Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kontrolowane odkształcanie hydrożeli 3D w obrazowaniu mikroskopowym na żywo

3.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61671

⸱

4 grudnia 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 2Department of Materials Science and Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 3School of Mechanical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 4Center for the Physics and Chemistry of Living Systems, Tel-Aviv University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiona metoda polega na jednoosiowym rozciąganiu miękkich hydrożeli 3D osadzonych w gumie silikonowej, umożliwiając jednocześnie mikroskopię konfokalną na żywo. Przedstawiono charakterystykę zewnętrznych i wewnętrznych szczepów hydrożelu, a także wyrównanie włókien. Opracowane urządzenie i protokół mogą oceniać reakcję komórek na różne reżimy szczepów.

Streszczenie

Siły zewnętrzne są ważnym czynnikiem w tworzeniu, rozwoju i utrzymaniu tkanek. Wpływ tych sił jest często badany przy użyciu specjalistycznych metod rozciągania in vitro. Różne dostępne systemy wykorzystują nosze 2D oparte na podłożu, podczas gdy dostępność technik 3D do naprężania miękkich hydrożeli jest bardziej ograniczona. W tym miejscu opisujemy metodę, która umożliwia zewnętrzne rozciąganie miękkich hydrożeli od ich obwodu, przy użyciu elastycznego paska silikonowego jako nośnika próbki. System rozciągania zastosowany w tym protokole jest zbudowany z części wydrukowanych w 3D i taniej elektroniki, dzięki czemu jest prosty i łatwy do odtworzenia w innych laboratoriach. Proces eksperymentalny rozpoczyna się od polimeryzacji grubych (>100 μm) miękkich hydrożeli fibrynowych (moduł sprężystości ~100 Pa) w wycięciu w środku paska silikonowego. Konstrukty silikonowo-żelowe są następnie dołączane do drukowanego urządzenia rozciągającego i umieszczane na stoliku mikroskopu konfokalnego. Pod mikroskopią na żywo aktywowane jest urządzenie do rozciągania, a żele są obrazowane w różnych wielkościach rozciągnięcia. Przetwarzanie obrazu jest następnie wykorzystywane do ilościowego określenia powstałych deformacji żelu, wykazując stosunkowo jednorodne odkształcenia i wyrównanie włókien na całej grubości 3D żelu (oś Z). Do zalet tej metody należy możliwość odcedzania niezwykle miękkich hydrożeli w 3D podczas wykonywania mikroskopii in situ oraz swoboda manipulowania geometrią i wielkością próbki zgodnie z potrzebami użytkownika. Dodatkowo, przy odpowiedniej adaptacji, metoda ta może być stosowana do rozciągania innych rodzajów hydrożeli (np. kolagenu, poliakrylamidu lub glikolu polietylenowego) i może pozwolić na analizę odpowiedzi komórek i tkanek na siły zewnętrzne w bardziej biomimetycznych warunkach 3D.

Wprowadzenie

Reakcja tkanek na siły mechaniczne jest integralną częścią szerokiego zakresu funkcji biologicznych, w tym ekspresji genów1, różnicowania komórek2, oraz przebudowy tkanek3. Co więcej, wywołane siłą zmiany w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), takie jak wyrównanie i zagęszczenie włókien, mogą wpływać na zachowanie komórek i tworzenie tkanek4,5,6. Włóknista struktura siatki ECM ma intrygujące właściwości mechaniczne, takie jak nieliniowa elastyczność, odkształcenia nieafiniczne i odkształcenia plastyczne7,8,9,10,11,12. Właściwości te wpływają na to, jak komórki i otaczające je mikrośrodowisko reagują na zewnętrzne siły mechaniczne13,14. Zrozumienie, w jaki sposób ECM i tkanki reagują na siły mechaniczne, umożliwi postęp w dziedzinie inżynierii tkankowej oraz opracowanie dokładniejszych modeli obliczeniowych i teoretycznych.

Najczęstsze metody mechanicznego rozciągania próbek skupiały się na wypełnionych komórkami substratach 2D, aby zbadać wpływ na zachowanie komórek. Obejmują one na przykład nałożenie odkształcenia na podłoża polidimetylosiloksanu (PDMS) i analizę kątów reorientacji komórek w odniesieniu do kierunku rozciągania15,16,17,18,19. Jednak metody badające reakcję hydrożeli osadzonych w komórkach 3D na rozciąganie zewnętrzne, sytuację, która bardziej naśladuje mikrośrodowisko tkanek, są bardziej ograniczone. Postęp w kierunku metod rozciągania 3D ma szczególne znaczenie, ponieważ komórki zachowują się inaczej na podłożach 2D w porównaniu z matrycami 3D20. Zachowania te obejmują wyrównanie komórek, poziomy ekspresji białek i wzorce migracji21,22,23.

Metody i urządzenia, które pozwalają na rozciąganie próbek 3D, obejmują zarówno dostępne na rynku24,25,26,27,28 oraz te opracowane do badań laboratoryjnych29. Metody te wykorzystują rozciągliwe rurki silikonowe30, komory wielodołkowe31, zaciski26,32, bioreactors11,33, cantilevers34,35,36, oraz magnesy37,38. Niektóre techniki generują rozciągliwość, która lokalnie deformuje hydrożele 3D, na przykład poprzez wyciąganie igieł z dwóch pojedynczych punktów w gel5, podczas gdy inne pozwalają na deformację całej masy żelu16. Co więcej, większość tych systemów koncentruje się na analizie pola odkształcenia w płaszczyźnie X-Y, z ograniczonymi informacjami na temat pola odkształcenia w kierunku Z. Ponadto tylko garstka z tych urządzeń jest zdolna do mikroskopowego obrazowania in situ. Głównym wyzwaniem związanym z obrazowaniem in situ w dużym powiększeniu (np. mikroskopem konfokalnym) jest ograniczona odległość robocza wynosząca kilkaset mikronów od soczewki obiektywu do próbki. Urządzenia, które umożliwiają obrazowanie na żywo podczas rozciągania, poświęcają jednorodność odkształcenia w osi Z lub są stosunkowo złożone i trudne do odtworzenia w innych laboratoriach39,40.

To podejście do rozciągania hydrożeli 3D pozwala na statyczne lub cykliczne jednoosiowe odkształcenia podczas żywej mikroskopii konfokalnej. Urządzenie do rozciągania (określane jako "Smart Cyclic Uniaxial Stretcher – SCyUS") jest zbudowane przy użyciu części drukowanych 3D i taniego sprzętu, co umożliwia łatwą reprodukcję w innych laboratoriach. Do urządzenia dołączona jest dostępna w handlu guma silikonowa z geometrycznym wycięciem pośrodku. Składniki hydrożelowe są polimeryzowane w celu wypełnienia wycięcia. Podczas polimeryzacji hydrożele biologiczne, takie jak fibryna lub kolagen, w naturalny sposób przylegają do wewnętrznych ścianek wycięcia. Za pomocą SCyUS pasek silikonowy jest rozciągany jednoosiowo, przenosząc kontrolowane odkształcenia do osadzonego hydrożelu41.

Ten system pozwala na unikalną kombinację funkcji i zalet w porównaniu z innymi istniejącymi metodami. Po pierwsze, system umożliwia jednoosiowe rozciąganie grubych miękkich hydrożeli 3D (>100 μm grubości, sztywność <1 kPa) od ich obrzeża, z jednorodnym odkształceniem Z w całym hydrożelu. Te hydrożele są zbyt miękkie, aby można je było chwycić i rozciągnąć konwencjonalnymi technikami rozciągania. Po drugie, urządzenie do rozciągania można łatwo powielić w innych laboratoriach, ponieważ druk 3D jest łatwo dostępny dla badaczy, a elektronika użyta w projekcie jest tania. Trzecią, i być może najbardziej atrakcyjną cechą, geometrią i rozmiarem wycięcia w pasku silikonowym można łatwo manipulować, co pozwala na przestrajalne gradienty odkształceń i warunki brzegowe, a także stosowanie różnych objętości próbek, aż do kilku mikrolitrów.

Prezentowany protokół polega na formowaniu żelu fibrynowego w krążki o średnicy ~2 mm w paskach z gumy silikonowej o grubości 0,5 mm, następnie na zasadzie jednoosiowego rozciągania pod mikroskopią konfokalną na żywo. Poniżej szczegółowo omówiono eksperymentalne procedury pomiaru i analizy odkształceń działających na wycięcie geometryczne, wewnętrzne odkształcenia powstałe w hydrożelu, a także wynikające z tego wyrównanie włókien po różnych manipulacjach rozciąganiem. Na koniec omówiono możliwość zatopienia komórek w hydrożelu i wystawienia ich na kontrolowane rozciąganie zewnętrzne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów (należy wykonać z wyprzedzeniem)

  1. Znakowaniey fibrynogenu
    UWAGA: Krok znakowania jest wymagany tylko w przypadku, gdy zamierzona jest analiza deformacji żelu fibrynowego. W eksperymentach komórkowych można zastosować żel nieznakowany.
    1. Do 1,5 mL roztworu fibrynogenu o stężeniu 15 mg/mL w probówce wirówkowej o pojemności 50 mL dodać 38 μL fluorescencyjnego barwnika z estrem succynimidylowym o stężeniu 10 mg/mL (rozpuszczonego w DMSO) (stosunek molowy 5:1) i umieścić na wytrząsarce na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie probówkę umieścić w wirówce na 3 minuty przy 800 x g (temperatura pokojowa).
    2. Nadpływ z poprzedniego kroku przefiltrować przez kolumnę do odsolenia wypełnioną żywicą z żelu dekstranowego (Tabela materiałów), aby oddzielić niezwiązany barwnik,42 zgodnie z poniższymi krokami.
      1. Wstępnie przemyć kolumnę 25 mL buforu do fibrynogenu.
      2. Powoli wstrzyknąć znakowany fibrynogen z kroku 1.1.1 do kolumny, upewniając się, że do filtra nie dostały się pęcherzyki powietrza. Odrzucić pierwsze ~0,3 mL eluaty (4-6 kropli słabo zabarwionego płynu). Następnie zebrać kolejne 1,0-1,5 mL oczyszczonego roztworu (szczegóły znajdują się w protokole producenta).
      3. Zakończyć proces filtracji poprzez sterylizację otrzymanego oczyszczonego roztworu za pomocą filtra strzykawkowego (0,22-0,45 μm).
      4. W celu oczyszczenia i ponownego wykorzystania kolumny, przemyć ją 20 mL buforu do fibrynogenu, a następnie przechowywać w 25 mL 20% etanolu.
  2. Po elucji podzielić otrzymany oczyszczony znakowany fibrynogen na małe alikwoty o objętości ~7-50 μL, w zależności od pożądanej liczby rozciągniętych żeli. Dla każdego rozciągniętego żelu o średnicy koła 2 mm przygotować około 3,5 μL fibrynogenu (2,5 μL zostanie zużyte na żel + 1 μL na błędy pipetowania).
    1. Alikwoty przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C. Można ich używać do około jednego roku (nie zaleca się ponownego rozmrażania i mrożenia).
    2. W pozostałej części niniejszego protokołu przechowywać około 7 μL oczyszczonego znakowanego fibrynogenu w lodówce (4 °C) aż do kroku 4. Objętość ta jest przeznaczona do utworzenia dwóch rozciągniętych żeli (na żel potrzeba 2,5 μL, a dodatkowa objętość 1 μL służy do zniwelowania błędów podczas przygotowywania próbek).
      UWAGA: Ta procedura filtrowania zazwyczaj rozcieńcza początkowy roztwór fibrynogenu o stężeniu 15 mg/mL do końcowego stężenia około 10 mg/mL. Stopień rozcieńczenia zależy od początkowej objętości i stężenia fibrynogenu, zgodnie z protokołem producenta.
  3. Przygotować 7 μL roztworu trombiny (rozcieńczyć buforem do trombiny do stężenia 2 jednostek/mL, Tabela materiałów) i przechowywać w lodówce (4 °C) aż do kroku 4. Objętość ta jest przeznaczona do wypełnienia wycięć w dwóch rozciągniętych żelach.
    UWAGA: W celu przeprowadzenia analizy odkształceń wewnętrznych do roztworu trombiny należy dodać fluorescencyjne kulki o średnicy 1 µm (zakupione jako zawiesina [2% ciał stałych] w wodzie z dodatkiem 2 mM NaN3) (dla obiektywu 40x zaleca się stosunek objętościowy kulek do trombiny 1:25 v/v %). Kulki należy dodawać tylko wtedy, gdy wymagane są pomiary odkształceń wewnętrznych, niezależnie od obecności komórek.

2. Przygotowanie pasków silikonowych

  1. Pobrać gumę silikonową o grubości 0,5 mm i wyciąć z niej paski o wymiarach 15 x 80 mm2 z otworem o średnicy 2 mm w centrum paska (Rycina 1). Jeśli to możliwe, należy użyć programowalnej wycinarki laserowej dla uzyskania wysokiej precyzji. W przypadku braku programowalnych maszyn, do wycięcia obrysu paska wystarczy użyć nożyczek, a do wykonania otworu centralnego małego dziurkacza.
    UWAGA: Komercyjna guma silikonowa jest zazwyczaj sprzedawana z folią plastikową po obu stronach. Jeśli to możliwe, należy pozostawić oryginalną folię ochronną po obu stronach silikonu. W przypadku ponownego wykorzystania pasków silikonowych z poprzedniego eksperymentu, należy poddać je działaniu trypsyny przez 0,5 h, moczyć w 0,2 M NaOH przez 0,5 h, a następnie moczyć w 70% etanolu przez 1 h. Przed użyciem pozwolić im wyschnąć.
  2. Przygotować warstwy folii uszczelniającej (hydrofobowej) o wymiarach co najmniej 20 × 30 mm2, tak aby były szersze od paska silikonowego, co umożliwi utworzenie uszczelnienia wokół całego wyciętego otworu.
  3. Umyć szalkę o średnicy 10 cm 70% etanolem, a następnie przetrzeć i osuszyć niepozostawiającymi włókien ściereczkami do precyzyjnych prac (zarówno w przypadku eksperymentów sterylnych, jak i nisterylnych). Krok ten jest istotny, ponieważ pozwala warstwom folii uszczelniającej lepiej przylegać do płytki i ogranicza przemieszczanie się próbki podczas procesu przygotowania.
  4. Umieścić warstwy folii uszczelniającej w umytej szalce 10 cm w taki sposób, aby było wystarczająco dużo miejsca na umieszczenie dwóch pasków obok siebie w każdej szalce (Rycina 2A).
    1. Zdjąć folię plastikową z jednej strony paska silikonowego i położyć odsłoniętą stronę na warstwie folii uszczelniającej w taki sposób, aby wycięcie było całkowicie otoczone przez folię uszczelniającą (Rycina 2B). Następnie, używając czystych palców w rękawiczkach, delikatnie docisnąć silikon do warstwy folii uszczelniającej, aby uszczelnić obszar wokół wycięcia.
      UWAGA: Należy upewnić się, że między silikonem a folią uszczelniającą nie pozostały pęcherzyki powietrza, zwłaszcza wokół wycięcia. Można to sprawdzić, oglądając dno szalki (Rycina 2C).

Układ do badania deformacji żelu; schemat rozkładu naprężeń pokazujący próbkę elastomeru.
Rycina 1: Metoda rozciągania hydrożelu. (A) Pasek silikonowy o wymiarach 15 × 80 mm2 z wycięciem o średnicy 2 mm w centrum paska (B) Pasek silikonowy z okrągłym wycięciem, w którym osadzono żel fibrynowy. W celach ilustracyjnych wycięcie w silikonie jest większe niż w rzeczywistych eksperymentach (C) Schemat metody rozciągania z paskiem silikonowym (pomarańczowy), okrągłym żelem (wycięcie w środku) oraz tkaninowymi przedłużaczami (zielone), które łączą silikon z urządzeniem rozciągającym. Powiększony obszar żelu wskazuje deformację żelu w odpowiedzi na jednoczesne rozciąganie silikonu wzdłuż jednej osi. Dla uproszczenia na ilustracji nie pokazano kompresji wzdłuż grubości żelu (oś Z). Ryciny 1B i 1C zostały opracowane na podstawie pracy Roitblat Riba i wsp.41 Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Eksperyment równowagi statycznej; układ w szalce Petri z zaklejonymi powierzchniami pokazujący tworzenie się pęcherzyków powietrza.
Rycina 2: Przykład prawidłowego umieszczenia paska silikonowego na warstwie folii uszczelniającej przed polimeryzacją żelu. (A) Umieszczenie dwóch warstw folii uszczelniającej w szalce 10 cm (B) Umieszczenie pasków silikonowych na warstwach folii uszczelniającej (C) Widok szalki od dołu, pokazujący uszczelnienie powietrzne między silikonem a warstwą folii uszczelniającej. Lewo: Prawidłowe uszczelnienie warstwy folii uszczelniającej do paska silikonowego wokół wycięcia, bez pęcherzyków powietrza. Prawo: Nieprawidłowe uszczelnienie warstwy folii uszczelniającej do wycięcia w pasku silikonowym z pęcherzykami powietrza wokół krawędzi wycięcia. Doprowadzi to do wycieku składników hydrożelu pod silikon. Czerwona strzałka wskazuje obszar, w którym utworzył się pęcherzyk powietrza. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

3. Przygotowanie trombiny z komórkami

UWAGA: Wykonaj ten krok tylko w przypadku, gdy pożądane jest zatopienie komórek w hydrożelu, oraz w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza (Tabela materiałów).

  1. Sterylizacja: w dniu poprzedzającym eksperyment komórkowy należy umieścić paski silikonowe i warstwy folii uszczelniającej w 70% etanolu na noc, a następnie przeprowadzić sterylizację UV przez 30 minut z każdej strony (jeśli szalki 10 cm nie są sterylne, należy je również wysterylizować w świetle UV przez 30 minut po przemyciu 70% etanolem). W protokole wykorzystano system UV wbudowany w dygestorium biologiczne.
    UWAGA: Alternatywnie można przeprowadzić cykl sterylizacji w autoklawie (140 °C) dla pasków silikonowych, ponieważ są one odporne do 260 °C.
  2. Należy przeprowadzić zliczenie komórek w celu określenia ich stężenia, a następnie odwirować i resuspender osad komórkowy w 7 μL trombiny (2 jednostki/mL) w probówce wirówkowej 1,5 mL. Zalecane stężenie komórek to 800 komórek/μL trombiny. Komórki należy przechowywać w warunkach chłodniczych do momentu użycia (nie dłużej niż pół godziny, aby uniknąć uszkodzenia komórek).

4. Polimeryzacja żeli fibrynowych

  1. Pobrać trombinę o stężeniu 2 U/ml & roztwory znakowanego fibrynogenu o stężeniu 10 mg/mL z lodówki (przygotowane w kroku 1) i umieścić je w lodzie w łatwo dostępnym miejscu.
    UWAGA: Przed procesem mieszania roztwory są przechowywane w niskiej temperaturze, aby spowolnić kinetykę reakcji polimeryzacji. Pozwala to na uzyskanie bardziej homogenicznego zmieszania białek.
  2. Po przygotowaniu naczynia/naczyń (krok 2), należy wyekstrahować 2.5 μL oznakowanego fibrynogenu i pipetuj go równomiernie do silikonowego wycięcia (z przymocowaną do jego dolnej strony warstwą folii uszczelniającej) w taki sposób, aby cały obwód wycięcia miał kontakt z fibrynogenem. Należy uważać, aby w roztworze nie powstały pęcherzyki powietrza, zwracając szczególną uwagę na dolne krawędzie wycięcia (styk między warstwą folii uszczelniającej a silikonem).
  3. Natychmiast pobrać 2.5 μL trombiny (z komórkami/kulkami lub bez nich) i pipetować ją bezpośrednio do roztworu fibrynogenu w wycięciu (osiągając objętość końcową wynoszącą 5 μL (fibryny). Następnie szybko wymieszaj oba roztwory, ostrożnie pipetując w górę i w dół około 10 razy. Podczas mieszania poruszaj końcówką w całej objętości, aby uzyskać jak najbardziej jednorodny roztwór.
  4. Dodaj bardzo niewielką ilość soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) [alternatywnie pożywki komórkowej w przypadku eksperymentów z komórkami, Tabela materiałów] wzdłuż krawędzi każdej szalki, aby hydrożel nie wyschł podczas procesu polimeryzacji. Należy upewnić się, że PBS/pożywka komórkowa nie ma kontaktu z próbkami, ponieważ spowodowałoby to ich uszkodzenie.
  5. Przykryć naczynia i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    UWAGA: Wymagany czas inkubacji zależy od objętości żelu. W przypadku zastosowania większych objętości czas inkubacji powinien zostać wydłużony.
  6. Wyjmij szalkę(szalki) z inkubatora i dodaj do niej PBS/pożywkę komórkową, tak aby całkowicie zanurzyć konstrukt żelowo-silikonowy.
  7. Ostrożnie wyjmij z naczynia konstrukcje próbek po jednej, upewniając się, że warstwa folii uszczelniającej pozostaje przyległa do paska. Powoli odseparuj warstwę folii uszczelniającej od silikonu, delikatnie odrywając ją od jednego końca silikonu do drugiego (Rycina 3). Należy unikać pobierania materiału z obszarów bliskich wycięcia, w których mogą występować koncentracje naprężeń (jest to szczególnie istotne w przypadku geometrii niekołowych). Należy unikać jakiegokolwiek kontaktu z wycięciem, ponieważ spowoduje to uszkodzenie próbki.
  8. Umieść pasek z powrotem w naczyniu z PBS/medium hodowlanym w taki sposób, aby pasek unosił się w naczyniu. Następnie przenieś naczynie (naczynia) pod standardowy mikroskop do hodowli komórkowych, aby jakościowo ocenić stan każdej próbki. Żele muszą być jednorodne, ciągłe w obrębie wycięcia i nie mogą zawierać pęcherzyków powietrza. Używając Rysunek 4 wybierz najlepsze próbki do dalszej analizy, traktując to jako wskazówkę.

Układ równowagi statycznej z wykorzystaniem czerwonego paska i plastiku z oznaczeniami, demonstrujący koncepcję fizyczną.
Rycina 3: Prawidłowe usuwanie warstwy folii uszczelniającej z dołu paska silikonowego. Proces usuwania należy przeprowadzać powoli, aby hydrożel nie uległ rozerwaniu i nie stracił przyczepności do wewnętrznych ścianek wycięcia. Biała strzałka wskazuje kierunek usuwania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy mikroskopowe struktury agregatów żelu silikonowego, pęcherzyków, rozdarć; analiza materiału.
Rysunek 4: Obserwacja mikroskopowa żeli fibrynowych w wycięciu silikonowym.(A) Dwa przykłady prawidłowo spolimeryzowanego żelu fibrynowego. Zwróć uwagę na względną homogeniczność żelu i pełną adhezję do krawędzi wycięcia (B) Dwa przykłady nieudanej polimeryzacji próbki. Góra: Zwróć uwagę na liczne pęcherzyki i agregaty powstałe w lewym dolnym rogu. Dół: Zwróć uwagę na oddzielanie się żelu od krawędzi wycięcia oraz agregaty w lewym dolnym obszarze wycięcia. Pasek skali = 300 μm Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Nakładanie próbek na urządzenie SCyUS

  1. Napełnić kąpiel buforem PBS/pożywką do hodowli komórek (Rycina 5) i umieść silikonowy pasek z żelem z próbką na górze w taki sposób, aby jego końce spoczywały po obu stronach kąpieli. Kąpiel ma zapobiegać wysychaniu żelu. Umieść i zaciśnij zaciski (fioletowe) wraz z paskami materiału (zielone) tak, aby wszystkie elementy były połączone w jeden prosty pasek z wycięciem w centrum (Rysunek 5).
  2. Wyjmij urządzenie SCyUS i przymocuj aluminiową komorę do cieczy oraz prostokątną szkiełko nakrywkowe 22 mm x 40 mm (nr 1 lub 1,5) (Rysunek 6Aiii). Przymocuj szkiełko nakrywkowe do dna dołka za pomocą materiału uszczelniającego (np. smaru próżniowego) w taki sposób, aby dołek można było napełnić cieczą bez wycieków.
    1. Napełnij dołek około 1-2 ml PBS/pożywki komórkowej i umieść konstrukt składający się z paska, tkaniny i żelu (Rysunek 6B) do urządzenia. Zaciśnij pasek tkaniny (2) do nawiasu (1) tak, aby wycięty fragment żelu (5) znajduje się w centrum, zgodnie z rysunkiem, następnie ostrożnie umieść wkładkę z pinem (4) do urządzenia i zablokuj je na miejscu.
    2. Następnie wsuń drugą stronę tkaniny na wrzeciono (bez podłączania serwosilnika) i zablokuj ją we wrzecionie (Rycina 6C).
  3. Wsuń urządzenie SCyUS z dołączoną próbką na stolik mikroskopu (Rysunek 6C). Podłącz mikrokontroler (Tabela materiałówdo komputera za pomocą kabla USB, a serwomotor podłącz do mikrokontrolera. Otwórz moduł sterujący SCyUS na komputerze. Próbka jest teraz gotowa do obrazowania w celu sprawdzenia odpowiedniej grubości żelu oraz jednorodności włókien pod mikroskopem konfokalnym.

Schemat równowagi statycznej, układ kąpieli PBS ilustrujący przepływ cieczy do analizy biochemicznej.
Rycina 5: (A) Przyrząd zawierający kąpiel PBS (wydruk 3D) (B) Umieszczenie paska w przyrządzie w celu zapewnienia prawidłowego liniowego przymocowania wsporników (na fioletowo) i zapobiegania wysychaniu żelu. Rycina została zmodyfikowana za zgodą Roitblat Riba i wsp.41 Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat konfiguracji urządzenia mikrofluidycznego i eksperymentu do analizy optycznej z wrzecionem serwo.
Rysunek 6: Urządzenie do rozciągania SCyUS.(A) Różne widoki modelu CAD głównych części SCyUS: wrzeciono połączone z serwo (niebieskie), kotwica statyczna (czerwona), wkładka dociskająca pasek silikonowy (fioletowa) oraz stabilizatory zapobiegające unoszeniu się wkładki (żółto-zielone). Widok systemu z góry (Ai), widok systemu w przekroju (Aii) pokazujący przebieg paska (pomarańczowa linia) oraz widok z dołu (Aiii) aluminiowej studni z pokrywką szklaną. Studnię można przesuwać w górę i w dół za pomocą śruby wkręconej w główny gwint. Ruch w górę aluminiowej studni jest ograniczony przez boczne skrzydła fioletowej wkładki, co wskazują białe strzałki (B). Rzeczywisty system: (1) kotwica statyczna (2) zielona tkanina nierozciągliwa (3) śruba do kontroli wysokości aluminiowej studni (4) czerwona wkładka dociskowa (5) pasek silikonowy z okrągłym wycięciem (6) niebieskie zaciski łączące (C) System rozciągania umieszczony na mikroskopie konfokalnym. Serwomotor i wrzeciono wskazano strzałkami. Rysunek zmodyfikowany za zgodą Roitblat Riba et al.41 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

6. Zapewnienie odpowiedniej ilości żelu do pobierania próbek

  1. Za pomocą mikroskopu konfokalnego (Tabela materiałów) wykonaj obraz kafelkowy całego żelu w niskim powiększeniu (10×) i niskiej rozdzielczości (rozmiar piksela ~1,4 μm x 1,4 μm) w formie stosu Z (wystarczające jest ≤10 przekrojów Z z krokiem ok. 10 μm), używając laserów 488/543/561, aby zbadać jednorodność oraz przyczepność do obwodu geometrycznego wycięcia w całej grubości silikonu (Rycina 7A-B). Wykorzystaj ten obraz stosu Z jako mapę dla kolejnych kroków.
  2. W ramach obrazowania na żywo w niskiej rozdzielczości przeskanuj żel i wyznacz najniższą pozycję Z, przy której widoczna jest pełna przyczepność do wewnętrznych ścianek wycięcia, bez rozdarć i pęcherzyków powietrza; zanotuj położenie Z mikroskopu (Zl). Aby ocenić pełną przyczepność żelu do silikonu wzdłuż całego jego obwodu, przeskanuj pod mikroskopem granicę między fluorescencyjną etykietą żelu a paskiem silikonu (ciemne tło) (Rycina 7C).
  3. Przesuwaj się w górę w kierunku Z, aż do momentu utraty ciągłości żelu, a następnie zanotuj pozycję Z (Zu):
  4. Odejmij górną granicę (Zu) w kierunku Z od granicy dolnej (Zl). Jest to referencyjna grubość próbki (Zo):
    Równanie równowagi statycznej, Z_o=Z_u-Z_l, reprezentacja wzoru.
    Jeśli Zo ≥ 100 μm, żel uznaje się za odpowiedni do analizy. Należy pamiętać, że grubość wycięcia w silikonie wynosi około 500 μm, jednak polimeryzacja żelu w wycięciu zazwyczaj skutkuje mniejszą grubością żelu. 100 μm to minimalna zalecana grubość, aby zapewnić stabilny proces rozciągania, bez rozdarć lub odrywania się żelu od wycięcia w silikonie.
    UWAGA: Grubość żelu może się różnić w zależności od lokalizacji XY. Ta część protokołu mierzy minimalną grubość żelu, co pozwala określić jego jakość i stwierdzić, czy jest on wystarczający do rozciągania. Dodatkowo wyznaczenie środka żelu zapewnia punkt odniesienia do powrotu po rozciąganiu, zarówno statycznym, jak i dynamicznym.

Schemat rozwoju komórek embrionalnych, obrazy mikroskopowe pokazujące wzorce rozmieszczenia komórkowego.
Rysunek 7: Homogeniczność żelu. Obrazy z kafelków zostały zarejestrowane i zestawione za pomocą oprogramowania do mikroskopu konfokalnego (Tabela materiałów) (A) Pojedynczy zestawiony obraz z kafelków z przekrojem Z próbki żelu fibrynowego o stosunkowo niejednorodnej gęstości włókien z powodu nieprawidłowego zmieszania trombiny i fibrynogenu przed polimeryzacją. Taki żel nie zapewni wiarygodnej analizy (B) Pojedynczy zestawiony obraz z kafelków z przekrojem Z próbki żelu fibrynowego o stosunkowo jednorodnej gęstości włókien. Jest to żel dopuszczalny do eksperymentów z rozciąganiem. Pasek skali dla obrazów A i B wynosi 200 μm (C) Powiększenie interfejsu między fluorescencyjnie znakowanym żelem (czerwony) a silikonem (czarne tło). Pasek skali = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

7. Obsługa, rozciąganie i obrazowanie w systemie SCyUS

  1. Po potwierdzeniu, że próbka jest odpowiedniej jakości i została prawidłowo umieszczona w urządzeniu SCyUS, należy wyznaczyć pozycję wstępnego rozciągnięcia próbki. Osiąga się to poprzez zastosowanie na żywo obrazowanie pod mikroskopem konfokalnym (analogicznie do kroku 6.2).
    1. Upewnij się, że serwosilnik znajduje się w pozycji zerowej, klikając Przejdź do pozycji zerowej serwomechanizmu przycisk (Kliknij w Rycina 8A i upewnić się, że Rycina 8B wyświetla zero) i przymocuj go do urządzenia rozciągającego, jak pokazano w Rycina 6C.
      UWAGA: Ten etap należy przeprowadzić powoli i ostrożnie, aby nie wywierać nadmiernego napięcia na próbkę.
    2. Podczas obrazowania próbki przesuń silnik o jeden stopień (Rycina 8C) naraz w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara, klikając w +1 przycisk, aż zauważy się ruch prawej krawędzi wycięcia. Następnie należy odwrócić kierunek ruchu (Rysunek 8D) powrót do pozycji przedostatniego kroku poprzez kliknięcie w -1 przycisk. Pozwala to zweryfikować, że próbka znajduje się pod minimalnym napięciem. Kliknij Ustawienie minimalnej pozycji serwa przycisk (Rycina 8E) w celu ustawienia pozycji referencyjnej. Do pozycji referencyjnej można powrócić w dowolnym momencie, klikając przycisk Przejdź do minimalnej pozycji serwomechanizmu przycisk (Rycina 8F).
      UWAGA: W celu zminimalizowania błędu w tym kroku zaleca się stosowanie obiektywu o dużym powiększeniu (≥40×).
    3. Wykonaj zdjęcie przy dużym powiększeniu (40×) i wysokiej rozdzielczości (~0.2 μm × 0.2 μm rozmiar piksela), pojedynczy obraz kafelkowy w jednym przekroju Z całej powierzchni żelu. Będzie on służył jako obraz referencyjny do analizy w procesie postprocesingu. Zaleca się wykonanie pojedynczego Z-wyciąć obraz w połowie grubości żelu (używając Zo z Równ. 1), co pozwoli na powrót do w przybliżeniu tej samej Z-pozycję po rozciągnięciu. Należy również wziąć pod uwagę, że obrazowanie całego obszaru żelu w formie kafelków o wysokiej rozdzielczości zajmuje znaczną ilość czasu (~20-30 min).
    4. Próbka jest teraz gotowa do statycznego rozciągania. Dostroić serwomotor do pożądanej wartości rozciągnięcia, przesuwając go o jeden stopień (Rysunek 8C) naraz w interfejsie graficznym użytkownika (wykonywać czynność powoli, z prędkością około 1 stopnia na sekundę).
  2. Dla każdej wartości rozciągnięcia, dla której wymagana jest analiza, należy wykonać pojedynczy obraz kafelkowy o wysokiej rozdzielczości w jednym przekroju Z (Z-slice) całego obszaru żelu do późniejszej analizy. Podobnie jak w kroku 6.2, należy zweryfikować, czy żel nie oddzielił się od silikonu na całej obwodzie, skanując powierzchnię styku żelu (kolor czerwony) i silikonu (ciemne tło) w poszukiwaniu zmian w adhezji względem poprzedniej wartości rozciągnięcia.
    UWAGA: Podczas aktywacji silnika należy użyć na żywo obrazowanie w celu śledzenia położenia żelu w X-Y (przy ustawieniach niskiej rozdzielczości i niskiego powiększenia). Żel ulega Z-efekt Poissona, w wyniku którego dno żelu unosi się, w związku z czym Z-pozycję mikroskopu należy również dostosować do przybliżonego środka grubości żelu dla każdego stopnia rozciągnięcia. Można to osiągnąć poprzez ponowne obliczenie Zo (Równ. 1) dla każdej wartości rozciągnięcia. Ponieważ rozciągnięcie w Z-Kierunek jest stosunkowo jednorodny, zatem znalezienie dokładnej głębokości środka żelu nie jest krytyczne.

Interfejs sterowania serwomotorem z regulacją pozycji, opcjami cyklu i funkcjonalnością resetowania.
Rycina 8: GUI modułu sterującego SCyUS. (A) Pozycja silnika w stopniach. Wartość mieści się w zakresie od -90° do 90° (B) „Set Minimum Servo Position” (Ustaw minimalną pozycję serwa). Przycisk ten umożliwia wstępne ustawienie minimalnej pozycji w celu wyznaczenia nowej pozycji referencyjnej, innej niż Zero Servo Position (C) Przycisk „Plus 1°” przesuwa serwomotor o jeden stopień zgodnie z ruchem wskazówek zegara (D) Przycisk „Minus 1°” przesuwa serwomotor o jeden stopień przeciwnie do ruchu wskazówek zegara (E) Przycisk „Go to zero position” (Przejdź do pozycji zerowej) ustawia pozycję serwomotoru na 0° (wartość [A] zostanie ustawiona na zero) (F) Przycisk „Go to minimum servo position” (Przejdź do minimalnej pozycji serwa) przesuwa serwomotor do zdefiniowanej przez użytkownika pozycji „Min”. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

8. Przetwarzanie pomiarów odkształcenia zewnętrznego

  1. Aby zmierzyć efektywne odkształcenia krawędzi wycięcia, należy zmierzyć długości od krawędzi do krawędzi w kierunku rozciągania (oś X) w centrum osi Y (Rycina 9A).
    1. Wgraj obraz przed rozciągnięciem do oprogramowania do przetwarzania obrazów (ImageJ FIJI43) i zmierz największą odległość od krawędzi do krawędzi, definiowaną jako długość osiowa otworu (Diagram statycznej równowagi, ΣFx=0, bilans sił, zasób edukacyjny dla koncepcji fizycznych.) w centrum.
    2. Zdefiniuj największą odległość od góry do dołu jako odległość prostopadłą (Równanie statycznej równowagi ΣFx=0 na diagramie; demonstruje równowagę, analizę sił, rozkład wektorów.).
    3. Powtórz ten proces dla wszystkich obrazów z przedziałów rozciągania i oblicz odległości osiowe (Chromatografia; równanie: Rt=Vm+KVs; diagram; system chromatografii gazowej; rozdzielanie chemiczne.) oraz prostopadłe (Diagram statycznej równowagi, ΣFx=0, ilustrujący bilans sił za pomocą wektorów i analizę równowagi.) obwodu wycięcia (Rycina 9A, dół), a następnie wykonaj następujące obliczenia, aby wyznaczyć odkształcenia krawędzi wycięcia:

Równanie odkształcenia εxx dla analizy równowagi statycznej; wzór do analizy deformacji.

Wzór na obliczanie odkształcenia, εyy(hole)=(d-do)/do, stosowany w analizie deformacji materiału.

Schemat analizy odkształceń z deformacją, obrazami mikroskopowymi i wykresem naprężenie-odkształcenie dla badania materiału.
Rysunek 9: Odkształcenia żelu wynikające z zewnętrznego rozciągania paska silikonowego.(A) Przekrój X-Y nierozciągniętego żelu fibrynowego (góra) oraz po zastosowaniu odkształcenia εhole = 64% w kierunku x (dół). Żel zawiera zatopione fluorescencyjne kuleczki. Odpowiednie długości d i l wykorzystane do obliczenia εhole są zaznaczone na obrazach (B) Powiększone obrazy obszaru zaznaczonego przerywanym kwadratem w części A (C) Ilustracja typów odkształceń rozważanych w niniejszym badaniu: εhole to odkształcenie osiowe wycięcia w jego maksymalnej średnicy, a εgel to odkształcenie osiowe w centrum żelu (mierzone na podstawie lokalizacji agregatów kuleczek) (D) Wykazano liniową zależność między εhole a εgel zarówno w kierunku xx (linia czerwona), jak i w kierunku yy (linia zielona). Rysunek został zaadaptowany za zgodą Roitblat Riba i wsp.41 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

9. Analiza orientacji włókien

  1. Wykorzystaj kwantyfikację wyrównania włókien do charakterystyki odpowiedzi strukturalnej żelu włóknistego na zwiększającą się amplitudę rozciągania. Prześlij obrazy o wysokiej rozdzielczości do oprogramowania ImageJ FIJI (NIH)43, a następnie przeanalizuj je za pomocą modułu OrientationJ (EPFL)44 (Ustawienia: gradient Gaussa i okno 3-pikselowe, Rycina 10).
    1. Oblicz dwuwymiarowy parametr uporządkowania nematycznego (NOP) na podstawie histogramu orientacji według wzoru:45
      Równanie NOP, 2(cosθ)²-1=0, symbol, stosowany w obliczeniach optycznych do analizy kątów padania.
      UWAGA: Wartość NOP = 1 wskazuje na idealne wyrównanie wzdłuż kierunku osiowego (kąt zero), a NOP = 0 wskazuje na izotropię. Kąt orientacji, θ, to kąt włókna w odniesieniu do osi odkształcenia (oś x) uzyskany poprzez analizę obrazu i precyzyjnie zdefiniowany w dokumentacji OrientationJ.44

Interfejs ImageJ do analizy orientacji; gradient gaussowski; okno ustawień wtyczki.
Rysunek 10: Analiza orientacji włókien przy użyciu oprogramowania FIJI ImageJ. (A) Menu główne ImageJ ze strzałką wskazującą położenie menu rozwijanego „Plugins”, w którym znajduje się „OrientationJ”. W rozszerzonym menu „OrientationJ” kliknij opcję „OrientationJ Distribution” (B) moduł Distribution programu OrientationJ. Ustaw „Local window σ” na 3 pixels oraz „Gradient” na „Gaussian”. Następnie naciśnij przycisk „Run” (czerwona strzałka). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

10. Ręczna analiza naprężenia wewnętrznego żelu

  1. Podczas obrazowania hydrożelu z zatopionymi kuleczkami przy dużym powiększeniu na żywo, ręcznie zlokalizuj obszar zainteresowania (ROI) z łatwo rozpoznawalnymi cechami (np. agregatami kuleczek), aby móc powrócić do tego samego miejsca po każdym stopniu rozciągnięcia.
    UWAGA: Kompresja w kierunku Z (efekt Poissona) może prowadzić do wzrostu gęstości kuleczek wraz ze wzrostem rozciągnięcia, dlatego sugerujemy wybór agregatów kuleczek na tyle dużych, aby były one wyraźnie identyfikowalne. Niniejszy protokół zakłada analizę centralnego obszaru żelu fibrynowego, choć można wybrać dowolny region.
  2. W pozycji przed rozciągnięciem (krok 6) wykonaj wysokorozdzielczy obraz w formie stosu Z-stack dla wybranego ROI. Po każdym pożądanym interwale rozciągnięcia powróć do tego samego ROI i powtórz proces przechwytywania obrazu.
  3. Pobierz obrazy i zaimportuj je do programu ImageJ. W ROI zapisz współrzędne pikselowe X-Y każdego widocznego agregatu kuleczek. Przenieś zapisane dane do arkusza kalkulacyjnego.
  4. Zmierz odległości między każdą parą agregatów i porównaj je z odległościami tych samych par na obrazie referencyjnym, co pozwoli na obliczenie odkształceń w kierunkach X i Y.
    UWAGA: Jeśli podczas rozciągania żelu rejestrowany jest ciągły film w czasie rzeczywistym (zamiast statycznego przechwytywania obrazów), automatyczną analizę odkształceń można przeprowadzić za pomocą metod cyfrowej korelacji obrazów lub wolumenów (DIC/DVC), jak wykazano wcześniej46,47. Należy jednak zauważyć, że automatyczna analiza DIC/DVC w tych warunkach jest trudna, ponieważ stos Z-stack przemieszcza się nie tylko w płaszczyźnie X-Y, ale także w kierunku Z z powodu efektu Poissona (kompresji), co powoduje znaczne dryfty podczas rejestrowanego filmu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne dane z rozciągania statycznego o rosnącej magnitudzie, zastosowanego do silikonowego paska z osadzonym 3D hydrożelem fibrynowym zawierającym fluorescencyjne kuleczki o średnicy 1 μm, przedstawiono na Rysunku 9. Analiza wykazuje wpływ rozciągania silikonu na zmiany geometryczne wyciętego otworu, a także na naprężenia powstałe wewnątrz żelu. Obrazy z serii Z-stack całego żelu służą do oceny deformacji pierwotnego kolistego wycięcia w geometrię eliptyczną (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda i protokół są w dużej mierze oparte na naszym poprzednim badaniu przeprowadzonym przez Roitblat Riba i wsp.41 Dołączamy tutaj pełne kody projektowania wspomaganego komputerowo (CAD), Pythona i mikrokontrolera urządzenia SCyUS .

Do głównych zalet prezentowanej metody w porównaniu z istniejącymi metodami należy możliwość odcedzania bardzo miękkich hydrożeli 3D (moduł sprężystości ~100 Pa) z ich obwodu oraz pod obrazowaniem konfokalnym <...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Niektóre rysunki tutaj zamieszczone zostały zaadaptowane za zgodą Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Odcedzenie hydrożeli 3D z jednolitymi odkształceniami w osi Z przy jednoczesnym umożliwieniu obrazowania mikroskopowego na żywo, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor 546 kwas karboksylowy, ester sukcynimidylowyInvitrogenA20002
Pożywka komórkowa (DMEM o wysokiej glukozie)Biological Industries01-052-1ADodaj 10% FBS, 1% PNS, 1% L-glutaminy, 1% pirogronianu sodu
Szkiełko nakrywkowe #1.5Bar-Naor Ltd.BN72204-3022 razy; 40 mm
DIMETHYL SULPHOXIDE 99,5% GC DMSOSigma-Aldrich Inc.D-5879-500 ML
Dulbecco's Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiPrzemysł biologiczny02-023-1A
EVICEL Fibrynowy uszczelniacz (ludzki)Omrix Biopharmaceuticals3902Fibrynogen: 70 mg / ml, Trombina: 800-1200 IU / mL
Bufor fibrynogenuNie dotyczyPrzepis na 1L: 7g NaCl, 2,94g dwuwodnego cytrynianu trisodowego, 9g glicyny, 20g chlorowodorku argininy i 0,15 g dwuwodnego chlorku wapnia. Doprowadź końcową objętość do 1L za pomocą PuW (pH 7,0-7,2)
Mikrokulki fluorescencyjne FluoSpheres (1 µ m)InvitrogenF8820Orange (540/560)
Dostarczany w postaci zawiesiny (2% ciał stałych) w wodzie plus 2 mM azydek sodu
Wysokotemperaturowy kauczuk silikonowyMcMaster-Carr3788T41580 µ m-gruby
E = 1,5 MPa
Współczynnik Poissona = 0,48
Wytrzymałość na rozciąganie = 4,8 MPa
Górna granica rozciągliwości = + 300% odprężenia inżynieryjnego
Kolumna odsalająca HiTrap 5 mL (Sephadex G-25 zapakowany)GE Healthcare17-1408-01
HIVAC-G Wysokopróżniowa masa uszczelniającaShin-Etsu Chemical Co., Ltd.Oprogramowanie HIVAC-G 100
ImageJ FIJI39National Institute of Health, Bethesda, MDWersja 1.8.0_112
Mikrokontroler (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3)Arduino/AdafruitArduino-DK001/Adafruit-1438
Wirówka MicroVL 21RThermo Scientific 75002470
ParafilmBemisPM-996
Mikroskop świetlny PrimovertCarl Zeiss Suzhou Co., Ltd.491206-0011-000
SCyUS CAD (Solidworks)Dassault Systè mesN/A
SCyUS Code37N/AN/A
Serwomotor - TowerPro SG-5010Adafruit155
SL 16R WirówkaThermo Scientific75004030Do probówek 50 mL
Sterylne płytki niehodowlane 10 cmCorning430167
Bufor trombinowyNie dotyczyPrzepis na 1 l: 20 g mannitolu, 8,77 g NaCl, 2,72 g trójwodnego octanu sodu, 24 ml 25% albuminy ludzkiej surowicy, 5,88 g chlorku wapnia. Doprowadź końcową objętość do 1 l za pomocą PuW (pH 7,0)
Trypsyna EDTA roztwór B (0,25%), EDTA (0,05%)Przemysł biologiczny03-052-1B
USB (typ B męski na typ A męski)N/AN/A
Mikroskop konfokalny Zeiss LSM 880Carl Zeiss AG2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3 ()Carl Zeiss AGRelease Version 14.0.0.0

Bibliografia

  1. Bleuel, J., Zaucke, V., Bruggemann, G. P., Niehoff, A. Effects of cyclic tensile strain on chondrocyte metabolism: a systematic review. PLoS ONE. 10, 0119816(2015).
  2. Pennisi, C. P., Olesen, C. G., de Zee, M., Rasmussen, J., Zachar, V. Uniaxial cyclic strain drives assembly and differentiation of skeletal myocytes. Tissue Engineering Part A. 17, 2543-2550 (2011).
  3. Grodzinsky, A. J., Levenston, M. E., Jin, M., Frank, E. H. Cartilage Tissue Remodeling in Response to Mechanical Forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2 (1), 691-713 (2000).
  4. Munster, S., et al. Strain history dependence of the nonlinear stress response of fibrin and collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110, 12197-12202 (2013).
  5. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS ONE. 4, 5902(2009).
  6. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 377-383 (2002).
  7. Natan, S., Koren, Y., Shelah, O., Goren, S., Lesman, A. Molecular Biology of the Cell. 31 (14), 1474-1485 (2020).
  8. Ban, E., et al. Mechanisms of Plastic Deformation in Collagen Networks Induced by Cellular Forces. Biophysical Journal. 114 (2), 450-461 (2018).
  9. Kim, J., et al. Stress-induced plasticity of dynamic collagen networks. Nature Communications. 8, 842(2017).
  10. Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. Nonlinear elasticity in biological gels. Nature. 435, 191-194 (2005).
  11. Wen, Q., Basu, A., Janmey, P. A., Yodh, A. G. Non-affine deformations in polymer hydrogels. Soft Matter. 8, 8039-8049 (2012).
  12. Muiznieks, L. D., Keeley, F. W. Molecular assembly and mechanical properties of the extracellular matrix: A fibrous protein perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1832, 866-875 (2012).
  13. Brown, A. E. X., Litvinov, R. I., Discher, D. E., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Multiscale mechanics of fibrin polymer: gel stretching with protein unfolding and loss of water. Science. 325, 741-744 (2009).
  14. Carroll, S. F., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Cyclic tensile strain can play a role in directing both intramembranous and endochondral ossification of mesenchymal stem cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 73(2017).
  15. Livne, A., Bouchbinder, E., Geiger, B. Cell reorientation under cyclic stretching. Nature Communications. 5, 3938(2014).
  16. Wang, L., et al. Patterning cellular alignment through stretching hydrogels with programmable strain gradients. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 15088-15097 (2015).
  17. Xu, G. K., Feng, X. Q., Gao, H. Orientations of Cells on Compliant Substrates under Biaxial Stretches: A Theoretical Study. Biophysical Journal. 114 (3), 701-710 (2017).
  18. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2013).
  19. Lu, J., et al. Cell orientation gradients on an inverse opal substrate. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (19), 10091-10095 (2015).
  20. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
  21. Bono, N., et al. Unraveling the role of mechanical stimulation on smooth muscle cells: a comparative study between 2D and 3D models. Biotechnology and Bioengineering. 113, 2254-2263 (2016).
  22. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
  23. Riehl, B. D., Park, J. H., Kwon, I. K., Lim, J. Y. Mechanical stretching for tissue engineering: two-dimensional and three-dimensional constructs. Tissue Engineering Part B: Reviews. 18, 288-300 (2012).
  24. Flexcell. Linear Tissue Train Culture Plate. Flexcell. , (2019).
  25. Flexcell. Tissue Train. Flexcell. , (2019).
  26. CellScale. MCT6 Stretcher. CellScale. , (2019).
  27. STREX. STB-150. STREX. , (2019).
  28. STREX. Stretch Chambers. STREX. , (2019).
  29. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab on a Chip. 16, 3193-3203 (2016).
  30. Weidenhamer, N. K., Tranquillo, R. T. Influence of cyclic mechanical stretch and tissue constraints on cellular and collagen alignment in fibroblast-derived cell sheets. Tissue Engineering Part C: Methods. 19, 386-395 (2013).
  31. Yung, Y. C., Vandenburgh, H., Mooney, D. J. Cellular strain assessment tool (CSAT): precision-controlled cyclic uniaxial tensile loading. Journal of Biomechanics. 42, 178-182 (2009).
  32. Chen, K., et al. Role of boundary conditions in determining cell alignment in response to stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 115, 986-991 (2018).
  33. Heher, P., et al. A novel bioreactor for the generation of highly aligned 3D skeletal muscle-like constructs through orientation of fibrin via application of static strain. Acta Biomaterialia. 24, 251-265 (2015).
  34. Foolen, J., Deshpande, V. S., Kanters, F. M. W., Baaijens, F. P. T. The influence of matrix integrity on stress-fiber remodeling in 3D. Biomaterials. 33, 7508-7518 (2012).
  35. Walker, M., Godin, M., Pelling, A. E. A vacuum-actuated microtissue stretcher for long-term exposure to oscillatory strain within a 3D matrix. Biomedical Microdevices. 20, 43(2018).
  36. Zhao, R. G., Boudou, T., Wang, W. G., Chen, C. S., Reich, D. H. Decoupling cell and matrix mechanics in engineered microtissues using magnetically actuated microcantilevers. Advanced Materials. 25, 1699-1705 (2013).
  37. Li, Y. H., et al. Magnetically actuated cell-laden micro-scale hydrogels for probing strain-induced cell responses in three dimensions. NPG Asia Materials. 8, 238(2016).
  38. Li, Y. H., et al. An approach to quantifying 3D responses of cells to extreme strain. Scientific Reports. 6, 19550(2016).
  39. Humphrey, J. D., et al. A theoretically-motivated biaxial tissue culture system with intravital microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 7, 323-334 (2008).
  40. Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 107, 3335-3339 (2010).
  41. Roitblat Riba, A., et al. Straining 3D hydrogels with uniform z-axis strains while enabling live microscopy imaging. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
  42. Gomez, D., Natan, S., Shokef, Y., Lesman, A. Mechanical interaction between cells facilitates molecular transport. Advanced Biosystems. 3 (12), 1900192(2019).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open- source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  44. EPFL Switzerland. OrientationJ plug in. EPFL Switzerland. , (2019).
  45. Goren, S., Koren, Y., Xu, X., Lesman, A. Elastic anisotropy governs the decay of cell-induced displacements. Biophysical Journal. 118 (5), 1152-1164 (2019).
  46. Notbohm, J., Lesman, A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Quantifying cell-induced matrix deformation in three dimensions based on imaging matrix fibers. Integrative Biology. 7 (10), 1186-1195 (2015).
  47. Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. Journal of Cell Biology. 205 (2), 155-162 (2014).
  48. Cha, C. Y., et al. Tailoring Hydrogel Adhesion to Polydimethylsiloxane Substrates Using Polysaccharide Glue. Angewandte Chemie International Edition. 52, 6949-6952 (2019).
  49. Wirthl, D., et al. Instant tough bonding of hydrogels for soft machines and electronics. Science Advances. 3, (2017).
  50. Juarez-Moreno, J. A., Avila-Ortega, A., Oliva, A. I., Aviles, F., Cauich-Rodriguez, J. V. Effect of wettability and surface roughness on the adhesion properties of collagen on PDMS films treated by capacitively coupled oxygen plasma. Applied Surface Science. 349, 763-773 (2015).
  51. Kim, H. T., Jeong, O. C. PDMS surface modification using atmospheric pressure plasma. Microelectronic Engineering. 88, 2281-2285 (2011).
  52. Prasad, B. R., et al. Controlling cellular activity by manipulating silicone surface roughness. Colloids and Surfaces. 78, 237-242 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rozciąganie hydrożelu 3Dsilikonowy pasek nośnyanaliza za pomocą mikroskopii konfokalnejpolimeryzacja żelu fibrynowegoprzyłożenie siły zewnętrznejkwantyfikacja odkształcenia żelupomiar orientacji włókienjednorodność odkształcenia w osi Zbiomimetyczne warunki 3D
Kontrolowane odkształcanie hydrożeli 3D w obrazowaniu mikroskopowym na żywo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.