Artykuł metodologiczny

Obrazowanie na żywo receptorów chemokiny w neutrofilach danio pręgowanego podczas reakcji na ranę

3.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61679

⸱

4 grudnia 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokoły do wykonywania obrazowania na żywo i analizy ilościowej dynamiki receptorów chemoatraktantu u neutrofili danio pręgowanego

Streszczenie

Prowadzenie leukocytów za pomocą gradientów chemicznych jest niezbędne dla odpowiedzi immunologicznej. Neutrofile są pierwszymi komórkami, które są rekrutowane do miejsc uszkodzenia tkanek, gdzie pełnią kluczowe funkcje przeciwdrobnoustrojowe. Ich transport do tych loci jest koordynowany przez kilka zapalnych chemoatraktantów, w tym chemokiny. Na poziomie molekularnym sygnalizacja chemoatraktantu jest regulowana przez wewnątrzkomórkowy transport odpowiednich receptorów. Nie jest jednak jasne, w jaki sposób subkomórkowe zmiany w receptorach chemokiny wpływają na dynamikę migracji leukocytów na poziomie komórkowym i tkankowym. W tym miejscu opisano metodologię obrazowania na żywo i analizy ilościowej dynamiki receptora chemokiny w neutrofilach podczas reakcji zapalnych na uszkodzenie tkanek. Narzędzia te ujawniły, że zróżnicowany transport receptorów chemokiny w neutrofilach danio pręgowanego koordynuje grupowanie i dyspersję neutrofili w miejscach uszkodzenia tkanek. Ma to implikacje dla naszego zrozumienia, w jaki sposób reakcje zapalne ustępują samoistnie. Opisane narzędzia mogą zostać wykorzystane do zrozumienia wzorców migracji neutrofili w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych, a metodologia może zostać rozszerzona na inne receptory sygnałowe.

Wprowadzenie

Migracja leukocytów ma ogromne znaczenie dla odpowiedzi immunologicznej. Komórki odpornościowe są prototypowymi komórkami migrującymi, które są niezwykle zdolne do przechodzenia przez tkanki i naczynia krwionośne oraz wyczuwania szeregu chemicznych wskazówek do migracji kierunkowej w kierunku drobnoustrojów lub innych ważnych komórek gospodarza. Prawidłowe wskazówki opierają się na rozpoznaniu chemoatraktantów, wśród których chemokiny stanowią najbardziej znaczącą kategorię1. Chemokiny są rozpoznawane przez wysoce specyficzne receptory sprzężone z siedmiobłonowym białkiem G. Po związaniu chemokiny receptory chemokiny zmieniają konformację, co prowadzi do aktywacji powiązanych trimerycznych białek G i ich dysocjacji na funkcjonalne podjednostki sygnalizacyjne, które promują zmiany cytoszkieletu i ukierunkowaną migrację1. Po drugie, receptory chemokiny są fosforylowane, a ta modyfikacja prowadzi do odczulenia na atraktant, po którym może nastąpić szybkie ponowne uwrażliwienie/recykling lub degradacja wewnątrzkomórkowa i regulacja w dół z powierzchni komórki2. Ta dynamika receptorów wpływa na czas trwania i dawkę sygnalizacji odbieranej przez komórki, ale sposób, w jaki wpływają one na zachowanie migracji leukocytów, był trudny do wyjaśnienia in vivo.

Śledzenie dynamiki receptorów w żywych leukocytach w tradycyjnych systemach ssaków napotyka kilka wyzwań. W przypadku badań na żywo fuzje receptorów z białkami fluorescencyjnymi muszą ulegać ekspresji w komórkach. Jest to trudne w przypadku leukocytów pierwotnych, szczególnie w neutrofilach, a dotychczasowe badania wykorzystywały zastępcze linie komórkowe neutrofili do ekspresji receptorów chemokin3,4. Generowanie transgenicznych modeli myszy, w których leukocyty wyrażają receptor fluorescencyjny lub zmutowane receptory z defektami transportu informacyjnego5,6, wiąże się ze znacznymi inwestycjami czasu i zasobów. Nawet w tych przypadkach rozdzielczość obrazowania i kontrast dla obrazowania dynamiki receptorów u żywego zwierzęcia mogą być ograniczone, a w badaniach wykorzystano immunohistochemię na nieruchomych skrawkach tkanki5. Biorąc pod uwagę te wyzwania techniczne, nasza wiedza na temat tego, w jaki sposób dynamika receptorów chemoatraktantu wpływa na zachowanie komórek w żywych tkankach, jest obecnie ograniczona.

Tutaj przedstawiamy metodologię monitorowania transportu receptorów u neutrofili danio pręgowanego. Danio pręgowany jest genetycznie podatny, podobnie jak myszy, ale transgeneza jest stosunkowo prostsza dzięki zastosowaniu wydajnych systemów transpozonów i bezpośredniej manipulacji zygotą7. Przezroczysta larwa jest idealnie podatna na obrazowanie. Dynamika receptora chemokiny została uwidoczniona w pierwotnych komórkach rozrodczych i zawiązkach linii bocznej poprzez ekspresję odpowiednich fuzji z fluorescencyjnymi reporterami8,9,10. Larwy danio pręgowanego są wyposażone w dojrzałe neutrofile, które mają wysoce konserwatywne właściwości genetyczne i komórkowe w stosunku do neutrofili ssaków. Dynamika sygnalizacji subkomórkowej, taka jak dynamika cytoszkieletu i regulatory polaryzacji, została zobrazowana w tych komórkach poprzez wygenerowanie odpowiednich linii transgenicznych11,12,13. Ostatnio zobrazowaliśmy i przeanalizowaliśmy funkcjonalnie dynamikę receptora chemokiny w neutrofilach w przebiegu reakcji zapalnych na uszkodzenie tkanek14. W tym miejscu opisujemy generowanie transgenicznych linii reporterowych do sygnalizacji chemokiny w neutrofilach, przygotowanie zarodków do obrazowania na żywo, test ran do badania sygnalizacji neutrofili oraz protokół pozyskiwania i analizy obrazów. Udostępniamy również protokół poboczny do testowania odpowiedzi receptorów chemokiny na kandydujące ligandy, co jest przydatne przy próbie ustalenia wzorców rozpoznawania ligandów w niescharakteryzowanych receptorach. Techniki te mogą być stosowane w połączeniu z dalszymi manipulacjami genetycznymi, takimi jak hamowanie endogennej ekspresji chemokiny lub generowanie zmutowanych receptorów ze zmienionym transportem indukowanym ligandem, w celu zbadania, w jaki sposób specyficzna dynamika sygnalizacji wpływa na zachowanie leukocytów in vivo. Linie transgeniczne wyrażające fluorescencyjnie znakowane receptory chemokiny mogą być również wykorzystywane jako reportery dla endogennych gradientów chemokin, które w przeciwnym razie są trudne do wykrycia przez bezpośrednie barwienie przeciwciałami. Opisana metodologia daje możliwości rozszerzenia generacji reporterów na inne receptory sygnalizacji immunologicznej.

Protokół

UWAGA: Wszystkie danio pręgowane były hodowane zgodnie z wytycznymi ARRIVE i przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych, UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986.

1. Generowanie transgenicznych larw danio pręgowanego do obrazowania transportu receptorów w leukocytach

  1. Wygeneruj konstrukt oparty na Tol2 dla specyficznej tkankowo ekspresji fluorescencyjnie znakowanego receptora będącego przedmiotem zainteresowania. W przypadku neutrofili należy użyć sekwencji promotorowych z klasy lizozymu C15 i genu mieloperoksydazy16. Konstrukt może być zaprojektowany jako fuzja z pojedynczym białkiem fluorescencyjnym (np. GFP), tandemowym zegarem fluorescencyjnym (np. szybko składającym się GFP i wolniej dojrzewającym tagRFP8,14,17) lub bicystronicznym wyrażeniem reporterowego GFP i kontrolnym markerem błonowym9 (zobacz Dyskusję, aby zapoznać się z rozważaniami przy wyborze podejścia).
    UWAGA: Ten konstrukt nie podsumowuje endogennych poziomów ekspresji receptora, ale jest przydatny do uzyskania wysokiego poziomu ekspresji receptora w typie komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Zapoznaj się z literaturą na temat podobnych receptorów3,5,6,8,9,10,14, aby zdecydować o położeniu znacznika fluorescencyjnego.
  2. Ustaw zbiornik zawierający dorosłe samce i samice typu dzikiego zgodnie ze standardowymi praktykami hodowlanymi18, oddzielony barierą na dzień przed tarłem jaj.
  3. W dniu tarła jaj należy przygotować mieszaninę transgenezy do mikroiniekcji zawierającą 12,5 ng/μL konstruktu DNA Tol2 i 17,5 ng/μL transpozazy mRNA7. Podnieś bariery ze zbiorników rybnych wkrótce po pojawieniu się świateł rano (może się to różnić w różnych obiektach dla ryb) i zbierz jaja w ciągu 15 minut do wstrzyknięcia mRNA.
    UWAGA: Upewnij się, że roztwór DNA jest wolny od RNazy, aby uniknąć degradacji mRNA transpozazy w mieszaninie. Sposobem na obejście tego problemu jest wstrzykiwanie jaj z oddzielnymi roztworami konstruktu Tol2 i transpozy.
  4. Postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami transgenezy i mikroiniekcji jaj danio pręgowanego19.
  5. Wstrzyknąć 1 nl roztworu do komórki zarodków w stadium jednokomórkowym.
    UWAGA: Wyniki odciągania są bardziej spójne w przypadku wstrzykiwania do wnętrza komórki i odrzucania wstrzyknięć, które mogą nie znajdować się wyraźnie wewnątrz komórki. Zarodki w stadium jednokomórkowym są przeznaczone ze względu na zmienność objętości wstrzyknięcia na komórkę podczas wstrzykiwania zarodków w stadium 2-16 komórek. Opcją byłoby oddzielenie iniekcji w fazie jednokomórkowej od partii późniejszych wstrzyknięć, w przypadku, gdy mają one różną skuteczność.
  6. Sprawdź wstrzyknięte zarodki później w ciągu dnia i usuń niezapłodnione lub martwe jaja, aby utrzymać lęg w zdrowiu.
  7. Po 3 dniach od zapłodnienia (dpf) należy przebadać larwy pod mikroskopem fluorescencyjnym. Marker będzie widoczny w neutrofilach, szczególnie w ogonowej tkance krwiotwórczej (CHT), która jest bogata w te komórki.
    UWAGA: Odsetek znakowanych komórek różni się w zależności od różnych konstruktów, ale zwykle oczekuje się, że 20-60% neutrofili wyraża konstrukt. Niższe wartości procentowe zwykle przewidują większą liczbę badań przesiewowych na etapie dorosłych. Dobrą praktyką jest również sprawdzenie prawidłowej lokalizacji receptora na błonie, za pomocą obrazowania o wyższej rozdzielczości, w próbce tych zarodków przed wyhodowaniem ryby.
  8. Hoduj larwy z dodatnim wynikiem zgodnie ze standardowymi praktykami hodowlanymi20. Reprezentują one pokolenie F0.
  9. W wieku 3 miesięcy przesiewaj ryby F0 dla założycieli. Krzyżuj poszczególne ryby z nietransgenicznym typem dzikim i badaj ich potomstwo pod kątem ekspresji receptora przy 3 dpf, oglądając je pod zakresem sekcji. W zależności od powodzenia transgenezy, który różni się w zależności od konstruktu, obserwuj procent dodatniego potomstwa w podzbiorze krzyżówek.
    UWAGA: Dla dobrej transgenezy, około jedna trzecia do połowy dorosłych daje pozytywne potomstwo. Odsetek potomstwa, które jest dodatnie w lęgu, różni się w zależności od liczby wstawionych kopii transgenów i może wynosić od 10 do 60%. Pomocne jest śledzenie proporcji mendlowskich w lęgach w celu identyfikacji transgenicznych z pojedynczą insercją (łatwiej zidentyfikować je w sprzęgach F2, szukając 50% stosunku larw dodatnich)20.
  10. Wyhoduj pozytywne potomstwo, które reprezentuje pokolenie F1.
  11. W wieku 3 miesięcy należy przeprowadzić badania przesiewowe dorosłych F1 w ten sam sposób, aby ustalić stabilną linię transgeniczną F2.
  12. Przeprowadzić eksperymenty na larwach F2 po walidacji specyficznej dla neutrofili ekspresji transgenu.
    UWAGA: Podczas transgenezy można zaobserwować różne poziomy ekspresji receptorów i zaleca się utrzymywanie różnych transgenicznych lęgów, aby uzyskać najbardziej odpowiedni poziom ekspresji dla pytań biologicznych. Wstępne wyniki można uzyskać na larwach F0 lub F1.

2. Zbieranie zarodków danio pręgowanego do oceny reakcji ran leukocytów

  1. Po ustanowieniu stabilnej transgenicznej linii reporterowej, należy skonfigurować krzyżówkę między dorosłymi i samicami transgenicznych ryb i zebrać jaja następnego ranka.
  2. Hoduj zarodki w temperaturze 28,5 °C na podłożu E3 (lub wodzie jajecznej18).
  3. Opcjonalnie, w temperaturze 24 hpf, inkubować zarodki w probówce wirówkowej zawierającej 50 ml pożywki E3 uzupełnionej 0,003% wybielaczem przez 5 minut. Następnie spłucz 3 razy w pożywce E3, odstawiając probówkę na kilka minut, aby zarodki osiadły na dnie, a następnie zdekantować i wymienić podłoże.
    UWAGA: Zapewnia to poziom kontroli narażenia larw na infekcje, co może wpływać na zachowanie leukocytów podczas zranienia.
  4. Po wybieleniu należy przechowywać zarodki w pożywce E3 uzupełnionej 0,003% 1-fenylo-2-tiomocznika, aby zapobiec syntezie melaniny. Błękit metylenowy, który jest często stosowany w celu zapobiegania infekcjom grzybiczym, nie jest tutaj dodawany, aby zminimalizować autofluorescencję tkanek.
  5. Pozwól larwom wykluć się naturalnie i używaj przy 3 dpf, gdy neutrofile są obfite21.

3. Ranienie larw w brzusznej płetwie

  1. Przygotuj larwy do zranienia. Używaj larw w dawce 2,5-3,5 dpf, gdy obserwuje się obfite neutrofile. Przenieść larwy na pożywkę E3 uzupełnioną 160-200 mg/L trikainą MS222.
    UWAGA: Stężone roztwory tricainy należy wcześniej przygotować i zamrozić w porcjach i rozmrozić w ciągu dnia.
  2. Pozostaw larwy w podłożu E3 + trikaina na 15 minut, aby upewnić się, że są znieczulone. Sprawdź ich reakcje, delikatnie dotykając małym pędzlem lub podobnym narzędziem.
  3. Wybrać larwy z ekspresją receptora transgenicznego pod fluorescencyjnym zakresem preparacji.
  4. Przenieść larwy na szalkę Petriego o średnicy 120 mm w E3 + trikaina w celu zranienia. Za pomocą sterylnego skalpela przeciąć płetwę brzuszną larwy, obserwując pod lunetą sekcyjną (Ryc. 1).
    UWAGA: Chodzi o to, aby wykonać wystarczająco głębokie cięcie, aby spowodować znaczną rekrutację neutrofili, ale bez przecinania naczyń CHT. Cięcie wykonuje się prostopadle do osi CHT, tak aby nacięcie prawie sięgało naczyń CHT. Wymaga to pewnej praktyki i powinno być najpierw wykonywane pod nadzorem na larwach, które nie są generowane w tym celu (np. nadmiar larw z innego eksperymentu).

4. Przygotowanie larw do obrazowania na żywo

  1. Rozpuść agarozę o niskiej temperaturze topnienia (LMP) w pożywce E3 przez ogrzewanie, aby uzyskać ciekły 2% roztwór agarozy.
  2. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury 60 °C.
    UWAGA: Kolbę lub probówkę z agarozą należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 60 °C, aby uniknąć ustawienia agarozy między mocowaniem różnych larw.
  3. Odpipetować 0,5 ml płynu LMP + E3 w naczyniu ze szklanym dnem do obrazowania mikroskopowego.
  4. Odpipetować ranną, znieczuloną larwę danio pręgowanego wraz z 0,5 ml E3 + 2x Tricaine w naczyniu ze szklanym dnem.
  5. Delikatnie wymieszaj oba roztwory, aby uzyskać 1% LMP/1x roztwór agarozy trikainowej/E3, unikając wytwarzania pęcherzyków. Ustaw zarodek bocznie i delikatnie dociśnij w dół, tak aby część ogonowa ryby znajdowała się jak najbliżej szkła.
    UWAGA: Tkanka, która ma być obrazowana, musi znajdować się jak najbliżej szklanego dna podczas obrazowania za pomocą mikroskopu odwróconego. Ustawienie orientacji larwy musi być szybkie, aby agaroza nie zastygła przed umieszczeniem larwy.
  6. Pozostaw roztwór agarozy do ostygnięcia i zestalenia się przez 5-10 minut. Sprawdź, czy agaroza jest zastygła, delikatnie dotykając żelu agarozowego małym pędzelkiem lub końcówką.
  7. Gdy agaroza stanie się w stanie twardym, dodaj 2 ml E3 uzupełnione 0,2 mg/ml tricainy do płytki obrazowej.

5. Obrazowanie konfokalne na żywo

UWAGA: Obraz zarodków na mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem lub jego odpowiedniku (Rysunek 2). Można również użyć laserowego mikroskopu skaningowego, ale czasowa rozdzielczość dynamiki będzie bardziej ograniczona. Przygotuj ustawienia obrazowania przed przyniesieniem zranionej larwy, aby można było jak najszybciej zobrazować reakcję po zranieniu. Neutrofile docierają do rany w ciągu 5 minut, a receptory w pierwszych przybywających komórkach mogą zinternalizować się w tym czasie. Po nabraniu wprawy możliwe jest zobrazowanie już po 15 minutach od zranienia.

  1. Włącz mikroskop: laser, kamerę i komputer zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Użyj oprogramowania do akwizycji, aby skonfigurować ustawienia obrazowania. Wybierz lasery dla odpowiednich fluoroforów i przybliżone czasy naświetlania na podstawie poprzednich eksperymentów (uzyskaj GFP przy 488 nm i tagRFP przy użyciu lasera 561 nm).
  3. Przenieść płytkę z zamontowanym zarodkiem, jak najszybciej po zastygnięciu agarozy, na platformę wirującego dysku do obrazowania konfokalnego.
  4. Użyj okularu mikroskopu, aby znaleźć rybę w naczyniu za pomocą stage joystick.
  5. Ustaw ostrość na obszarze rany za pomocą pokrętła ostrości.
    UWAGA: Aby znaleźć obszar zainteresowania, łatwiej może być użyć obiektywu powietrznego o małym powiększeniu (10x).
  6. Wybierz pole, które chcesz zobrazować wokół rany. Użyj obiektywu 30x/40x z dużą aperturą numeryczną, aby uzyskać wystarczającą rozdzielczość.
  7. Użyj przycisków oprogramowania, aby dostosować czas naświetlania tak, aby marker fluorescencyjny był widoczny z dobrym kontrastem, ale bez nasycania sygnału.
    UWAGA: Czas naświetlania musi być jak najkrótszy, aby zminimalizować ekspozycję na fluorescencyjną i zmaksymalizować rozdzielczość czasową w filmie poklatkowym. Moc lasera zależy od stanu lasera, ale musi być dostosowana do poziomu, który pozwala na wystarczająco niski czas naświetlania dla obrazowania dynamicznego.
  8. Użyj przycisków oprogramowania, aby wybrać wolumin do obrazu jako stos z
  9. Ustaw upływ czasu co 30 s dla żądanego czasu trwania.
    UWAGA: W przypadku sterylnych ran płetwy brzusznej maksymalną rekrutację obserwuje się przez 2-3 godziny.
  10. Przed uruchomieniem filmu poklatkowego zrób zdjęcie jasnego pola, aby udokumentować pole widzenia. Jeśli to możliwe, uzyskaj jasne pole w filmie poklatkowym.

6. Kwantyfikacja internalizacji receptora u neutrofili danio pręgowanego

  1. Zapisz interwał czasowy akwizycji obrazu i rozmiar obrazu w pikselach. Zapisuj, ile minut po zranieniu rozpoczęło się obrazowanie.
  2. Otwórz zestawy danych obrazów za pomocą Fidżi, przeciągając obraz do interfejsu oprogramowania, wybierz reprezentatywną ramkę zainteresowania dla każdego zestawu danych za pomocą suwaka czasu, np. po 1-1,5 h po zranieniu, i zapisz go.
  3. Kontynuuj korzystanie z programu MATLAB, aby przetworzyć zestaw danych obrazu.
  4. Utwórz nowy skrypt i dołącz funkcje do odczytu obrazu (wiersz 6 w skrypcie o nazwie "select_neutrophils.m" do definicji środka ciężkości w pliku uzupełniającym 1), otwierania (wiersz 11 w pliku uzupełniającym 1) i ręcznego wyboru punktów na obrazie (wiersz 12 w pliku uzupełniającym 1).
  5. Otwórz ramkę zainteresowania, uruchamiając ten skrypt (plik uzupełniający 1), zidentyfikuj neutrofile do analizy za pomocą oględzin, kliknij na nie i zapisz oszacowanie ich centroidów, zarówno w ranie płetwy brzusznej, jak i w CHT.
    UWAGA: Niezmobilizowane neutrofile w CHT służą jako wewnętrzne odniesienie dla neutrofili, których rozmieszczenie receptorów pozostaje stałe. Pozwala to na normalizację wartości kontrastu komórek w ranie do wewnętrznego odniesienia.
  6. Kontynuuj segmentację neutrofili w każdej klatce przy użyciu techniki aktywnych konturów22, jak opisano w poniższych krokach.
  7. Utwórz funkcję zawierającą metadane wymagane do segmentacji według aktywnych konturów (tj. liczba iteracji, odchylenie konturu, szacowany środek ciężkości itp.)22 (zobacz 'wound data.m' w pliku uzupełniającym 2).
  8. Utwórz skrypt, który wywołuje funkcję "wound_data.m" w celu wprowadzenia informacji niezbędnych do segmentacji każdego neutrofila (wiersz 28 w skrypcie o nazwie "calc_contrast.m" w pliku uzupełniającym 3).
  9. Uwzględnij w skrypcie polecenia do odczytu obrazu (wiersz 32 w pliku uzupełniającym 3).
  10. Dodaj wygenerowanie czarnego obrazu (tj. obrazu, w którym wartości pikseli są zerami) o rozmiarze równym obrazowi wejściowemu (wiersz 44 w pliku uzupełniającym 3) oraz definicję kwadratu o wymiarach 10 × 10 pikseli wokół środka ciężkości każdego neutrofila (wiersz 45 w pliku uzupełniającym 3).
  11. Uwzględnij segmentację neutrofili za pomocą aktywnych konturów (wiersze 48-49 w pliku uzupełniającym 3) i usuwanie małych, fałszywie wykrytych obiektów (linia 52 w pliku uzupełniającym 3).
    UWAGA: Początkowy kontur segmentacji to kwadrat wokół środka ciężkości, który ewoluuje za pomocą techniki aktywnego konturu w oparciu o intensywność pikseli, liczbę iteracji i odchylenie konturu. Wynikiem segmentacji jest maska binarna, w której wszystkie piksele mają wartość 0 z wyjątkiem obszaru neutrofili, którego piksele mają wartość 1.
  12. Uwzględnij pomnożenie podzielonego na segmenty obrazu binarnego z oryginalnym, aby uzyskać intensywność pikseli tylko neutrofili, przy czym reszta obrazu nie jest liczbą, więc nie ma to wpływu na obliczenia (wiersze 56-57 w pliku uzupełniającym 3).
  13. Dodać obliczenie macierzy współwystępowania na poziomie szarości dla każdego neutrofila (GLCM)14,23 (wiersz 61 w pliku uzupełniającym 3). GLCM to kolejna reprezentacja obrazu pokazująca względne położenie pikseli pod względem intensywności pikseli.
  14. Uwzględnij obliczenie kontrastu neutrofili na podstawie GLCM (wiersze 62,65 w pliku uzupełniającym 3). Metryka kontrastu mierzy różnice w intensywności między sąsiednimi pikselami. Piksele są porównywane z pikselami oddalonymi od siebie w pewnej odległości, które można dostosować empirycznie na podstawie wielkości lokalnych szczytów intensywności. Jako wskazówkę, dla obrazów, o rozmiarze piksela 0,389 μm, gdy receptor wykazywał rozmieszczenie pęcherzykowe, każda jasna kropka mieściła się w zakresie 5 pikseli. W związku z tym intensywności porównano w pikselach oddalonych od siebie o 5 pikseli.
  15. Dodaj polecenia, aby zapisać wartości oddzielnie dla poszczególnych neutrofili w płetwie brzusznej (wiersz 68 w pliku uzupełniającym 3).
  16. Należy uwzględnić obliczenie średniej wartości kontrastu neutrofili dla wszystkich neutrofili CHT w taki sam sposób, jak dla neutrofili w ranie (wiersze 72-119 w pliku uzupełniającym 3). Dla neutrofili CHT wywołać funkcję "cht_data.m" (wiersz 77 w pliku uzupełniającym 4).
  17. Uwzględnij normalizację wartości kontrastu poszczególnych neutrofili w ranie do średniego kontrastu neutrofili CHT obliczonego powyżej w kroku 6.16 (tj. podział) (wiersz 122 w pliku uzupełniającym 3). Daje to znormalizowany kontrast, który odzwierciedla, jak "kropkowany" jest wygląd receptora w poszczególnych reagujących komórkach w porównaniu z komórkami kontrolnymi, które nie reagują (Rysunek 3 i Rysunek 4).
  18. Uruchom skrypt (plik uzupełniający 3), klikając symbol uruchamiania w oprogramowaniu.
  19. Powtórz wszystkie kroki dla różnych warunków.
  20. Użyj oprogramowania statystycznego (patrz Spis materiałów), aby zaimportować wyniki dla różnych warunków, tworząc tabelę kolumnową, wykreślić wyniki i przeprowadzić test statystyczny, aby sprawdzić istotność różnicy między wartościami średnimi.
    UWAGA: Kody do analizy można również znaleźć w serwisie GitHub pod adresem https://github.com/LeukocyteMotionAndDynamics/ReceptorTraffic

7. Testy odpowiedzi na chemokinę we wczesnych zarodkach

UWAGA: To jest opcjonalny eksperyment poboczny, który pozwala na testowanie zmian w dystrybucji receptorów w odpowiedzi na kandydata na chemokinę i jest niezależny od opisanych powyżej eksperymentów dotyczących ekspresji neutrofili w konstruktach receptorów. Różnice w indukowanym przez ligandy transporcie między receptorami są trudne do ustalenia za pomocą tej techniki, ponieważ poziomy ligandów są nasycone14. Jeśli jednak zaobserwuje się internalizację receptora przez ligand w tym układzie, może to wskazywać, że ligand jest rozpoznawany przez receptor w przypadkach, gdy tożsamość liganda jest niejasna. Jest to przydatne, ponieważ ekspresja receptorów chemokiny w ustalonych liniach komórkowych, takich jak HEK293T cells14 może być kłopotliwa.

  1. Ustaw krzyżówkę ryb typu dzikiego (np. AB) i zbierz ikrę następnego ranka, wkrótce po podniesieniu separatorów (jak opisano powyżej).
  2. Wstrzyknij 100 pg fluorescencyjnie znakowanego mRNA receptora (np. Cxcr1-FT) wraz ze 100 pg mRNA dla markera błonowego (np. CFP błony). Włączyć do mieszaniny różne dawki mRNA dla ligandu chemokinowego.
    UWAGA: Jako wskazanie, 150 pg mRNA Cxcl8a dało wyraźną internalizację fluorescencyjnego Cxcr1-FT (patrz Rysunek 5).
  3. Opłucz zarodki pożywką E3 i inkubuj w temperaturze 28°C.
  4. Przy około 7 hpf przetestuj ekspresję mRNA na fluorescencyjnej lunecie preparacyjnej i wybierz zarodki do obrazowania.
  5. Przygotować wcześniej 0,8 % agarozy LMP i przechowywać w szklanej probówce w bloku grzewczym w temperaturze 60 °C. Do manipulowania zarodkami należy użyć szklanej pipety. Delikatnie odcięj zarodki za pomocą kleszczy w każdej ręce.
  6. Odessać pojedynczy zarodek z dechorionacją za pomocą szklanej pipety, upewniając się, że na końcu nie ma pęcherzyków. Delikatnie wypuść zarodek do probówki z agarozą, pozwalając mu zanurzyć się w probówce.
  7. Odessaj zarodek z rurki agarozy, zbierając po drodze trochę płynnej agarozy. Delikatnie wypuść zarodek na środek naczynia do obrazowania ze szklanym dnem. Szybko obróć zarodek tak, aby słup zwierzęcia był skierowany w stronę dna naczynia (ta strona musi być najbliżej obiektywu w przypadku korzystania z mikroskopu odwróconego).
    UWAGA: Może być konieczne ponowne dostosowanie orientacji zarodków, gdy agaroza nadal zastyga.
  8. Po związaniu agarozy uzupełnij 2 ml pożywki E3.
    UWAGA: Zarodki na tym etapie są bardzo delikatne w porównaniu z larwami i wymaga trochę praktyki, aby je zdechorionować i zmontować. Ważne jest, aby zasysać i uwalniać tak delikatnie, jak to możliwe, aby uniknąć pęknięcia zarodka.
  9. Powtórz proces, dążąc do załadowania 3-5 zarodków na talerz.
  10. Obrazowanie zarodków w odwróconym mikroskopie konfokalnym (patrz tabela materiałów). Użyj obiektywu olejowego 40x/1,3 NA, aby uzyskać wystarczająco wysoką rozdzielczość. Wizualizacja mCFP, sfGFP i tagRFP z odpowiednio 405, 488 i 552 nm na zakresie. Dostosuj filtry i ustawienia, aby uzyskać wysoki kontrast, unikając nasycenia i minimalizując wycieki między kanałami.
  11. Powtórz montaż i obrazowanie dla różnych warunków.

Wyniki

Zranieniu płetwy brzusznej towarzyszy szybka mobilizacja neutrofili z CHT do płetwy brzusznej i ich gromadzenie się na brzegu rany w ciągu 30–60 min (Rycina 1). Zwizualizowano rozkład dwóch receptorów chemokin, Cxcr1 i Cxcr2, które są eksprymowane przez neutrofile danio pręgowanego24 oraz rozpoznają Cxcl8a i Cxcl8b14, z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii dyskowej. Wygenerowano dwie odpowiadające im linie transgeniczne, Tg(lyz:Cxcr1-FT) i Tg(lyz:Cxcr2-FT), w której neutrofile wykazują ekspresję konstruktu czasownika fluorescencyjnego (FT) receptora, tj. fuzji z tandemem sfGFP i tagRFP (Rycina 2 or referencja14). Zastosowanie dwóch fluoroforów miało na celu umożliwienie monitorowania szerokiego zakresu losów receptorów oraz określenie czasu obrotu białek w błonie komórkowej, ponieważ nowo syntetyzowane receptory emitowałyby zieloną fluorescencję, a wraz z upływem czasu stopniowo stawałyby się czerwone.8,14Stwierdzono jednak, że receptory te charakteryzują się szybkim konstytutywnym obrotem w błonie plazmatycznej neutrofili, a czas ich rezydencji był krótszy niż czas dojrzewania tagRFP; w stanie stacjonarnym sfGFP wykazywało lokalizację błonową, natomiast tagRFP lokalizację pęcherzykową (Wideo uzupełniające 1 oraz referencje14). W związku z tym skupiliśmy się na rozmieszczeniu sfGFP, aby monitorować indukowaną ligandem internalizację w miejscach uszkodzenia tkanki. Wzorzec rozmieszczenia receptora ilościowo określono za pomocą wskaźnika kontrastu, który określa różnice w intensywności między sąsiednimi pikselami. Przyjęto założenie, że gdy rozmieszczenie receptora ma charakter błonowy i gładki, wartość kontrastu jest niska. Gdy rozmieszczenie receptora ma charakter pęcherzykowy i bardziej punktowy, wartość kontrastu jest wysoka (Rycina 3).

Alternatywną metodą jest ilościowe określenie stosunku poziomów receptora (intensywność sfGFP) do poziomów kontrolnego markera błonowego, np. błonowego CFP (mCFP) (Rysunek 3). Obie metody mogą wykryć internalizację receptorów, co objawia się bardziej pęcherzykowym wzorcem rozmieszczenia receptorów w całej komórce (wyższa wartość kontrastu) lub niższym poziomem receptorów w błonie (niższy stosunek sfGFP/mCFP). Jednak parametr kontrastu mógł również wykryć internalizację receptorów w skupiskach neutrofili w miejscu rany, w których segmentacja błony była mniej dokładna i nie była możliwa do zastosowania (Rysunek 3). Dzięki zastosowaniu tego parametru byliśmy w stanie ilościowo określić widoczne różnice w transportach Cxcr1 i Cxcr2 w neutrofilach w miejscu rany (Rysunek 4 oraz Wideo uzupełniające 2). Cxcr1-FT uległ internalizacji w komórkach znajdujących się w miejscu rany, podczas gdy Cxcr2-FT pozostał w błonie neutrofili w miejscu rany (Rysunek 4A-C, Wideo uzupełniające 2 oraz Wideo uzupełniające 3). Supresja Cxcl8a i Cxcl8b, poprzez zastosowanie morfolino, w różny sposób wpłynęła na internalizację Cxcr1-FT w miejscu rany (Rysunek 4C,D). Aby dodatkowo potwierdzić, że Cxcr1-FT reaguje na Cxcl8a, przeprowadziliśmy testy odpowiedzi na chemokiny we wczesnych embrionach. Stwierdzono, że Cxcr1-FT uległ wyraźnej internalizacji w embrionach, w których współwyrażano Cxcl8a (Rysunek 5). Podsumowując, wyniki te wskazują, że opisane metody mogą być wykorzystane do pomiaru indukowanej chemokinami internalizacji receptorów w neutrofilach oraz do ustalenia tożsamości liganda pośredniczącego w tych efektach.

Schemat migracji neutrofili i obraz mikroskopowy pokazujący odpowiedź na ranę w naczyniach zebrafish.
Rysunek 1: Migracja neutrofili do ran płetwy brzusznej. (A) (Po lewej) Schemat larwy w 3 dpf pokazujący lokalizację tkanki krwiotwórczej ogona (CHT), krążenia żylnego (VC, kolor niebieski), płetwy brzusznej (VF) i miejsca rany. (Po prawej) Schemat przedstawiający obszar rany (W), gdzie neutrofile są mobilizowane z CHT i gromadzą się w miejscu rany. Splot żyły ogonowej (CVP) tkanki CHT zaznaczono na niebiesko. (B) Obraz w polu jasnym (po lewej) i projekcja konfokalna (po prawej) pokazujące ranę płetwy brzusznej i rozkład neutrofili w larwach Tg(mpx:GFP) 2 h po powstaniu rany. Linie przerywane wskazują zarysy VF i CHT. Pasek skali = 25 µm. Schemat i obraz fluorescencyjny zmodyfikowane z ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Chemotaksja i mobilizacja transgenicznych rybek zebrafish, schemat promotora lyz, mikroskopia fluorescencyjna.
Rycina 2: Obrazowanie na żywo transportu receptorów chemokin w neutrofilach.(A) Konstrukcje użyte do neutrofilowej specyficznej ekspresji transgenicznej Cxcr1-FT (Fluorescent Timer) oraz Cxcr2-FT. Projekcje konfokalne neutrofili w głowie transgenicznej larwy w 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT), góra; Tg(lyz:Cxcr2-FT), dół) pokazujące kanały tRFP (magenta) i sfGFP (zieleń). Pasek skali = 20 µm. (B) Schemat anatomiczny larwy w 3 dpf, jak na Rycini 1A. Poniżej larwy znajdują się schematy przedstawiające obszar rany (W) z neutrofilami mobilizowanymi z CHT (góra) lub wykonującymi chemotaksję po wejściu do płetwy brzusznej (dół). Przerywany kwadrat wskazuje obszar obrazowany na migawkach po prawej stronie. (C) Neutrofile w larwach Tg(lyz:Cxcr1-FT) (pokazano sfGFP) podczas mobilizacji z CHT (panele górne) lub chemotaksji w kierunku rany (panele dolne). Strzałki wskazują te same komórki w czasie. Punkty czasowe na obrazie po prawej to minuty, które upłynęły od obrazu po lewej. Pasek skali = 10 µm. (D) Schematyczne przedstawienie podejścia eksperymentalnego do obrazowania na żywo transportu receptorów chemokin. Panele A-C zmodyfikowane z ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces segmentacji konturów komórek; analiza kontrastu GFP i stosunku CFP/GFP; obrazy mikroskopowe.
Rycina 3: Przykłady kwantyfikacji dynamiki receptorów. Pojedyncze (niebieskie) lub zgrupowane neutrofile (zielone) w ranach lub neutrofile niemobilizowane w CHT (czerwone, pomarańczowe) zostały poddane segmentacji i analizie za pomocą różnych metod w celu porównania wyników. Te same przykładowe komórki zostały przeanalizowane dwiema metodami, aby powiązać obraz z zakresem wyekstrahowanych wartości. (A) Powierzchnia wybranych przykładowych komórek została wysegmentowana na podstawie definicji konturu w kanale sfGFP. (B) Kontrast obliczono dla przykładowych komórek przedstawionych w części A. (C) Membrana wybranych przykładowych komórek została wysegmentowana na podstawie definicji konturu w kanale CFP. Następnie przeprowadzono analizę ratiometryczną sfGFP/CFP. (D) Stosunek sfGFP/CFP obliczono dla przykładowych komórek przedstawionych w części C. Słupki błędów reprezentują S.E.M. z pojedynczych komórek; w przypadkach n>1 wartości te nie zostały użyte do analizy statystycznej, a jedynie w celu zilustrowania pomiarów uzyskanych różnymi metodami kwantyfikacji. Pasek skali = 10 µm. Rycina zmodyfikowana z ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy mikroskopowe i wykres odpowiedzi na ranę u danio pręgowanego; ekspresja sfGFP; analiza Cxcr1/Cxcr2.
Rycina 4: Zróżnicowana dynamika Cxcr1 i Cxcr2 w odpowiedzi na zranienie. (A) Projekcja konfokalna neutrofili w larwach Tg(lyz:Cxcr1-FT) lub Tg(lyz:Cxcr2-FT) w miejscu rany w 80 min po zranieniu (pokazano kanał sfGFP). Pasek skali = 10 µm.  (B) Powiększony neutrofil Cxcr1-FT (lewo) oraz Cxcr2-FT (prawo) w miejscu rany. Zielony receptor przedstawiono w kolorze szarym. Pasek skali = 5 µm. (C) Znormalizowany kontrast (kontrast pojedynczego neutrofila znormalizowany do średniego kontrastu komórek niemobilizowanych w CHT). cxcl8a odnosi się do wstrzyknięcia morpholino blokującego splicing wraz z morpholino blokującym translację cxcl8a. cxcl8b odnosi się do wstrzyknięcia morpholino blokującego splicing dla cxcl8b. Dla Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 komórki (CHT), n=47 komórki (rana) z 8 larw. Dla Tg(lyz:Cxcr1-FT) z morpholinami: n=28 komórek (Cxcl8a-MO) z 5 larw, n=16 komórek (Cxcl8b-MO) z 5 larw. Dla Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 komórek (CHT) i n=20 komórek (rana) z 3 larw. Dane zostały połączone z niezależnych larw uzyskanych w 1-5 sesjach obrazowania. Test Kruskala-Wallisa z testem wielokrotnych porównań Dunna dla Tg(lyz:Cxcr1-FT), dwustronny nieparzysty test Manna-Whitneya dla Tg(lyz:Cxcr2-FT). (D) Projekcja konfokalna neutrofili w transgenicznych larwach Tg(lyz:Cxcr1-FT) traktowanych morpholiną (MO) cxcl8a (lewo) oraz MO cxcl8b (prawo) reagujących na rany płetwy (kanał sfGFP pokazany na zielono). Migawka wykonana w punktach czasowych odpowiadających równemu poziomowi akumulacji neutrofili (85 min po zranieniu na obrazie po lewej i 45 min po zranieniu na obrazie po prawej). Pasek skali = 10 µm. Rycina zmodyfikowana na podstawie ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej: znakowane białka, wiązanie receptor-ligand, lokalizacja komórkowa.
Rysunek 5: Analiza odpowiedzi na chemokiny we wczesnych embrionach. Przekroje konfokalne z laserowym skanowaniem gastrulujących embrionów, ukazujące ekspresję i rozmieszczenie Cxcr1-FT. 100 pg mRNA Cxcr1-FT wstrzyknięto do jaj w stadium jednej komórki z dodatkiem lub bez dodatku 150 pg mRNA Cxcl8a. Zielone i czerwone receptory przedstawiono w oddzielnych kanałach. Kontrolny marker błonowy CFP (mCFP) pokazano w kanale cyjanowym. Pasek skali = 20 μm. Rysunek zmodyfikowany z ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Film uzupełniający 1: Transgeniczne neutrofile w głowie larwy Tg(lyz:Cxcr1-FT) (po lewej) i Tg(lyz:Cxcr2-FT) (po prawej) w 3 dpf. sfGFP (zielony), tagRFP (magenta). Odstęp między klatkami wynosi 30 sec, a częstotliwość klatek to 5 fps. Pasek skali = 20 μm. Materiał wideo pochodzi z ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film uzupełniający 2: Neutrofile w larwach transgenicznych Tg(lyz:Cxcr1-FT) (lewo) i Tg(lyz:Cxcr2-FT) (prawo) reagujące na rany płetwy. Film rozpoczyna się w ciągu 10 min po zranieniu i trwa 60 min. sfGFP (zielony), tagRFP (magenta). Interwał między klatkami wynosi 30 sec, a liczba klatek na sekundę to 10 fps. CHT = tkanka krwiotwórcza ogonowa. VF = płetwa brzuszna. Pasek skali = 25 μm. Wideo pochodzi z ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Dodatkowy film 3. Dodatkowe przykłady neutrofili z ranionej larwy transgenicznej Tg(lyz:Cxcr1- FT) (inna larva niż ta pokazana w Filmie 2), zarejestrowane w wyższej rozdzielczości, ukazujące internalizację receptorów (kanał sfGFP pokazany na zielono) podczas mobilizacji w CHT lub podczas wnikania i chemotaksji w płetwie brzusznej. Odstęp między klatkami wynosi 30 sec, a częstotliwość klatek 2 fps. Pasek skali = 10 μm. Film pochodzi z ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Plik uzupełniający 1: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Plik uzupełniający 4: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Opisana metoda pozwala na obrazowanie na żywo dynamiki receptorów w odpowiedzi na endogenne ligandy in situ podczas odpowiedzi zapalnej na uszkodzenie tkanek. Zastosowanie reporterów neutrofili Cxcr1/Cxcr2 można rozszerzyć na inne ustawienia fizjologiczne, takie jak infekcje, modele nowotworów lub inne rodzaje uszkodzeń tkanek 14,25,26,27. Ponadto transgeniczne linie ratunkowe, w których endogenny receptor jest tłumiony i ratowany przez egzogenny zmutowany receptor, mogą dostarczyć użytecznych narzędzi do analizy znaczenia określonych wzorców migracji neutrofili w odpowiedziach immunologicznych. Na przykład mutanty receptora Cxcr1, które mają upośledzoną desensytyzację, powodują bardziej widoczne grupowanie neutrofili w miejscach zapalnych14. Ten fenotyp wzmocnienia funkcji może być wykorzystany do zrozumienia roli gromadzenia neutrofili w różnych procesach fizjologicznych, np. gojeniu ran, chorobach zakaźnych lub ewolucji guza, a także eksperymentach z knockdownem/nokautem receptora dopełniacza. Metodologia ta stanowi również podstawę do rozszerzenia zakresu dostępnych podmiotów zgłaszających. Wybór reportera fluorescencyjnego jest ważny do rozważenia i zależy od kwestii biologicznej. Stwierdziliśmy, że konstytutywny obrót tych receptorów chemokiny w neutrofilach był wysoki w porównaniu z komórkami nabłonkowymi i że reporterzy o szybkim dojrzewaniu (np. sfGFP) byli zobowiązani do zgłaszania poziomów błony w stanie stacjonarnym i usuwania różnic po stymulacji neutrofili 8,14. Tak więc proporcje błonowe sfGFP / tagRFP nie mają zastosowania do pomiaru internalizacji indukowanej ligandem w tym typie komórki, ale wzór tagRFP umożliwia śledzenie wewnątrzkomórkowych losów receptora, co może być przydatne w niektórych badaniach. Odkryliśmy również, że bardziej skoncentrowany wewnątrzkomórkowy sygnał tagRFP jest przydatny do badań przesiewowych poszczególnych larw. Alternatywnym podejściem do pomiaru poziomów receptorów w błonie plazmatycznej byłaby koekspresja fluorescencyjnego markera błonowego w neutrofilach w tym samym transgenie9 lub w niezależnym transgenie14. W pierwszym scenariuszu transgen zapewniłby dodatkowy środek do badań przesiewowych ryb, a poziomy ekspresji byłyby porównywalne między markerem a receptorem. To drugie podejście byłoby bardziej modułowe, w tym sensie, że linia danio pręgowanego z reporterem receptorowym mogłaby być łączona z różnymi liniami reporterowymi. W obu przypadkach warto zauważyć, że kwantyfikacja poziomów receptorów w błonie jest trudna w zgrupowanych neutrofilach (patrz poniżej). Na koniec zauważamy, że możliwym rozszerzeniem tego protokołu byłoby kontynuowanie obrazowania na żywo za pomocą immunohistochemii w celu uzyskania bardziej szczegółowych analiz lokalizacji.

System transgenezy Tol2 jest dobrze ugruntowany7, a promotor lizozymu C jest szeroko stosowany do ekspresji neutrofili11,15. Podejście transgenezy jest zatem stosunkowo proste, a poziom ekspresji osiągnięty za pomocą tego promotora jest wystarczająco wysoki, aby zapewnić wystarczający kontrast do analizy dynamiki receptora. Możliwym ograniczeniem jest to, że poziom ekspresji nie podsumowuje poziomów ekspresji receptorów endogennych. Nowe technologie CRISPR mogą zostać wykorzystane do ustanowienia linii knock-in dla receptorów o szczególnym znaczeniu28. Technologie te są nadal kłopotliwe i mogą nie gwarantować wymaganych poziomów ekspresji dla obrazowania subkomórkowego, ale ich pomyślny rozwój byłby ważnym przełomem w zrozumieniu endogennej dynamiki sygnalizacji. Walidacje funkcjonalne są ważne dla interpretacji danych z konstruktami receptorów transgenicznych. Na przykład testy rozpoznawania ligandów można wykorzystać do ustalenia, że fluorescencyjne białko fuzyjne jest funkcjonalne, a uratowanie fenotypów nokautu można wykorzystać do ustalenia, że poziomy ekspresji transgenicznych neutrofili są zgodne z funkcjonalnością14. Wreszcie, bardziej bezpośrednim sposobem walidacji fuzji receptorów byłoby zastosowanie testu funkcjonalnego in vitro z znakowanym receptorem wraz z nieznakowanymi wersjami14.

Podejście oparte na kwantyfikacji rozwiązuje konkretne trudności związane z dokładną segmentacją błon w neutrofilach in vivo. W komórkach o charakterze nabłonkowym kwantyfikacja poziomów receptorów może być wykonywana automatycznie poprzez normalizację poziomów receptorów błonowych do markera kontrolnego, który może być wyrażany w tandemie lub oddzielnie9. Rzeczywiście, zastosowaliśmy takie podejście, stosując test rozpoznawania ligandów w gastrulujących zarodkach14. Jednak neutrofile ulegają złożonym, szybkim zmianom kształtu komórek in vivo, co utrudnia segmentację błony zarówno w 2D, jak i3D 14. Jest to jeszcze trudniejsze w przypadku grupowania neutrofili, co występuje w wielu warunkach fizjologicznych29. Metryka kontrastu pokonuje to ograniczenie, ponieważ nie wymaga segmentacji błony, ale zamiast tego odzwierciedla ogólny stan rozmieszczenia receptorów w komórce (błoniasty / gładki vs pęcherzykowy / kropkowany). Ważne jest, aby pamiętać, że na metrykę kontrastu może mieć wpływ ogólny kontrast obrazu, dlatego wymagana jest normalizacja wartości poszczególnych komórek do wewnętrznego odniesienia, aby uwzględnić zmienność sygnału w różnych zarodkach/próbkach. Na przykład, użyliśmy średniej wartości kontrastu komórek niereagujących neutrofili w CHT (tj. neutrofili, które pozostają nieruchome i nie migrują do płetwy brzusznej)14. Dodatkową możliwością byłaby normalizacja za pomocą wartości kontrastu markera kontrolnego w tej samej komórce. Zapewniłoby to rozwiązanie, gdy wewnętrzne odniesienie do komórek niereagujących nie jest dostępne i prawdopodobnie mogłoby rozwiązać drobniejsze różnice ilościowe w dynamice receptorów między różnymi warunkami.

Lokalizacja obrazowania to kolejna zmienna, którą należy wziąć pod uwagę. Powodem, dla którego wybrano tutaj ranę płetwy brzusznej, w przeciwieństwie do częściej stosowanego modelu rany płetwy ogonowej16,30, jest to, że miejsce zranienia znajduje się w pobliżu miejsca zamieszkania neutrofili/pochodzenia migracyjnego. Przyspiesza to czas trwania testu, ponieważ dotarcie neutrofili zajmuje stosunkowo niewiele czasu. Dodatkowo daje możliwość uchwycenia zachowania komórek zarówno na początku migracji (CHT), jak i w docelowym miejscu zainteresowania (rana). Jest to tutaj istotne, ponieważ rozdzielczość przestrzenna i czasowa wymagana do obrazowania subkomórkowego jest trudna do połączenia z dużym polem widzenia lub skanowaniem wielopozycyjnym. W ten sposób test rany płetwy brzusznej pozwala na śledzenie ewolucji odpowiedzi migracyjnej od początku migracji i jednoczesne wychwytywanie niespecyficznych fluktuacji receptorów w komórkach, które nie reagują. Jak wspomniano powyżej, ta ostatnia metoda jest przydatna do celów kwantyfikacji, ponieważ stanowi wewnętrzne odniesienie dla dynamiki niespecyficznej. W innych systemach uzyskanie takiego wewnętrznego odniesienia może nie być możliwe, w którym to przypadku wartości kontrastu współwyrażonego markera błonowego stanowiłyby alternatywną kontrolę.

Podsumowując, przewidujemy, że metodologia ta ma zastosowanie do innych systemów i może być stosowana do różnych celów. Na przykład te same reportery mogą być wykorzystywane w innych warunkach zapalnych, takich jak infekcje lub inne modele choroby. Repertuar linii reporterowych receptorów danio pręgowanego można rozszerzyć na inne receptory sygnałowe, aby zrozumieć mechanizmy sygnalizacji lub przedstawić dynamikę ligandów in vivo. Podejście to można połączyć z technikami knockdown/knockout w celu zbadania mechanistycznych podstaw obserwowanej dynamiki. Na przykład zaburzenie ekspresji liganda może wskazywać na zależność liganda od obserwowanej dynamiki receptora. Przewidujemy, że w przyszłości system będzie mógł być dalej udoskonalany w celu uwzględnienia funkcji wstawiania zgłoszeń typu knock-in. Ostatecznie, odkrycia wykorzystujące tę metodologię dostarczyłyby nowych informacji cennych nie tylko w społeczności danio pręgowanego, biorąc pod uwagę ochronę tych receptorów sygnałowych u ssaków i względne wyzwanie związane z prowadzeniem tych badań na większych organizmach.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów

Podziękowania

Dziękujemy Christine Holt i Billowi Harrisowi za pomoc w mikroskopii konfokalnej. Dziękujemy Darrenowi Gilmourowi za konstrukcje szkieletowe zegara fluorescencyjnego i Annie Huttenlocher za wektor szkieletowy Tol2-Lyz. Dziękujemy Steve'owi Renshawowi za linię Tg(mpx:GFP)i114. Prace te były wspierane przez MRC (MR/L019523/1), Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] oraz grant Isaac Newton Trust 19.23(n). C.C. był wspierany przez stypendium MRC DTP i częściowo przez Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Dotacja Isaac Newton Trust [12.21(a)i]. H.W. był wspierany przez stypendium MRC DTP. H.P. był wspierany przez Wellcome Trust PhD Grant (105391/Z/14/Z) oraz częściowo przez Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Grant Isaac Newton Trust [12.21(a)i] oraz MRC (MR/L019523/1).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-fenylo-2-tiomocznikSigma-AldrichP7629-25G
50mL Probówka wirówkowa CellStarGrenier Bio-One Limited210270
Szkło kapilarne ClarkAparat Harvard30-0020
Cleanline Thin BleachNaukowe materiały laboratoryjneCLE0301
Luneta sekcyjnaNikonSMZ645
Grzałka blokowa DriTechneFDB02AD
FijiNational Institutes of Health, Bethesda, MD
Kleszcze, Jubilerzy Dumont No. 5Sigma-AldrichF6521
Naczynia mikrostudzienkowe ze szklanym dnemMatTekP35G-1.5-14-C
Szklana pipeta PasteuraFisherbrand11795098
Zestaw do transkrypcji Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Mikroskop konfokalnyInvitrogen10391175
Leica SP8LeicaN/A
Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaInvitrogen16520-100
Stojak magnetycznyNarishigeGJ-1
MATLABThe MathWorks, Inc., Natick, MA
BłękitmetylenowySigma-AldrichM9140-25G
MgSO4Sigma-AldrichM-2643
System mikroiniekcjiKońcówkiPicospritzer III
MicroloaderEppendorf5242956003
MicromanipulatorNarishigeM-152
Ściągacz do mikropipetSutter Instrument CompanyFlaming/Brown P-97
Szkiełko mikroskopoweThermo-ScientificJ1800AMNZ
PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem Olympus IX81OlympusN/A
szalka Petriego (120mm)Grenier Bio-One Limited632180
Czerwień fenolowaSigma-AldrichP0290-100ML
Poly(A) Zestaw do ogonowaniaInvitrogenAM1350
PrismGraphPad Software
Mały pędzel malarskiNie dotyczy
Spectral Applied Research ModułNie dotyczy
Ostrze skalpela chirurgicznego nr 23Swann-Morton233-5528
Tricaine MS222Sigma-AldrichE10521-50G
Oprogramowanie VolocityNie dotyczy
Yokogawa CSU10 skaner konfokalny z wirującym dyskiemYokogawaN/A
do pipet Parker laserowy LMM5

Bibliografia

  1. Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).
  2. Cotton, M., Claing, A. G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration. Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).
  3. Liu, X., et al. Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases. Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).
  4. Wen, X., Jin, T., Xu, X. Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells. Journal of Visualized Experiments. (115), e54511(2016).
  5. Arnon, T. I., et al. GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood. Science. 333 (6051), 1898-1903 (2011).
  6. Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4. PloS One. 10 (6), 0128387(2015).
  7. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  8. Donà, E., et al. Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient. Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).
  9. Venkiteswaran, G., et al. Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue. Cell. 155 (3), 674-687 (2013).
  10. Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration. Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).
  11. Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. Journal of Cell Science. 125, Pt 23 5702-5710 (2012).
  12. Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
  13. Buchan, K. D., et al. A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase. PLoS One. 14 (4), 0215592(2019).
  14. Coombs, C., et al. Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish. Nature Communications. 10 (1), 5166(2019).
  15. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42(2007).
  16. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  17. Khmelinskii, A., et al. Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics. Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).
  18. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
  19. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), 1115(2009).
  20. Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , Elsevier. Burlington. (2004).
  21. Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  22. Chan, T. F., Vese, L. A. Active contours without edges. IEEE Transactions on Image Processing. 10 (2), 266-277 (2001).
  23. Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. Textural features for image Classification. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).
  24. Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).
  25. Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology. Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).
  26. Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation. PLoS Biology. 8 (12), 1000562(2010).
  27. Poplimont, H., et al. Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals. Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).
  28. Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline. Frontiers in Pharmacology. 9, 703(2018).
  29. Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
  30. Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. Journal of Visualized Experiments. (95), e52654(2015).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Konfokalna mikroskopia dysku rotującegointernalizacja receptoraCXCR1 CXCR2metryka kontrastuzranienie płetwy brzusznejgrupowanie neutrofili
Obrazowanie na żywo receptorów chemokiny w neutrofilach danio pręgowanego podczas reakcji na ranę
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.