Artykuł metodologiczny
Przedstawiona metoda polega na jednoosiowym rozciąganiu miękkich hydrożeli 3D osadzonych w gumie silikonowej, umożliwiając jednocześnie mikroskopię konfokalną na żywo. Przedstawiono charakterystykę zewnętrznych i wewnętrznych szczepów hydrożelu, a także wyrównanie włókien. Opracowane urządzenie i protokół mogą oceniać reakcję komórek na różne reżimy szczepów.
Siły zewnętrzne są ważnym czynnikiem w tworzeniu, rozwoju i utrzymaniu tkanek. Wpływ tych sił jest często badany przy użyciu specjalistycznych metod rozciągania in vitro. Różne dostępne systemy wykorzystują nosze 2D oparte na podłożu, podczas gdy dostępność technik 3D do naprężania miękkich hydrożeli jest bardziej ograniczona. W tym miejscu opisujemy metodę, która umożliwia zewnętrzne rozciąganie miękkich hydrożeli od ich obwodu, przy użyciu elastycznego paska silikonowego jako nośnika próbki. System rozciągania zastosowany w tym protokole jest zbudowany z części wydrukowanych w 3D i taniej elektroniki, dzięki czemu jest prosty i łatwy do odtworzenia w innych laboratoriach. Proces eksperymentalny rozpoczyna się od polimeryzacji grubych (>100 μm) miękkich hydrożeli fibrynowych (moduł sprężystości ~100 Pa) w wycięciu w środku paska silikonowego. Konstrukty silikonowo-żelowe są następnie dołączane do drukowanego urządzenia rozciągającego i umieszczane na stoliku mikroskopu konfokalnego. Pod mikroskopią na żywo aktywowane jest urządzenie do rozciągania, a żele są obrazowane w różnych wielkościach rozciągnięcia. Przetwarzanie obrazu jest następnie wykorzystywane do ilościowego określenia powstałych deformacji żelu, wykazując stosunkowo jednorodne odkształcenia i wyrównanie włókien na całej grubości 3D żelu (oś Z). Do zalet tej metody należy możliwość odcedzania niezwykle miękkich hydrożeli w 3D podczas wykonywania mikroskopii in situ oraz swoboda manipulowania geometrią i wielkością próbki zgodnie z potrzebami użytkownika. Dodatkowo, przy odpowiedniej adaptacji, metoda ta może być stosowana do rozciągania innych rodzajów hydrożeli (np. kolagenu, poliakrylamidu lub glikolu polietylenowego) i może pozwolić na analizę odpowiedzi komórek i tkanek na siły zewnętrzne w bardziej biomimetycznych warunkach 3D.
Reakcja tkanek na siły mechaniczne jest integralną częścią szerokiego zakresu funkcji biologicznych, w tym ekspresji genów1, różnicowania komórek2, oraz przebudowy tkanek3. Co więcej, wywołane siłą zmiany w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), takie jak wyrównanie i zagęszczenie włókien, mogą wpływać na zachowanie komórek i tworzenie tkanek4,5,6. Włóknista struktura siatki ECM ma intrygujące właściwości mechaniczne, takie jak nieliniowa elastyczność, odkształcenia nieafiniczne i odkształcenia plastyczne
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
1. Przygotowanie roztworów (należy wykonać z wyprzedzeniem)
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Reprezentatywne dane z rozciągania statycznego o rosnącej magnitudzie, zastosowanego do silikonowego paska z osadzonym 3D hydrożelem fibrynowym zawierającym fluorescencyjne kuleczki o średnicy 1 μm, przedstawiono na Rysunku 9. Analiza wykazuje wpływ rozciągania silikonu na zmiany geometryczne wyciętego otworu, a także na naprężenia powstałe wewnątrz żelu. Obrazy z serii Z-stack całego żelu służą do oceny deformacji pierwotnego kolistego wycięcia w geometrię eliptyczną (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedstawiona tutaj metoda i protokół są w dużej mierze oparte na naszym poprzednim badaniu przeprowadzonym przez Roitblat Riba i wsp.41 Dołączamy tutaj pełne kody projektowania wspomaganego komputerowo (CAD), Pythona i mikrokontrolera urządzenia SCyUS .
Do głównych zalet prezentowanej metody w porównaniu z istniejącymi metodami należy możliwość odcedzania bardzo miękkich hydrożeli 3D (moduł sprężystości ~100 Pa) z ich obwodu oraz pod obrazowaniem konfokalnym <.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Niektóre rysunki tutaj zamieszczone zostały zaadaptowane za zgodą Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Odcedzenie hydrożeli 3D z jednolitymi odkształceniami w osi Z przy jednoczesnym umożliwieniu obrazowania mikroskopowego na żywo, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 546 kwas karboksylowy, ester sukcynimidylowy | Invitrogen | A20002 | |
| Pożywka komórkowa (DMEM o wysokiej glukozie) | Biological Industries | 01-052-1A | Dodaj 10% FBS, 1% PNS, 1% L-glutaminy, 1% pirogronianu sodu |
| Szkiełko nakrywkowe #1.5 | Bar-Naor Ltd. | BN72204-30 | 22 razy; 40 mm |
| DIMETHYL SULPHOXIDE 99,5% GC DMSO | Sigma-Aldrich Inc. | D-5879-500 ML | |
| Dulbecco's Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Przemysł biologiczny | 02-023-1A | |
| EVICEL Fibrynowy uszczelniacz (ludzki) | Omrix Biopharmaceuticals | 3902 | Fibrynogen: 70 mg / ml, Trombina: 800-1200 IU / mL |
| Bufor fibrynogenu | Nie dotyczy | Przepis na 1L: 7g NaCl, 2,94g dwuwodnego cytrynianu trisodowego, 9g glicyny, 20g chlorowodorku argininy i 0,15 g dwuwodnego chlorku wapnia. Doprowadź końcową objętość do 1L za pomocą PuW (pH 7,0-7,2) | |
| Mikrokulki fluorescencyjne FluoSpheres (1 µ m) | Invitrogen | F8820 | Orange (540/560) Dostarczany w postaci zawiesiny (2% ciał stałych) w wodzie plus 2 mM azydek sodu |
| Wysokotemperaturowy kauczuk silikonowy | McMaster-Carr | 3788T41 | 580 µ m-gruby E = 1,5 MPa Współczynnik Poissona = 0,48 Wytrzymałość na rozciąganie = 4,8 MPa Górna granica rozciągliwości = + 300% odprężenia inżynieryjnego |
| Kolumna odsalająca HiTrap 5 mL (Sephadex G-25 zapakowany) | GE Healthcare | 17-1408-01 | |
| HIVAC-G Wysokopróżniowa masa uszczelniająca | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | Oprogramowanie HIVAC-G 100 | |
| ImageJ FIJI39 | National Institute of Health, Bethesda, MD | Wersja 1.8.0_112 | |
| Mikrokontroler (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) | Arduino/Adafruit | Arduino-DK001/Adafruit-1438 | |
| Wirówka MicroVL 21R | Thermo Scientific 75002470 | ||
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Mikroskop świetlny Primovert | Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. | 491206-0011-000 | |
| SCyUS CAD (Solidworks) | Dassault Systè mes | N/A | |
| SCyUS Code37 | N/A | N/A | |
| Serwomotor - TowerPro SG-5010 | Adafruit | 155 | |
| SL 16R Wirówka | Thermo Scientific | 75004030 | Do probówek 50 mL |
| Sterylne płytki niehodowlane 10 cm | Corning | 430167 | |
| Bufor trombinowy | Nie dotyczy | Przepis na 1 l: 20 g mannitolu, 8,77 g NaCl, 2,72 g trójwodnego octanu sodu, 24 ml 25% albuminy ludzkiej surowicy, 5,88 g chlorku wapnia. Doprowadź końcową objętość do 1 l za pomocą PuW (pH 7,0) | |
| Trypsyna EDTA roztwór B (0,25%), EDTA (0,05%) | Przemysł biologiczny | 03-052-1B | |
| USB (typ B męski na typ A męski) | N/A | N/A | |
| Mikroskop konfokalny Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss AG | 2811000417 | |
| ZEN 2.3 SP1 FP3 () | Carl Zeiss AG | Release Version 14.0.0.0 |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie