohol izopropylowySigma-AldrichSolvent
Taśma kaptonowaDuPontTaśma poliamidowa
Wyrównywacz do masekSUSS MicroTecMJB4Nakładka do maski, źródło UV
Filtr membranowyMilliporeGSWP047000,22 μ m filtr wielkości porów
Szkiełko mikroskopoweFisher Scientific 121646823 x 1 cal szkiełka
podstawowe NOA81Norland Products Inc. NOA81Żywica fotoutwardzalna
PiekarnikMemmertPiekarnik
ParafilmSigma-AldrichP6543Parafilm M rozmiar rolki 20  w. &czasy; 50  ft
PDMSDow CorningSylgard 184Silikon
PEG 400Hampton ResearchHR2-603Chemiczna
szalka PetriegoSigma-AldrichP5731100 x 15 mm
PGMEASigma-Aldrich484431Developer
Sprzęt plazmowyDiener ElectronicZEPTOObróbka plazmowa
PMMAGoodfellow137-745-63Arkusze PMMA 150x150 mm, grubość 0,175 mm
System napędzany ciśnieniemElveflowOB1 MK3+Regulator ciśnienia/podciśnienia
Rurki PTFEMikrofluidyka Elveflow/DarwinLVF-KTU-15Rolka rurki PTFE 1/16" OD X 1/32" ID
RC membrana dializacyjnaSpectra/PorRóżne MWCO
SkalpelSwann-MortonOstrza chirurgiczne ze stali węglowej
Octan soduSigma-AldrichS2889Chemiczny
Chlorek soduSigma-Aldrich746398Chemical
SolidworksDassault Systemes3D-CAD
Powlekarka wirowaSPSSpin150Przędzarka waflowa
SU-8 seria 3000MicroChem Corp.SU-8 3050fotorezystyczna
BD3096281 mL strzykawka Luer-Lok
Sieciownik UVUvitecCL-508Usieciownik UV
WieWeb Oprogramowanie do projektowania Strzykawka

Bibliografia

  1. Garman, E. F. Radiation damage in macromolecular crystallography: what is it and why should we care. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 339-351 (2010).
  2. Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
  3. Fraser, J. S., et al. Accessing protein conformational ensembles using room-temperature X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16247-16252 (2011).
  4. Gotthard, G., et al. Specific radiation damage is a lesser concern at room temperature. IUCrJ. 6 (4), 665-680 (2019).
  5. Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 32-47 (2016).
  6. Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal X-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133(2018).
  7. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470, 73-78 (2011).
  8. Hunter, M. S., et al. Fixed-target protein serial microcrystallography with an x-ray free electron laser. Science Reports. 4, 6026(2014).
  9. Pawate, A. S., et al. Towards time-resolved serial crystallography in a microfluidic device. Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology Communications. 71, 823-830 (2015).
  10. Owen, R. L., et al. Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 73, 373-378 (2017).
  11. Leng, J., Salmon, J. -B. Microfluidic crystallization. Lab on a Chip. 9, 24-34 (2009).
  12. Morel, M., Galas, J. -C., Dahan, M., Studer, V. Concentration landscape generators for shear free dynamic chemical stimulation. Lab on a Chip. 12, 1340-1346 (2012).
  13. Miralles, V., Huerre, A., Malloggi, F., Jullien, M. -C. A review of heating and temperature control in microfluidic systems: techniques and applications. Diagnostics. 3, 33-67 (2013).
  14. Sui, S., Perry, S. L. Microfluidics: from crystallization to serial time-resolved crystallography. Structural Dynamics. 4, 032202(2017).
  15. Hansen, C. L., Sommer, M. O. A., Quake, S. R. Systematic investigation of protein phase behavior with a microfluidic formulator. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14431-14436 (2004).
  16. Laval, P., Lisai, N., Salmon, J. -B., Joanicot, M. A microfluidic device based on droplet storage for screening solubility diagrams. Lab on a Chip. 7, 829-834 (2007).
  17. Shim, J. -U., et al. Control and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics. Journal of the American Chemical Society. 129, 8825-8835 (2007).
  18. Selimovic, S., Gobeaux, F., Fraden, S. Mapping and manipulating temperature-concentration phase diagrams using microfluidics. Lab on a Chip. 10, 1696-1699 (2010).
  19. Junius, N., et al. A microfluidic device for both on-chip dialysis protein crystallization and in situ X-ray diffraction. Lab on a Chip. 20, 296-310 (2020).
  20. Greaves, E. D., Manz, A. Towards on-chip X-ray analysis. Lab on a Chip. 5, 382-391 (2005).
  21. Dhouib, K., et al. Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis. Lab on a Chip. 9, 1412-1421 (2009).
  22. Guha, S., Perry, S. L., Pawate, A. S., Kenis, P. J. A. Fabrication of X-ray compatible microfluidic platforms for protein crystallization. Sensors and Actuators B. Chemical. 174, 1-9 (2012).
  23. Sui, S., et al. Graphene-based microfluidics for serial crystallography. Lab on a Chip. 16, 3082-3096 (2016).
  24. Russo Krauss, I., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. An overview of biological macromolecule crystallization. International Journal of Molecular Science. 14, 11643-11691 (2013).
  25. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 70, 2-20 (2014).
  26. Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A droplet-based, composite PDMS/Glass capillary microfluidic system for evaluating protein crystallization conditions by microbatch and vapor-diffusion methods with on-chip X-ray diffraction. Angewandte Chemie. 43, International Edition in English 2508-2511 (2004).
  27. Talreja, S., Kim, D. Y., Mirarefi, A. Y., Zukoski, C. F., Kenis, P. J. A. Screening and optimization of protein crystallization conditions through gradual evaporation using anovel crystallization platform. Journal of Applied Crystallography. 38, 988-995 (2005).
  28. Hansen, C. L., Classen, S., Berger, J. M., Quake, S. R. A microfluidic device for kinetic optimization of protein crystallization and in situ structure determination. Journal of American Chemical Society. 128, 3142-3143 (2006).
  29. Schieferstein, J. M., et al. X-ray Transparent microfluidic platforms for membrane protein crystallization with microseeds. Lab on a Chip. 18, 944-954 (2018).
  30. Ghazal, A., et al. Recent advances in X-ray compatible microfluidics for applications in soft materials and life sciences. Lab on a Chip. 16, 4263-4295 (2016).
  31. Li, L., Ismagilov, R. F. Protein crystallization using microfluidic technologies based on valves, droplets, and SlipChip. Annual Review of Biophysics. 39, 139-158 (2010).
  32. Du, W., Li, L., Nichols, K. P., Ismagilov, R. F. SlipChip. Lab on a Chip. 9, 2286-2292 (2009).
  33. Zhang, S., et al. Microfluidic platform for optimization of crystallization conditions. Journal of Crystal Growth. 472, 18-28 (2017).
  34. Abdallah, B. G., et al. Protein crystallization in an actuated microfluidic nanowell device. Crystal Growth & Design. 16, 2074-2082 (2016).
  35. Monteiro, D. C. F., et al. A microfluidic flow-focusing device for low sample consumption serial synchrotron crystallography experiments in liquid flow. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 406-412 (2019).
  36. de Wijn, R., et al. A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography. IUCrJ. 6, 454-464 (2019).
  37. Shim, J. -U., Cristobal, G., Link, D. R., Thorsen, T., Fraden, S. Using microfluidics to decouple nucleation and growth of protein crystals. Crystal Growth & Design. 7, 2192-2194 (2007).
  38. de Jong, J., Lammertink, R. G. H., Wessling, M. Membranes and microfluidics: a review. Lab on a Chip. 6, 1125-1139 (2006).
  39. Paustian, J. S., Nery Azevedo, R., Lundin, S. T. B., Gilkey, M. J., Squires, T. M. Microfluidic microdialysis: spatiotemporal control over solution microenvironments using integrated hydrogel membrane microwindows. Physical Review X. 3, 041010(2013).
  40. Kornreich, M., Heymann, M., Fraden, S., Beck, R. Cross polarization compatible dialysis chip. Lab on a Chip. 14, 3700-3704 (2014).
  41. Song, S., Singh, A. K., Shepodd, T. J., Kirby, B. J. Microchip dialysis of proteins using in situ photopatterned nanoporous polymer membranes. Analytical Chemistry. 76, 2367-2373 (2004).
  42. Skou, M., Skou, S., Jensen, T. G., Vestergaard, B., Gillilan, R. E. In situ microfluidic dialysis for biological small-angle X-ray scattering. Journal of Applied Crystallography. 47, 1355-1366 (2014).
  43. Zou, L., et al. A multistage dialysis microdevice for extraction of cryoprotectants. Biomedical Microdevices. 19, 30(2017).
  44. Satya Eswari, J., Naik, S. A critical analysis on various technologies and functionalized materials for manufacturing dialysis membranes. Materials Science for Energy Technologies. 3, 116-126 (2020).
  45. Spano, M., Salmon, J. -B., Junius, N. FR3044685A1. UJF. , (2015).
  46. Bartolo, D., Degre, G., Nghe, P., Studer, V. Microfluidic stickers. Lab on a Chip. 8, 274-279 (2008).
  47. Junius, N., et al. A crystallization apparatus for temperature controlled flow-cell dialysis with real-time visualization. Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).
  48. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 125-132 (2010).
  49. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).
  50. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and developments of COOT. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  51. Apostolopoulou, V., Junius, N., Sear, R. P., Budayova-Spano, M. Mixing salts and polyethylene glycol into protein solutions: The effects of diffusion across semipermeable membranes and of convection. Crystal Growth & Design. 20, 3927-3936 (2020).
  52. Liebschner, D., et al. Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: recent developments in Phenix. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 75, 861-877 (2019).
  53. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Annual Review of Materials Science. 28, 153-184 (1998).
  54. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314(2016).
  55. Baxter, E. L., et al. High-density grids for efficient data collection from multiple crystals. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 72, 2-11 (2016).
  56. Feiler, C. G., Wallacher, D., Weiss, M. S. An all-in-one sample holder for macromolecular X-ray crystallography with minimal background scattering. Journal of Visualized Experiments. (149), e59722(2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Krystalizacja bia ekmetoda mikrodializywytwarzanie chip w mikroprzep ywowychregenerowana membrana celulozowakrystalografia seryjnadyfrakcja w temperaturze pokojowejwzrost kryszta w lysozymuanaliza diagramu fazowegowspornik wydrukowany w 3D
Krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.