Artykuł metodologiczny

Wysokowydajne i głębokie profilowanie proteomu za pomocą 16-pleksowego etykietowania znaczników masy w tandemie w połączeniu z chromatografią dwuwymiarową i spektrometrią mas

DOI:

10.3791/61684

⸱

18 sierpnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 2Center for Proteomics and Metabolomics, St. Jude Children's Research Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół o wysokiej przepustowości, opracowany z 16-pleksowymi tandemowymi odczynnikami do oznaczania masy, umożliwiający ilościowe profilowanie proteomu próbek biologicznych. Rozległe frakcjonowanie zasadowe pH i LC-MS/MS o wysokiej rozdzielczości łagodzą kompresję proporcji i zapewniają głębokie pokrycie proteomu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znakowanie izobarycznego tandemowego znacznika masy (TMT) jest szeroko stosowane w proteomice ze względu na jego wysoką zdolność multipleksowania i głębokie pokrycie proteomem. Niedawno wprowadzono rozszerzoną metodę 16-plex TMT, która dodatkowo zwiększa przepustowość badań proteomicznych. W tym manuskrypcie przedstawiamy zoptymalizowany protokół 16-pleksowego profilowania głębokiego proteomu opartego na TMT, w tym przygotowanie próbki białka, trawienie enzymatyczne, reakcję znakowania TMT, frakcjonowanie dwuwymiarowej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (LC/LC), tandemową spektrometrię mas (MS/MS) oraz przetwarzanie danych obliczeniowych. Podkreślono kluczowe etapy kontroli jakości i ulepszenia procesu specyficzne dla analizy TMT 16-plex. Ten multipleksowany proces stanowi potężne narzędzie do profilowania różnych złożonych próbek, takich jak komórki, tkanki i próbki kliniczne. Ponad 10 000 białek i modyfikacji potranslacyjnych, takich jak fosforylacja, metylacja, acetylacja i ubikwitynacja w wysoce złożonych próbkach biologicznych z maksymalnie 16 różnych próbek, można określić ilościowo w jednym eksperymencie, zapewniając potężne narzędzie do badań podstawowych i klinicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szybki rozwój technologii spektrometrii mas umożliwił osiągnięcie wysokiej czułości i głębokiego pokrycia proteomem w zastosowaniach proteomicznych1,2. Pomimo tych zmian, multipleksowanie próbek pozostaje wąskim gardłem dla badaczy zajmujących się analizą dużej kohorty próby.

Multipleksowane techniki znakowania izobarycznego są szeroko stosowane do względnej kwantyfikacji dużych partii próbek na całym proteomie3,4,5,6. Kwantyfikacja oparta na znacznikach masy tandemowej (TMT) jest popularnym wyborem ze względu na wysoką zdolność multipleksowania7,8. Odczynniki TMT zostały początkowo wprowadzone na rynek jako zestaw 6-plex zdolny do ilościowego oznaczania do 6 próbek jednocześnie9. Technologia ta została rozszerzona o ilościowe oznaczanie 10-11 próbek10,11. Niedawno opracowane odczynniki 16-plex TMTpro (zwane dalej TMT16) jeszcze bardziej zwiększyły zdolność multipleksowania do 16 próbek w jednym eksperymencie12,13. Odczynniki TMT16 wykorzystują grupę reporterową opartą na prolinie, podczas gdy 11-plex TMT stosuje grupę reporterową pochodzącą z dimetylopiperydyny. Zarówno TMT11, jak i TMT16 wykorzystują tę samą grupę reaktywną aminy, ale grupa bilansu masy TMT16 jest większa niż TMT11, co umożliwia połączenie 8 stabilnych izotopów C13 i N15 w jonach reporterowych w celu uzyskania 16 reporterów (Rysunek 1).

Wzrost możliwości multipleksowania stanowi platformę do projektowania eksperymentów z wystarczającą liczbą powtórzeń, aby sprostać wyzwaniom statystycznym14. Co więcej, dodatkowe kanały w 16-plex TMT pomagają zmniejszyć całkowitą ilość materiału wyjściowego na kanał, co może pomóc w rozwoju powstającej proteomiki pojedynczej komórki15. Wysoka zdolność multipleksowania będzie również cenna w ilościowym określaniu modyfikacji potranslacyjnych, które zazwyczaj wymagają dużych ilości materiału wyjściowego16,17.

Proteomiczne przepływy pracy wykorzystujące technologię TMT zostały usprawnione18,19,20, a w ciągu ostatniej dekady znacznie się rozwinęły pod względem przygotowania próbek, separacji metodą chromatografii cieczowej, pozyskiwania danych ze spektrometrii mas i analizy obliczeniowej21,22,23,24,25,26. Nasz poprzedni artykuł zawiera dogłębny przegląd platformy TMT 10-plex27. Opisany tutaj protokół wprowadza szczegółową, zoptymalizowaną metodę TMT16, w tym ekstrakcję i trawienie białka, znakowanie TMT16, łączenie i odsalanie próbek, zasadowe pH i kwaśną fazę odwróconej fazy pH (RP) LC, MS o wysokiej rozdzielczości i przetwarzanie danych (Rysunek 2). W protokole podkreślono również kluczowe etapy kontroli jakości, które zostały włączone w celu pomyślnego zakończenia ilościowego eksperymentu proteomicznego. Protokół ten może być rutynowo stosowany do identyfikacji i ilościowego oznaczania ponad 10 000 białek o wysokiej odtwarzalności, do badania szlaków biologicznych, procesów komórkowych i progresji choroby20,28,29,30.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie tkanki do badania zostały uzyskane za zgodą Programu Dawstwa Mózgu i Ciała w Instytucie Badawczym Zdrowia Banner Sun.

1. Ekstrakcja białka z tkanek i kontrola jakości

UWAGA: Aby zmniejszyć wpływ pobierania próbek na proteom, ważne jest pobieranie próbek w jak najkrótszym czasie w niskiej temperaturze, jeśli to możliwe31. Jest to szczególnie ważne podczas analizy modyfikacji potranslacyjnych, ponieważ zazwyczaj są one labilne, na przykład niektóre zdarzenia fosforylacji mają tylko kilka sekund okresu półtrwania32,33.

  1. Akcyza i ważenie próbek tkanek
    1. Wytaruj probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml za pomocą wagi analitycznej i wstępnie schłodź probówkę nad suchym lodem.
    2. Wytnij zamrożoną tkankę (np. ludzką tkankę mózgową, ~10 mg) z określonego obszaru na małe kawałki i natychmiast przenieś fragmenty tkanki do wstępnie schłodzonej probówki.
      UWAGA: Aby zmniejszyć niejednorodność próbki, ważne jest, aby użyć jednorodnych rozmiarów i regionów anatomicznych dla wszystkich 16 próbek. Ilość białka uzyskanego z tkanki wynosi zazwyczaj 5-10% masy tkanki.
    3. Zważ probówkę wraz z chusteczką i natychmiast umieść probówkę na suchym lodzie. Pozostałe 15 próbek należy przetworzyć przy użyciu tej samej procedury. Próbki należy przechowywać w suchym lodzie natychmiast po rozbiorze i przechowywać w temperaturze ˗80 °C.
  2. Liza próbek tkanek
    1. Przygotuj świeży bufor do lizy (50 mM HEPES pH 8,5, 8 M mocznika i 0,5% deoksycholanu sodu) w dniu eksperymentu. Inhibitory fosfatazy należy dodać do buforu do lizy, aby zachować stan fosforylacji białek.
      UWAGA: Przed użyciem należy umieścić bufor do lizy w temperaturze pokojowej, ponieważ 8 M mocznika wytrąca się na lodzie, co może spowodować niepełną denaturację białka podczas lizy próbki i zmniejszyć wydajność trawienia białek.
    2. Dodać bufor do lizy (dodać 100 μl buforu do lizy na 10 mg tkanki, aby uzyskać końcowe stężenie białka od 5 do 10 μg/μL) i szklane kulki (~20% objętości lizatu, średnica 0,5 mm) do każdej próbki.
    3. Ubić tkankę w blenderze w temperaturze 4 °C z prędkością 8 przez 30 s, odpocząć przez 5 s, powtarzać aż do homogenizacji próbek (~ 5 cykli).
  3. Przygotować podwielokrotności lizatów.
    1. Przygotować co najmniej dwie podwielokrotności dla każdej próbki. Mała porcja (~10 μL) jest używana do analizy stężenia białka i oceny jakości białka (np. walidacja Western blot białek kontroli pozytywnej). Większa podwielokrotność (~50 μL) jest używana do analizy proteomu.
    2. Podwielokrotności należy natychmiast zamrozić na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
  4. Zmierz stężenie białka
    UWAGA: Stężenie białka można zmierzyć za pomocą testu BCA lub metody barwienia żelem w krótkim SDS34(Rysunek 3A). Ponieważ składniki nieredukujące białka w lizacie tkankowym mogą wpływać na pomiar w teście BCA, użytkownicy mogą zweryfikować stężenie białka za pomocą metody barwienia żelem SDS. Krótka metoda barwienia żelem SDS jest przedstawiona tutaj.
    1. Rozcieńczyć 16 porcjowanych próbek 10-krotnie i przygotować wzorzec BSA (np. miareczkowanie BSA 0,15, 0,5, 1,5 i 3 μg).
    2. Uruchomić próbki i wzorzec BSA na 10% żelu SDS-PAGE (26 dołków) z żelem do układania w stosy, aż wszystkie białka przeniosą się na około 3 mm do żelu.
    3. Zabarwij żel kolorem Coomassie blue przez 1 godzinę i odbarwiaj żel, aż tło w pustym obszarze będzie czyste.
    4. Zeskanuj żel, aby zmierzyć intensywność prążków białkowych barwionych Coomassie za pomocą ImageJ i utwórz standardową krzywą BSA zgodnie z pomiarami.
    5. Obliczyć bezwzględne stężenie białka za pomocą krzywej wzorcowej.
      UWAGA: Końcowe stężenie białka dla każdej próbki w tym eksperymencie wynosiło ~5-10 μg/μL. Do analizy proteomicznej opartej na TMT16 wystarczy 50 μg białka na próbkę (łącznie 0,8 mg białka do analizy całego proteomu).
  5. Kontrola jakości próbki
    UWAGA: Ten etap kontroli jakości ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji próbek niskiej jakości przed wykonaniem analizy TMT. W przypadku próbek ze znaną zmianą białka sugeruje się walidację zmiany za pomocą western blot. Standardowa analiza SDS-PAGE jest również zalecana w celu zbadania wzorców białek i wykluczenia wszelkich próbek o wysokim stopniu degradacji (Rysunek 3B).
    1. Pobrać ~10 μg każdej próbki z małej podwielokrotności i przepuścić próbki na gradientowym żelu SDS-PAGE, aż niebieski barwnik bromofenolowy dotrze do dna żelu.
    2. Zabarwić żel kolorem Coomassie blue i odplamić żel. Sprawdź jakość białka, aby usunąć próbki białek o wysokim stopniu degradacji.
      UWAGA: Zdegradowane próbki można zidentyfikować jako takie, które mają bardzo mało prążków białkowych w regionie o wysokiej masie cząsteczkowej i zintensyfikowane prążki w regionie o niskiej masie cząsteczkowej (Rysunek 3B).

2. Trawienie białek w roztworze, redukcja peptydów i alkilowanie, test efektywności trawienia i odsalanie peptydów

  1. Trawienie białek przez Lys-C i trypsynę
    1. Weź ~ 50 μg białka z dużej porcji każdej próbki i dodaj bufor do lizy do 50 μl.
    2. Dodaj 100% acetonitrylu (ACN), aby osiągnąć końcowe stężenie 10%.
    3. Przeprowadź trawienie Lys-C, dodając Lys-C w stosunku białko:Lys-C 100:1 (w/w) i inkubując w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
    4. Próbki rozcieńcza się tak, aby zawierały końcowe stężenie 2 M mocznika przez 50 mM HEPES (pH 8,5).
    5. Dodaj trypsynę do każdej próbki w stosunku białko do trypsy 50:1 (w/w) i przeprowadzaj trawienie w temperaturze pokojowej przez 3 godziny lub przez noc.
  2. Redukcja peptydów i alkilowanie
    1. Dodać świeżo przygotowany roztwór ditiotreitolu (1 M DTT) do końcowego stężenia 1 mM i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w celu zmniejszenia wiązań dwusiarczkowych.
    2. Dodać świeżo przygotowany roztwór jodoacetamidu (1 M IAA) do końcowego stężenia 10 mM przez 30 minut w ciemności, aby alkilować reszty cysteiny.
    3. Ugasić nieprzereagowany IAA, dodając 1M DTT do końcowego stężenia 30 mM i inkubować w temperaturze pokojowej przez kolejne 30 minut.
  3. Zbadaj wydajność trawienia
    1. Pobrać ~1 μg z każdej próbki i odsolić za pomocą końcówek do pipet pokrytych żywicą C18 zgodnie z protokołem producenta.
    2. Przeanalizuj każdą próbkę za pomocą krótkiego gradientowego przebiegu LC-MS/MS (więcej szczegółów w kroku 5).
    3. Przeszukaj bazę danych pod kątem nieprzetworzonych danych MS (więcej szczegółów w kroku 6). Oblicz procent zidentyfikowanych peptydów z co najmniej jednym miejscem nieprawidłowego rozszczepienia trypsyny. Odsetek ten wynosi zwykle poniżej 15%.
    4. Jeśli procent jest większy niż 15%, dodaj dodatkową trypsynę do próbek, aby powtórzyć trawienie.
    5. Po mineralizacji próbki należy zakwasić, dodając TFA do 0,5% (v/v). Sprawdź pH za pomocą paska pH, aby upewnić się, że pH jest niższe niż 3.
  4. Odsalanie peptydów
    1. Odwirować zakwaszone peptydy w stężeniu 21 000 x g przez 10 minut. Przenieść supernatanty do nowej probówki.
    2. Kolumny odsalające C18 (~25 μL żywicy) przepłukać dwukrotnie 250 μL 100% metanolu przez odwirowanie przy 500 x g przez 30 s.
      UWAGA: Aby zmniejszyć utratę peptydów podczas procesu odsalania, wybierz kolumny odsalające o zdolności wiązania dopasowanej do ilości wsadu.
    3. Przepłukać kolumny dwukrotnie przy użyciu 250 μl buforu elucyjnego (60% ACN, 0,1% TFA) przez odwirowanie przy 500 x g przez 30 s.
    4. Zrównoważyć kolumny dwukrotnie 250 μl równoważenia i przemywać bufor (0,1% TFA) przez odwirowanie przy 500 x g przez 30 s.
    5. Załadować próbki na kolumny wstępnie zrównoważone. Pozostawić próbki do połączenia się z kolumnami, wirując w tempie 100 x g przez 6 minut. Upewnij się, że cały roztwór przeszedł przez kolumnę.
    6. Przemyć kolumny trzykrotnie 250 μl równowagi i przepłukać bufor przez odwirowanie przy 500 x g przez 30 s.
    7. Eluować peptydy, dodając 125 μl buforu elucyjnego do każdej kolumny i wirując z prędkością 100 x g przez 3 minuty. Sprawdzić, czy kolumna nie zawiera żadnych resztek roztworu.
    8. Wysuszyć eluowane peptydy w koncentratorze próżniowym i przechowywać peptydy w temperaturze -80 °C do przyszłego etykietowania TMT.

3. Etykietowanie peptydów TMT16, test efektywności etykietowania, łączenie próbek i odsalanie peptydów oznaczonych

  1. Znakowanie peptydów TMT16
    1. Zawiesić każdą odsoloną próbkę peptydu w 50 μl 50 mM HEPES (pH 8,5) poprzez kilkukrotne wirowanie lub rozpuszczenie ultradźwiękowe, a następnie użycie paska pH w celu sprawdzenia pH
      UWAGA: Próbka może być kwaśna, jeśli nie zostanie całkowicie wysuszona przed etykietowaniem, co negatywnie wpływa na skuteczność etykietowania. Upewnij się, że pH wynosi od 7 do 8.
    2. Weź ~1 μg nieznakowanych peptydów z każdej próbki jako kontrolę ujemną do testu skuteczności etykietowania TMT.
    3. Rozpuść odczynniki TMT16 w bezwodnym ACN. Przeprowadzić reakcję znakowania, dodając odczynniki w stosunku TMT:białko 1,5:1 (w/w) i inkubując w temperaturze pokojowej przez 30 min.
      UWAGA: Stosunek TMT do białka stosowany w TMT16 jest o 50% wyższy niż stosunek stosowany w TMT11. Ta niewielka rozbieżność może wynikać z tego, że masa cząsteczkowa TMT16 jest większa (1,2-krotnie) niż odczynników TMT11. Ilość białka szacuje się na podstawie próbek bez uwzględnienia strat podczas odsalania.
  2. Test skuteczności etykietowania
    1. Weź ~1 μg znakowanych peptydów z każdej próbki do testu skuteczności znakowania. Umieścić pozostałe próbki w temperaturze -80 °C bez wygaszania reakcji.
    2. Odsolić ~1 μg każdą z próbek znakowanych i nieznakowanych TMT16 za pomocą końcówek do pipet pokrytych żywicą C18 zgodnie z protokołem producenta.
    3. Analizować próbki metodą LC-MS/MS (patrz sekcja 5, z wyjątkiem sytuacji, gdy gradient wynosi 10 minut).
    4. Oszacuj skuteczność etykietowania, analizując redukcję intensywności MS1 nieznakowanych peptydów między próbkami nieznakowanymi i znakowanymi. Wybierz od 6 do 10 różnych peptydów, aby zweryfikować skuteczność etykietowania i upewnić się, że wszystkie peptydy są oznakowane. W celu pełnego etykietowania nie obserwuje się nieznakowanych peptydów.
      UWAGA: Ważne jest, aby zapewnić pełne oznakowanie wszystkich próbek w celu dokładnej identyfikacji i kwantyfikacji białek w dalszej części procesu.
    5. Jeśli etykietowanie nie jest kompletne, dodaj dodatkowe odczynniki TMT, aby oznaczyć pozostałe peptydy i ponownie sprawdź skuteczność etykietowania przed hartowaniem. Po całkowitym znakowaniu próbki wygasić reakcję w temperaturze pokojowej, dodając hydroksyloaminę do końcowego stężenia 0,5% i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  3. Gromadzenie próbek i odsalanie
    1. Zebrać połowę każdej próbki znakowanej TMT w celu uzyskania mieszaniny.
    2. Pobrać 1 μg z mieszaniny i odsolić za pomocą końcówek do pipet pokrytych żywicą C18, a następnie przeanalizować za pomocą LC-MS/MS przy użyciu krótkiego gradientu (~30 min).
    3. Oblicz stężenie względne, używając średniej intensywności każdego jonu reporterowego TMT16 i porównując rozbieżności między 16 kanałami. Aby uzyskać równomierne wymieszanie każdego kanału, dodaj pozostałą część próbek znakowanych TMT do mieszaniny zgodnie z obliczoną średnią intensywnością. Powtarzać regulację, aż wszystkie próbki zostaną równomiernie wymieszane. Reprezentatywne dane przedstawiające proces grupowania próbek przedstawiono w tabeli 1.
      UWAGA: Ponieważ błędy pipetowania mogą mieć wpływ na dokładność stężeń i ilościowe oznaczanie białka, ważne jest, aby zapewnić prawidłowe łączone ilości. Rozbieżności w intensywności wśród 16 próbek powinny być mniejsze niż 5%.
  4. Oznakowane odsalanie peptydów
    UWAGA: Ponieważ pochodne tła w reakcji znakowania TMT16 (np. TMTpro-NHOH z reakcji hartowania hydroksyloaminy i TMTpro-OH z hydroksylacji TMT) są hydrofobowe, w przypadku próbek znakowanych TMT16 stosuje się rozległe warunki mycia, aby skutecznie usunąć pochodne. Stosuje się dodatek 5% ACN w zwykłym buforze do płukania (0,1% TFA) i 10-krotność objętości złoża bufora do płukania.
    1. Zakwasić zbiorczą próbkę, dodając 10% TFA do pH < 3.
    2. Odwirować zbiorczą próbkę o masie 21 000 x g przez 10 minut i umieścić supernatant w nowej probówce.
    3. Wysuszyć próbkę za pomocą koncentratora próżniowego w celu usunięcia ACN.
    4. Wstępnie kondycjonować wkład ekstrakcyjny do fazy stałej zawierający kolumnę sorbentową 50 mg, przemłukując kolumnę 2 ml 100% metanolu, następnie 2 ml buforu elucyjnego (60% ACN plus 0,1% TFA) i na koniec 2 ml buforu do przemywania (0,1% TFA).
    5. Załaduj próbkę do kolumny. Dostosuj natężenie przepływu do ~100 μl/min, aby zapewnić pełny zakres wiązania peptydów. Zachowaj przepływ.
    6. Przemyć kolumnę trzykrotnie 1 ml buforu do przemywania wodą.
    7. Peptydy elutyczne za pomocą 1 ml buforu elucyjnego.
    8. Wysuszyć eluowane peptydy w koncentratorze próżniowym i przechowywać peptydy w temperaturze -80 °C do dalszego frakcjonowania.

4. Wstępne frakcjonowanie metodą offline podstawowej pH LC

  1. Przygotowanie systemu frakcjonowania
    1. Przygotuj bufor A (10 mM mrówczanu amonu, pH 8,0) i bufor B (10 mM mrówczanu amonu, 90% ACN, pH 8,0) do wysokowydajnego systemu LC o przepływie mikrolitrów.
    2. Ustawić kolumnę HPLC zawierającą zmostkowane cząstki hybrydowe etylenu (wielkość cząstek 3,5 μm, 4,6 mm × 25 cm) w wysokowydajnym systemie LC o przepływie mikrolitrów do frakcjonowania.
    3. Zainstalować pętlę na próbkę o pojemności 100 μl i kolejno przemyć pętlę 300 μl metanolu, wody i buforu A.
    4. Do umycia kolumny należy użyć 100 μl izopropanolu w stosunku 1:1:1:1 izopropanol : metanol : acetonitryl : woda. Następnie dalej równoważyć kolumnę przez 0,5 h w 95% buforu A.
  2. Przygotowanie próbki
    1. Rozpuścić zbiorczą i odsoloną próbkę TMT16 w 70 μl buforu A. Potwierdzić, że pH próbki wynosi ~ 8,0. Jeśli nadal jest kwaśny, dostosuj pH do 8,0 za pomocą 28% wodorotlenku amonu (NH4OH).
      UWAGA: Aby uniknąć utraty próbki, objętość próbki powinna być mniejsza niż 70% objętości pętli.
    2. Odwirować próbkę o masie 21 000 x g przez 10 minut w celu usunięcia osadów.
  3. Frakcjonowanie i konkatenacja
    UWAGA: Przed frakcjonowaniem rzeczywistej próbki zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie eksperymentu pilotażowego, aby upewnić się, że system LC jest w dobrym stanie. Można to wykonać z niewielką ilością rzeczywistej próbki (~5%) lub z mieszaniną peptydów nieznakowaną TMT.
    1. Wstrzyknąć próbkę i frakcjonować ją według następującego gradientu: 5% bufor B przez 10 minut, 5-15% bufor B przez 2 minuty, 15–45% bufor B przez 148 minut i 45–95% bufor B przez 5 minut. Należy użyć natężenia przepływu 0,4 ml/min.
    2. Ustaw kolektor frakcji tak, aby zbierał ułamki co 1 minutę i łączył 160 frakcji z powrotem z 40 frakcjami w 4 cyklach.
      UWAGA: Konkatenacja jest wykonywana przez połączenie wczesnych, środkowych i późnych frakcji LC eluowanych z tych samych wewnętrznych frakcji czasu w frakcję konkatenowaną. Połączone frakcje w niewielkim stopniu nakładają się na siebie w pierwszym wymiarze LC, zwiększając w ten sposób efektywne wykorzystanie okna elucji w drugim wymiarze LC. Ponadto, poprzez kilka rund konkatenacji, peptydy mogą być równomiernie rozprowadzane we wszystkich połączonych frakcjach. Wykazano, że takie podejście zwiększa pokrycie proteomu w porównaniu z analizą poszczególnych frakcji35,36.
    3. Wysuszyć wszystkie skonkatenowane frakcje w koncentratorze próżniowym i przechowywać wysuszone próbki w temperaturze -80 °C do dalszej analizy LC-MS/MS.

5. Analiza kwasowego pH RPLC-MS/MS

  1. Przygotowanie systemu o kwaśnym pH RPLC-MS/MS
    1. Zapakuj pustą kolumnę (średnica wewnętrzna 75 μm z otworem końcówki 15 μm) żywicą C18 1,9 μm o długości 10-15 cm.
    2. Podgrzać kolumnę w temperaturze 65 °C za pomocą podgrzewacza portfela motylkowego w celu zmniejszenia ciśnienia wstecznego.
    3. Dokładnie przemyć kolumnę 95% buforem B (3% dimetylosulfotlenku, 0,2% kwasu mrówkowego i 67% ACN). Następnie w pełni zrównoważyć kolumnę w 95% buforze A (3% dimetylosulfotlenku i 0,2% kwasu mrówkowego).
    4. Sprawdź wydajność systemu LC-MS/MS, uruchamiając 100 ng peptydów mózgu szczura lub peptydów BSA przed analizą próbek eksperymentalnych.
  2. Analiza LC-MS/MS frakcji skonkatenowanych
    1. Rozpuść wysuszone peptydy z zasadowych frakcji pH w 5% FA i odwiruj przy 21 000 × g przez 5 minut. Przenieść supernatant z każdej próbki do wkładki do fiolki HPLC.
    2. Załaduj ~1 μg peptydów każdej frakcji na kolumnę. Peptydy są eluowane przy natężeniu przepływu 0,25 μl/min z 60-minutowym gradientem buforu 18–45% B.
      UWAGA: Aby uzyskać wysokie numery identyfikacyjne, uruchom jedną frakcję i dostosuj nachylenie dla pozostałych frakcji w oparciu o pierwszy przebieg. Najlepszy gradient powinien mieć równomiernie rozmieszczone peptydy w całym gradiencie (Rysunek 4A).
    3. Uruchomić spektrometr mas z następującymi parametrami do analizy próbek znakowanych TMT16: Skany MS1 (pełny zakres skanowania MS: 450-1600 m/z; Rozdzielczość Orbitrap: 60 000; Cel automatycznej kontroli wzmocnienia: 1 x 106; maksymalny czas jonowania: 50 ms) oraz 20 skanów MS2 zależnych od danych (rozdzielczość Orbitrap: 60 000; Cel AGC: 1 x 105; maksymalny czas jonowania: 110 ms; HCD znormalizowana energia zderzenia: 32%; okno izolacyjne: 1,0 m/z; przesunięcie izolacji: 0,2 m/z; Wykluczenie dynamiczne: 10 s).
      UWAGA: Parametry użyte tutaj są zoptymalizowane dla jednego typu spektrometru mas (patrz Tabela materiałów). W przypadku różnych instrumentów MS użytkownicy powinni dostroić parametry urządzenia, aby osiągnąć wysokiej jakości wyniki. Jednym z ustawień jest monitorowanie znormalizowanej energii zderzenia HCD, ponieważ optymalna energia może się różnić w zależności od instrumentu, a także między TMT11 i TMT16.

6. Przetwarzanie danych

UWAGA: Analiza danych została przeprowadzona przy użyciu pakietu oprogramowania JUMP37,38,39 zawierającego hybrydowy silnik wyszukiwania baz danych (oparty na wzorcach i tagach), oprogramowanie filtrujące, które kontroluje wskaźnik fałszywych odkryć (FDR) zidentyfikowanych peptydów/białek oraz oprogramowanie do kwantyfikacji zestawów danych TMT. W zależności od sytuacji użytkownika, analiza danych może być wykonywana za pomocą innych komercyjnych lub ogólnodostępnych programów.

  1. Przeszukiwanie bazy danych
    1. Przekonwertuj pliki .raw z instrumentu MS na pliki .mzXML i przeszukaj widma MS2 w nienadmiarowej bazie danych zwodzików docelowych40 wygenerowanych z sekwencji białek ludzkich UniProt (lub innej odpowiedniej bazy danych specyficznych dla gatunku), aby obliczyć FDR zidentyfikowanych białek.
      UWAGA: Wygeneruj nienadmiarową bazę danych, łącząc sekwencje białek z baz danych Swiss-Prot i TrEMBL. Można również dodać niestandardowe sekwencje białek, które nie znajdują się w tych referencyjnych bazach danych, w tym białka rozszczepione proteazą, białka z polimorfizmami pojedynczych nukleotydów i powszechne zanieczyszczenia.
    2. Przeprowadź wyszukiwania przy użyciu następujących parametrów. Tolerancja masy dla prekursora: 10 ppm; tolerancja masy dla jonów poprodukcyjnych: 15 ppm; maksymalna liczba nietrafionych dekoltów: 2; maksymalne miejsca modyfikacji: 3; modyfikacje statyczne: 304.20715 Da dla znaczników TMT16 na resztach Lys i końcach N, 57.02146 Da dla karbamidometylacji na resztach Cys; modyfikacja dynamiczna: 15,99492 Da do utleniania na Met.
  2. Filtrowanie wyników wyszukiwania
    1. Przefiltruj wynikowe dopasowania widma peptydów (PSM) według długości peptydu (>6 aminokwasów), dokładności masy jonu prekursorowego i wyników dopasowania opartych na JUMP (Jscore i ΔJn). Peptydy są następnie grupowane według długości peptydu, końców tryptycznych, modyfikacji, pominiętych miejsc rozszczepienia i stanu naładowania.
    2. Filtruj dane dalej za pomocą pasujących wyników, aby osiągnąć FDR poniżej 1% na poziomie białka (analiza całego proteomu) lub peptydu (analiza fosfoproteomu).
      UWAGA: Jeśli na etapach filtrowania brakuje peptydów/białek kontroli pozytywnej, FDR można zwiększyć do rozsądnego poziomu, aby te peptydy/białka można było uratować.
    3. W przypadku peptydów wspólnych dla więcej niż jednego członka rodziny białek, należy zgrupować pasujące elementy w jedną grupę.
      UWAGA: Zgodnie z zasadą oszczędności, grupa jest reprezentowana przez białko homologiczne z największą liczbą wspólnych peptydów i innych białek dopasowanych do unikalnych peptydów.
  3. Kwantyfikacja białek
    1. Określ ilościowo białka za pomocą wbudowanego programu pakietu oprogramowania statystycznego do podsumowania intensywności jonów reporterowych TMT dla wszystkich dopasowanych PSM.
    2. Wyodrębnij intensywności jonów reporterowych TMT z każdego zaakceptowanego PSM i skoryguj surowe intensywności zgodnie z rozkładem izotopowym każdego odczynnika do znakowania (np. TMT16-126 generuje odpowiednio 92,6%, 7,2% i 0,2% jonów 126, 127C i 128C m/z) i odfiltruj PSM o niskiej intensywności i/lub bardzo hałaśliwym na podstawie progów zdefiniowanych przez użytkownika. Znormalizuj dane ilościowe, używając średniej obciętej (lub mediany) intensywności próbek, aby skorygować odchylenie obciążenia.
    3. Dla każdego zidentyfikowanego białka oblicz średnie intensywności w próbkach (tj. względne intensywności) dopasowanych PSM i podsumuj względne intensywności PSM, biorąc średnią dla próby. Przekształć sygnały względne na bezwzględne, mnożąc ogólną średnią intensywność trzech najliczniej dopasowanych PSM.
    4. Popraw interferencję kwantyfikacji przy użyciu wcześniej zgłoszonego podejścia do korekcji jonów y137, które zakłada, że intensywność jonów y1 jest skorelowana z intensywnością jonów reporterowych. Szacując liniową zależność między intensywnością jonów y1 a reporterowymi z czystych skanów, uzyskuje się i koryguje poziom zakłóceń od intensywności zanieczyszczonych jonów y1 w hałaśliwych skanach.
      UWAGA: W przypadku peptydów tryptycznych znakowanych TMT, reszty K-TMT i R są dwoma reprezentatywnymi jonami y1 (odpowiednio 376.27574 Da i 175.11895 Da) w widmie MS2. Jeśli wykryty zostanie tylko jeden jon y1 i jest on zgodny ze zidentyfikowanym peptydem, wówczas MS2 jest uważany za czysty skan. Jeśli zostaną wykryte oba jony y1, MS2 jest uważany za skanowanie zaszumione.
    5. Przenieś wartości ilościowe białka do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy. Użyj nienadzorowanych metod analizy danych, takich jak PCA lub analiza skupień, aby zbadać rozkład próbek. Aby zidentyfikować białka o zróżnicowanej ekspresji, należy użyć metod statystycznych, takich jak test t i analiza wariancji (ANOVA).

7. Walidacja danych MS

UWAGA: Przed przeprowadzeniem czasochłonnych eksperymentów biologicznych, użyj przynajmniej jednej metody walidacji, aby ocenić jakość danych dotyczących stwardnienia rozsianego.

  1. Ręcznie sprawdź widma MS/MS interesujących Cię białek, aby zweryfikować sekwencję peptydową i intensywność jonów reporterowych TMT.
  2. Stosuj podejścia oparte na przeciwciałach (np. western blotting lub analiza immunohistochemiczna), aby zweryfikować zmiany w poziomach białka. Aby potwierdzić obecność peptydów natywnych, użyj peptydów syntetycznych jako wzorców wewnętrznych. Widma MS/MS peptydów i czas retencji podczas LC-MS/MS powinny być identyczne w tych samych warunkach.
  3. Zastosuj ukierunkowane podejście do stwardnienia rozsianego w celu weryfikacji zmian w białkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół dla nowo opracowanego TMT16, w tym reakcja etykietowania, odsalanie i warunki LC-MS, był systematycznie optymalizowany41. Ponadto bezpośrednio porównaliśmy metody 11-plex i 16-plex, używając ich do analizy tych samych próbek AD u ludzi41. Po optymalizacji kluczowych parametrów dla TMT16, obie metody TMT11 i TMT16 dają podobne pokrycie proteomu, identyfikację i kwantyfikację > 100 000 peptydów w > 10 000 ludzkich białek.

Ponieważ od...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoptymalizowany protokół głębokiego profilowania proteomu opartego na TMT16 został z powodzeniem wdrożony we wcześniejszych publikacjach 12,13,41. Dzięki obecnemu protokołowi ponad 10 000 unikalnych białek z maksymalnie 16 różnych próbek może być rutynowo oznaczanych ilościowo w jednym eksperymencie z dużą precyzją.

Aby uzyskać wysokiej jakości wyniki, ważne jest, aby zwracać uwagę na krytyczne kroki ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez National Institutes of Health (R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, RF1AG064909 i U54NS110435) oraz ALSAC (American Liban Syrian Associated Charities). Analiza stwardnienia rozsianego została przeprowadzona w Centrum Proteomiki i Metabolomiki St. Jude Children's Research Hospital, które jest częściowo wspierane przez NIH Cancer Center Support Grant (P30CA021765). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% Criterion TGX Prefabrykowany żel białkowyMidi Biorad5671035
10X TGS (Tris/Glycine/SDS) BuforBioRad161-0772
4– 20% Criterion TGX Precast Midi Protein GelBiorad5671095
50% HydroxylamineThermo Scientific90115
6 x SDS Bufor do ładowania próbekBoston Bioproducts IncBP-111R
Mrówczan amonu (NH4COOH)Sigma70221-25G-F
Wodorotlenek amonu, 28%Sigma338818-100ml
Bullet BlenderNext AdvanceBB24-AU
Butterfly Portfolio PodgrzewaczPhoenix S& TPST-BPH-20
C18 ZiptipsAparat Harvard74-4607Używany do odsalania
ditiotreitolu (DTT)SigmaD5545
Kwas mrówkowySigma94318
Kolektor frakcjiGilsonFC203B
Kod żelowy Odczynnikdo niebieskiej plamyKoraliki24592
Next AdvanceGB05
HEPESSigmaH3375
HPLC Grade AcetonitrylBurdick & JacksonAH015-4
Woda klasy HPLCBurdick & JacksonAH365-4
Jodoacetamid (IAA)SigmaI6125
Lys-CWako125-05061
Spektrometr masowyThermo ScientificQ Exactive HF
MassPrep BSA Mineralizacja Wody standardowe186002329
MetanolBurdick & JacksonAH230-4
Nanoflow UPLCThermo ScientificUltimate 3000
Pierce BCA Zestaw do oznaczania białekThermo Scientific23225
Żywica ReproSil-Pur C18, 1,9umDr. Maisch GmbHr119.aq.0003
Kolumny do samodzielnego pakowaniaNowy obiektywPF360-75-15-N-5
SepPak 1cc 50mgWodyWAT054960Służy do odsalania
Deoksycholanu soduSigma30970
SpeedvacThermo ScientificSPD11V
TMTpro 16plex Zestaw odczynników do etykietThermo ScientificA44520
Kwas trifluorooctowy (TFA)Applied Biosystems400003
TrypsynaPromegaV511C
Ultra-mikro kolumna wirowa, aparat C18Harvard74-7206Używany do odsalania
mocznikaSigmaU5378
Xbridge Kolumna C18Wody186003943Używany do zasadowego pH LC
DMSO Sigma 41648 szklane Thermo

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levy, M. J., Washburn, M. P., Florens, L. Probing the sensitivity of the orbitrap lumos mass spectrometer using a standard reference protein in a complex background. Journal of Proteome Research. 17 (10), 3586-3592 (2018).
  2. Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
  3. Mertins, P., et al. Proteogenomics connects somatic mutations to signalling in breast cancer. Nature. 534 (7605), 55-62 (2016).
  4. Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (3), 1646-1654 (2015).
  5. Moulder, R., Bhosale, S. D., Goodlett, D. R., Lahesmaa, R. Analysis of the plasma proteome using iTRAQ and TMT-based Isobaric labeling. Mass Spectrometry Reviews. 37 (5), 583-606 (2018).
  6. Wang, H., et al. Deep multiomics profiling of brain tumors identifies signaling networks downstream of cancer driver genes. Nature Communications. 10 (1), 3718(2019).
  7. Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 5293-5309 (2014).
  8. Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045(2018).
  9. Dayon, L., et al. Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6-plex isobaric tags. Analytical Chemistry. 80 (8), 2921-2931 (2008).
  10. Stepanova, E., Gygi, S. P., Paulo, J. A. Filter-based protein digestion (FPD): A detergent-free and scaffold-based strategy for TMT workflows. Journal of Proteome Research. 17 (3), 1227-1234 (2018).
  11. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical Chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  12. Thompson, A., et al. TMTpro: Design, synthesis, and initial evaluation of a proline-based isobaric 16-plex tandem mass tag reagent set. Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).
  13. Li, J., et al. TMTpro reagents: a set of isobaric labeling mass tags enables simultaneous proteome-wide measurements across 16 samples. Nature Methods. 17 (4), 399-404 (2020).
  14. Arul, A. B., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).
  15. Labib, M., Kelley, S. O. Single-cell analysis targeting the proteome. Nature Reviews Chemistry. 4 (3), 143-158 (2020).
  16. Ren, R. J., Dammer, E. B., Wang, G., Seyfried, N. T., Levey, A. I. Proteomics of protein post-translational modifications implicated in neurodegeneration. Translational Neurodegeneration. 3 (1), 23(2014).
  17. Pagel, O., Loroch, S., Sickmann, A., Zahedi, R. P. Current strategies and findings in clinically relevant post-translational modification-specific proteomics. Expert Review of Proteomics. 12 (3), 235-253 (2015).
  18. Mertins, P., et al. Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 13 (7), 1632-1661 (2018).
  19. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  20. Bai, B., et al. Deep multilayer brain proteomics identifies molecular networks in Alzheimer's disease progression. Neuron. 105 (6), 975-991 (2020).
  21. Kelstrup, C. D., et al. Rapid and deep proteomes by faster sequencing on a benchtop quadrupole ultra-high-field orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6187-6195 (2014).
  22. Meier, F., et al. Online parallel accumulation - serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (12), (2018).
  23. Schweppe, D. K., et al. Full-featured, real-time database searching platform enables fast and accurate multiplexed quantitative proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2026-2034 (2020).
  24. Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. Journal of Proteome Research. 14 (2), 829-838 (2015).
  25. Dey, K. K., et al. Deep undepleted human serum proteome profiling toward biomarker discovery for Alzheimer's disease. Clinical Proteomics. 16, 16(2019).
  26. Bai, B., et al. Deep profiling of proteome and phosphoproteome by isobaric labeling, extensive liquid chromatography, and mass spectrometry. Methods in Enzymology. 585, 377-395 (2017).
  27. High, A. A., et al. Deep proteome profiling by isobaric labeling, extensive liquid chromatography, mass spectrometry, and software-assisted quantification. Journal of Visualized Experiments. (129), e56474(2017).
  28. Chick, J. M., et al. Defining the consequences of genetic variation on a proteome-wide scale. Nature. 534 (7608), 500-505 (2016).
  29. Wang, Z., et al. Quantitative phosphoproteomic analysis of the molecular substrates of sleep need. Nature. 558 (7710), 435-439 (2018).
  30. Tan, H., et al. Integrative proteomics and phosphoproteomics profiling reveals dynamic signaling networks and bioenergetics pathways underlying T cell activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
  31. Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764(2011).
  32. Kleiman, L. B., Maiwald, T., Conzelmann, H., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Rapid phospho-turnover by receptor tyrosine kinases impacts downstream signaling and drug binding. Molecular Cell. 43 (5), 723-737 (2011).
  33. Mertins, P., et al. Ischemia in tumors induces early and sustained phosphorylation changes in stress kinase pathways but does not affect global protein levels. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (7), 1690(2014).
  34. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  35. Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10A cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
  36. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  37. Niu, M., et al. Extensive peptide fractionation and y(1) ion-based interference detection method for enabling accurate quantification by isobaric labeling and mass spectrometry. Analytical Chemistry. 89 (1), 2956-2963 (2017).
  38. Wang, X., et al. A tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (12), 3663(2014).
  39. Li, Y., et al. JUMPg: An integrative proteogenomics pipeline identifying unannotated proteins in human brain and cancer cells. Journal of Proteome Research. 15 (7), 2309-2320 (2016).
  40. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  41. Wang, Z., et al. 27-plex tandem mass tag mass spectrometry for profiling brain proteome in Alzheimer's disease. Analytical Chemistry. 92 (10), 7162-7170 (2020).
  42. Ow, S. Y., et al. iTRAQ underestimation in simple and complex mixtures: "The good, the bad and the ugly". Journal of Proteome Research. 8 (11), 5347-5355 (2009).
  43. Karp, N. A., et al. Addressing accuracy and precision issues in iTRAQ quantitation. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (9), 1885-1897 (2010).
  44. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
  45. Gygi, J. P., et al. A triple knockout isobaric-labeling quality control platform with an integrated online database search. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1344-1349 (2020).
  46. Savitski, M. M., et al. Measuring and managing ratio compression for accurate iTRAQ/TMT quantification. Journal of Proteome Research. 12 (8), 3586-3598 (2013).
  47. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376(2002).
  48. Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513(2014).
  49. Brenes, A., Hukelmann, J., Bensaddek, D., Lamond, A. I. Multibatch TMT reveals false positives, batch effects and missing values. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 1967-1980 (2019).
  50. Yu, J., Peng, J., Chi, H. Systems immunology: Integrating multi-omics data to infer regulatory networks and hidden drivers of immunity. Current Opinion in Systems Biology. 15, 19-29 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Znakowanie TMT 16 plexprzygotowanie pr bek bia ektrawienie enzymatycznefrakcjonowanie LC LCtandemowa spektrometria maskomputerowe przetwarzanie danych
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły